JPS6298259A - 免疫活性物質測定キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、主として体液中の被測定物質を免疫学的手法
により簡便に測定しうる測定キットに関する。

（従来の技術） 生体成分を簡便に測定しうる診断用キットや試験紙が市
販されている。例えば、尿成分を測定するための試験紙
は試料の尿と接触させると発色が起こり、尿中の蛋白質
などが検出もしくは半定量される。このような診断用キ
ットや試験紙で測定されうる物質は蛋白質、ブドウ糖、
尿素などの生化学物質に限られ、生体内の免疫グロブリ
ンなどの免疫活性物質を簡単な手法で短時間のうちに測
定できる診断用キットや試験紙はほとんど存在しない。

免疫学的手法を用いた診断用キ・７トとしては。

わずかに妊娠診断用キットが製造されているだけである
。この妊娠診断用キットでは、妊婦の尿中に存在するヒ
ト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）を免疫学的に測定す
ることにより妊娠の有無を判断する。上記キットにはヒ
ト絨毛性ゴナドトロピン（ＩＩＣＧ）に特異的な抗体が
セットされており。

これに検体を加えると被測定物質であるヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（ＨＣＧ）が上記抗体に結合し反応が生じる
。その結果、沈降リングが形成されるように調製されて
いる。このリングの形状を判断することにより妊娠の存
無が判断される。しかし、専門的知識の乏しい者にとっ
ては沈降パターン（リングの形状）を正確に判断するの
が難しいという欠点がある。

ところで１通常、免疫活性物質を測定するには。

酵素免疫測定法（エンザイム　イムノアッセイ；ＥＩＡ
）や放射免疫測定法（ラジオイムノアッセイ；ＲＩＡ）
が利用されている。ＥＴＡとＲＩＡのいずれの方法にお
いても固相法が好適に利用される。固相法のひとつとし
てサンドインチ法が知られている。

サンドインチ法は被測定物質およびそれに特異的な抗原
もしくは抗体が２つ以上の結合部位をもつ場合に利用さ
れうる。このサンドインチ法により例えばインシュリン
を定量する場合には、まず。

セファデックス（フエルマシア社製）微粒子などの不活
性担体懸濁液に抗インシュリン抗体を加えて、これを該
担体に担持させる。この固相化抗体に被測定物質である
インシュリンを作用させ、該インシー１リンを上記抗イ
ンシュリン抗体に結合させる。次に、放射性物質や酵素
で標識した過剰量の抗インシュリン抗体をこれに作用さ
せ、標識化抗インシュリン抗体をインシュリンに結合さ
せる。

このようにすると、被測定物質であるインシュリンは抗
インシュリン抗体にサンドインチ状にはさまれた形態と
なる。放射性物質で標識した場合は。

洗浄後、上記酵素反応後の固相系をオートラジオグラフ
ィにかけると放射性物質が検出されるためインシュリン
量が算出されうる。酵素で標識した場合は、これに基質
を作用させて該酵素反応による反応結果を測定１例えば
発色状態を比色定量。

することにより酵素量が検出される。つまりインシュリ
ン量が算出されうる。

サンドインチ法以外に競合法もしばしば利用される。競
合法により２例えばインシュリンを定量する場合には、
まずセファデックス微粒子などの不活性担体懸濁液に抗
インシュリン抗体を加えて。

これを咳担体に担持させる。次に、この固相化抗体に、
被測定物質であるインシュリンと既知量の標識化インシ
ュリンとを含む試料を加えて、これらを競合的に結合さ
せる。標識化インシュリンは。

インシュリンを放射性物質や酵素で標識することにより
調製される。被測定物質であるインシュリンおよび標識
化インシュリンは試料中に含有される割合に応じて固相
化抗体（抗インシュリン抗体）に結合する。そのため、
上記酵素反応後の固相系の標識を検出することにより被
測定物質であるインシュリンの量が算出される。

上記サンドインチ法や競合法などの固相法で測定を行う
場合に２例えばサンドインチ法において。

不活性担体に抗インシュリン抗体と被測定物質であるイ
ンシュリンとが担持された固相系に標識化抗インシュリ
ン抗体を加えて反応させた後、過剰量の抗インシュリン
抗体を洗浄・除去する必要がある。不活性担体として用
いられるセファデックスは微細な粒子であるため、洗浄
を行うためには。

