JPS63229366A - 凝集反応免疫分析及び緩衝塩洗浄液を使用する多価免疫種測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的試料中に存在するストレプトコッカ
スＡのような、多価免疫種の測定方法に関する。本発明
は、また、この方法を実施するのに有用な試験キットに
関する。

〔従来の技術〕

抗原−抗体反応は、全ての免疫学的試験方法の基礎であ
る。抗体として知られている成る種の蛋白質は、抗原、
即ち他の蛋白質又は炭水化物である異質の物質の存在に
反応（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）　Ｉ、で、啼乳動物により産
出される。この異質物質に対する正常生体反応（ｎｏｒ
ｍａｌ　ｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、種々の疾病
、戻患、及び生理学的障害を診断するために使用される
多くの技術の開発を導いた。一般的な意味で、本明細書
に於て、検出すべき抗体−抗原反応の一つの成分は、免
疫種として定義され、一方性の対応する成分は、レセプ
ターと考えられる。

予想される蛋白質の存在のためのインビトロ試験に於て
、生物学的試料中の抗原又は抗体は、該生物学的試料に
免疫学的対部分を添加することによって運び出される。

もし予想される物質が存在するならば、その結果である
抗原−抗体反応は、抗原−抗体錯体くコンプレックス）
の沈澱によって示される。この反応錯体は、一般的に肉
眼で検出することは困難である。この理由のために、抗
体又は抗原の何れかは、しばしば、不溶性粒子、例えば
、ポリマーラテックス粒子に結合し、そうして、錯体が
生成した場合に、それは凝集物の存在を観察するか、又
は該粒子に付随した検出し得るトレーサーによって、生
ずる凝集反応から容易に検出することができる。次いで
凝集反応は、粒子の懸濁液から粒子を凝集させることに
より特徴付けられる。公知の凝集反応方法の更に詳細な
ことは、米国特許第４．４１９．４５３号及び同第４．
４５９．３６１号に開示されている。

ストレプトコッカスのいくつかの群のうち、群Ａストレ
プトコッカス（Ｓ、化＠）　（Ｓ、　１１！１０ｇｅｎ
ｅｓ）は、Ｂ−溶血性肺炎、狸紅熱、リウマチ熱、心臓
後遺症、糸球体腎炎、敗血症扁桃腺炎、及び産褥敗血症
のようなヒトの病的状態を引き起こす第一の原因である
。ストレプトコッカスＡによって潜在的に引き起こされ
る感染の危険な性質のために、感染の初期段階でその存
在を診断し、適切な治療手順を選択することが重要であ
る。検出の初期試験では、生物学的試料を普通少な（と
も１８時間であり、４８時間までの長時間培養すること
が必要である。多くの場合、このような長い試験は治療
を遅らせるので好ましくない。

ストレプトコッカスＡの最近の試験は、培養技術よりも
速いと記載されている。米国特許第４、６１８．５７６
号には、喉からの標本を得るために使用したスワブ（ｓ
ｗａｂ）から抗原を直接抽出するためにある種の酵素を
使用する凝集反応試験が記載されている。標本を集める
ための塗布手段（ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ　ｍｅａｎｓ）
　、酵素を含有する抽出試薬、及び適当な指示試薬から
なるキットも記載されている。記載された方法は、抽出
した抗原を抗体で被覆されたラテックス粒子と共に試料
板の窪みに置くことからなる。抗原−抗体反応を促進す
るために窪みを機械的に撹拌した後、凝集反応が該窪み
内の混合物中に観察された。この方法は、凝集体が顕微
鏡を使用しない限り容易に観察されず、培養しなくては
ならないバクテリアから製造された抽出酵素を必要とす
るために不利である。

種々のラテックス粒子と凝集体を観察するための着色技
術を使用する他の凝集反応分析が、ヨーロンパ特許公報
第１５０．５６７号及び同１７４．１９５号に記載され
ている。米国特許第４．５５２．８３９号には、固体表
面上の小さい領域に粒子を集めることによって行なう凝
集反応分析が記載されている。集められた粒子は、検体
、即ち抗原の検出を助けるためにそれに結合した抗体又
はラベルを有し得る。

分析の条件は、ビーズ同志の反応を調節するよう選択さ
れる。例えば、水性媒体のイオン強度は、凝集反応を最
大にするために粒子の自然電荷に基づいて調節される。

一般に、イオン強度は、０．０００１から０．１まで変
わる。一度凝集体が形成され、吸収物質（例えば、濾紙
）上の濃縮が行なわれると、結合した物質から結合しな
かった物質を分離することを助けるために、界面活性剤
を含有する燐酸塩緩衝塩溶液洗浄が適用される（第６カ
ラム、第５０〜５５行）。

