JPS63231268A - 連鎖球菌ａ抗原測定用試験キット，抽出装置および測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は連鎖球菌Ａ抗原の測定用試験キットと、連ｇ球
菌微生物から抗原を抽出するための抽出装置と、抗原の
測定法に関する。

［従来の技術］ 抗原抗体反応は総ての免疫学的試験法の基礎である。抗
体として知られているある種のタンパク質は別種のタン
パク質または炭水化物のような抗原すなわち異物である
の存在に応答してｌ’ｌｉ孔類によって産生される。こ
の異物に対する正常な身体の応答によって、′８−柿の
病気、異常および生理条件を診断するのに用いられる多
くの技術が開発さり、できた。一般的意味においては、
検出される抗原抗体反応の成分はこの場合には免疫種と
して定義され、他の対応する成分はレセプターと考えら
れている６ 例えば、生体試料についての疑わしいタンパク質、抗原
または抗体の存在についての試験管内試験は生物試料に
免疫学的に対をなすものを加えることによって行われる
。疑わしい物質が存在するときには、抗原−抗体組体の
沈澱によって生じる抗原抗体反応を示すことかできる。

この反応錯体は通常は目視によって検知することが困難
である。

このため抗体または抗原の一方をポリマーラテ・ｙクス
粒子のような不溶性粒子に結合させることにより、錯体
が形成された場合には、凝集体または粒子に関連した検
出可能なトレーサーを観察することによって生成する凝
集から錯体を容易に検出することができる０次いで、凝
集は粒子の懸濁液からの粒子の凝集によって特徴付けら
れる。

数種の連鎖球菌の群のうち、群へ連鎖球菌（ストレプト
コッカス・ピオゲンス（Ｓ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　）
は、β溶血性肺炎、狸紅熱、リウマチ熱、心不全（ｃａ
ｒｄｉａｃ　５ｅｑｕｅｌａｅ）、糸球体腎炎、敗血性
咽頭炎や産褥熱のようなヒトにおける病的状況を引き起
こす主因である。連鎖球菌Ａによって引き起こされる可
能性の高い感染症か重篤であるなめ、感染の早期の段階
で連鎖球菌Ａの存在を診断して適正な治療経路を選択し
得るようにすることが大切である。初期の検出のための
試験では、生物試料を通常は少なくとも１８時間から４
８時間までの長期間培養する必要があった。大抵の場合
、このように長たらしい試験では治療が遅れてしまうの
で、これらの試験は好ましくない。医者によっては、試
験培養物を評価のために郵便または輸送によって試験室
へ送らねばならず、それによって治療は更に遅れること
になる。

更に近年の連郭球菌Ａの試験では、培養法より速やかで
あるといわれる方法が報告されている。

成る既知の凝集試験ではある種の酵素を用いて、喉から
標本を得るのに用いた消毒綿から直接抗原を抽出する。

この分析法のためのキ７１’は、標本を収集するアプリ
ケーター装置と、酵素を含む抽出試薬と、適当な指示試
薬から成っている。

もう一つの凝集法は欧州特許公告第１５０，５６７号明
細書に記載されている。この分析法では水＃酸と組み合
わせた亜硝酸ナトリウムの溶ン後を用いる抽出法か記載
されている。しかしながらこの分析法は抽出組成物が渫
管、輸送あるいは取扱いが容易でないため、極めて不利
である６酢酸は通常の使用条件である室温で揮発性液体
である。

それ故、長期間の保存や取扱いの容易さの点か問題とな
る。

米国特許第４，６７３，６３９号明細書には、揮発性抽
出試薬に関連した問題点を解決するどいわｔＬる手段が
記載されているにの文献では、直ぐに使用できるマイク
ロチューブに１種または２種の抽出試蓮を水溶性結合剤
材料と組み合わせて担持する（ａｆｆｉｘｉｎｇ）こと
が提案されている。用いられる試薬にはクエン酸のよう
な不揮発性酸がある。この特許明細書は、この方法が既
知の分析法に比し中和工程が不要である点も有利である
ことら教示している。この工程を省いても、使用される
凝集試薬や分析結果には悪影響を与えないことが記載さ
れている。

［発明が解決しようとする問題点］ 中和工程を省略すると連鎖球菌Ａ抗原の分析においであ
る種の凝集試薬が悪影響を受けることが見出たされてい
る。また、これらの試薬が低いＰ　Ｈ環境中に余り長時
間あると、中和工程を省略することによって抗体が悪影
響を受けることかある６更に、抽出試薬を固定するため
の結合剤材料を用いると余計な材料や製造経費が掛かる
ので、結合剤材料を用いる必要をなくすことも望まれる
。