通常、数回の遠心分離操作を必要とする。このように、
固相法により被測定物質を測定する場合には、固相系に
結合した抗原もしくは抗体（ｂｏｕｎｄｆｏｒｍ）と結
合しなかった抗原もしくは抗体（ｆｒｅｅｆｏｒｍ）と
の分離（Ｂ／Ｆ分離）に煩雑な操作が必要であり、測定
に時間がかかるという欠点を有する。

そのため、このような手法は筒便に測定を行うための測
定キソ１−には応用することが難しい。特に。

Ｉ？ＩＡでは放射性物質を用いるため、一般に市販する
ためのキットには応用できない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、被測定物質を簡単な操作で短
時間に、かつ精度良く免疫学的に測定しうる測定キット
を提供することにある。本発明の他の目的は、被測定物
質を固相法を用いてＥＴＡの手法により簡単な操作で短
時間にかつ精度良く測定しうる測定キットを提供するこ
とにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の免疫活性物質測定キットは、（１）被測定物質
に特異的な抗原もしくは抗体を担持した高分子重合体粒
子の分散液、（２）多孔質膜、（３）該被測定物質に特
異的な酵素標識化抗原もしくは抗体；または酵素標識化
被測定物質、（４）該酵素の基質、および（５）緩衝液
、を含有し、そのことにより上記目的が達成される。

本発明キットに用いられる被測定物質に特異的な抗原も
しくは抗体を担持しうる高分子重合体粒子は液体１通常
水性溶液に分散され、調製・使用される。この分散液は
９重合性単量体を通常、乳化（共）重合することにより
得られる。用いられる重合性単量体は（共）重合により
ポリマーを形成するものであればよい。通常、エチレン
、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸
ビニル、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル
類、スチレン、メチルスチレン、ブタジェン、イソプレ
ン、アクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリレー
トリルなどが用いられる。得られる（共）重合体は、そ
のガラス転移点が後述の抗原抗体反応が行われる温度よ
りも高くなるように上記単量体が選択される。単量体は
２種以上混合して用いられてもよい。

上記分散液中の高分子重合体粒子に被測定物質に特異的
な抗原もしくは抗体を担持させるには。

■物理的に吸着させる方法、■共有結合により結合させ
る方法、または■イオン結合により結合させる方法が用
いられる。■の物理的吸着により抗原もしくは抗体を担
持させる方法においては、高分子重合体粒子の素材は何
ら限定されない。上記単量体の（共）重合体が用いられ
うる。

■の共有結合により抗原もしくは抗体を結合させる方法
では、高分子重合体粒子としては該抗原もしくは抗体を
共有結合させうる官能基２例えばカルボキシル基、水酸
基、アミノ基、ヒドラジド基、グリシジル基などが導入
された高分子素材が用いられる。これらのうちカルボキ
シル基、水酸基、グリシジル基を有する高分子重合体粒
子を得るためには、上記重合性単量体にカルボキシル基
。

水酸基またはグリシジル基を有する単量体を乳化（共）
重合させればよい。カルボキシル基を有する単量体とし
てはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸；水酸基を
有する単量体としてはヒドロキシエチルアクリレート、
ヒドロキシエチルメタクリレート；グリシジル基を有す
る単量体としてはグリシジルメタクリレートが挙げられ
る。カルボキシル基を有する高分子重合体粒子を含有す
る分散液は、アクリル酸エステルなどのエステル基を有
する単量体を乳化（共）重合させた後、このエステル基
を加水分解することによっても得られる。カルボキシル
基を有する高分子重合体粒子は後述の■イオン結合によ
り抗原もしくは抗体を担持させる方法にも利用されうる
。アミノ基を有する高分子重合体粒子を含有する分散液
は１重合性単量体とアミド基を有する単量体３例えばア
クリルアミド、とを乳化（共）重合し、得られた共重合
体のメチルエステル基にヒドラジンを作用させることに
より得られる。

■のイオン結合により抗原もしくは抗体を結合させる方
法では、高分子重合体粒子としては該抗原もしくは抗体
をイオン結合しうるイオン交換基。

例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基など
の酸基；３級アミノ基、４級アミノ基などの塩基性基が
導入された高分子素材が用いられうる。これらの高分子
重合体粒子を含有する分散液を得るには、上記重合性単
量体に上記スルホン酸基、カルボキシル基などのイオン
交換基を有する単量体を共重合させればよい。スルホン
酸基を有する単量体としては、スチレンスルホン酸、ス
ルホプロピルメタクリレート；カルボキシル基ををする
単量体としては、アクリル酸、メタクリル酸、　　　　
゛イタコン酸；リン酸基を有する単量体としては。