〔解決すべき課題〕

多くの多価免疫種［例えば、ストレプトコツ力ｘ　（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　Ａ　、ヒト絨毛性検線刺
激ホルモン（ｈＣＧ）、クラミジア、淋病、ヘルペス、
ＨＩＶ又はＨＴＬＶビールス及びその他］のための現在
の凝集反応分析は、いくつかの点で有用性が限定されて
いる。これらは干渉及びしばしば感受性がないために、
一般に判断が困難であり非定量的である。抗体結合粒子
を使用して行なわれる多価免疫種の凝集反応分析の感度
及び正確度を改良するために、凝集物質をバラバラに破
壊することから保護し、同時に、凝集物質と非凝集物質
とを効果的に分離するための方法が必要であることが見
出された。

〔課題を解決するための手段〕

従来の凝集反応分析でみられる課題は、本発明に従えば
、水性液体中の多価免疫種を測定するに当り、 （ａ）遊離体の形の多価免疫種を含有する水性液体を、
付随するトレーサー分子を協働的に有しかつ免疫種と反
応性のレセプター分子とをその表面に結合せしめた水不
溶性粒子を含む試薬とを接触させて、免疫種とレセプタ
ー分子との反応生成物の凝集体を形成せしめ、 （ｂ）接触工程（ａ）と同時にか又はそれに続いて、該
凝集体を該水不溶性粒子の平均直径よりも少なくとも５
倍大きい平均孔サイズを有する微孔性水不溶性膜と接触
させ、 （ｃ）　ｐＨが５〜１０でイオン強度が少なくとも０．
２５の洗浄溶液で、該膜上に凝集体を残しながら非凝集
残渣物質を液膜を通して洗い出し、そして、（ｄ）該膜
上に残留する該凝集体又は該残渣物質の何れかの中のト
レーサーの量を測定することを含んで成る、多価免疫種
の凝集反応測定方法によって解決された。

更に、本発明は、トレーサー分子を協働的に有しかつ多
価免疫種と反応性のレセプター分子をその表面に結合せ
しめた水不溶性粒子を含む凝集反応指示試薬、及び、 ｐＨが５〜１０でイオン強度が少なくとも０．２５の洗
浄溶液を含んでなる、多価免疫種測定用試験キットを提
供する。

〔実施態様〕

本発明は、非常に短時間、即ち１０分間未満で複雑な装
置を使用することなしに実施することができる、免疫反
応性種のための診断検査を提供する。これは、診療所で
検査を行なうことを許容し、医師が検査の結果に基づい
て治療の手順を同じ日に決定することを可能にする。こ
の検査は、咽喉からのスワブ標本、尿標本又は他の水性
液体の試料のような生物学的試料中の、ストレプトコッ
カスＡ抗原、クラミジア若しくは淋病抗原、又はｈＣＧ
のような種の存在を検出する。このような生物学的試料
は、望ましくない残骸（組織片）（ｄｅｂｒｉｓ）又は
妨害物（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔｓ）を除くための前処
理（例えば、濾過）をしたり又はすること無しに検査で
きる。

本発明にしたがって、試験キットは、本発明の方法を実
施するために必要な物質及び試薬を提供する。一般的に
このキットには、（１）トレーサー分子を協働的に有す
る水不溶性粒子に結合した多価免疫種のためのレセプタ
ー分子からなる凝集反応指示試薬、及び（２）本明細書
に記載した性質を有する洗浄液が含まれる。任意にそし
て好ましくは、キットにはまた、もし核種が遊離形にな
っていなければ、生物学的標本から核種を抽出するため
の組成物も含まれる。また任意に、キットは、抽出が行
なわれた後に抽出組成物を中和するための中和溶液、又
は生物学的標本を集めるための適当な塗布手段からなる
。塗布手段は一般に、塗布棒とその一端にある繊維のス
ワブを含む。ストレプトコッカスＡ試験のために有用な
塗布手段は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特
許第４、６１８．５７６号に記載されたものを含む。全
てのこれらのキット構成要素を、以下に更に詳細に記述
する。

本発明の方法は、広範囲の種々の免疫反応性種のあらゆ
るものを検出及び定量するために使用できる。このよう
な種は、一般に、対応するレセプター、即ち、対応する
抗体と錯体化するための少なくとも２個のサイトを有す
る抗原である。また、検出すべき多価の種は、対応する
抗原又は情抗体と反応性の少なくとも２個の錯体化サイ
トを有する抗体とすることができる。本発明によって検
出できる多価免疫種には、ストレプトコッカス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　Ａ抗原、クラミジル及び淋菌
有機体からの抗原、ＨＩＶ又はＨＴＬＶ抗原又は抗体、
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）　、ロイチナイ
ズ化（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン（ＬＨ）、ヘ
ルペスビールス、医薬、抗生物質並びに他のホルモン性
、細菌性、又はビールス性抗原及び抗体が含まれるが、
これらに限定されるものではない。

