JPS6298257A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、主として体液中の被測定物質を抗原抗体反応
を利用して測定する免疫学的測定法に関する。

（従来の技術） 体液中の特定の化学物質を免疫学的手法によって測定す
る方法としては、この被測定物質に特異的な抗原もしく
は抗体を担持させた赤血球やポリスチレン粒子と被測定
物質とを接触させて、その凝集反応を目視観察する方法
がある。凝集反応を目視観察する代わりに分光光度計を
用いて吸光度を測定することも行われている。これらの
方法は被測定物質の定性もしく半定量には好適であるが
。

正確な定量値を求めるのには適していない。最近。

吸光度測定法において、定量化しようという研究が盛ん
に行われているが、実用上の信頼性がまだ充分に確立さ
れていない。

被測定物質を定量的に測定するには、酵素免疫測定法（
エンザイム　イムノアッセイ；　ＥＴＡ）や放射免疫測
定法（ラジオイムノアッセイｉ　ＲＩＡ）が利用されて
いる。ＥＩＡとＲＩＡのいずれの方法においても同相法
が好適に利用される。固相法のひとつとしてサンドイン
チ法が知られている。サンドイツチ法は被測定物質およ
びそれに特異的な抗原もしくは抗体が２つ以上の結合部
位をもつ場合に利用されうる。このサンドイツチ法によ
り例えばインシュリンを定量する場合には、まず、セフ
ァデックス（フェルマシア社製）微粒子などの不活性担
体懸濁液に抗インシュリン抗体を加えて、これを該担体
に担持させる。この固相化抗体に被測定物質であるイン
シュリンを作用させ、該インシュリンを上記抗インシュ
リン抗体に結合させる。次に、放射性物質や酵素で標識
した過剰量の抗インシュリン抗体をこれに作用させ、標
識化抗インシュリン抗体をインシュリンに結合させる。

このようにすると、被測定物質であるインシュリンは抗
インシュリン抗体にサンドインチ状にはさまれた形態と
なる。放射性物質で標識した場合は、洗浄後１上記酵素
反応後の固相系をオートラジオグラフィにかけると放射
性物質が検出されるためインシュリン量が算出されうる
。酵素で標識した場合は、これに基質を作用させて該酵
素反応による反応結果を測定２例えば発色状態を比色定
量、することにより酵素量が検出される。つまりインシ
ュリン量が算出されうる。

サンドインチ法以外に競合法もしばしば利用される。競
合法により１例えばインシュリンを定量する場合には、
まずセファデックス微粒子などの不活性担体懸濁液に抗
インシュリン抗体を加えて。

これを該担体に担持させる。次に、この固相化抗体に、
被測定物質であるインシュリンと既知量の標識化インシ
ュリンとを含む試料を加えて、これらを競合的に結合さ
せる。標識化インシュリンは。

インシュリンを放射性物質や酵素で標識することにより
調製される。被測定物質であるインシュリンおよび標識
化インシュリンは試料中に含有される割合に応じて固相
化抗体（抗インシュリン抗体）に結合する。そのため、
上記酵素反応後の固相系の標識を検出することにより被
測定物質であるインシュリンの量が算出される。

上記サンドイツチ法や競合法などの固相法で測定を行う
場合に１例えばサンドインチ法において。

不活性担体に抗インシュリン抗体と被測定物質であるイ
ンシュリンとが担持された固相系に標識化抗インシュリ
ン抗体を加えて反応させた後、過剰量の抗インシュリン
抗体を洗浄・除去する必要がある。不活性担体として用
いられるセファデックスは微細な粒子であるため、洗浄
を行うためには。

通常、数回の遠心分離操作を必要とする。このように、
固相法により被測定物質を測定する場合には、固相系に
結合した抗原もしくは抗体（ｂｏｕｎｄｆｏｒｍ）と結
合しなかった抗原もしくは抗体（ｆｒｅｅｆｏｒｍ）と
の分離（Ｂ／Ｆ分離）に煩雑な操作が必要であり、測定
に時間がかかるという欠点を有する。