アシッドホスホキシエチルメタクリレート、３−クロロ
−２−アシッドホスホキシプロピルメタクリレート：３
級アミノ基を有する単量体としては。

ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノ
プロピルメタクリルアミド；４級アミノ基を有する単量
体としては、メタクリルアミドプロピルトリメチルアン
モニウムクロライド、メタクリロイルオキシエチルトリ
メチルアンモニウムクロライドが挙げられる。４級アミ
ノ基を有する高分子重合体粒子を含有する分散液はまた
１重合性単量体にグリシジル基を有する単量体を乳化共
重合させた後、これに３級アミンを作用することによっ
ても得られる。

上記いずれの場合においても、高分子重合体粒子の調製
時に多官能性単量体を加えて共重合させることも可能で
ある。多官能性単量体が加えられていると、内部架橋が
おこるため、得られる高分子重合体粒子のガラス転移点
を高めることができる。多官能性単量体は重合時の安定
性にも寄与する。イオン交換基を有する高分子重合体粒
子を乳化重合により調製するときに、単量体の種類によ
っては水溶性の重合体が形成される場合も生じる。

上記多官能性単量体を共重合させると、このような水溶
性の重合体が形成されにくい。多官能性単量体としては
２例えば、エチレングリコールジメタクリレート、トリ
エチレングリコールジメタクリレート１　ジプロピレン
グリコールジメタクリレ−Ｉ−，１・３−ブチレングリ
コールジメタクリレート、トリエチレングリコールジア
クリレート。

トリメチロールプロパントリメタクリレート、トリメチ
ロールプロパントリメクリレートなどの多価アルコール
のポリ　（メタ）アクリレート；ジビニルベンゼンがあ
る。

得られる高分子重合体粒子の粒径は０．０５μｍ〜１■
曹、好ましくは０．２〜２００μｍである。粒径が小さ
すぎると後述の多孔質膜による固相系の分離が難しい。

粒径が大きすぎると均一分散されにくい。高分子重合体
粒子の総表面積が小さいため。

測定の感度も低い。

本発明キットで測定しうる被測定物質は、抗原。

抗体などの免疫活性物質であれば特に限定されない。被
測定物質としては２例えば、ヒトや動物の免疫グロブリ
ン、α−フェトプロティン、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）な
どの蛋白質；肝炎ウィルス関連抗体、風疹１１Ａ抗原な
どの各種ウィルス抗原；各種細菌（例えば、トキソプラ
ズマ、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ）、真菌、毒
素などの微生物抗原；アルブミン、補体成分などの各種
血漿蛋白成分；ニストロジエン、ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン（ＨＣＧ）などの各種ホルモン；がある。これらを
抗原としたときの抗体も測定が可能である。

本発明キットに用いられる多孔質膜は、後述の抗原抗体
反応後の反応系から生成した固相系を濾取・分離するた
めに用いられる。その材質は、不活性でありかつ蛋白質
などを非特異的に吸着しないものであればよい。そのよ
うな多孔質膜としては１合成樹脂製多孔質膜、再生セル
ロールメンブランフィルタ−、セルロールアセテートメ
ンブランフィルタ−１濾紙などがある。合成樹脂製多孔
質膜の素材としては、ポリアクリロニトリル、ポリアミ
ド、ポリイミド、ポリスチレン、エチレン−酢酸ビニル
共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体ケン化物など
が挙げられる。ニトロセルロールなどの素材は蛋白質を
非特異的に吸着するため好ましくない。多孔質膜の孔径
は反応後の固相系が通過できない程度の大きさであれば
よ（２通常０５０２〜５００μｍである。抗原抗体反応
後に凝集剤を添加したりｐＨを変化させて固相系を凝集
させた後、多孔質膜で濾取する場合もある。このときは
、多孔質膜の孔径がやや大きくてもよい。

本発明キットにおいて使用される酵素標識化被測定物質
、抗原、抗体などは通常の標識化の手法により得られる
。標識物質である酵素としては着色反応を行う反応を触
媒するものが用いられる。