核種は、レセプター分子と反応するために容易に近づき
易いことを意味する遊離形で検出できる。

ある例に於て、種は生物学的標本中に見出される有機体
又はビールスから抽出しなければならない。

他の例に於て、種は反応性形態中に既にあり、分析の前
に抽出換作を必要としない。与えられた種のための抽出
方法は、当業者に公知である。ストレプトコッカスＡ抗
原のための典型的抽出方法を、下記に記載する。

好ましくは、本発明は次の実施態様及び下記例１に示さ
れるようなストレプトコッカスＡ抗原を検出するために
使用される。ストレプトコッカスＡ抗原に関する本発明
のこの実施態様は、説明の目的のために示されるが、本
発明の範囲とこれらに限定するものでないことは理解さ
れるであろう。

抗原を含有すると考えられる生物学的試料は、あらゆる
適当な手段で患者から集めることができる。

しかしながら、一般に、予想される感染領域を塗布スワ
ブで接触し、それによってもし存在するならば、ストレ
プトコッカスＡ有機体の細胞を集めることによって、生
物学的試料を集めるために塗布器具が使用される。続い
て、抗原は適当な方法で有機体から抽出される。好まし
い抽出方法には、スワブを、単独又は組合せで試料中の
有機体、標本細胞及び他の組織片からストレプトコッカ
スＡ抗原を放出する１種又は２種以上の試薬を含む適当
な抽出組成物中に浸漬することが含まれる。

当該技術で公知の有用な抽出組成物には、ヨー法には、
米国特許第４．６１８．５７６号に記載されたような細
菌ストレプトマイセスアルプス（Ｓｔｒｅｐ−亜硝酸す
ｌ−＋Ｊウム又は亜硝酸カリウム）と有機酸（例えば、
琥珀酸、マロン酸、クエン酸及び当該技術で公知の他の
もの）との混合物である。本発明の方法に於て使用され
るとき、組成物のこれら二つの試薬は、組合わさって強
い抽出試薬である硝酸の溶液を形成する。

抽出に続いて、もし所望ならば短時間インキュベーショ
ンをしてもよい。遠心分離を、無関係の物質を除くため
に使用することもできる。抽出後、抽出された抗原を含
有する媒体を、もし必要ならば媒体ｐＨを抗原−抗体反
応に適するようにするために中和することもできる。例
えば、抽出をクエン酸と亜硝酸塩とで行なうとき、ｐＨ
は反応のために最適に望ましいもの以下に低下する。こ
のような任意の工程は、例えば、５ｌｉｆｋｉｎ及び他
の人のＪ、Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１５（１）
、　ｐｐ、１８７−１８９．　１９８２に記載されてい
る。

遊離形の多価免疫種、例えば、ストレプトコッカスＡ抗
原の存在は、付随するトレーサー分子と、粒子の表面に
適当な手段で結合している、免疫種と反応性のレセプタ
ー分子（例えば、ストレプトコッカスＡ抗原の抗体）と
を有する水不溶性粒子からなる本発明の凝集反応指示試
薬によって検出される。次いで、免疫種とレセプターと
の反応（又は結合）は、粒子同士が結合する結果となり
、それらは凝集し懸濁液から沈殿する。

指示試薬に於て有用である適当な粒子は、水不溶性で、
ある方法で付随される適当な数のトレーサー分子を有し
得る天然又は合成の粒子で有り得る。有用な粒子の例に
は、フェリチン結晶、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）粒
子、ガラスピーズ、ラテックス粒子のようなポリマー粒
子、及び当該技術で公知の他のものが含まれる。次の文
献には代表的な有用な粒子が記載されている。米国特許
第３、７００．６０９号、同第３．８５３．９８７号、
同第４．１０８．９７２号同第４．４０１．７６５号、
同第４．４１９．４５３号、同第４、４５９．３６１号
、同第４．４７８．９４６号、及び同第１ｆ　５９１＋
　５７１号。本発明に於て有用な粒子は、一般に非常に
小さく、即ち直径１声未満である。好ましくは、それら
は０．１〜０．７陶、最も好ましくは、０．３〜０．５
陶の平均直径を有する。

