KR940005599B1 - 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actino-bacillus actinomycetemcomitans)에 대한 항체 조성물 및 진단법에서의 그의 용도 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actino-bacliius actinomycetemcomitans)에 대한 항체 조성물 및 진단법에서의 그의 용도

제1도는 샌드위치 측정에서 나타내지는 절대 투과밀도(D_T) 대 에이. 액티노마이세탬코미탄스(A. actinomycetemcomitans)의 절대세포 농도사이의 그래프 도면이다.

제2도는 직접 반응 분석에서 나타내지는 절대 투과밀도(D_T) 대 에이. 액티노마이세템코미탄스의 절대세포 농도의 그래프 도면이다.

본 발명은 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actionmycetemcomitans)의 세가지 항원형(A,B 및 C) 모두를 탐지하는데에 유용한 폴리클로날 항체 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물이 고정된 수-불용성 제품 및 미생물을 탐지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 치과적 연구 및 건강 보호에 유용하다.

의학, 치과학 및 수의학적 진료에서, 연구 및 진단과정에서 및 생물학적 유체 또는 시료중에 존재하는 생물학적 또는 화학적 물질의 빠르고 정확한 탐지 또는 정량화를 위해서 계속적인 요구가 있었다. 예를 들어, 사람 및 동물 조직, 유체 또는 세포중의 다양한 미생물의 존재는 질병의 진단 및 효과적인 치료를 위해 매우 중요하다.

특정 미생물은 치은염 및 치주염과 같은 사람 및 동물에서의 다수의 치주 질환의 표지로서 관련되어 왔다. 이러한 질환의 중요성은 특히 사람이 보다 더 오래 삶에 따라 인류에 있어 증대되고 있고, 이의 방지가 의학적 및 상업적으로 상당히 중요하게 되고 있다. 또한, 동물에 대한 적절한 보호(치과적 보호 포함)가 문화에서 증대되는 관심사항이다.

치주 질환과 관련된 미생물의 감지는 배양기법(일반적으로 느리다), DNA 프로브 및 응집 분석, 효소결합 면역흡착측정(ELISA), 면역형광 및 면역침강과 같은 다수의 면역학적 과정을 이용하여 달성하여 왔다. 면역학적 과정은 미생물의 항원 부위(이는 미생물로부터 추출된 성분상에 있을 수도 있다)와 이에 특이한 상응하는 항체와의 면역학적 반응을 포함한다. 이어서 생성된 면역학적 반응 복합물을 다수의 방법으로 탐지할 수 있다.

액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actino-bacillus actinomycetemcomitans(본 명세서에서는 A. actinomycetemcomitans로 기재됨)은 생물중 헤모필루스(Haemophilus)와 밀접한 관련이 있는 구강 그람-음성 통성 생물이다. 이 생물은 세균성 심내막염, 갑상선농양, 요도 감염, 뇌농양 및 척추 골수염을 포함하는 심각한 인체 감염증을 일으킬 수 있다. 상기 생물은 특정 타입의 치주 질환의 병인, 특히 국부적인 유년기 치주염에서 및 특히 몇몇 형태의 사람 치주염에 강하게 관련되어 왔다. 에이.액티노마이세템코미탄스의 사람 단리물은 잠본 등 (Zambon et al., Infect. Immun., 41, pp-27, 1983)에 의해 각각 75(AT_CC4317), Y4(ATCC 43718) 및 67(ATCC 43719)로 표시되는 균주에 상응하는 항원형 A,B 및 C로 표시되는 세개의 주요 항원그룹으로 분리되어 왔다.

치은구 극간 유체 및 치은하의 치플라크에서 이러한 세균에 특이한 임상적 분석이 치주 질환의 진단, 치주치료의 선택 및 치주 치료의 진전의 평가에 대해서 및 추후 치과적 조사에서 환자의 상태를 결정하는데에 유용하다. 이러한 생물을 동정하는데에 사용되는 표준 배양 기법은 시간이 소모되고, 값이 비싸며, 높은 수준의 작업전문가를 요구한다. 이러한 시험은 또한 이동동안 요구되는 엄격한 혐기 조건에 기인한 낮은 수준의 생물을 탐지하기 위한 충분한 민감도를 결여할 수도 있다.

상기 기술된 다양한 면역 측정이 발전되어 몇몇의 성공과 함께 이용되고 있다. 특히 유용한 것은 방사선 면역 침강 측정 및 ELISA 시험이다. 이들 시험은 표준 배양 기법에 대해 개선을 제공하지만 ,헤모필루스 그룹중의 생물과 같은, 유사한 다른 생물과의 교차-반응성을 감소시킬 뿐만 아니라 원하는 생물에 대한 측정 민감도를 증가시키기 위하여 추가의 개선이 시도되어 왔다. 예를 들어, US-A-4,741,999호에는 에이.액티노마이세템코미탄스의 항원에 대한 모노클로날 항체 생산이 개시되어 있다.

언급된 모노클로날 항체는 생물의 몇몇 항원에 대한 개선된 특이성을 제공하는 반면에, 이는 폴리클로날 항체와 비교하여 낮은 수준의 생물을 감지하는데 있어 감소된 민감도를 나타낸다.

높은 민감도와 유사한 생물의 항원 부위와의 최소의 교차-반응성으로 에이. 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하는 개선된 수단에 대한 요구가 여전히 남아 있다.

상기 언급된 문제는 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 하나의 항원과 면역학적 복합물을 형성하는데 유용한 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물 의항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다)로 극복된다.

또한 본 발명은 적어도 제1및 제2의 대향 외부 표면을 갖고 상기 표면들의 적어도 하나에 상기 기술된 폴리클로날 항체 조성물을 고정시킨 미세다공성(micro-porous)기재를 포함하는 수-불용성 제품이다.