［問題点を解決するための手段］ 既知の試験キットと連鎖球菌Ａの分析法に関して上記し
た問題点は、 （ａ）　　連鎖球菌Ａ微生物からの抗原の亜硝酸抽出に
必要な乾燥して結合剤を含まない第一の抽出試薬をコー
ティングした水に不溶性の基材と、（１））　　亜硝酸
抽出に要する第二の抽出試薬の水性溶ンαと、 （ｃ　）　　Ｉ）　Ｈが５〜１０の中和溶（後と、（ｄ
）　　連鎖球菌Ａ抗原またはこの抗原か結きする抗体の
いずれかを有する７に不溶性粒子から成る試料または免
疫反応性試薬とから成る連鎖球菌Ａ抗原の測定用試験キ
ｙｌ−を用いることによって解決される。

本発明によれは連鎖球菌Ａ微生物を含むことが疑われる
生物標本から連鎖球菌Ａ抗原を抽出するための抽出装置
であって、 （ｉ）　　連鎖球菌Ａ　ＩＮ’ｌ生１勿からの抗原を亜
硝酸抽出するのに要する乾燥して結合ｆｆｌ＋を含まな
い抽出試薬のコーティングを内部に担持した水不溶性容
器と、 （ｉｉ）　　容器内に生物標本を採取して沈澱させるア
プリケーター手段とから成る抽出装置か堤供される。

連鎖球菌Ａ抗原の測定法は、 くイ）　連蓋球菌Ａ微生物を含むことが疑われる生物標
本を、該微生物から抗原を亜硝酸抽出するのに要する第
一および第二の抽出試薬であって、第一の試薬は水不溶
性基村上に乾燥して結合剤を含まないコーティングとし
て供給され、第二の試薬が水性溶液で供給されるものと
接触させ、（ロ）　生成する抽出された抗原の溶液を中
和し、 （ハ）　抽出された抗原をこの抗原に対する抗体と反応
させて抗原と抗体の反応生成物を形成させ、 （ニ）　反応生成物と未反応材料とを分離し、（ホ）　
反応生成物または未反応材料のいずれか一方の量を測定
することから成っている。

生物標本中の連鎖球菌Ａ抗原の好ましい測定法は、 （イ）　連鎖球菌Ａ微生物を含むことが疑われる生物標
本を、該微生物から抗原を亜硝酸抽出するのに要する乾
燥して結合剤を含まない第一の抽出試薬をコーティング
した水不溶性基材と接触させ、 （ロ）　接触段階（イ）と実質的に同時に、標本と亜硝
酸抽出に要する第二の抽出試薬の水性溶液とを接触させ
、 （ハ）　９０℃以下の温度で５分間以内の時間、生成す
る抽出溶液をインキュベートし、（ニ）　抽出溶液を中
和し、 （ホ）　試験装置中で、その抗体自体が結合する抗原に
対する抗体を有する水不溶性粒子を含んでなる、抗原用
免疫反応性試薬と、前記の中和した抽出溶液とを接触さ
せ、抗体と抗原との凝集反応生成物を形成し、 （へ）　凝集した反応生成物と未反応材料とを分離し、 （ト）　　凝集した反応生成物または未反応材料の址を
測定することから戎っている。

［実施の態様１ 本発明は、極めて短時間すなわち通常は１０分間未満で
行うことかでき且つ複雑な装置を用いない連鎖球菌Ａの
診断試験を堤供する。これによって、試験か医者のオフ
ィスで行うことかできるようになり、且つ医者は同日に
試験の結製に基づいて治療経路を決定することかできる
ようになる。

この試験は咽喉からの脱脂綿標本、尿標本またはその他
の水性ン夜体の試料のような生物試料中の連鎖球（ｉ　
Ａ抗原の存在を検出する。これらの生物試料は、好まし
くない砕片または干渉物を取り除くための前処理く例え
ば、と過）を行ってもまたは行わなくとも試験すること
かできる。

本発明の試験キットは、乾燥して結合剤を含まない第一
の抽出試薬（以下に説明する）をコーティングした水不
溶性基材を有する。この基材は、水不溶性で江つ抗原の
分析に用いられる反応に対して不活性であれは如何なる
好適な形態、構造または材料のものでもよい、　ｓ’ｉ
ｊｉも単純な形態では、この基材は試験管、カラススラ
イド、マイクロチューブ、試験スライド、濾紙ストリッ
プまたは結合剤材料を使用せずに１以ヒの表面または腔
部に担持して乾燥することができるその池の好適な材料
でよい、この基材組成物は、如何なる好適な天然または
合成材料（例えは、ガラス、ポリマー生材料、セルロー
ス性材料およびその他の当業界に知られているもの）と
することかできる。