そのような酵素としては、パーオキシダーゼ、カタラー
ゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼがある。これら
の酵素は１例えば、カルボジイミド類、ジアルデヒド類
、ジイソシアネート類。

ビスジアゾベンジジンなどにより被標識化物質に共有結
合させることができる。

本発明キットを調製するには、まず７被測定物質に特異
的な抗原もしくは抗体（例えば被測定物質がＣＲＰであ
れば抗ＣＲＰ抗体）を調製し、これを上記高分子重合体
粒子に担持させる。担持量は担持（固定化）すべき物質
の種類によっても異なるが９通常、高分子重合体粒子１
ｇあたり、０゜１〜５００■、好ましくは１０〜２００
■である。抗原もしくは抗体が担持された高分子重合体
粒子は該抗原もしくは、抗体の失活が起こらないように
適当な緩衝液中に分散させる。緩衝液としては適当なｐ
Ｈおよび濃度に調製したグリシン緩衝液、リン酸緩衝液
、ホウ酸緩衝液などが用いられる。例えば、抗ＣＲＰ抗
体が担持された高分子重合体粒子はグリシン緩衝液中に
分散される。抗原もしくは抗体が担持された高分子重合
体粒子は緩衝液中に０．２〜５重盪％、好ましくは０．
５〜２重景％の割合で分散される。

本発明の測定キットは２通常、（１）被測定物質に特異
的な抗原もしくは抗体が担持された高分子重合体粒子の
分散液、（２）多孔質膜を有する濾過器。

（３）被測定物質に特異的な酵素標識化抗原もしくは抗
体；または酵素標識化被測定物質、　（４）（３）の酵
素が触媒しうる反応（着色反応）の基質、および（５）
多孔質膜による分離時の洗浄に用いられる緩衝液を含む
。これらのほか、必要に応じて、非特異吸着を抑制して
測定時のバックグラウンドを上げない目的で使用される
牛血清アルブミンやゼラチンの溶液；反応時に使用する
試験管などがセットされていてもよい。

本発明のキットを用い、試料中のＣＲＰをサンドイツチ
法により測定する場合を例に挙げて説明する。まず、抗
ＣＲＰ抗体を担持させた高分子重合体粒子を含有する分
散液に被測定物質であるＣＲＰを含有する試料を加える
。これを通常、室温〜３７°Ｃで約５〜１２０分間イン
キュベートし試料中のｃ　Ｒｒ’を上記抗ＣＲＰ抗体に
特異的に結合させる。次に、パーオキシダーゼなどで標
識化した過剰量の抗ＣＲＰ抗体を加えてさらに反応させ
、標識化抗ＣＲＰ抗体を上記固相に結合したＣＲＰに特
異的に結合させる。この反応系を上記多孔質膜を有する
濾過器で濾過し、緩衝液で洗浄してＢ／Ｆ分離を行う。

このとき、吸引濾過を行うと効果的に洗浄がなされる。

濾過器がない場合は、上記多孔質膜の裏側に吸水性の濾
紙、不織布、吸水性高分子を接触させておき、膜上に上
記反応混合物をそそげば、液体成分は上記濾紙などに吸
収される。

このように、濾過操作により上記反応後の固相系は多孔
質膜上に残留する。次に膜上の標識化酵素に基質を作用
させる。例えば、パーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を
用いる場合には、パーオキシダーゼの基質である過酸化
水素水と０−フェニレンジアミンとがキットに含まれる
。この過酸化水素水とＯ−フェニレンジアミンとを含む
溶液を濾過後の多孔質膜に付与すると、標識化抗ＣＲＰ
抗体が存在すれば、酵素反応により着色がおこる。

この着色の度合を目視観察することにより試料中のＣＲ
Ｐの有無の判定もしくはＣＲＰの半定量がなされる。上
記過酸化水素と。−フェニレンジアミンとを含有する溶
液に反応後の固相系をトラップした上記多孔質膜を浸漬
して攪拌し１着色した溶液の吸光度を測定すれば試料中
のＣＲＰを定量することも可能である。

上記サンドイツチ法の他に競合法によっても測定がなさ
れる。この場合は測定キットには、被測定物質に特異的
な酵素標識化抗原もしくは抗体の代わりに酵素標識化さ
れた被測定物質（標識化ＣＲＰ）がセットされている。