上記遠心分離操作をなくして短時間で測定を行うために
、不活性担体として４〜６−１程度の粒径を有するポリ
スチレンビーズなどを使用して測定する方法も採用され
ている。このような粒径の大きいビーズを用いるとデカ
ンテーションにより洗浄が行われるため操作が簡単であ
る。しかし、ビーズの総表面積が例えばセファデックス
などの微細粒子を用いた場合よりも小さくなるため測定
怒度が低い。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、被測定物質を簡単な操作で短
時間に、かつ精度良く免疫学的に測定する方法を提供す
ることにある。本発明の他の目的は。

被測定物質を固相法を用いてＥＩＡ　、　ＲＩＡなどの
手法により簡単な操作で短時間にかつ精度良く測定する
方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の免疫学的測定法は、（１）被測定物質に特異的
な抗原もしくは抗体を担持ｔた高分子重合体粒子の分散
液を得る工程、（２）該高分子重合体粒子分散液に該被
測定物質を加えて該抗原もしくは抗体に特異的に結合さ
せ、これに、該被測定物質に特異的な標識化抗原もしく
は抗体を加えて該標識化抗原もしくは抗体を該被測定物
質に結合させる工程；または、該高分子重合体粒子分散
液に該被測定物質および標識化した既知量の該被測定物
質を加えて両者を競合的に該抗原もしくは抗体に結合さ
せる工程；および、（３）上記（２）項で得られた反応
系を多孔質膜で濾過し、該膜上の標識を検出する工程を
包含し、そのことにより上記目的が達成される。

本発明方法に用いられる被測定物質に特異的な抗原もし
くは抗体を担持しうる高分子重合体粒子は液体１通常水
性溶液に分散された状態で使用される。この高分子重合
体粒子は２重合性単量体を通常、乳化（共）重合するこ
とにより得られる。

用いられる重合性単量体は（共）重合によりポリマーを
形成するものであればよい。通常、エチレン、プロピレ
ン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ア
クリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレ
ン、メチルスチレン。

ブタジェン、イソプレン、アクリルアミド、アクリロニ
トリル、メタクリレートリルなどが用いられる。得られ
る（共）重合体は、そのガラス転移点が後述の抗原抗体
反応が行われる温度よりも高くなるように上記単量体が
選択される。単量体は２種以上混合して用いられてもよ
い。

上記高分子重合体粒子に被測定物質に特異的な抗原もし
くは抗体を担持させるには、■物理的に吸着させる方法
、■共有結合により結合させる方法、または■イオン結
合により結合させる方法が用いられる。■の物理的吸着
により抗原もしくは抗体を担持させる方法においては、
高分子重合体粒子の素材は何ら限定されない。上記単量
体の（共）重合体が用いられうる。

■の共有結合により抗原もしくは抗体を結合させる方法
では、高分子重合体粒子としては該抗原もしくは抗体を
共有結合させうる官能基１例えばカルボキシル基、水酸
基、アミノ基、ヒドラジド基、グリシジル基などが導入
された高分子素材が用いられる。これらのうちカルボキ
シル基、水酸基、グリシジル基を有する高分子重合体粒
子を得るためには、上記重合性単量体にカルボキシル基
。

水酸基またはグリシジル基を有する単量体を乳化（共）
重合させればよい。カルボキシル基を有する単量体とし
てはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸；水酸基を
有する単量体としてはヒドロキシエチルアクリレート、
ヒドロキシエチルメタクリレート；グリシジル基を有す
る単量体としてはグリシジルメタクリレートが挙げられ
る。カルボキシル基を有する高分子重合体粒子は、アク
リル酸エステルなどのエステル基を有する単量体を乳化
（共）重合させた後、このエステル基を加水分解するこ
とによっても得られる。カルボキシル基を有する高分子
重合体粒子は後述の■イオン結合により抗原もしくは抗
体を担持させる方法にも利用されうる。アミン基を有す
る高分子重合体粒子は１重合性単量体とアミド基を有す
る単量体。