好ましい７ｉＪ様では、基材は抽出装置の一部である容
器であり、必要な試薬を用いて容器内で生物（志木から
抗原を抽出することができるように設計されている容器
である。このような抽出装置は、容器内の生物標本を収
集して付着させるアプリケーター手段を備えていてもよ
い。アプリケーター手段は、通常はアプリケーター棒と
その一方の末端にある線維質の消毒綿とを有している。

連鎖球菌Ａ試験に有用なアプリケーター手段は当業界で
知られており、例えは米国特許第４，６１８．５７６号
明細書に記載されている。その最も単純な形状では、抽
出装置はアプリケーター手段を保持するためのホルダー
を有する単純なカップでよい６第一の抽出試薬をカップ
の内側に付着させる。

亜硝酸は有機物から連鎖球菌Ａ抗原を抽出するのに有用
な化合物であることか知られているが、不安定であるこ
とも知られている。それ故、互いに反応して抽出操作の
際にただちに亜硝酸を供給する第一および第二の試薬を
使用するのが好ましい。通常は、これらの試薬は、亜硝
酸塩と、この亜硝酸塩と反応して亜硝酸を供給する酸と
から成っている。

これらの試薬の一方は上記の基材または抽出装置上に乾
燥状態で存在する。どちらかそれであるかは重要ではな
いが、不揮発性酸（以下に説明する）であることか好ま
しい。第一の試薬は、ベース４．６７３．６３９号明細
書に教示されているような々１】何なる結き剤材料とも
混合されない。乾燥した試薬は不揮発性であり、周囲条
件（すなわち、１６８〜３０℃）で組成的に安定である
。第一の試薬を、乾燥した形状の１種類以上の付加物（
例えは、界面活性剤、榎街剤または当業者に知られてい
るその他の材料）と混合することは任意である。

抽出試薬は、適当な方法で基材に塗布され、適当な粂件
下で乾燥される。

第一の試薬は、好ましくは融点か１８℃以上であり且つ
ｐＫａが５以下である不揮発性の有機酸である。有用な
有機酸の例としては下記のものがあげられるが、それら
に限定されるものではない。

クエン酸、マロン酸、フェニル酢酸、シュウ酸、グリコ
ール酸、クロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、
ブロモ西［酸、ヨード酢酸、コハク酸、ゲルタール酸、
アジピン酸、ピメリン酸、スペリン酸、安息香酸、ベン
ゼンスルホン酸、ρ−トルエンスルホン酸、アゼライン
酸およびセバシン酸。

上記のカルボン酸が特に有用であり、クエン酸が最も好
ましい。

抽出処理に要する第二の抽出試薬は亜硝酸塩である。有
用な亜硝酸塩には一曲硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム
、亜硝酸カルシウム、亜硝酸ストロンチウム、亜硝酸バ
リウムおよび亜硝酸銀のような無機亜硝酸塩、および亜
硝酸ブチルおよび亜硝酸イソアミルのような有機亜硝酸
塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

亜硝酸ナトリウムおよびカリウムが好ましく、亜硝酸ナ
トリウムが最も好ましい。一方の抽出試薬（例えは、有
Ｕ（酸）は、通常は上記の基材上に乾燥した形状でキッ
トに供給されるが、もう一方の試薬（例えば、亜硝酸塩
）は通常は水性溶ｌ後で供給される。この溶液は界面活
性剤または反応に不活性で亜硝酸を生成するその他の付
加物を任意に有することができる。

生成する抽出溶ン後中の組み合わせた亜硝酸塩と有機酸
の濃度は、１重用する特定の化合物、それらの水溶性お
よび試験試料中に存在する抗原の推定址によって広範囲
に変えることかできる。更に詳細には、存在する亜硝酸
塩の是は、少なくとも０゜０５モルであり、２〜１２モ
ルとすることができる。有機酸は、通常は少なくとも０
０１モルの址で存在し、好ましくは０．０１〜１モルの
量で存在する。

試験キ・ントはｐＨが５・〜１０、好ましくは６゜５〜
８．５の中和溶液も含んでいる。この溶液は、抽出か起
った後で且つ凝集試薬と接触する前に抽出溶液を中和す
るのに用いられる。分析処理の更に詳細についてはＨｆ
に説明する６一般的には、中和溶液は所望なＰ　Ｉ−［
を有する好適な緩衝液である。多くのこのような緩衝液
が当業界に知られている。一つの好ましいｌＪｔ　ｊＲ
？（＋は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
である。中和溶液は、任、似にエチレンジアミン四ｉ！
ｌ？［Ｗのような金属キレート削を含むことができる。