この方法で測定を行うには。

まず上記抗ＣＲＰ抗体が担持された高分子重合体粒子の
分散液に測定すべきＣＲＰを含有する試料と既知量の標
識化ＣＲＰ溶液との混合液を加えて。

測定すべきＣＲＰと標識化ＣＲＰとを抗ＣＲＰ抗体に競
合的に反応させる。反応後の反応系を多孔質膜で濾過・
洗浄し、上記サンドインチ法の場合に準じて多孔質膜上
の標識化酵素を基質と反応させるごとにより検出する。

この方法では試料中のＣＲＰが？１１ｆｆｉであると目
視観察による判定が難しい場合もある。そのような場合
は、吸光度などを測定してＣＲＰの測定を行う。

上記サンドイッチ法、競合法のいずれにおいても抗原抗
体反応の結果、固相系が凝集を起こすことがある。反応
の途中で粒子間の凝集が起こることは好ましくないため
１粒径の小さい高分子重合体粒子を用いたり、高分子重
合体粒子同士の電気的反発を高める目的でカルボキシル
基が多く導入された高分子重合体粒子を用いることも行
われる。

非特異的凝集を阻害するために界面活性剤などの添加剤
を加えてもよい。逆に抗原抗体反応終了後、多孔質膜で
濾過を行うときには固相系をａ集させて濾過操作を行い
やすくすることもできる。

このような場合は無機塩、２価または３価の塩。

高分子凝集剤などを凝集剤として加えたり１反応系のｐ
Ｈを変化させて高分子重合体粒子の分散安定性を低下さ
せる。このとき、抗原抗体反応により固相系に結合され
ている抗原や抗体、もしくは標識物質が脱離しないこと
が必要である。標識酵素が失活しないことも重要である
。そのため３反応後の固相系に何らかの影響を与えない
ように注意する必要がある。特に、急激にｐｌ＋を変化
させることは好ましくない。

（作用） このように２本発明の測定キットを用いると１被測定物
質に特異的な抗原もしくは抗体の担持された高分子重合
体粒子の分散液を用いて抗原抗体反応により免疫活性物
質を簡単な操作で測定することができる。被測定物質は
酵素反応による着色の度合を観察することにより測定さ
れるので、従来の２例えば妊娠診断用キットで沈降リン
グを観察する場合に比べて、Ｎ単に検出もしくは半定量
がなされる。さらに着色の度合を吸光度測定などによっ
て計測し、被測定物質を定量することも可能である。こ
のキットを用いてサンドインチ法や競合法により生成し
た固相系は多孔質膜上にトラップされるため反応系から
容易に分離され得、洗浄操作も簡単である。そのため、
従来のセフアゾ７クス粒子を用いた固相法のようにＢ／
Ｆ分離のために遠心分離操作を行う手間がかからず、短
時間で測定がなされる。抗原もしくは抗体の担体となる
高分子重合体粒子は非常に粒径の小さいものを利用する
ことが可能であるため、抗原もしくは抗体が担持され得
る面積が非常に広い。そのため。

抗原抗体反応には均一系に近い状態で行われ、従来のＩ
ＥＩ八に比べて高精度で被測定物質の測定が可能である
。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

去範■上 サンドインチ法によるＣＲＰの測定キット■キットの３
周製： （Ａ）高分子重合体粒子分散液の調製：スチレンモノマ
−５０ｇと蒸留水３００ｇとを反応容器に入れ、窒素気
流下７０°Ｃに加熱した。別に過硫酸アンモニウム０．
３ｇを水１０ｇに溶解した重合開始剤水溶液を調製し、
これを上記反応容器に加えて１１００ｒｐで攪拌しなが
ら１２時間重合させた。平均粒径０．６２μｍの高分子
重合体粒子水性分散液が得られた。この分散液ｉｏｏ　
ｇを遠心分離し、水溶性重合体、開始剤に由来する電解
質などで含む上澄を除去した後、沈澱粒子を再び蒸留水
１００ｍＩ２に分散させた。同様の操作をさらに２回繰
り返し、高分子重合体粒子を１％の割合で含有する精製
ポリスチレン分散液を得た。

（Ｂ）抗ＣＲＰ抗体の調製：ヒ１−〇皿清から分離した
ＣＲＰをウサギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血
清をアフィニティクロマトグラフィーにより精製してＩ
ｇＧ分画を得、これを抗ＣＲＰ抗体とした。