例えばアクリルアミド、とを乳化（共）重合し。

得られた共重合体のメチルエステル基にヒドラジンを作
用させることにより得られる。

■のイオン結合により抗原もしくは抗体を結合させる方
法では、高分子重合体粒子としては該抗原もしくは抗体
をイオン結合しうるイオン交換基。

例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基など
の酸基；３級アミノ基、４級アミノ基などの塩基性基が
導入された高分子素材が用いられうる。これらの高分子
重合体粒子を含有する分散液を得るには、上記重合性単
量体に上記スルホン酸基、カルボキシル基などのイオン
交換基を有する単量体を共重合させればよい。スルホン
酸基を有する単量体としては、スチレンスルホン酸、ス
ルホプロピルメタクリレート；カルボキシル基を存する
単量体としては、アクリル酸、メタクリル酸。

イタコン酸；リン酸基を有する単量体としては。

アシッドホスホキシエチルメタクリレート　３−クロロ
−２−アシッドホスホキシプロビルメタクリレート；３
級アミノ基を有する単量体としては。

ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノ
プロピルメタクリルアミド；４級アミノ基を有する単量
体としては、メタクリルアミドプロピルトリメチルアン
モニウムクロライド、メタクリロイルオキシエチルトリ
メチルアンモニウムクロライドが挙げられる。４級アミ
ン基を有する高分子重合体粒子はまた２重合性単量体に
グリシジル基を有する単量体を乳化共重合させた後、こ
れに３級アミンを作用することによっても得られる。

上記いずれの場合においても、高分子重合体粒子の製造
時に多官能性単量体を加えて共重合させることも可能で
ある。多官能性単量体が加えられていると、内部架橋が
おこるため、得られる高分子重合体粒子のガラス転移点
を高めることができる。多官能性単量体は重合時の安定
性にも寄与する。イオン交換基を有する高分子重合体粒
子を乳化重合により調製するときに、単量体の種類によ
っては水溶性の重合体が形成される場合も生じる。

上記多官能性単量体を共重合させると、このような水溶
性の重合体が形成されにくい。多官能性単量体としては
１例えば、エチレングリコールジメタクリレート　トリ
エチレングリコールジメタクリレート、ジプロピレング
リコールジメタクリレート５１・３−ブチレングリコー
ルジメタクリレート、トリエチレングリコールジアクリ
レート。

トリメチロールプロパントリメタクリレート、トリメチ
ロールプロパントリアクリレートなどの多価アルコール
のポリ　（メタ）アクリレート；ジビニルベンゼンがあ
る。

得られる高分子重合体粒子の粒径は０．０５μｍ〜１龍
、好ましくは０．２〜２００μｍである。粒径が小さす
ぎると後述の多孔質膜による固相系の分離が難しい。粒
径が大きすぎると均一分散されにくく、また総表面積が
小さいため、測定の感度も低い。

本発明方法で測定しうる被測定物質は、抗原。

抗体などの免疫活性物質であれば特に限定されない。被
測定物質としては１例えば、ヒトや動物の免疫グロブリ
ン、α−フェトプロティン、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）な
どの蛋白質；肝炎ウィルス関連抗体、風疹ＨＡ抗原など
の各種ウィルス抗原；各種細菌（例えば、トキソプラズ
マ、マイコプラズマ。

梅毒トレポネーマ）、真菌、毒素などの微生物抗原；ア
ルブミン、補体成分などの各種血漿蛋白成分；ニストロ
ジエン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ　）などの
各種ホルモン；がある。これらを抗原としたときの抗体
も測定が可能である。

本発明方法に用いられる多孔質膜は、後述の抗原抗体反
応後の反応系から生成した固相系を濾取・分離するため
に用いられる。その材質は、不・活性でありかつ蛋白質
などを非特異的に吸着しないものであればよい。そのよ
うな多孔質膜としては。

合成樹脂製多孔質膜、再生セルロールメンブランフィル
タ−、セルロールアセテートメンブランフィルタ−１濾
紙などがある。合成樹脂製多孔質膜の素材としては、ポ
リアクリロニトリル、ポリアミド、ポリイミド、ポリス
チレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−酢
酸ビニル共重合体ケン化物などが挙げられる。ニトロセ
ルロールなどの素材は蛋白質を非特異的に吸着するため
好ましくない。多孔質膜の孔径は反応後の同相系が通過
できない程度の大きさであればよく１通常０．０２〜５
００μｍである。抗原抗体反応後に凝集剤を添加したり
ｐＨを変化させて固相系を凝集させた後。