特に有用な粒子は、ポリマーラテックス粒子であり、更
に好ましくは、コアーシェル型ポリマーラテックス粒子
として当該技術分野で公知のものである。広範囲の種々
のモノマーが、粒子が水不溶性である限り、このような
粒子の製造に使用できる。ポリマー化学に於ける当業者
は、適切なラテックス粒子を設計し製造できる。本発明
の実施における好ましいコアーシェルポリマーラテック
ス粒子は、下記例に記載されている。これらの粒子は、
スチレンのホモ−又はコポリマーから成るコアと、クロ
ロメチルスチレンのホモ−又はコポリマーから成るシェ
ルを有する。

本発明の実施に於て有用な粒子は、凝集体又は非凝集残
渣物質のいずれかの中に見られるトレーサーの量から種
の定量的測定をするために、それと−緒になる十分なト
レーサー分子を有している。

トレー→Ｊ°−分子は、適当には粒子の外表面に結合し
ており、又は好ましくは、粒子内に分布している。凝集
体を検出することができる如何なるトレーサー物質も使
用できる。もし、フェリチン結晶が粒子として使用され
るならば、トレーサー分子はそれらの結晶中に元々ある
鉄の分子である。他の天然又は合成粒子は、トレーサー
としてラジオアイソトープ、比色化合物、螢光化合物、
化学ルミネッセンス化合物、燐光化合物、及び当該技術
で公知の他の検出し得る物質を有し得る。好ましくは、
トレーサーは、ラジオアイソトープ、比色染料、又は螢
光化合物（例えば、染料又は希土類キレート）である。

当業者は、適切なトレーサーを使用される特定の粒子と
組み合わせることができる。

一つの実施態様に於て、トレーサーは、例えば、米Ｉ特
許第４．２５９．３１３号に記載されているようなユウ
ロピウムキレートのような螢光希土類キレートである。

他の好ましい実施態様に於て、トレーサーは凝集体中で
容易に検出される比色化合物である。有用な染料は当該
技術分野で公知である。

ある染料は、粒子を製造するとき粒子中に導入できる。

また、染料は滲出しないような方法で予備成形粒子中に
吸収される。

トレーサーは、適当な方法で粒子中に分布される。例え
ば、トレーサーは例えば、上記米国特許第３．８５３．
９８７号に示されているようにして、その中に均一に分
布できる。好ましくは、トレーサー分子は粒子の限定さ
れた領域、例えば、表面付近又は内部に優位に位置され
る。好ましいコアーシェル粒子に於て、トレーサーはコ
ア又はシェルのいずれかにあるが、最も好ましくは、実
質的に粒子のコアにある。換言すれば、該染料の非常に
少量部分（例えば、５重量％未満）が、粒子のシェル部
分にある。

ストレプトコッカスＡ抗原のような検出すべき免疫種と
反応性のレセプター分子（例えば、抗体）は、適当な手
段、例えば、吸着又は共有結合によって粒子の外側表面
に結合している。結合は例えば、上記文献に記載された
ような公知の技術を使用して達成できる。レセプター分
子が結合の後粒子から取り除かれ難いので、共有結合が
好ましい。

共有結合で結合しているとき、レセプター分子は粒子に
直接結合するか、又は適当な結合基を介して結合する。

レセプター分子が抗体であるとき、モノクローナル又は
ポリクローナルの何れも使用できるけれども、モノクロ
ーナル抗体が一般に好ましい。抗体は、商業的に人手で
きるか又は公知技術を使用して製造できる。例えば、ポ
リクローナルは、一般に適当な哺乳動物に抗原を注入し
、ついで哺乳動物が使用のために除去される抗体を生成
することにより製造できる。モノクローナルは公知のハ
イブリドーマ技術を使用して得られる。

レセプター分子が抗原であるとき、所望の抗原分子は、
適当な生物学的原料から該分子を分離する公知の方法を
使用して得ることができる。例えば、ＨＩＶ又はＨＴＬ
Ｖ抗原は、ビールスに感染した患者の血清から得ること
ができる。

抽出された多価免疫種をレセプター分子と接触させて凝
集体を形成させると同時か又はそれに続いて、凝集体は
また微孔性水不溶性膜と接触される。一つの実施態様に
於て、凝集体は分離した容器内で形成でき、次いで膜と
接触させる。また、好ましくは、凝集体は膜の存在下に
形成される。

この膜（詳細は下記に記載）は、簡単には手で支えられ
たフィルタ一手段であり、フィルターを通して非凝集物
質は濾過される。しかしながら、好ましくは、それは分
析を行なう試験装置に装着される。このような試験装置
も以下に記載する。