（Ｃ）抗ＣＲＰ抗体の高分子重合体粒子への感作：　（
Ｂ）項で得られた抗ＣＲＰ抗体を０．３■／ｍｌ、そし
て生血清アルブミ７（ＢＳＡ）を０．５ｎｗ／ｍ！！の
濃度で含有する０、０５Ｍグリシンバッファー（ｐＨ８
，２）と（Ａ）項で得られたポリスチレン粒子分散液と
を１０ｍＪずつ混合し、ゆっくり攪拌しながら２０”ｃ
で６時間反応させた。これを遠心分離し、未感作の抗Ｃ
ＲＰ抗体を洗浄・除去した後、ＢＳＡを０．５％の割合
で含有する０、０５Ｍグリシンバッファー（ｐＨ８，２
）　１０　ｍｌに再分散させて抗ＣＲＰ抗体感作高分子
重合体粒子分散液を得た。

（Ｄ）パーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体の調製：　（
Ｂ）項で得られた抗ＣＲＰ抗体を用い、下記の過ヨウ素
酸架橋法によりパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を調
製した。

過ヨウ素酸架橋法によるパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ
抗体の調製：パーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社；Ｔｙｐ
ｅ　Ｖｌ　）　５＋ｎｇ／ｍＡ溶液１容に１％の１−フ
ルオロ−２・４−ジニトロベンゼンエタノール溶液１／
１０容を加えて、室温で１時間反応させた。

これに０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１／１ｏ容を加
え、室温で３０分間反応させた後、　０．１６Ｍエチレ
ングリコール１／１０容を加えて室温で１時間反応させ
た。これを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ファルマシア
社；ｆｉｎｅ）のカラムにかけて未反応試薬を除去した
後。

５■／ｍｌの抗ＣＲＰ抗体１容を加え、室温で３時間反
応させた。さらに５■／ｍｊ！の水素化ホウ素ナトリウ
ム１容を加え、４℃で一晩放置した後、　５ｅ−ｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−２００（ファルマシア社）のカラムにかけ
てパーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を得た。

上記（Ｃ）項で得られた抗ＣＲＰ抗体感作高分子重合体
粒子分散液；　（Ｄ）項で得られたパーオキシダーゼ標
識化抗ＣＲＰ抗体溶液（０，５■／ｍ　ｌ　）　；１％
牛血清アルブミン溶液；孔径０．４５μｍ、厚さ１８０
μｍで直径が２５關の円形の再生セルロースメンブラン
フィルタ−、ｐＨ７，２の０．０１Ｍグリシンバッファ
ー；そして過酸化水素および０−フェニレンジアミンを
それぞれ５ｍＭおよび２８ｍＭの割合で含有する基質溶
液をセントしたＣＲＰ測定キットを得た。

■キットを用いたＣＲＰの測定： ヒト血清３０μβと１％牛血清アルブミン溶液３０μｌ
とを抗ＣＲＰ抗体感作高分子重合体粒子分散液５０μｌ
に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。これに
パーオキシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体溶液を３０μｌ加え
、３７℃でさらに２０分間インキュベートした。次に、
数枚の濾紙を積層し、その上に中央部をくぼませた再生
セルロースメンブランフィルタ−を乗載した。この上に
上記反応混合物をそそぎ、水分を濾紙に吸収させた後、
　０．０１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ７，２）を滴下
して洗浄した。

このメンブランフィルタ−上に基質溶液を数滴滴下した
。メンブランフィルタ−の着色状態を目視観察し、あら
かじめ作成した比色表を用いて試料（血清）中のＣＲＰ
ｉを求めた。

１施例２ サンドインチ法によるα−フェトプロティンの測定キッ
ト（１） ■キットの８周製： （Ａ）高分子重合体粒子の調製：メタクリル酸メチル２
０ｇ、アクリル酸１．５ｇ、メタクリロニトリル４ｇ、
トリエチレングリコールジメタクリレ−ｈｏ、７ｇおよ
び蒸留水３７０ｇを反応容器に入れた。さらに蒸留水１
０ｇに過硫酸カリウム０．１ｇを溶解させた重合開始剤
水溶液を加え、窒素気流下。