多孔質膜で濾取する場合もある。このときは、多孔質膜
の孔径がやや大きくてもよい。

本発明方法において使用される標識化被測定物質、抗原
、抗体などは通常の標識化の手法により得られる。標識
物質としては放射性物質、酵素。

螢光物質などが用いられ得、標識すべき物質に適したも
のが選択される。放射性物質としては１例えば１３１■
または１２ｓＴが利用され、被標識化物質にクロラミン
Ｔ法、ラクトペルオキシダーゼ法、ポルトン・ハンター
法、ヨードダン法などにより結合される。酵素としては
、特に着色反応を行う反応を触媒するものが好適に用い
られる。そのような酵素としては、パーオキシダーゼ、
カタラーゼ。

β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウ
レアーゼ、アルカリホスファターゼがある。

これらの酵素は９例えば、カルボジイミド類、ジアルデ
ヒド類、ジイソシアネート類、ビスジアゾベンジジンな
どにより被標識化物質に共有結合させることができる。

螢光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート
、テトラローダミンインチオシアネートなどが用いられ
、常法により被標識化物質に結合される。

本発明方法を、サンドインチ法により被測定物質を測定
する場合を例に挙げて説明する。まず。

被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体（例えば被測定
物質がＣＲＰであれば抗ＣＲＰ抗体）を調製し。

これを上記分散液中の高分子重合体粒子に担持させる。

担持量は担持（固定化）すべき物質の種類によっても異
なるが２通常、高分子重合体粒子１ｇあたり、０．１〜
５００■、好ましくは１０〜２００■である。抗原もし
くは抗体が担持された高分子重合体粒子は該抗原もしく
は、抗体の失活が起こらないように適当な緩衝液中に分
散される。緩衝液としては適当なｐＨおよび濃度に調製
したグリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液など
が用いられる。例えば、抗ＣＲＰ抗体が担持された高分
子重合体粒子はグリシン緩衝液中に分散される。抗原も
しくは抗体が担持された高分子重合体粒子は緩衝液中に
０．２〜５重量％、好ましくは０．５〜２重量％の割合
で分散される。

上記方法により抗ＣＲＰ抗体を高分子重合体粒子に固定
化し、これを用いて試料中のＣＲＰを測定する場合を例
に挙げて説明する。上記抗ＣＲＰ抗体を担持させた高分
子重合体粒子分散液に被測定物質であるＣＩ？Ｐを含有
する試料を加える。これを通常。

３０〜３７℃で約２０〜６０分間インキュベートし試料
中のＣＲＰを上記抗ＣＲＰ抗体に特異的に結合させる。

インキュベート時間はさらに長くすることも可能である
。次に、パーオキシダーゼなどで標識化した過剰量の抗
ＣＲＰ抗体を加えてさらに反応させ。

標識化抗ＣＲＰ抗体を上記固相に結合したＣＲＰに特異
的に結合させる。この反応系を上記多孔質膜で濾過・洗
浄してＢ／Ｆ分離を行う。このとき、吸引濾過を行うと
効果的に洗浄がなされる。上記反応後の固相系は多孔質
膜上に残留する。膜上の標識を検出することによりＣＲ
Ｐ量が算出される。例えば、パーオキシダーゼ標識抗Ｃ
ＲＰ抗体を用いた場合には、パーオキシダーゼの基質で
ある過酸化水素と０−フェニレンジアミンとを含有する
溶液に反応後の固相系をトラップした上記多孔質膜を浸
漬して攪拌し２着色した溶液の吸光度を測定することに
より検出がなされる。

上記サンドイツチ法の他に競合法によっても測定がなさ
れる。この場合は上記抗ＣＲＰ抗体が担持された高分子
重合体粒子分散液に測定すべきＣＲＰを含有する試料と
既知量の標識化ＣＲＰ溶液との混合液を加えて、測定す
べきＣＲＰと標識化ＣＲＰとを抗ＣＲＰ抗体に競合的に
反応させる。反応後の反応系を多孔質膜で濾過・洗浄し
、上記サンドイツチ法の場合に準じて多孔質膜上の標識
を検出すると測定すべきＣＲＰ量が算出される。