あらゆる微孔性水不溶性膜が、それが分析に使用される
物質に不活性であり、流体及び非凝集物質を通過させる
が凝集物質を残留させる所望の孔度を有する限り使用で
きる。換言すれば、膜の孔は、指示試薬、抗原及び非凝
集粒子の通過を許容するに充分な大きさでなくてはなら
ないが、凝集粒子が通過することを許容するに充分な大
きさであってはならない。更に特に、膜の平均孔サイズ
は、上記水不溶性粒子の平均直径の少なくとも５倍でな
くてはならない。好ましくは、平均孔サイズは平均粒子
直径の６〜１５倍である。有用な膜には、種々の供給者
から商業的に入手し得るポリマー物質が含まれる。一つ
の有用な膜は、ＢＩＯＤＹＮε又は［ＪＬＴｒＰＯＲと
してＰａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造され
市販されているナイロン−６６微孔性膜である。

適当なインキュベーション期間が、もし所望ならば、膜
との接触の前又はその間に、凝集反応を最適化するため
に使用できる。この期間の後、非凝集残渣物質は、膜上
に凝集体を残しながら、膜を通して洗出される。本発明
の重要な特徴は、５〜１０のｐＨを有し、下記のような
イオン性化合物を含有する洗浄溶液でこの洗浄工程を行
なう。好ましくは、該溶液は、６〜９のｐＨに緩衝され
る。

適当な有機又は無機緩衝剤が、それが所望のｐＨを与え
る限り洗浄溶液中に使用できる。有用な緩衝剤には、グ
リシン、トリシン、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンス
ルホン酸、３−　（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホ
ン酸及び当業者に公知の他のものが含まれる。

洗浄溶液には、該溶液に少なくとも０．２５のイオン強
度を与えるに充分な濃度で存在する１種又は２種以上の
イオン性化合物が含まれる。好ましくは、溶液のイオン
強度は０．５〜３である。イオン性化合物は所望のイオ
ン強度を与えるために使用できる。このような化合物は
水溶液中で高度にイオン化されるものである。このよう
な化合物は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び当業
者に公知の他のもののような１価の塩である。塩化ナト
リウムの使用が好ましい。また、イオン性化合物は、洗
浄溶液のｐＨで充分にイオン化するが、あらゆる条件下
で完全にはイオン化しない化合物であってよい。このよ
うな化合物の例には、グリシン、トリシン、ナトリウム
グリシネート、ナトリウムトリシン、３−　（Ｎ−モル
フォリノ）プロパンスルホン酸及び当業者に明かな他の
もののような緩衝剤が含まれる。

一度非凝集残漬物質が膜から洗出されると、凝集体又は
残渣物質中の多価免疫種の量は、もし、トレーサーが容
易に目視できる比色染料であるならば、一般に肉眼で測
定できる。他方、標準比色検出装置が使用できる。池の
種類のトレーサー、例えば、ラジオアイソトープ、螢光
染料、燐光染料及び類似物は、適当な検出装置を必要と
する。

好ましい実施態様に於て、ストレプトコッカスＡを検出
する方法は、 （１）塗布棒と繊維スワブとを含む塗布器を用意し、ス
ワブで生物学的試料を集め、 （ｉｉ）スワブからストレプトコッカスＡ抗原の放出を
効果的にするための、亜硝酸ナトリウム及びクエン酸か
ら成る抽出組成物を用意し、スワブを抽出組成物に浸漬
し、そして該スワブから抗原を放出するに充分な時間抽
出組成物中でスワブをインキュベートし、 （ｉｉｉ　）抽出された抗原の溶液を中和し、（１ｖ）
抽出された抗原の中和した溶液を、トレーサー分子を実
質的に粒子コア中に含有する水不溶性ポリマーコアーシ
ェルラテックス粒子からなり、そしてその表面に結合し
た抗原と反応性の抗体からなる、凝集反応指示試薬と接
触させて、抗原と抗体との反応生成物の凝集体を形成さ
せ、該接触を使い楡で試験装置に装填された微孔性水不
溶性膜の存在下で行ない、液膜は上記水不溶性粒子の平
均直径の少なくとも５倍である平均孔サイズを有してお
り、 （ｖ）上記のような洗浄溶液で凝集体を膜の上に残して
非凝集残漬物質を膜を通して洗い出し、そして、 （ｖｌ）膜上に残留する凝集体中のトレーサーの量を測
定する ことからなる。

本発明はそれに限定されるものではないが、多価免疫種
の分析は、本明細書に記載した微孔性膜からなる適当な
試験装置を使用して行なうことができる。このような装
置は、抽出された抗原が凝集反応指示試薬と反応するた
めに堆積している１個又は２個以上の窪みを有すること
ができる。この試薬は、分析の間装置に添加でき、また
、製造の時点でその中に含ませることができる。一度凝
集体が形成されると、非凝集残漬物質は該洗浄溶液で膜
から膜の下の分離した区画内に洗い出すことができる。