７５°Ｃの温度で攪拌速度１９０ｒｐｍで攪拌しながら
８時間重合を行った。平均粒径０．３６μｍのカルボキ
シル化アクリル系高分子重合体粒子を含む水性分散液を
得た。重合率は９９％であった。この重合体粒子の水性
分散液を蒸留水にて４回遠心洗浄した。

次いで０．ＯＩＭホウ酸バッファー（ｐＨ＝　７．５）
にて２回遠心洗浄して精製した後、さらに同バッファー
にて固形分が５重量％になるように再分散させた。

（Ｂ）抗α−フェトプロティン抗体の調製：ヒトのガン
患者の腹水から採取したα−フェトプロティンを精製後
ウサギに免疫し、抗血清を採取した。この抗血清をアフ
ィニティクロマトグラフィーにより精製してＩｇＧ分画
を得、これを抗α−フェトプロティン抗体とした。

（Ｃ）抗α−フェトプロティン抗体の高分子重合体粒子
への感作：本実施例（Ａ）項で得られた高分子重合体粒
子分散液５　ｍｌ、　０．０１Ｍホウ酸バッファー（ｐ
Ｈ＝７．５）　２　＋＋４！および蒸留水１１ｍＪを混
合し、これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（５■／ｍＡ）２
　ｍｌを加えた。さらに、　３０分後に本実施例（Ｂ）
項で得られた抗α−フェトプロティン抗体の溶液（５ｎ
＋ｇ／ｍ＃）２　ｍｌを添加し、１０℃で６時間反応さ
せた。次に２反応混合物中の余剰のカルボジイミドを消
費するために、１０重量％のし一リジン水溶液（ｐＨ＝
７．５）　５　ｍｌｌを加え、１時間インキュベートし
た。次いで、　０．０１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ＝
８．２）にて遠心洗浄を３回行った後、同バッファーに
分散させて、全量を１０　ｍｌに調製した。

（Ｄ）パーオキシダーゼ標識抗α−フェトプロティン抗
体の調製二本実施例（Ｂ）項で得られた抗α−フェトプ
ロティン抗体を用い実施例１　（Ｄ）項の方法に準じて
パーオキシダーゼ標識抗α−フェトプロティン抗体を得
た。

上記（Ｃ）項で得られた抗α−フェトプロティン抗体感
作高分子重合体粒子分散液；　（Ｄ）項で得られたパー
オキシダーゼ標識化抗α−フェトプロティン抗体溶液（
５■／ｍｌ）；孔径０．２μｍ。

厚さ１６０μｍの酢酸セルロースメンブランフィルタ−
を有する濾過器；ｐＨ７，２の０．０１Ｍホウ酸バッフ
ァー；そして過酸化水素および０−フェニレンジアミン
をそれぞれ５ｍＭおよび２８１の割合で含有する基質溶
液をセットしたα−フェトプロティン測定キットを得た
。

■キットを用いたα−フェトプロティンの測定：ヒト血
清５０μｌを抗α−フェトプロティン抗体感作高分子重
合体粒子分散液５０μｌに加え、３７℃で１０分間イン
キュベートした。これに、パーオキシダーゼ標識抗α−
フェトプロティン抗体溶液を３０μ！加え、３７℃でさ
らに１５分間インキュベートした。次に酢酸セルロース
メンブランフィルタ−を用いて上記反応混合物を吸引し
ながら濾過し。

０．０１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ＝７．２）を用いて
洗浄した。メンブランフィルタ−上に基質溶液を数滴滴
下して約１０分間放置後２着色状態を目視観察し。

あらかじめ作成した比色表を用いて試料（血清）中のα
−フェトプロティンの量を求めた。

去嵐拠主 サンドインチ法によるα−フェトプロティンの測定キッ
ト（２） ■キットの８周製： （Ａ）高分子重合体粒子分散液の調製：実施例２　（Ａ
）項と同様である。

（Ｂ）抗α−フェトプロティン抗体の調製：実施例２（
Ｂ）項と同様である。

（Ｃ）抗α−フェトプロティン抗体の高分子重合体粒子
への感作：実施例２（Ｃ）項と同様である。

（Ｄ）アルカリフォスファターゼ標識抗α−フェトプロ
ティン抗体の調製二本実施例（Ｂ）項で得られた抗α−
フェトプロティン抗体を用い、実施例１　（Ｄ）項の方
法に準じてアルカリフォスファターゼ標識抗α−フェト
プロティン抗体を得た。