本発明の実施において供給され且つ使用される免疫反応
性試薬は、３！１！鎖球菌Ａ抗原または適当な水不溶性
粒子〈ト記に定義する）の表面に結合し　　□たこの抗
原に対する抗体を含んでいる。粒子、抗原または抗体は
、試薬を検出可能にするためのトレーサー物質〈下記に
定義する）で好適な方法で標識することができる６試薬
は、乾燥試料としてもまたは水性分散液としても供給す
ることができる。

一つの態様では、免疫反応性試薬は、水不溶性ｌｆ）′
ｌ子の表面に結合した抗体から成っている。生物標本中
の抽出された連鎖球菌Ａ抗原の競合的結合分析は、本発
明では標識した連鎖球菌Ａ抗原の所定量と組み合わせた
免疫反応性試薬を用いて行う。

不溶性免疫反応性試薬と標識および非標識抗原との反応
生成物が次に形成され、適当な方法で未反応材料から分
離される。不溶化されたまたは可溶性標ふ１抗原を計測
して、標本中の抗原の量を決定することができる。

或いは、抗体を抽出された抗原および成る方法でで標識
されている粒子に結合した抗原を有する免疫反応性試薬
と競合的に反応させることもできる。

もう一つの態様では、抽出された抗原を適当な固形状担
体物質に結合させる。免疫反応性試薬、この抗原に対応
する抗体である。この抗体を適当に標識して、反応生成
物または未反応抗体を計測することができる。

川にもう一つの態様では、連鎖球菌Ａ抗原は、免疫反応
性試薬の抗体に標識抗体を加える分析において担体粒子
に結合した抗体から成る免疫反応性試薬を用いて決定す
ることかできる。かかる抗体は放射性同位体、化学発光
化合物、比色または螢光化合物、およびその他の当業界
に知られている物のような適当なトレーサーで標識する
ことができる。例えは、抗原を、「サンドイッチＩＥＬ
ＩＳＡとしても当業界に知られている「サンドイツチ」
酵素標識免疫収着分析法で測定することができる。この
技法は、粒子に結合した第一の抗体くモノクローン性ま
たはポリクローン性抗体）と適当な酵素で標識した第二
の抗体くモノクローン性またはポリクローン性抗体）を
用いることがら成っている。これらの抗体は両Ｈ共連鎖
球菌Ａ抗原に特異的である。免疫反応性試薬は、抗原と
酵素を標識した抗体との反応の前、同時または後に、抽
出された抗原と反応させることができる。

好ましい態様では、適当な方法で粒子の表面に結合した
連鎖球菌Ａ抗原に対する抗体を有する水不溶性粒子から
成る試薬を用いて凝集法によって、連鎖球菌Ａ抗原の存
在を検出する。抗原と抗体分子との反応〈結合）によっ
て、次いで粒子か互いに連結されてそれらが大きな凝集
体を形成するようになる。

試薬に用いられる好適な水不溶性粒子は、水不溶性であ
り且つ何らかの方法で適当な数の抗体分子を結合させる
ことができる天然または合成粒子であることができる。

有用な粒子の例には、フェリチン結晶、アガロース粒子
、カラスビーズ、ラテックス粒子のようなポリマー粒子
、およびその他の当業界に知られているものが挙げられ
る。下記の文献には、代表的な有用な粒子が記載されて
いる。本田特許第３，７００．６０９号、第３゜８５３
゜９８７号、第４．１０８，９７２号、第１１．２５８
．００１号、第４．４０１．７６５号、第４．４１９．
４５３号、第４．４５９．３６１号、第４，４７８．９
４６号および第１１５９１゜５７１号明細書。本発明に
有用な粒子は、大概は極めて小さく、直径が２μｓ未満
である。好ましくは、これらの粒子の平均直径は０．１
〜１ＩＩ１１１である。

特に有用な粒子はポリマー性ラテックス粒子であり、更
に好ましくはそれらはコアー−シェルポリマーラテック
ス粒子として当業界に知られているものである。粒子が
水不溶性である限り、がかる粒−ｔの調製に多種多様な
モノマーを用いることができる。ポリマー化学の技術に
熟練した作業者は、適当なラテ・ソクス粒子を設計して
ユＩ製することができるであろう７本発明の実施におい
て好ましいコアー−シェルポリマー性うテ・ソクス粒子
を、下記の実施例に記１銭する。これらの粒子は、スチ
レンのホモまたはコポリマーがら成るコアーとクロロメ
チルスチレンまたはｍ−およびρ−（２−クロロエチル
スルホニルメチル）スチレンのホモ−またはコポリマー
から成るシェルを有する６本発明は、外表面に遊離のカ
ルホキシル基を有するポリマー粒子の場合には特に有利
である。かかる基は、水性媒体中に粒子を分散させ且つ
これらを分散した状態に保つのに有用であることがある
。