더더구나, 미생물 액티노바실러스 액티노마이세탬코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하기 위한 방법은 :

A. 미생물액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스로부터 추출된 항원을 상기 기술된 폴리클로날 항체 조성물과 접촉시켜, 항원과 폴리클로날 항체사이에 면역학적 복합물을 형성시키고, B. 항원의 존재를 나타내는 것으로서 복합물의 존재를 탐지하는 것을 포함한다.

본 발명의 폴리클로날 조성물은 에이. 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두에 매우 특이하다.

따라서, 오직 두개의 항체만이 환자의 시료중에 존재할 수도 있는 상기 미생물의 모든 균주들을 탐지하는데에 필요하다. 보통 미생물의 세가지 항원형 모두를 탐지하기 위해 세가지 모두의 항원형에 특이한 항체들이 필요하다. 더구나, 상기 조성물은 샌드위치 및 직접적인 결합 측정(하기 기술됨)을 포함하는 다양한 분석 방법에서 유리하게 사용될 수 있다. 조성물을 상기 측정을 위해 완충된 용액중에 적용시킬 수 있으나, 일회용 시험 디바이스(하기 기술됨)와 같은 수-불용성 제품중에 존재하는 미세다공성 기재의 고정시키는 것이 바람직하다.

제1도는 하기 실시예 3에서 보다 상세히 기술된다.

제2도는 하기 실시예 4에서 보다 상세히 기술된다.

본 발명은 에이. 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두의 항원들(예, 리포폴리사카라이드, 캡슐 항원 또는 막 단백질)을 빠르고 민감하게 탐지하기 위하여 사용할 수 있다. 이러한 항원은 완전한 세포의 부분으로서 탐지할 수도 있는 반면에, 이들은 생물학적 시료중에 존재할 수도 있는 완전한 세포로부터 적절한 방법으로 추출된다. 이러한 시료에는, 제한되는것은 아니지만, 목 또는 입으로부터의 타액 또는 점액, 오줌, 누액, 사람 또는 동물의 조직추출물, 치아 플라크 및 치은 극간의 유체가 있다. 일반적으로 생물은 치아 플라크, 타액 또는 치은 극간 유체에서 탐지된다.

항원 추출은 예를 들어, US-A-4,741,999에 기술된 바와 같이 표준 방법을 이용하는 세척제(나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 데옥시콜레이트 또는 나트륨 데실 설페이트)의 사용, 삼투 충격(예를 들어, 다리엔조등(Dirienzo et al)의 문헌[Infect & immun., 47(1), pp 31-36, 1985]참조)의 사용, 또는 초음파 수단[예를 들어, 잼본등(Zambon et al)의 문헌[Infect. & Immun., 41(1), pp. 19-27, 1983]의 사용과 같은 물리적 또는 화학적 수단을 이용하여 적절하게 달성한다.

본 발명의 조성물은 본질적으로 두개의 상이한 폴리클로날 항체로 구성되며 제1폴리클로날 항체는 에이. 액티노마이세템코미탄스의 항원형 A의 적어도 하나의 항원을 목표로 하고, 제2폴리클로날 항체는 에이. 액티노마이세템코미탄스의 항원형 B의 적어도 하나의 항원을 목표로 한다. 이들 항체는 상기 언급된 잼본 등의 참고문헌에 기술된 것과 같은 공지된 공정을 이용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 포유동물(토끼와 같음)을 적절한 양의 항원 성분 또는 흥미있는 항원형의 완전한 세균 세포로 1회 이상의 횟수로 면역화시킨다. 적절한 시간후, 역가가 허용가능할 때, 항혈청의 포유동물로부터 회수한다. 항체를 항혈청으로부터 회수하여, 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고, 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 공정의 상세한 사항이 본 분야에 잘 알려져 있다.

일반적으로, 항체가 단리되면, 이들은 하나 이상의 완충제 및 원하는 경우 방부제를 함유하는 완충된 용액중에 저장 및 사용할 수 있다. 바람직하게는, 이들을 냉동 형태로 저장한다. 완충된 용액중에서, pH는 일반적으로 약 6 내지 약 9로 유지하고, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 8.5로 유지한다. 유용한 완충제에는 인산염 완충된 염수 용액, 트리스(하이드록시메틸(아미노메탄, 트리신, 비신, N-트리신(하이드록시메틸)메틸-2-아미노에탄 설폰산 및 본 분야에 숙련된자에게 쉽게 명백한 다른 완충제가 있다.

상기 기술된 폴리클로날 항체의 조성물을 입자성생물, 중합체, 유리, 세라믹, 천연 또는 합성수지, 규조토 또는 자화가능한 입자로부터 형성된 수-불용성 입자 담체 물질상에 적절한 방식으로 고정화시킨다. 이들 입자는 구조 및 공간적 형태는 중요하지 않지만, 모양이 구형인 것이 바람직하고, 약 0.01 내지 약 10㎛, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5㎛의 평균 직경을 갖는다.

항체는 물질의 표면상에 흡착 또는 그의 반응성 그룹과의 공유 반응을 포함하는 물리적 또는 화학적 수단에 의해 입자 담체 물질에 부착시킬 수 있다. 공유 부착이 바람직하다. 바람직한 중합체 입자는 항체 분자를 공유적으로 부착시키기 위한 적절한 표면 반응성 그룹을 갖는다. 담체물질상의 항체 분자의 밀도는 물질의 조성, 항체의 크기 및 성질에 따라 변할 수도 있지만, 측정에서 적절한 민감도를 위해 요구되는 충분한 밀도가 본 분야에 숙련된자에 의해 결정될 수 있다. 항체는 필요한 경우 부착을 위해 적절하게 개질시킬 수 있다.