上記（Ｃ）項で得られた抗α−フェトプロティン抗体感
作高分子重合体粒子分散液；　（Ｄ）項で得られたアル
カリフォスファターゼ標識化抗α−フェトプロティン抗
体溶液（５■／１Ｉ１１）；孔径０．２μｍ、厚さ１６
０μｍの酢酸セルロースメンブランフィルタ−を有する
濾過器；　ｐＨ７，２の０．ＯＩＭホウ酸バッファー；
そして、フェニルリン酸二ナトリウムを１■／ｍｌ、４
−アミノアンチピリンを０．４５■／ｍｊ！、　　フェ
リシアン化カリウムを１■／ｌ１１１の割合で含有する
基質溶液をセットしたα−フェトプロティン測定キット
を得た。

■キットを用いたα−フェトプロティンの測定：バーオ
キシダーゼ標識抗α−フェトプロティン抗体の代わりに
アルカリフォスファターゼ標識α−フェトプロティン抗
体を用いたこと以外は実施例２と同様に行った。反応混
合物を濾過・洗浄し。

メンブランフィルタ−上に基質溶液を数滴滴下して約１
０分間放置した。フィルター上の着色状態を目視観察し
、あらかじめ作成した比色表を用いて試料（血清）中の
α−フェトプロティンの量を求めた。

ト ■キットの８周製： （Ａ）高分子重合体粒子分散液の調製：実施例２　（Ａ
）項と同様である。

（Ｂ）抗α−フェトプロティン抗体の調製：実施例２　
（Ｂ）項と同様である。

（Ｃ）抗α−フェトプロティン抗体の高分子重合体粒子
への感作：実施例２（Ｃ）項と同様である。

（Ｄ）パーオキシダーゼ標識α−フェトプロティンの調
製：実施例１　　（Ｄ）項に準じてα−フェトプロティ
ンをパーオキシダーゼで標識した。

上記（Ｃ）項で得られた抗α−フェトプロティン抗体感
作高分子重合体粒子分散液；　（Ｄ）項で得られたパー
オキシダーゼ標識化α−フェトプロティン溶液（５＋ｗ
／ｍ　ｌ　）　　ｉ孔径０．２μｍ　、厚さ１６０μｍ
の酢酸セルロースメンブランフィルタ−を有する濾過器
；ｐＨ７，２の０．０１１’ｌホウ酸バッファー；そし
て過酸化水素および０−フェニレンジアミンをそれぞれ
５ｍＭおよび２８ｍＭの割合で含有する基質溶液をセッ
トしたα−フェトプロティン測定キットを得た。

■キットを用いたα−フェトプロティンの測定：ヒト血
清５０μｌとパーオキシダーゼ標識α−フェトプロティ
ン溶液５０μｌとを混合した。これを抗α−フェトプロ
ティン抗体感作高分子重合体粒子分散液５０μｌに加え
て３７℃で３０分間インキュベートした。酢酸セルロー
スメンブランフィルタ−を用いて上記反応混合物を吸引
しながら濾過し。

０．０１Ｍホウ酸バッファーを用いて洗浄した。メンブ
ランフィルタ−上に基質溶液を数滴滴下して約１０分゛
間放置後１着色状態を目視観察し、あらかじめ作成した
比色表を用いて試料（血清）中のα−フェトプロティン
の量を求めた。

（発明の効果） 本発明のキットを用いると、このように、生体内の免疫
活性物質を簡単な操作で短時間のうちに。

しかも精度良く測定することができる。被測定物質は酵
素反応による着色を観察することにより測定されるので
、従来の沈降反応を目視観察する場合に比べて、専門的
知識のない者でも簡単に測定を行うことができる。この
ような測定キットは。

特に、試料中の被測定物質を短時間で検出・半定量する
ための診断用キットとして有用である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）被測定物質に特異的な抗原もしくは抗体を担
   持した高分子重合体粒子の分散液、 （２）多孔質膜、 （３）該被測定物質に特異的な酵素標識化抗原もしくは
   抗体；または酵素標識化被測定物質、（４）該酵素の基
   質、および （５）緩衝液、 を含有する免疫活性物質測定キット。 ２、前記高分子重合体粒子の粒径が０．０５μｍ〜１ｍ
   ｍであり、かつ前記多孔質膜の孔径が０．０２〜５００
   μｍである特許請求の範囲第１項に記載の測定キット。