これらの基はカルボキシル基を有する工、チレン不飽和
重合性モノマーから調製されるホモまたはコポリマー中
に存在することがあり、上記モノマーにはアクリル酸、
メタクリル酸、イタコン酸および当業界に知られている
その他のものがあるがこれらに限定されるものではない
。

本発明の分析は、例えば光散乱またはその他の適当な技
法を用いて凝集体の有無を観察することによって行うこ
とができるが、粒子が、粒子と組み合わせた十分なトレ
ーサー分子を有して、凝集両膜は未凝集の残留物質に見
られるトレーサーの量から種を定量分析することができ
るようにするのが好ましい、トレーサー分子を、粒子の
外表面に結きさせるかまたは好ましくは（染料のような
）粒子内に分布させることができる。如何なるトレーサ
ー材料であっても、凝集体の検出を可能にすることがで
きるものであれば使用することができる。フェリチン結
晶を粒子として用いる場合には、トレーサー分子はそれ
らの結晶に固有の跣の分子である。その他の天然または
合成粒子は、トレーサーとして、放射性同位体、比色化
合物、螢光化合物、化学発光化合物、燐光化合物および
その他の当業界に知られている検出可能な物質を有する
ことができる。好ましくは、トレーサーは放射性同位体
、比色化合物または螢光化合物（例えば、染料または希
土類キレート）である、当業者は、適当なトレーサーを
使用される特定の粒子と組み合わせることができるであ
ろう。

一つの態様では、トレーサーは、例えば米国特許第４，
２５９，３１３号明細書に記・絨されているユーロピウ
ムキレートのような螢光希土類キレートとすることがで
きる。もう一つの好ましい態様では、トレーサーは凝集
体において容易に検出される比色化合物である。有用な
染料は当業界に知られている。幾つかの染料を、粒子を
調製するときに粒子に配合することができる。また、染
料を、それらが漏洩しないような方法で予備成型された
粒子に吸収させる。

トレーサーは如何なる好適な方法でも粒子内に分布させ
ることができる０例えば、トレーサーは、例えば米国特
許第３，８５３，９８７号明細書に示されるように、そ
の中に均一に分布させることができる。好ましくは、ト
レーサー分子は、粒子の限定されたＷ域、例えば表面付
近または主として粒子の内部に配置される。好ましいコ
アー−シェル粒子では、トレーサーはコアーまたはシェ
ルのいずれにあってもよいが、最も好ましくは、実質的
に総て力１〜レーサーは粒子のコアーにある。

連鎖球菌Ａ抗ハにまたはこの抗原に討する抗体は、適ノ
ｉな方法、例えば吸着または共有結合によって杓ｒの外
人面に結合される６結合は、例えば上記文献に記、戎さ
れているような既知の技法を用いて行う、二とかできる
。共有結合は、分子が粒子がら↑り脱離しないので、好
ましい８共有的に結合する場合には、抗原または抗体分
子を直接に粒子に結なさせることもまたは適当な結合基
を介して結きさせることもできる。モノクローン性また
はポリクローン性抗体のいずれを用いることらできる。

抗体は、商業的に入手することもまたは既知の技法を用
いてｉｌｌ製することもできる０例えば、ポリクローン
性抗体は、一般的には好適な用ｉ乳類に抗原を注ｑ・［
することによって調製され、次いでこの叩ニアＬ　５Ｊ
、か抗体を生じ、これを取り出して使用することができ
るのである。モノクローン抗体は、標準的なハイブリド
ーマ技法を用いて得られる。

本発明の試験キントは、反応した物質から未反応′Ｉ！
］質を洗浄するのに好適な洗浄溶液を任意に有すること
かできる。好ましい洗浄溶液は、ρト１が５〜１０であ
り、少なくとも０２５のイオン強度を提供するイオン性
化合物を含む。

連鎖球菌Ａ抗原の分析は、凝集分析法の場合と同様に、
反応した物質を未反応物質がら分離するための微孔性ｌ
摸を有する好適な試験装置を用いて行うことができるが
、本発明はそれに限定されるものではない。かかる装置
は、抽出された抗原を付着させて免疫反応性試薬と反応
させるための１個以上のウェルを有することかできる。