例１：ストレプトコッカスＡの−Ｈ１定のための比較実
施例 本例は、ストレプトコッカスＡ抗原の測定のための本発
明の実施を示す。これはまた、０．２５モル濃度未満の
塩を含有する洗浄溶液（即ち、０．２５イオン強度未満
）を使用する本発明の範囲外の分析に対して、少なくと
も０．２５モル濃度の塩濃度（即ち、少なくとも０．２
５のイオン強度）を有する洗浄溶液を使用する本発明の
実施を比較する。

コア中にレッド染料（Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ）を含有
するコアーシェルポリマーラテックス粒子を、コアーシ
ェル重合技術を使用して製造した粒子中に染料を固定化
することによって製造した。粒子のコアは、ポリ　（ス
チレン−共−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト）（７０：３０重量比）から成り、一方シエルはポリ
　（ｍ、ｐ−クロロメチルスチレン）から成った。該粒
子の平均直径は、約０．４５Ｊ−であった。ストレプト
コッカスＡ抗原に対するモノクローナル抗体を次のよう
にしてこれらの粒子上に固定化した。即ち、５０ミリモ
ル濃度のホウ酸塩緩衝液（ｐｆ１８．５　）　０．６　
ｍに、抗５ｔｒｅｐ　Ａ（ａｎｔｉ−３ｔｒｅｐ　Ａ）
抗体（ＰＢＳとして公知の燐酸塩緩衝塩溶液中の２．９
　ｍｇ／　ｍｌｌ！溶液として購入）とカゼイン（１０
ｍｇ／ｒｒ＋ｊ！水）との１０：１混合物からなる全蛋
白質０．１ｍｇを添加した。混合の後、ポリマーラテッ
クス粒子の５％懸濁液４１．５ｔＩＩを添加しく０．３
％固形分となる）、得られた溶液を３７℃で２４時間垂
直方向に回転させ（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）抗体の
粒子の外表面への共有結合を起こさせ、凝集反応指示試
薬を形成した。

無水琥珀酸の溶液（１０ｍｇ／ｍｊ！ジメチルスルホキ
シド）を、上記凝集反応指示試薬の懸濁液に、無水物１
部：全蛋白質１部の重量比で添加した。

得られた懸濁液を２５℃で４時間混合し、７０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離し、次いで得られたペレットを０．
１モル濃度グリシン緩衝液（ｐＨ８，５＞中に０．３％
固体の濃度に再懸濁した。

地方の病院から得られたストレプトコッカスＡ抗原の分
離物を、本例の分析に使用した。ストレプトコッカスＡ
抗原は分離物から２５℃で１分間亜硝酸ナトリウム（８
モル濃度）及びクエン酸（０，２モル濃度）の等容量の
溶液を使用して抽出した。次いで該溶液を、等容量の、
エチレンジアミンテトラ酢酸（７５ミｌＪモル濃度）を
含有する３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸
緩衝液（２モル濃度、ｐＨ７，５）で中和した。

ナイロン６６微孔性膜（５−平均孔サイズ）をディスポ
ーザブル試験装置の試験窪み内に導入し、２％スクシニ
ル化カゼイン溶液１００ｔｌｌで洗浄することによって
前処理した。

塩化ナトリウム（８０ｉ１１．１モル濃度）、上記凝集
反応指示試薬懸濁液（４０１１１）及びｍｌ当り約４．
２Ｘ１０５　コロニー形成単位に含有する抽出抗原（８
０ｔ１りの混合物を、膜を含有する試験装置の試験窪み
に添加し、その中で２分間２５℃でインキュベートした
。次いで液体の膜の下の室に流し、膜上の凝集体を下記
第１表に示す洗液１５０ｔｌｌで洗浄した。対照Ａは蒸
留水であり、対照Ｂは０．０２５２５モル濃化す）　Ｉ
Ｊウムを含有する洗浄溶液（即ち、イオン強度０．０２
５）であった。

洗浄工程の後、膜上の凝集体中の染料の量を、反射率測
定装置を使用して５４０ｎｍで測定した。

ｌすｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ変換器（Ｊ、０ｐ
ｔｉｃａｌ　Ｓｏｃ、Ａｍ、。

４３、　ｐ、５９５．１９５３）を、変換濃度値（ｔｒ
ａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｄｅｎｓｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）を
計算するために使用した。測定の結果を△ＤＴ、試験試
料から形成された染料と抗原を含有しない対照からのバ
ックグラウンド読みとの差、として下記第１表に示す。