항체의 공유적 부착은 항체의 유리 아민, 탄수화물 또는 설프하이드릴 그룹과 직접적으로나 간접적으로 (즉, 단백질 또는 아비딘-비오틴과 같은 결합을 통해)반응할 수 있는 표면 반응성 그룹을 이용하여 보통 달성한다. 이러한 표면 반응성 그룹에는 제한되는 것은 아니지만, 카복시, 에폭시, 알데히드, 활성 할로원자, 활성화된 2- 치환된 에틸설포닐, 비닐설포닐 및 본 분야에 공지된 다른 그룹이 있다. 입자의 바람직한 태양에 관한 하기 논의는 단지 예시적인 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다.

특히 유용한 중합체 입자는 EP-A-O-323 692에 기술된 것을 포함한다. 이러한 입자는 일반적으로 약 0.01㎛보다 큰 평균 입자크기를 갖는 수-불용성 라텍스 입자이다. 이들은 적어도 하나가 활성 할로원자 또는 활성화된 2-치환된 에틸설포닐 또는 비닐설포닐 그룹을 갖는 하나 이상의 에틸렌성 불포화 중합가능한 단량체로부터 제조된 중합체로 구성된다.

상기 기술된 단량체 하나이상을 단독 중합체 또는 공중합체를 형성시키기 위해 개별적으로 또는 조합하여 중합시킬 수 있다. 달리 및 바람직하게는 하나이상의 단량체를 적어도 하나의 다른 에틸렌성 불포화 중합가능한 단량체와 공중합시킨다. 일반적으로 이러한 단량체는 소수성, 분산성 또는 다른 특징과 같은 다양한 바람직한 성질을 제공한다. 특히 유용한 공단량체가 EP-A-O 323 692에 기술되어 있다.

대표적인 유용한 중합체에는 하기의 것이 있다 :

폴리(m & p-클로로메틸스티렌),

폴리(스티렌-co-m & p-클로로메틸스티렌- co-2-하이드록시에틸 아크릴레이트)(67:30:3 몰비),

폴리[스티렌-co-m & p-(2-클로로에틸설포닐메틸)-스티렌](96:4 몰비),

폴리{스티렌-co-N-[m & p-(2-클로로에틸설포닐메틸)페닐]-아크릴아미드}(99.3 : 0.7 몰비), 폴리(m & p-클로로메틸스티렌-co-메타크릴산) (95:5, 98:2 및 99.8 : 0.2 몰비),

폴리[스티렌-co-m & p-(2-클로로에틸설포닐메틸)스티렌-co-메타크릴산](93.5:4.5:2 몰비), 폴리{스티렌-co-N-[m & p-(2-클로로에틸설포닐메XLF)페닐]아크릴 아미드-co-메타크릴산)(97.3:0.7:2 몰비), 및

폴리(스티렌-co-m & p-클로로메틸스티렌)(70:30 몰비).

항체를 입자에 부착시키는 과정이 본 분야에 잘 알려져 있다. 대표적인 과정이 예를 들어, EP-A-O 323 692, US-A-3,925,157, US-A-4,181,636, US-A-4,703,018 및 언급하기에 너무 많은 다른 참고문헌 등에 기술되어 있다. 일반적으로 항체를 부착 형태(흡착, 공유 또는 연결그룹의 사용)에 따라 적절한 조건하에서 입자와 혼합시킨다. 본 분야에 숙련된자는 본 명세서에 제시된 예시적인 교시뿐만 아니라 선행기술으로부터 적절한 조건을 쉽게 결정할 것이다. 예를 들어, 반응성 할로원자, 활성화된 2-치환딘 에틸설포닐 또는 비닐설포닐 그룹을 갖는 입자에의 부착을 위하여, 항체를 일반적으로 pH 약 7 내지 약 10의 완충된 현탁액중에서 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 24시간 이하동안 입자와 혼합시킨다. 반응을 위하여 카복시 그룹을 사용하는 경우, EP-A-O 308 235에 기술된 것과 같은 카바모일로늄 활성제 뿐만 아니라 잘 공지된 카보디이미디 활성제도 사용할 수 있다. 현탁액중의 입자 및 항체를 적절한 온도에서 수시간 동안 항온 저장하여 항체를 입자에 흡착시킬 수 있다.

본 발명의 중요한 태양은 본 발명의 항체 조성물이 고정된 수-불용성 제품의 사용이다. 상기 제품는 제1 및 제2외부 표면을 갖는 미세다공성 기재로 구성된다. 기재는 어떠한 화학적 또는 생물학적 반응에 불활성이며, 일반적으로 항체를 고정시키기에 충분한 완전성(integrity) 및 측정동안 적절한 여과를 위한 다공성(일반적으로 약 0.5 내지 약 10㎛의 평균 세공 크기)을 갖는 하나이상의 천연 또는 합성 물질로 구성된다. 제한되는 것은 아니지만, 유용한 기재 물질에는 천연 또는 합성 중합체 매트 또는 직물, 소결 유리, 유리 또는 중합체성 필름 또는 섬유의 막 또는 필터, 다공성 세라믹 또는 셀룰로즈성 물질, 접착제 또는 결합 물질과 함께 결합된 비드로 구성된 다공성 입자구조가 있다. 미세다공성 기재는 일반적으로 균일하나 제품에 대해 원하는 경우, 약간의 만곡뿐만 아니라 표면에서의 약간의 불규칙성도 수용할 만하다. 본 분야에 숙련된자는 본 발명에서 유용한 많은 시판되는 물질 또는 고안물을 쉽게 결정할 수 있다. 특히 유용한 물질은 폴코포레이션(Pall Corp.)로부터 시판되는 미세다공성 폴리아미드(특히, 나일론)막이다.