この試薬は、分析中に別個にまたは抽出された抗原と共
に装置に添加することができ、または製造時に装置に組
み込むこともできる。

一般的には、抗原は、例えは消毒線上の生物標本を、試
薬か所望な結果を達成するような方法で（例えば、抽出
装置中の）溶液状の抽出試薬と接触させることによって
抽出される。　９０　℃以下の温度はく５分間以下の）
インキュベーション時間を必要とすることもある。低温
では更に長時間を用いることもできる。好ましくは、イ
ンキュベーションは９０℃以下では１分間以内であり、
または３０℃以Ｆでは５分間以内である６Ｂも好ましく
は、インキュベーションは２５℃（室温）で１分間行わ
れる。本発明の好ましい態様の利点は、抽出か速やかに
起こるので、分析全体か極めて速やかになることである
。

生成する抽出溶液をＬ記中和／８液で中和した後、抽出
された抗原を上記のような試験装置で免疫反応性試薬と
接触させて、抗原と抗体の反応生成物を形成させるよう
にする。

上記の好ましい態様では、生成物は凝集体である。抽出
した抗原を抗体分子と接触させて凝集体を形成するのと
同時にまたはその後に、凝集体を微孔性の水不溶性膜と
接触させるのも好ましい。

一つの態様では、別個の容器に凝集体を形成させた後、
膜と接触させることができる。′ａ隼体を膜の存在にお
いて形成させるのも好ましい。この膜（詳細は後述）は
、単に毛で支持されたフィルタ一手段であってこれを通
して未凝集物質を２過するものであってもよい。しかし
ながら、分析を行う試験装置に膜を設置するのが好まし
い、このような試験装置はＬ記している。

如何なる微孔性の水不溶性膜であっても、それか分析に
用いられる物質に対して不活性であり、且つ流体と未凝
集物質は通過させるが凝集した物質はよめるような所望
な多孔性を有するがきり、用いることができる。換言ず
れは、膜の孔は未凝集粒子を通過させるのにモ分なほど
大きいが、凝集した粒子を通過させるほど大きくはない
ものでなければなちない。更に詳細には、膜の平均孔径
は、上記水不溶性粒子の平均直径の少なくと＃Ｊ５倍で
なければならない、好ましくは、平均孔径は、手向粒子
直径の６〜１５倍である。有用な膜には、各種源から商
業的に利用し得るポリマー性物質がある。一つの有■な
膜は、パル・コーポレーション（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ、
）によってバイオダイア　（ＢＩＯＤＹＮＬ）またはウ
ルチボア（ＵＬＴＩＰＯＲ）として製造させ且つ市販さ
れているナイロン−６６微孔性膜である。

好適なインキュベーション時間を用いて、所望ならば膜
と接触させる前または接触時に、凝集を最適にすること
かできる。この時間が経過した後、未凝集残留物質を膜
を通して洗浄し、凝集体は膜上に残す。この分離−［程
は、通常は試験装置に中和された溶液を添加する１〜１
０分以内に行われる。

未凝集の残留物質を膜から洗い落としてしまったならば
、トレーサーか容易に観察し得る比色染料である場合に
は、通常は凝集体または残留物質中の抗原の邊を肉眼で
計測することができる５或いは、標準的な比色検出装置
を用いることもできる。放射性同位体、螢光染料、燐光
染料等のその他の型のトレーサーには、適当な検出装置
が必要である。

［実施例ｊ 実施例１ 抽出処理においてクエン酸を用いる連鎖球菌への凝集定
量 この実施例では、連鎖球菌Ａ抗原の定量に就いての本発
明の詳細な説明する。

コアーシェルポリマー性ラテックス粒子を、コアーシェ
ル重合法を用いて１卯１製した。赤色染料（オイルレッ
ドイージーエズ（Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　ＥＧ旧　）を、粒子
のコアーに吸収させた。拉ｒのコアーはポリ（スチレン
−ヨー２−アセｌ〜アセトキシエチルメタクリレート）
（東通比７０　：　３　（）　）から成り、シールはポ
リ（ｍ、ｐ−クロロメチルスチレン）から成っていた。

粒子の平均直径は約０．４５−であった。連鎖球菌Ａ抗
原に対するモノクローン抗体とカゼインを、Ｆ記のよう
にしてこれらの粒子に固定した。５０ミリモルホウ酸緩
衝液（））　８８．５）Ｏ１６の１に、抗連鎖球菌！ａ
ｎｔｉ−３ｔｒｅｏ）Ａ抗体（ＰＢＳとして当業界に知
られているリン酸桜街食塩水中の２．９■／　ｏｏｌ　
ｌ８渣）とカゼイン（１０■／　ｏｏｌ水）の１０＝１
混合掬からなる総タンパク質０．１＋ｕ＋ｒを加えた。

混合の後、ボリマーラテ・ソクス粒子の５％懸濁冴４１
．５μｍを加えて（０，３％同形分を供給し）、生成す
る溶液を３７℃で２４時間回転させ（転倒型ミキサー）
、抗体を粒子の外表面に共有結合させ且つ凝集指示薬を
形成させる。