洗浄溶液中の塩の高濃度を使用する本発明の分析が、膜
上に容易に観察することができる凝集体を与えることが
、データから分かる。しかしながら、対照Ａ及びＢは、
少量の染料が観察され、洗浄溶液中に充分な塩がないと
、膜上への凝集体の充分な保留が妨げられることを示し
ている。

以下余白 第１表 イオン強度　　　　　　ΔＤＴ Ｏ〈対照Ａ）　　　　０．０１８ ０．０２５　　（対照Ｂ）　　　　０．０２２０．２５
　　　　　　　　　０．１４８０．５　　　　　　　　
　０．１５２ １．０　　　　　　　　　０．１７０ ３．０　　　　　　　　　０．１１４ 本例は、淋病の分析のための本発明の実施例を示す。本
例で使用した凝集指示試薬は、ベルギー特許第８４３．
６４７号に記載された方法に従った、ユウロピウム（■
）　（テノイルトリフルオロアセトン）３とトリオクチ
ルホスフィンオキサイドとをキレート１部対オキサイド
２部の比で５重量％固定化した、ポリ　（スチレン−共
−ｍ、ｐ−クロロメチルスチレン−共−２−ヒドロキシ
エチルアクリレート）　　（７６：２３　：　１重量比
）から成るラテックス粒子かみ成った。この粒子は、約
０．４５−の平均直径を有していた。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａ　　（またＰ
ＩＢ抗原として当該技術で公知である）の血清群Ｂ　（
ｓｅｒｏｇｒｏｕｐＢ）のＰＩ抗原に対するモノクロー
ナル抗体を、下記のようにして上記の粒子上に固定化し
た。即ち、５０ミリモル濃度のホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８
，５）１．３誦に、燐酸塩緩衝塩（ＰＢＳ）中の１．０
８ｍｇ／−抗体溶液０．１５蔵、及びカゼインの１ｍｇ
／ｍｌ水溶液０．３２ｍｊ？を添加した。

混合の後、上記のラテックス粒子の５％懸濁液４１、．
５ｄを添加し、得られた溶液を３７℃で２４時間混合し
た。無水琥珀酸（１０ｍｇ／ｍｊ！ジメチルスルホキシ
ド溶液０．１７４　ｒｄ）を添加し、得られた溶液を、
２２℃で４時間混合した。次いでこの溶液を１０分間遠
心分離し、得られたベレ７）を０．１モル濃度グリシン
（ｐＨ８，５）に再懸濁させ、凝集反応指示試薬の０．
３％固体を含有する混合物を得た。

ＰＩＢ抗原を、１％エタノールアミン及び１０ミリモル
（１度エチレンジアミンテトラ酢酸の混合物を使用して
Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａの標本から抽
出し、次いで超音波処理及び濾過した。

５−の平均孔サイズを有するナイロン６６微孔性膜を、
２％カゼイン溶液中に浸漬することによって前処理した
。塩化す）　ＩＪウム（５０ｄ、６モル濃度）、特定量
の抗原（ナノグラム）を有する抗原溶液（５０ｐｊ）及
び上記凝集反応指示薬溶液（５０１ｔｌ）の混合物を試
験管に添加し、２２℃で３０分間インキュベートし、次
いで処理された微孔性膜を通して濾過した。膜上の得ら
れた凝集体を１モル濃度トリシン（ｐＨ８，６）　０．
１５ｔｌｌで洗浄した。凝集体の量は、標準表面螢光測
定装置（励起３４２ｎｍ　、放射６１０ｎｍ）を使用し
て凝集体中の螢光の量を測定することによって決定した
。異なる抗原（即ち、Ｎｅ１ＳＳｅｒｌａ　ｇｏｎｏｒ
ｒｈｅａの血清群ＡのＰＩ抗原、またＰＩＡ抗原として
公知である）の抽出物の特定量を含有する対照溶液を、
ＰＩＢ抗原に対する抗体で非特異性相互作用を測定する
ためと同じ方法で処理した。下記第■表は、これるの試
験の結果を示す。本発明の分析が、特定の淋病の血清群
の所望の抗原を決定するために使用できることが明らか
である。

第■表 本例は、ヒト絨毛性性線列激ホルモン（ｈｃＧ）の測定
のための本発明の実施例を示す。

コア／シェルポリマー粒子を、公知の方法に従ってＯｉ
ｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ染料で固定化した。粒子のコアは、
ポリ　（スチレン−共−２−アセトアセトキシエチルメ
タクリレート）（８５：１５重量比）から成り、粒子の
シェルはポリ　（ｍ、ｐ−り四ロメチルスチレンー共−
メククリル酸）　　（９９，８：　０．２重量比）から
成った。該粒子は、約０，３２−の平均直径を有してい
た。