미세다공성 기재는 측정동안 부딪치는 유체 및 비복합물화된 물질을 빠르게 배출시키기에 충분한 다공성을 갖도록 고안한다. 이러한 비복합물화된 물질에는 비복합물화된 항원, 항체, 세포 조각 및 생물학적 시료로부터의 다른 비입자성 외부 물질이 있다. 그러므로, 미세다공성 기재의 세공 크기는 상기 언급된 물질이 다공성 기재를 통과하는 크기이어야 한다. 더더구나, 약간의 시약이 제품의 세공안에 포획될 수도 있는 반면에, 세공크기는 일반적으로 측정에서 사용되는 시약의 상당한 부분에 적합하지 않다. 실질적으로 모든 항체 조성물이 미세다공성 기재를 외부 표면들중 하나위에 있는 것이 매우 바람직하다.

원한다면, 미세다공성 기재를 비특이성 상호반응을 감소시키기 위해서 본 분야에 알려진 단백질(카제인 또는 석시닐화 카제인)로 코팅시키거나, 빠른 여과를 촉진하는 계면 활성제, 또는 측정을 용이하게 할 수도 있는 다른 임의의 물질으로 코팅시킬 수 있다.

본 발명의 항체 조성물을 항체가 시료중의 항체와의 반응에 이용이 가능한 어떠한 적절한 방법으로 미세다공성 기재에 고정시킬 수 있다. 일반적으로, 제조하는 동안 기계적 장애를 조절하고 핸들링이 항체를 느슨하게 하지 않도록 항체를 고정시킨다. 더더구나, 항체는 일반적으로 측정동안 기재로부터 떨어지지 않는다. 예를 들어, 항체는 코팅, 스포팅 또는 분무에 의해 기계적으로 고정시킬 수 있고 분자와 기재사이 뿐만 아니라 분자들사이의 소수성 결합에 의해 기재위에 고정시킬 수 있다. 또한 항체는 적절한 화학 반응에 의해 공유적으로 고정시킬 수 있다.

항체 조성물을 기재상에 코팅시켜 친수성의, 중성 또는 양전하의 결합물질과 혼합시켜, 이로써 입자 조성물을 형성하는 입자 물질에 부착하여 미세다공성 기재에 고정화시키는 것이 특히 유용하다. 결합물질의 양은 일반적으로 시약의 총중량을 기준으로 20% 미만이다.

특히 유용한 결합제에는, 제한되는 것은 아니지만, 비닐피롤리돈 중합체, 아크릴아미드 중합체 및 4차 염을 함유하는 중합체 및 중성전하 또는 양전하의 본 분야에 알려진 다른 결합제가 있다. 전하에서 "중성"이란 중합체가 분자중에 어떠한 전하도 갖지 않거나 비교적 작은 순수 음성 또는 양성 전하를 갖는 것을 의미한다. 중합체는 단독-또는 공중합체일 수 있고 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 아크릴아미드 중합체는 또한 메타크릴아미드 중합체를 포함하는 것으로 정의된다.

유용한 양성-전하의 중합체성 결합제에는 매염제가 충분히 수용성인하 US-A-4,069,017 및 본 명세서에서 기술된 매염제가 있다. 충분한 수용성은 일반적으로 양전하의 그룹을 함유하는 단량체로 구성되는 중합체 적어도 50중량%을 갖음으로써 제공된다.

본 발명의 항체 조성물은, 5% 미만(시약의 중량단위로)로 기재내에 포획된다는 것을 의미하는 것으로, 미세다공성 기재의 표면위에 실질적으로 있는 것이 가장 바람직하다. "포획된"이란 전조성물이 기재의 세공안에 있는 것을 의미한다. 이는 항체 분자가 세공안에 또는 기재의 표면 또는 가까이에서 부분적으로 묻힐수 없다는 것을 의미하지는 않는다.

항체 조성물을 각 영역이 표면의 총면적보다 더 적게 나타내는, 표면의 하나이상의 분리된 영역중의 기재 표면에 고정시킬 수 있다. 달리는, 조성물을 전표면에 고정시킬 수 있다.

항체 조성물은 상기 언급된 바와 같이 이를 외부 표면에 고정시키는 적절한 방법으로 다공성 기재에 적용시킬 수 있다. 코팅, 침착, 또는 단지 적절한 조건하에서 적절한 용매(항체에 악영향을 끼치지 않는 물, 완충제 또는 유기 용매등)중의 표면에 항체 조성물을 떨어뜨리는 것이 허용가능하다. 일반적으로 조성물은 필수적이지는 않지만 측정에서 사용전에 건조시킨다.

본 발명의 수-불용성 제품은, 원한다면 (예를 들어, 유체가 이를 통해서 용기에로 배출되는 손으로 - 쥐는 제품으로서), 다른 장치 또는 시험용기 없이 측정에 사용할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 상기 제품을 시험 디바이스의 일부로서 탑재시킨다. 다양한 시험 디바이스가 US-A-3,825,410, US-A-3,888,629, US-A-3,970,429 및 US-A-4,446,232에 기술된 것을 포함하여 본 분야에 공지되어 있다. 특히 유용한 디바이스는 항원 물질의 탐지를 위해 슈르셀(Surecell)^TM시험키트(이스트만 코닥 캄파니)의 일부로 시판되는 디바이스다. 이러한 디바이스가 EP-A-O 308 231 및 EP-A-P 321 261에 기술되어 있다.