無水コハク酸のｌ８液（１０ｒＵｌ：／　ｏｎｌジメチ
ルスルホキシド）を上記の凝集指示薬の懸濁液に、総タ
ンパク質１部に対して無水物１部重址比で加えた。

生成する懸濁液を２５℃で４時間混合し、７０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離し、生成するベレットを０．１モル
グリシン緩衝液（ｐＨ８，５）に再分散して０．３％固
形分の濃度を得た。

地方の病院から得られた連鎖球菌Ａの単離物を本実施例
の分析に使用した。連鎖球菌Ａ抗原を、亜硝酸ナトリウ
ム〈８モル）とクエン酸（０，２モル）との等容の溶液
を用いて抽出装置中で単離物から２５℃で１分間抽出し
７た。クエン酸は、単離物を加える前に結合剤なしで装
置にコーティングして乾燥させておいた８次いで、抽出
溶液を、エチレンジアミン四酢酸（７５ミリモル）を含
む等容の３＝　（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
榎街府（２モル、ｐＨ７，５）で中和した。

ナイロン６６の微孔性Ｉ！　（平均杭径５囲）を使い捨
て可能な試験装置の試験ウェルに組み込み、２°６スク
シニル化したカセイン溶’ｔ（＜　１００　ｕｌで洗浄
することによって前処理した。

塩化ナトリウム（８０ｕｌ、１モル）と、上記の舒集指
示薬溶液＜　４０　ＬＩＩ　）と、約４．２ｘ１０５個
のコロニー形成単位を含む抽出抗原（８０μｍ）との混
合物を、膜を有する試験装置の試験ウェルに加えて、そ
の中で２５℃でインキュベーションした。次いで、流体
を膜の下方の区画へ排出させ、股上の凝集体をイオン強
度が薬１．０の洗浄流体１５０μｍで洗浄した。

洗浄工程の後、膜上の凝集体における染料の１を、反射
率測定装置を用いて５４０ｒ＋ｍで測定した。

ウィリアムス−クラ・ソバ−・トランスフオーム（Ｗｉ
ｌｌｉａｌＩｌｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒ
ｎ）（Ｊ、　０ｐｔｉｃａｌ　Ｓａｃ。

Ａｎ、、　４３．５９５　（１９５３））を用いて、透
過密度値を計算した。膜上の凝集体は容易に観察するこ
とができ、バックグラウンド・コントロールの密度より
かなり大きな密度値を有したく差は０．１４８であった
）、これらのデーターは、本発明が生物試料中の連鎖球
菌Ａ抗原の抽出と走進に有用であることを示している。

実施例２ 抗原抽出相コハク酸を用いる連ｇＩｉ球ｉＪＡの定量実
施例１に記載した処理法と試薬を、クエン酸をコハク酸
に代えたことを除いて、本実施例に用いなう 連鎖球菌ノ＼抗原は、クエン酸９０ｐｌ（０，２モル）
と亜硝酸す１〜リウム９０μｍ（８モル）との溶液を用
いて１紋生物ｍ雛物から２５℃で１分間抽出した。次に
、抽出′／ｇ液をトリシン緩衝液（１モル、ｐｌ−１８
，６）とエチレンシアミン四酢酸（２５ミリモル）を用
いて中和した。

凝集試薬（９０μｍ）と抽出溶液（４，０ｕｌ　）との
混合物を２５℃で２分間混合した。次いで、これを、ス
クシニル化したカゼインで前処理した微孔性膜（バイオ
ダインＦＢＩＯＤＹＮＥ）　Ａフィルター）を有する使
い捨て可能な試験装置に添加した６次に、流体を膜を通
して排出させ、膜りの凝集体をイオン強度か薬１．０の
洗浄流体１５０　ｕｌで洗浄した。

凝集体中の染料の量を実施例１に起債した方法でｄ相定
し、クエン酸を用いた場合と同様な結果を得た。これは
、本発明の実施において、コハク酸を連鎖球菌Ａ抗原を
抽出するのに効果的に用いることができることを示して
いる。

実施例３ 翌秋メ遣 この例では、本発明の中和工程を省略する効宋を示す６ 連鎖球菌Ａ抗原を、クエン酸（１０μｍ１．２モル）の
／８滝添加した抽出！Ａ置を用いて微生物単離物から抽
出して、−晩乾燥した０次に、亜硝酸ナトリウム（１，
２０、ｌ、８モル）の溶液を装置に加えて、第一の試！
倹抽出溶液を形成させた。第二の抽土／ｇ液は、微生物
単離物の代わりに蒸溜水を用いたくすなわち、抗原を含
まない）ことを除いて、同様にして調製した。いずれの
抽出／ｇ冴も中和しなかった。