上記サンドインチ法、競合法のいずれにおいても抗原抗
体反応の結果、固相系が凝集を起こすことがある。反応
の途中で粒子間の凝集が起こることは好ましくないため
１粒径の小さい高分子重合体粒子を用いたり、高分子重
合体粒子同士の電気的反発を高める目的でカルボキシル
基が多く導入された高分子重合体粒子を用いることも行
われる。

非特異的凝集を阻害するために界面活性剤などの添加剤
を加えてもよい。逆に抗原抗体反応終了後、多孔質膜で
濾過を行うときには固相系を凝集させて濾過操作を行い
やすくすることもできる。

このような場合は無機塩、２または３価の塩、高分子凝
集剤などを凝集剤として加えたり９反応系のｐｉを変化
させて高分子重合体粒子の分散安定性を低下させる。こ
のとき、抗原抗体反応により。

固相系に結合されている抗原や抗体、もしくは標識物質
が脱離しないことが必要である。標識物質として酵素を
用いる場合には、この酵素が失活しないことも重要であ
る。そのため１反応後の固相系に何らかの影響を与えな
いように注゛意する必要がある。特に、急激にｐＨを変
化させることは好ましくない。

（作用） このように９本発明方法では、サンドインチ法や競合法
により生成した同相系が多孔質膜上にトラップされるた
め反応系から容易に分離され得。

洗浄操作も筒車である。そのため、従来のセファデック
ス粒子を用いた固相法のようにＢ／Ｆ分離のために遠心
分離操作を行う手間がかからず、短時間で測定がなされ
る。抗原もしくは抗体の担体となる高分子重合体粒子は
非常に粒径の小さいものを利用することが可能であるた
め、抗原もしくは抗体が担持され得る面積が非常に広い
。そのため。

抗原抗体反応には均一系に近い状態で行われ、従来のＥ
ｒＡやＲＩＡに比べて高精度で被測定物質の測定が可能
である。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実施例１ サンドイツチ法によるＣＲＰの測定（酵素標識）（Ａ）
高分子重合体粒子分散液の調製：スチレンモノマ−１５
ｇと奈留水３００ｇとを反応容器に入れ、窒素気流下７
０゛Ｃに加熱した。別に過硫酸アンモニウム０．３ｇを
水１０ｇに溶解した重合開始剤水溶液を調製し、これを
上記反応容器に加えて１２０ｒｐｍで攪拌しながら２４
時間重合させた。平均粒径０．２９μｍの高分子重合体
粒子水性分散液が得られた。この分散液１００ｇを遠心
分離し、水溶性重合体、開始剤に由来する電解質などで
含む上澄を除去した後、沈澱粒子を再び蒸留水１００ｍ
ｊｌ！に分散させた。同様の操作をさらに２回繰り返し
、高分子重合体粒子を１％の割合で含有する精製ポリス
チレン分散液を得た。

（Ｂ）抗ＣＲＰ抗体の調製：ヒトの血清から分離したＣ
ＲＰをウサギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血清
をアフィニティクロマトグラフィーにより精製してＩｇ
Ｇ分画を得、これを抗ＣＲＰ抗体とした。

（Ｃ）抗ＣＲＰ抗体の高分子重合体粒子への感作：　（
Ｂ）項で得られた抗ＣＲＰ抗体を０．３■／ｎｕ。

そして牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を０．５■／ｍ
ｉ！の濃度で含有する０、０５Ｍグリシンバッファー（
ｐＨ８，２）と（Ａ）項で得られたポリスチレン分散液
とを１０ｍｊ２ずつ混合し、ゆっくり攪拌しなから２０
”Ｃで６時間反応させた。これを遠心分離し、未感作の
抗ＣＲＰ抗体を洗浄・除去した後、ＢＳＡを０．５％の
割合で含有する０、０５Ｍグリシンバッファー（ｐｔｌ
　８．２）　１０　ｍｌに再分散させて抗ＣＲＰ抗体感
作高分子重合体粒子分散液を得た。