보다 특히는, 시험 디바이스가 자체안에 하나이상의 시험 웰(각 시험 웰은 생물학적 시료 및 적절한 시약의 샘플을 수용할 수 있다)을 갖는 수-불용성 셀을 포함한다.

셀은 유리, 중합체 물질, 세라믹, 섬유성물질, 셀룰로즈성 물질 및 본 분야에 공지된 다른 물질과 같은 유용한 수-불용성 물로부터 제조할 수 있다.

바람직한 태양에서, 시험 디바이스는 시료 시험결과 및 양성 및 음성 대조용 결과를 제공하도록 고안된 세개의 시험 웰을 갖는다. 각 시험 웰은 그 자체안에 탑재된 미세다공성 제품을 갖고, 시험 웰은 적어도 하나가 그 자체안에 탑재된 본 발명의 미세다공성 제품을 갖는다. 유용한 시험 디자이스의 다른 변형들이 본 분야에서의 보통의 숙련가의 이해 범위안에 들 것이다.

본 발명의 방법은 폴리클로날 항체 조성물을 면역학적 복합물이 항체와 존재하는 어떠한 항원사이에 형성되도록 에이. 액티노마이세템코미탄스의 하나이상의 항원형을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 접촉시키는 방식으로 수행할 수 있다. 일반적으로, 상기 접촉은 시료와 자체위에 고정화된 항체를 갖는 본 발명의 제품을 접촉시켜 수행한다. 접촉은 어떤 적절한 방법으로 달성할 수 있으나, 바람직하게는 시료는 일회용 시험 디바이스중에서와 같은 제품에 떨어뜨리거나 붓는다.

이어서 이렇게 형성된 복합물을 시료중의 항체읜 존재의 표시로서 적절한 방법으로 탐지한다. 탐지 과정은 적절한 시약 및 장치가 있다하더라도 수행하려는 측정 타입 및 사용된 표지의 타입에 좌우될 것이다.

예를 들어, 상기 방법은 측정된 양의 표지된 항체가 시료중의 항원 뿐만 아니라 항체와 반응하도록 허용하는 경합(competitive) 결합 면역측정으로서 알려진 것일 수 있다. 더더구나, 항원을 본 발명의 제품에 고정된 표시 및 비표지된 항체와 접촉시켜 항원을 간접적으로 측정하는 것이 가능하다. 이러한 측정의 상세한 사항은 본 분야에 보통으로 숙련된자의 이해 범위안에 든다.

또다른 태양에서, 시료중의 항원(바람직하게는 생물으로부터 추출된)이 소위 말하는 "직접 결합" 측정에서 고체 지지체상에 직접적으로 결합될(또는, 포획될)수 있다. 지지체에 일단 부착되면, 이 항원을 본 발명의 항체 조성물과 접촉시켜 지지체에 결합된 면역학적 복합물을 형성시킬 수 있다. 이 복합물은, 항체가 표지된 경우(효소등으로), 탐지될 수 있으며 ,또는 비표지된 경우, 제1항체에 지정된 항-항체를 지지체상에 탐지가능한 항원-항체-항체 복합물을 형성시키기 위하여 첨가할 수 있다. 두 경우 어느 경우에나, 탐지는 효소 및 그의 기질의 존재하에서 색소를 제공하는 조성물을 사용하여 가능하다.

바람직한 태양에서, 상기 방법은 항원과 약간이 불용성이고 약간이 탐지가능한 표지되었으나 불용성은 아닌 항체 조성물의 폴리클로날 항체의 복합물화를 포함한다. 조성물의 표지 및 비표지된(불용성) 항체와의 복합물화는 결합 또는 분리 디바이스 또는 고체 지지체에 의한 수집과 순서적으로, 또는 동시에 일어날 수 있다.

예를 들어, 항원은 본 발명의 불용성화된 항체 조성물과 뿐만 아니라 본 발명의 제1의 수용성의 탐지가능하게 표지된(상기 기술된 바와 같이) 항체 조성물과 복합물화시킬 수 있다. 이는 일반적으로 면역측정법(immunometric) 또는"샌드위치"측정으로서 본 분야에 공지되어 있다. 표지는 특히 결합 시약(아비딘 및 비오틴과 같은), 방사선 동위원소 또는 효소 및 본 분야에 공지된 다른 것을 포함하는 탐지가능한 잔기일수 있다. 표지가 표소(퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 글루코즈옥시다제, 우레아제 또는 β-갈락토시다제등)인 것이 바람직하다.

바람직한 "샌드위치"측정이 하기 실시예에서 보다 상세히 기술되고, 보다 일반적으로 캐나다(대만, 한국 또는 멕시코) 특허출원(1990년 1월 22일 출원된 미합중국 특허출원 제468,395호, 제468,046호 및 제468,047호에 상응)에 기술되어 있다.

달리는, 불용화된 항체는 본 발명의 폴리클로날 항체 조성물의 항체일수 있고, 표지된 항체는 항체에 지정된 수용성의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일수 있다. 모노클로날 항체 및 제조방법이 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, US-A-4,741,999에 기술된 바와 같이 ).

바람직한 태양에서, 미생물 엑티노바실러스 엑티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두의 탐지를 위한 방법은 :

A. 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스로부터의 추출된 항원을 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 시료를 적어도 제1 및 제2의 대향 외부 표면을 갖고, 표면의 적어도 하나에 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 하나의 항원과 면역학적 복합물을 형성시키는데 유용한 폴리클로날 항체 조성물(조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다)을 고정시킨 미세다공성 기재를 포함하는 수-불용성 제품과 접촉시켜 항원과 폴리클로날 항체사이에 면역학적 복합물을 형성시키고, B. 시료중의 항원의 존재의 표시로서 복합물의 존재를 탐지하는 것을 포함한다.