ｈＣＧの二つの異なったエビトビツクサイト（ｅｐｉｔ
ｏｐｉｃ　５ｉｔｅ）に対するモノクローナル抗体を次
のようにしてこれらの粒子上に固定化した。即ち、５０
ミリモル濃度のホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，５）０．６−
に、ｈｃｃ抗体（２，９ｍｇ／ｍ／！燐酸塩緩衝塩溶液
）とカゼイン（１０ｍｇ／ｍｌ水）との１０：１混合物
０．１　ｍｇを添加した。混合の後、上記ラテックス粒
子の５％懸濁液４１．５ｄを添加し、得られた懸濁液を
３７℃で２４時間垂直方向（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ
）で回転し、抗体の粒子への共有結合を起こさせ、凝集
反応指示試薬を形成した。

無水琥珀酸の溶液（１０ｍｇ／−ジメチルスルホキシド
）を、上記凝集反応指示試薬の懸濁液に、無水物１部二
全蛋白質１部の重量比で添加し、得られた混合物を２５
℃で４時間混合し、７０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
た。得られたベレットを０．１モル濃度グリシン（ｐＨ
８，５）中に０．３％固体の濃度に再懸濁した。

種々の量のｈＣＧ　（ミリ１．Ｕ、／ｍｌ）を、０．５
％ウシ血清アルブミンを含有する燐酸塩緩衝塩溶液（０
，１モル濃度の燐酸すｌ−ＩＪウム及び０．１５５モル
濃の塩化ナトリウム）に添加した。約５ＪＭの平均孔サ
イズを有するナイロン６６微孔性膜を、上記例１に記載
したのと同様のディスポーザブル試験装置の試験窪み内
に導入した。この膜は、スクシニル化カゼインの１％水
溶液２滴で洗浄した。ミｊ月、Ｕ、でのｈＣＧ濃度は、
５０００ミ１月、Ｕ、が精製ｈ（：Ｇｌｘに相当すると
して定義する。

４モル濃度の塩化す）　ＩＪウム６０ｐＩ、１モル濃度
のトリシン緩衝液（ｐＨ８，６）、上記凝集反応指示試
薬の懸濁液６０ｕｉ及び上記のｈＣＧ溶液２４０４の混
合物を試験管に添加し、ゆっくり混合し、２５℃で１０
分間インキニベートした。各溶液（３００Ｉ１１）の一
部を膜を含有する試験窪みに添加し、膜を通過して流し
た。しかしながら、膜上に形成した凝集体は、流出しな
かった。凝集体を１モル濃度の塩化す）　ＩＪウム溶液
３００Ｉで洗浄し、凝集体中の染料の量を、例１に記載
したようにして５４０ｎｍで測定した。これらの測定の
結果を下記第■表に変換濃度（ＤＴ　）として示す。こ
れは、本発明の分析がｈＣＧを決定するために使用でき
ることを示している。

第１表 ｈＣＧ抗原　（ミリＩ、　ｔｌ、　／ｒｄ）　　　　　
　ＤＴｏ　　　　　　　　　　０．０４３ ５００　　　　　　　　　０．０４７ １０００　　　　　　　　　０．１３３〔発明の効果〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性液体中の多価免疫種を測定するに当り、（ａ）
   遊離形の多価免疫種を含有する水性液体を、トレーサー
   分子を協働的に有しかつ免疫種と反応性のレセプター分
   子をその表面に結合せしめた水不溶性粒子を含む試薬と
   を接触させて、該免疫種と該レセプター分子との反応生
   成物の凝集体を形成せしめ、 （ｂ）接触工程（ａ）と同時にか又はそれに続いて、該
   凝集体を該水不溶性粒子の平均直径よりも少なくとも５
   倍大きい平均孔サイズを有する微孔性水不溶性膜と接触
   させ、 （ｃ）ｐＨが５〜１０でイオン強度が少なくとも０．２
   ５の洗浄溶液で、該膜上に凝集体を残しながら非凝集残
   渣物質を該膜を通して洗い出し、そして、（ｄ）該膜上
   に残留する該凝集体又は該残渣物質の何れかの中のトレ
   ーサーの量を測定することを含んで成る、多価免疫種の
   凝集反応分析方法。 ２、トレーサー分子を協働的に有しかつ多価免疫種と反
   応性のレセプター分子をその表面に結合せしめた水不溶
   性粒子を含む凝集反応指示試薬、及び、ｐＨが５〜１０
   でイオン強度が少なくとも０．２５の洗浄溶液を含んで
   なる、多価免疫種測定用試験キット。