（Ｄ）パーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体の調製：　（
Ｂ）項で得られた抗ＣＲＰ抗体を用い、下記の過コウ素
酸架橋法によりパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を調
製した。

過ヨウ素酸架橋法によるパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ
抗体の調製：パーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社；　Ｔｙ
ｐｅ　Ｖｌ　）　５　ｍｇ７ｍｌ溶液１容に１％の１−
フルオロ−２・４−ジニトロベンゼンエタノール？容液
１／１０容を加えて、室温で１時間反応させた。

これに０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１／１０容を加
え、室温で３０分間反応させた後、　０．１６Ｍエチレ
ングリコール１／１０容を加えて室温で１時間反応させ
た。これを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ファルマシア
社；ｆ　１ｎｅ）のカラムにかけて未反応試薬を除去し
た後。

５ｎｗ／ｍｊ２の抗ＣＲＰ抗体１容を加え、室温で３時
間反応させた。さらに５■／ｍβの水素化ホウ素ナトリ
ウム１容を加え、４℃で一晩放置した後、　５ｅ−ｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ−２００（ファルマシア社）のカラムにか
けてパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を得た。

（Ｅ）ＣＲＰの測定＝２０倍希釈したヒト血清３０μβ
と１％牛血清アルブミン溶液３０μｌとを（Ｃ）項で得
られた抗ＣＲＰ抗体感作高分子重合体粒子分散液５０μ
ｐに加え、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。こ
れに（Ｄ）項で得られたパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ
抗体（０，３ｍｇ／ｍ　（！　）を３０ｐＥ加え、３７
℃でさらに３０分間インキュベートした。次に孔径０．
２２μｍ、厚さ１８０μｍの再生セルロースメンブラン
フィルタ−を用いて上記反応混合物を吸引しながら濾過
し、　０．０１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ７，２）を
用いて洗浄した。この濾過膜をそのまま過酸化水素およ
び０−フェニレンジアミンをそれぞれ５ｍＭおよび２８
ｍＭの割合で含有する基質溶液に浸漬し、攪拌・反応さ
せた後、　４９２ｎｍでこの溶液の吸光度を測定した。

あらかじめ作成した検量線をもとに血清中に存在するＣ
ＲＰを定量した。

（Ｆ）毛細管法との比較：ＣＲＰを種々の濃度で含有す
る複数の試料ン佼を調製し、　（Ｅ）項の方法で操作を
行い、吸光度を測定した。本発明方法の精度を従来の毛
細管法と比較する目的で、同一の試料について、従来の
毛細管法でも測定を行った。その相関関係を表１に示す
。表１において。

枠内の数字は試料数を示す。本発明による（Ｅ）項の方
法で測定された吸光度は１表２に示すように１毛細管法
における−〜６＋までの８段階の測定基準に対応するよ
うに８段階に等紙分けされた。

表１ −　±　１＋　２＋　３＋　４＋　５＋　６＋本発明に
よる評価値 表２ 表１は本発明方法による測定結果と従来の毛細管法によ
る測定結果とが著しい相関を有することを示している。

このことから１本発明方法は、従来の毛細管法に代えて
免疫学的診断に適用されうろことが明らかとなった。

去施斑１ サンドイツチ法によるα−フェトプロティンの測定（酵
素標識） （Ａ）高分子重合体粒子分散液の調製：メタクリル酸メ
チル１５ｇ、アクリル酸１．０ｇ、メタクリロニトリル
３．０ｇ、）リエチレングリコールジメタクリレート０
．７ｇおよび蒸留水３７０ｇを反応容器に入れた。さら
に蒸留水ｌｏｇに過硫酸カリウム０．１ｇを溶解させた
重合開始剤水溶液を加え、窒素気流下、７５℃の温度で
攪拌速度１９０ｒｐｍで攪拌しながら８時間重合を行っ
た。平均粒径０．２６μｍのカルボキシル化アクリル系
高分子重合体粒子を含む水性分散液を得た。重合率は９
９％であった。