또한, 미생물의 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하기 위한 방법은 ;

A. 미생물의 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스로부터의 추출된 항원을 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 시료와 일회용 시험 디바이스중의 수-불용성 제품[이 제품은 적어도 제1 및 제2대향 외부 표면을 갖고, 표면들중 하나의 분리된 영역에 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체 및 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체(이들 항체 모두는 약 0.01 내지 약 10㎛의 평균 직경을 갖는 중합체 입자(이 입자는 약 0.01 내지 약 10㎛의 평균 직경을 갖고 친수성 중합체 물질과 혼합되어 있다)상에 고정되어 있다)로 구성되는 폴리클로날 항체 조성물의 코팅을 고정시킨, 미세다공성 막을 포함한다]을 접촉시켜 항원과 막상의 폴리클로날 항체사이에 면역학적 복합물을 형성시키고, B, 단계 A에서의 접촉전, 접촉과 동시 또는 접촉에 있어서, 시료의 항원형 A 및 B에 대한 수용성의 효소-표지된 항체를 접촉시켜 막위에 표지된 항체, 고정화된 항체와 항원의 표지된 복합물을 형성시키며, C. 접촉단계 B와 동시에 또는 그에 있어서, 막를 통해 비복합물화된 물질을 세척하여 표지된 복합물로부터 비복합물화된 물질을 분리시키고, D. 시료중의 항원의 존재의 표시로서, 효소의 존재하에서 색소를 제공하는 조성물을 사용하여, 막상의 표지된 복합물의 존재를 탐지하는 것을 포함한다.

에이. 액티노마이세템코미탄스 항원은 상기 언급된 적절한 추출기법을 이용하여, 바람직하게 는10%(중량) 나트륨 도데실 설페이트로 생물학적 시료로부터 추출할 수 있다.

이어서 추출된 항원을 상기 기술된 미세다공성 제품과 접촉시켜 그에 고정된 본 발명의 폴리클로날 항체 조성물과의 항원-항체 복합물을 형성시킨다. 짧은 항온 저장기간이 복합물 형성을 향상시키기 위해서 바람직할 수도 있지만, 이는 보통 실온에서 5분미만, 바람직하게는 2분미만이다.

표지된 복합물은 항원에 대한 탐지가능하게 표지된 항체를 사용하여 형성시킨다. 표지된 항체를 막상의 항체와 접촉시키기전, 접촉과 동시 또는 접촉에 이어서 항원과 반응시킬 수 있다. 바람직하게는 접촉에 이어서 반응시킨다.

비복합물화된 물질로부터 생성된 복합물의 분리는 실질적으로 복합물 형성과 동시에 시작한다. 그러나, 바람직하게는, 반응물 및 액체를 완전한 반응을 확증시키기 위하여 짧은 기간동안 막상에 항온 저장할 수 있다. 항원과 두개이상의 항체들의 불용성의 표지된 복합물이 막상에 보유된다. 분리를 향상시키는 것은 원하는 경우 한번 이상의 세척을 적용할 수도 있다.

이어서 표지된 복합물을 적절하게 탐지한다. 표지가 효소인 것인 바람직하고 효소 및 기재의 존재하에서 색소(색원소 또는 형광발색소)를 제공하기 위해서 적절한 색소-형성 조성물을 첨가한다. 퍼옥시다제가 바람직한 효소 표지이고, 다수의 적절한 색소-형성 조성물이 색소-형성 반응물 뿐만 아니라 기질 또는 기질 형성 반응물을 포함하는 것으로 알려져 있다. 기질 자체는 벤지딘, 테트라메틸벤지딘 또는 다른 벤지딘 유도체, 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸론-6-설폰산), 페놀 레드, O-페닐렌디아민, 피로갈롤, 4-아미노안티피리린, 브로모피로갈롤레드 및 본 분야에 알려진 다른 것과 같은 색소-형성 화합물일수 있다. 달리는, 수소 공여체 및 전자 수용체가 결합하여 본 분야에 공지된 바와 같은 탐지가능한 종을 제공할 수 있다.

바람직하게는, 색소 형성 조성물은 과산화수소 및 퍼옥시다제(예로, US-A-4,089,747에 기술된 바와 같은 트리아릴이미다졸 또는US-A-4,670,385에 기술된 바와 같은 트리아릴메탄 류코 색소)의 존재하에서 색소를 제공하는 류소 색소를 포함한다. 바람직한 색소-제공 조성물이 하기 실시예에서 예시된다.

일단 색소가 불용성 복합물의 존재하에서 형성된 경우, 측정이 시료중의 항원의 존재를 나타내는 지를 결정하기 위해서 시각적으로 또는 분광광도 장치를 이용하여 평가할 수 있다. 양성 및 음성 대조용시험 모두 시료시험과 함께 수행하는 것이 바람직할 수도 있다. 각 대조용시험 경우 적절한 시약들을 사용할 수 있다.

본 발명의 진단 시험 키트는 항원에 대해 탐지 가능하게 표지된 항체 분자 뿐만 아니라 본 발명의 제품을 포함한다. 이들 키트 성분들을 적절한 방법으로 패키징시킬 수 있고, 제품(단독 또는 시험 디바이스중에서) 및 액체 또는 고체 시약의 바이알 또는 병을 수용하도록 구분될 수 있는 몇몇 타입의 담체안에 포함시킬 수 있다. 또한, 상기 진단 시험 키트에는 방법을 수행하는데 유용한 하나 이상의 하기의 것을 포함할 수 있다 : 색소-형성 조성물, 추출 시약(측정전에 리간드를 추출하여야 한다). 세척용액, 희석제, 추가의 수용체 분자 및 주어진 측정에 대해 본 분야에 숙련된자에게 공지된 다른 시약, 시약은 건조형태 또는 적절한 용액 상태로 제공할 수 있다. 키트의 비반응성 성분은 지시사항, 혼합용기, 교반수단, 피펫 등을 포함할 수 있다.