塩化ナトリウム（８０μｍ、１モル）の溶液と、実施例
１に起債した凝集試薬＜　４０　ｐｉ　）と、上記の第
一の抽出溶液（４０μＩ）を、実施例１に起債ｊ〜なの
と同様な試験装置の試験ウェルに連続して加え、その中
で２５℃で約２分間インキュベーションした。

同様に、塩化すｌ〜ツリウム容液と、凝集試薬と、第二
の抽出溶液を、第二の試験装置の試験ウェルに連続的に
加えて、インキュベーションした。

インキュベーションの後、流体を試験装置の膜を通して
排出し、股上に残っている凝集試薬を塩化す）〜リウム
溶液（８０μｍ、１モル）で洗浄した後、目視で検査し
た。両試験装置の総てのウェルには１強い赤色が観察さ
れた。これは抽出溶液を中和しなかった結果として凝集
試薬により非特異的凝＄か起こり、抗原が存在してもま
たはしなくとも凝集が起こることを示している。

抽出／８液を中和せずに別の試験管中で凝集試薬と混合
することを除いて、上記の試験を繰り返した７両試験管
に　凝集の存在が観察された。

［発明の効用１ 本発明は一連３ｆ４球菌Ａ抗原の既知の分析法に比し多
くの利点を提供する。本発明は、酢酸やその曲の障害と
なり得る試薬の使用を回避する。更に、本発明は不揮発
性酸を用いるので、ある種の型の基材上に試薬を固定す
るための結合剤材料の使用を回避する。上記のように、
結合剤材料の使用は、追加の材料と、製造経費および操
作とを必要とするので不利である。結合剤材料は実験室
分析では好適であることかあるか、競合の激しい市場で
は大量の商業的製造操作は経費を少なくしなけれはなら
ない。

更に、本発明は、分析において中和工程を用いて抗体分
子と、遊離のカルボキシル基を有する凝集試薬に対する
強い酸性条件の悪影響を少なくしまたは除く。抗原抽出
処理法の強い酸性条件は、ポリマー粒子上の遊離のカル
ボキシル基と同様に抗体分子の遊離のカルボキシル基に
著しく影響を与える。それ故、米国特許第４，６７３．
６３９号明細書で指摘されたような問題点は回避される
。

以下余Ｐ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）連鎖球菌Ａ微生物からの抗原の 亜硝酸抽出に必要な乾燥して結合剤を含まない第一の抽
   出試薬をコーティングした水不溶性の基材と、 （ｂ）亜硝酸抽出に要する第二の抽出試薬の水性溶液と
   、 （ｃ）ｐＨが５〜１０の中和溶液と、 （ｄ）連鎖球菌Ａ抗原またはこの抗原が結合する抗体の
   いずれかを有する水不溶性粒子から成る免疫反応性試薬
   の試料とから成る連鎖球菌Ａ抗原の測定用試験キット。 ２、連鎖球菌Ａ微生物を含むことが疑われる生物標本か
   ら連鎖球菌Ａ抗原を抽出するための抽出装置であって、 （ｉ）連鎖球菌Ａ微生物からの抗原を亜硝酸抽出するの
   に要する乾燥して結合剤を含まない抽出試薬のコーティ
   ングを内部に担持した水不溶性容器と、 （ｉｉ）容器内に生物標本を採取して沈澱させるアプリ
   ケーター手段とから成る抽出装置。 ３、生物標本中の連鎖球菌Ａ抗原の測定法において、 （イ）連鎖球菌Ａ微生物を含むことが疑われる生物標本
   を、該微生物から抗原を亜硝酸抽出するのに要する乾燥
   して結合剤を含まない第一の抽出試薬をコーティングし
   た水不溶性基材と接触させ、 （ロ）接触段階（イ）と実質的に同時に、標本と亜硝酸
   抽出に要する第二の抽出試薬の水性溶液とを接触させ、 （ハ）９０℃以下の温度で５分間以内の時間、生成する
   抽出溶液をインキュベートし、 （ニ）抽出溶液を中和し、 （ホ）試験装置中で、その抗体自体が結合する抗原に対
   する抗体を有する水不溶性粒子を含んでなる、抗原用免
   疫反応性試薬と、前記の中和した抽出溶液とを接触させ
   、抗体と抗原との凝集反応生成物を形成し、 （ヘ）凝集した反応生成物と未反応材料とを分離し、 （ト）凝集した反応生成物または未反応材料の量を測定
   することから成る測定法。