この重合体粒子の水性分散液を蒸留水にて４回遠心洗浄
した。次いでＯ，ＯＩＭホウ酸バッファー（ｐＨ＝７．
５）にて２回遠心洗浄して精製した後、さらに同バッフ
ァーにて固形分が５重世％になるように再分散させた。

（Ｂ）抗α−フェトプロティン抗体の調製：ヒトのガン
患者の腹水から採取したα−フェトプロティンを精製後
ウサギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血清をアフ
ィニティクロマトグラフィーにより精製してＩｇＧ分画
を得、これを抗α−フェトプロティン抗体とした。

（Ｃ）抗α−フェトプロティン抗体の高分子重合体粒子
への感作：本実施例（Ａ）項で得られた高分子重合体粒
子分散液５　ｍｐ、　０．０１Ｍホウ酸バッフｙ　　、
（ｐＨ＝１．５＞２　ｍｌおよび蒸留水１ｍｍ６を混合
し、これにｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（５■／ｍ１）２　
ｍｌを加えた。さらに、　３０分後に本実施例（Ｂ）項
で得られた抗α−フェトプロティン抗体の溶液（５ｍｇ
／ｍ１）２　ｍｌを添加し、　１０℃で６時間反応させ
た。次に９反応混合物中の余剰のカルボジイミドを消費
するために、１０重量％のし一リジン水溶液（ｐＨ＝７
．５）５　ｍｌｌを加え、１時間インキュベートした。

次いで、　０．０１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ＝　８
．２）にて遠心洗浄を３回行った後、同バッファーに分
散させて、全量を１０ｍＡに調製した。

（Ｄ）パーオキシダーゼ標識抗α−フェトプロティン抗
体の調製：本実施例（Ｂ）項で得られた抗α−フェトプ
ロティン抗体を用い実施例１　（Ｄ）項の方法に準じて
パーオキシダーゼ標識抗α−フェトプロティン抗体を得
た。

（Ｅ）α−フェトプロティンの測定：ヒト血清５０μｌ
を本実施例（Ｃ）項で得られた抗α−フェドブロチイン
抗体感作高分子重合体粒子分散液５０μ！に加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。

これに１本実施例（Ｄ）項で得られたパーオキシダーゼ
標識抗α−フェトプロティン抗体を３０μ！加え、３７
℃でさらに２０分間インキュベートした。

次に孔径０．２μｍ、厚さ１６０μｍの酢酸セルロース
メンブランフィルタ−を用いて上記反応混合物を吸引し
ながら濾過し、　０．０１Ｍホウ酸バッファー（ｐｔｌ
　＝　７．２）を用いて洗浄した。この濾過膜をそのま
ま過酸化水素および０−フェニレンジアミンをそれぞれ
５ｍＭおよび２８ｍＭの割合で含有する基質溶液に浸漬
し、攪拌・反応させた後、　４９２ｎｍでこの溶液の吸
光度を測定した。あらかじめ作成した検量線をもとに血
清中のα−フェ［プロティンを定量した。α−フェトプ
ロティンの標準溶液を用いて測定した結果、試料中のα
−フェトプロティンは５〜６００■／ｍ７！の範囲で定
量できることが確認された。