한 태양에서, 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 측정에 유용한 진단 시험 키트는 :

a. 적어도 제1 및 제2대향 외부 표면을 갖고, 표면의 적어도 하나에 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 한항원과 면역학적 복합물을 형성하는데에 유용한 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체 및 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다)을 고정시킨 미세다공성 기재를 포함하는 수-불용성 제품, 및 b. 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 하나의 항원과 면역학적 복합물을 형성하기에 유용한 비고정된 폴리클로날항체 조성물[이 조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체(이들 비고정된 항체 조성물의 제1 및 제2항체는 탐지가능하게 표지되어 있다)로 구성되어 있다]을 포함한다.

또다른 태양에서, 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 결정에 유용한 진단 시험 키트는

a. 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 한 항원과 면역학적 복합물을 형성하기에 유용한 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 상기 미생물 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체 및 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다). 및 b. 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 제1 및 제2폴리클로날 항체 또는 세가지 항원형 모두에 대한 탐지가능하게 표지된 항체를 포함한다.

하기 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 예시하고자 제공한다. 달리 표시되지 않으며 모든 %는 중량단위이다.

[실시예 1]

액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스에 대한 다클론선 항체 조성물

본 실시예에서, 에이. 액티노마이세템코미탄스의 두가지 항원형에 대한 폴리클로날 항체를 제조하였다.

상기 두 항원형을 균주 75(ATCC 43717) 및 Y4(ATCC 43718)이라고 명명하고 각각 항원형 A 및 B라고 언급한다. ATCC는 미합중국 종균협회(American Type Culture Co-llection)(Rockville, Maryland)를 나타낸다.

면역원의 제조 및 면역 과정이 잼본등(Zambon et al)에 의해 문헌[Infect. Immun., 41(1), pp. 19-27, 1983]에 기술되어 있다.

항원형 A 형 B에 대한 항혈청을 제이. 제이. 잼본 및 에이치. 에스 레이놀즈(Dr. J. J. Zambon and H. S. Reynolds)(SUNY, Buffalo School of Dentistry)로부터 입수하였다. 이어 서두항체의 lgG 분확물을 황산암모늄 침강에 의해 제조하고 인산염 완충된 염수 용액(0.3 내지 0.4% 용액)중의 혼합물 형태로(연구 목적으로 사용되는 소량 경우 4℃로, 보다 많은 양의 경우 -70℃로) 저장하였다.

[실시예 2]

항체 조성물이 자체에 부착된 미세다공성 제품

본 실시예는 측정에서 사용하기 위해 항체 조성물이 자체에 부착된 본 발명의 제품을 기술한다.

실시예 1에 기술된 폴리클로날 항체 조성물을 폴리[스티렌-co-m & p-(2-클로로에틸설포닐메틸)스티랜](96:4 몰비)으로 구성한 중합체 입자에 고정화시켰다. 입자를 EP-A-O 323 692에 기술된 공정 및 출발물질을 이용하여 제조하였다.

에이. 액티노마이세템코미탄스의 항원형 A에 대한 항체를 포함하는 항체 조성물(인산염 완충된 염수 용액 67μl중의 56.5㎍) 및 에이. 액티노마이세템코미탄스(인산염 메르티올레이트 완충된 염수 용액 45μl 중의 56.5㎍)의 항원형 B에 대한 항체를 시험 튜브 및 혼합된 웰중의 붕산염 완층제(659μl, 0.05몰농도, pH8.5)의 용액에 첨가하였다. 중합체 입자(13.15% 고체를 함유하는 228μl 현탁액)을 항체 조성물에 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 14 내지 24시간동안 끝에서 끝에 걸쳐(end-over-and)회전시켜 항체가 입자에 공유 부착하도록 하였다. 이어서 현탁액을 2800rpm에서 10분동안 원심분리시켰다. 현탁액을 버리고 펠레트를 메르티올레이트(0.01%)를 함유하는 글리신 완충제(1ml, 0.01몰농도, pH 8.5)중에 현탁시켰다.

이 과정을 2회 반복하였다.

최종 항체/입자 시약 조성물은 하기의 것을 함유하였다 : 글리신 완충제(0.1몰 농도, pH 8.5)중에 항체/입자 시약(1%), 폴리아크릴아미드 결합제(5%) 및 메르티올레이트 방부제(0.01%), 이어서 상기 시약 조성물을 로프로딘(LoProdyne)^TM또는 비오딘(Biodyne)^TMA 미세다공성 막(Pall Corp)의 영역에 첨가하고 건조시켜, 자체위에 항체 조성물을 갖는 제품을 형성하였다.

[실시예 3]

액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형의 샌드위치 측정

본 실시예는 샌드위치 측정에서 에이. 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하기 위해 항원형 A 및 B에 대한 항혈청을 함유하는 본 발명의 폴리클로날 조성물의 사용을 예시한다.

물질 :

슈르셀^TM일회용 시험 디바이스를 측정에서 사용하였다. 각 디바이스는 플루오래드(Fluorad)^TMFC-135 비이온성 계면활성제(0.05g/m²)로 코팅된 로프로딘(Lo-Prodyne)^TM미세다공성 막(5㎛)이 있는 세개의 시험 웰을 가졌다.