実施例３ 競合法によるα−フェトプロティンの測定（酵素標識） （Ａ）高分子重合体粒子分散液の調製：実施例２　（Ａ
）項と同様である。

（Ｂ）抗α−フェトプロティン抗体の潤製：実施例２（
Ｂ）項と同様である。

（Ｃ）抗α−フェトプロティン抗体の高分子重合体粒子
への感作：実施例２（Ｃ）項と同様である。

（Ｄ）パーオキシダーゼ標識α−フェトプロティンの調
製：実施例１　（Ｄ）項に乍じてα−フェトプロティン
をパーオキシダーゼで標識した。

（Ｅ）α−フェトプロティンの測定：ヒト血清５０μｌ
と本実施例（Ｄ）項で得られたパーオキシダーゼ標識α
−フェトブロテインン容液５０μｌとを混合した。これ
を本実施例（Ｃ）項で得られた抗α−フェトプロティン
抗体感作高分子重合体粒子分散液５０μｌに加えて３７
℃で３０分間インキュベートした。孔径０．２μｍ、厚
さ１６０μｍの酢酸セルロースメンブランフィルタ−を
用いて上記反応混合物を吸引しながら濾過し、　０．０
１Ｍホウ酸バッファー（ｐｌ＋＝７．２）を用いて洗浄
した。この濾過膜をそのまま過酸化水素および０−フェ
ニレンジアミンをそれぞれ５ＩＩＩＭおよび２８ｎ＋Ｍ
の割合で含有する基質溶液に浸漬し、ＰＡ拌・反応させ
た後、　４９２ｎｍでこの溶液の吸光度を測定した。あ
らかじめ作成した検量線をもとに血清中のα−フェトプ
ロティンを定量した。α−フェトプロティンの標準溶液
を用いて測定した結果、試料体のα−フェトプロティン
は５〜６００ｎｇ／ｍβの範囲で定量できることが確認
された。

ｎ滑工 競合法によるα−フェトプロティンの測定（放射性物質
標識） （Ａ）高分子重合体粒子分散液の調製：実施例２　（Ａ
）項と同様である。

（Ｂ）抗α−フェトプロティン抗体の調製：実施例２　
（Ｂ）項と同様である。

（Ｃ）抗α−フェトプロティン抗体の高分子重合体粒子
への感作：実施例２　（ｃ）項と同様である。

（Ｄ）１２５Ｉ標識α−フェトプロティンの調製：α−
フェトプロティン溶液（５■／ｍβ）２００μｌに１２
５１を２ｍＣ１，ラクトペルオキシダーゼおよびグルコ
ースオキシダーゼをそれぞれ４μｇ、そしてブドウ糖を
２０ｍＭとなるように加え、室温で３０分間反応させた
。これに窒化ナトリウム１０ｍＭを加えて反応を停止さ
せ、　０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐｔｌ　７．５）に透
析後、沈澱物を遠心分離にて除去し　＋２５１標識α−
フェトプロティンを得た。

（Ｅ）α−フェトプロティンの測定：パーオキシダーゼ
標識α−フェトプロティン溶液の代わりに本実施例（Ｄ
）項で得られた１２５■標識α−フェトプロティン溶液
の２，０００倍希釈液を用い、多孔質膜として孔径０．
２μｍの再生セルロースメンブランフィルタ−を用いた
こと以外は実施例３　（Ｅ）項に卓じて反応、濾過およ
び洗浄を行なった。メンブランフィルタ−上の放射性物
質（＋２Ｊ）の量をシンチレーションカウンターで測定
し、あらかじめ作製した検量線から血清中のα−フェト
プロティン量を算出した。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、免疫学的手法により
体液成分などの被測定物質を簡単な操作で短時間のうち
に、しかも精度良く測定することができる。この方法は
従来の［Ａ　、　ＲＩＡの手法をそのまま適用でき、し
かも従来のεＩＡやＲＩＡに比べて精度が高い。そのた
め、特に体液中の微量成分などの定量に好適である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体を担
   持した高分子重合体粒子の分散液を得る工程、（２）該
   高分子重合体粒子分散液に該被測定物質を加えて該抗原
   もしくは抗体に特異的に結合させ、これに、該被測定物
   質に特異的な標識化抗原もしくは抗体を加えて該標識化
   抗原もしくは抗体を該被測定物質に結合させる工程；ま
   たは、該高分子重合体粒子分散液に該被測定物質および
   標識化した既知量の該被測定物質を加えて両者を競合的
   に該抗原もしくは抗体に結合させる工程；および、 （３）上記（２）項で得られた反応系を多孔質膜で濾過
   し、該膜上の標識を検出する工程、 を包含する免疫学的測定法。 ２、前記高分子重合体粒子の粒径が０．０５μｍ〜１ｍ
   ｍであり、かつ前記多孔質膜の孔径が０．０２μｍ〜５
   ００μｍである特許請求の範囲第１項に記載の測定法。 ３、前記標識化が酵素、放射性物質または螢光物質によ
   りなされる特許請求の範囲第１項に記載の測定法。