항원형 A 및 B에 대한 항체를 상기 실시예 2에서 기술된 바와 같이 중합체 입자에 공유적으로 결합시켰다. 생성된 항체/입자 시약 조성물(2μl)을 시험 디바이스의 각 시험 웰에 첨가하였다.

효소-항체 결합물을 두항원형 A 및 B항체로부터 제조하여, 요시다케 등(Yoshitake et al)(Eur. J. Bio-chem., 101, 395, 1979)의 공정에 의해 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합시켰다. 결합물 조성물은 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산 완충제(0.1몰농도, pH 7.5)중에 카제인(0.5%) 및 메르티올레이트(0.01%)를 포함하는 용액중에 상기 두 결합물(각 항체 2.5㎍/ml)을 포함하였다.

색소-제공 조성물은 2-(4-하이드록시-3,5-디메톡시페닐)-4,5-비스(4-메톡시페닐) 이미다졸 류코색소(0.008%), 폴리(비닐 피롤리돈)(1%), 나트륨 인산염 완충제(10밀리몰농도, pH 6.8) 디에틸렌트리아민펜타아세트산(10μ몰농도), 4'-하이드록시아세트아닐리드(2밀리몰농도) 및 과산화수소(10밀리몰농도)를 포함하였다.

세척 용액은 물중에 나트륨 데실 설페이트(18g/ℓ)를 포함하였다.

각각 항원형 A,B 및 C에 상응하는 세균 균주 75, Y4 및 67를 제이. 제이. 잼본 및 에이치. 에스. 레이놀즈(상기 언급됨)로부터 입수하였다. 항원을 실온에서 약 1분동안 나트륨 도데실 설페이트(0.05%)를 사용하여 추출하였다.

분석:

항원형 A, B 및 C의 각각으로부터의 추출된 항원(50㎍)을 시험 디바이스의 분리된 시험 웰에 첨가하고, 자체안의 막상에 고정화된 항체와 복합물을 형성하도록 하였다. 나트륨 도데실 설페이트(0.5%의 50μl)를 음성대조용으로서 각 시험 디바이스의 단일 웰에 첨가하였다. 결합물 조성물(50μl)을 시험 웰에 첨가하고, 이어서 실온에서 약 5분동안 항온조장하였다.

세척 용액(240μl)을 시험 웰에 2회 첨가하고, 이어서 색소-제공 조성물(1방울)을 첨가하여, 시험 디바이스를 실온에서 2분동안 항온저장하였다. 막상에 형성된 색소를 시각적으로 판독하고 반사 밀도 값을 갖는 캘리브레이팅된 색상 차트에 비교하여, 윌리암-클래퍼 변환(Williams-Clapper transform)(J. Opt. Soc. Am., 43, 595, 1953)을 이용하여 투과 밀도(Dr)로 전환시켰다. 절대 세포 농도의 대수(logarithm) 대 절대 D_T로서 제1도에 나타내진 결과는 항원형 A 형 B항체의 조성물이 샌드위치 측정에서 미생물의 모든 균주들을 탐지하기 위하여 사용할 수 있음을 나타낸다. 측정을 750마리의 적은 세포들을 탐지하기 위해 사용할 수 있다.

[실시예 4]

액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 모든 세가지 항원형 모두에 대한 직접적인 결합 측정

본 실시예는 직접적인 결합 측정에서 에이. 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하기 위한 본 발명의 폴리클로날 항체 조성물의 사용을 예시한다.

물질 :

조닐(Zonyl)^TMFSM 비이온성 계면활성제(0.05g/m², 듀퐁)로 코팅된 5㎛ 비오딘^TM에이 미세다공성 막(Pall Corp.)을 함유하는 슈르셀^TM일회용 시험 디바이스를 사용하였다.

차단(blocking) 용액은 3-(N-모르폴리노) 프로판 설폰산 완충제(0.01몰농도, pH 7.5)중에 카제인(0.5%), 트윈^TM20 비이온성 계면활성제(0.3%) 4'-하이드록시아세트아닐리드(0.1몰농도) 및 메르티올레이트 0.01%를 포함하였다.

항원형 A 및 B에 지정된 효소-항체 결합물을 요시다께 등(실시예 3에서 언급)의 공정에 의해 특히 토끼 폴리클로날 항체에 양고추냉이 퍼옥시다제를 공유적으로 결합시켜 제조하였다. 결합 조성물은 두결합물(차단 용액 ml당 각각의 9㎍)을 포함하였다.

실시예 3의 색소용액을 사용하였다.

세척용액은 3-사이클로헥실아미노-2-하이드록시-1-프로판설폰산 완충제(0.05몰농도), Emcol^TMCC-9 양이온성 계면활성제(0.75%, Witco Chemical) 및 메르티올레이트(0.01%)를 포함하였다. pH를 수산화나트륨(0.05노르말)을 첨가하여 10으로 조정하였다.

세가지 항원형 모두에 대한 세균 균주를 수득하고 상기 실시예 3에 기술된대로 추출하였다.

측정:

추출된 항원(50μ)을 일회용 시험 디바이스의 시험 웰에 첨가하고 미세다공성 막에 흡착되도록 하였다. 인산염 완충된 염수 용액(50μl)을 음성 대조용으로서 제2웰에 첨가하였다. 효소-항체 결합물 용액(50μl)을 상기 두 시험 웰에 첨가하고, 이어서 실온에서 5분동안 항온 저장하였다.

시험 웰을 2회 세척하고(약 240μl), 이어서 색소-제공 조성물(50μl)을 첨가하였다. 실온에서 2분동안 항온저장후, 막상의 색소를 시각적으로 관찰하고 상기 실시예3에서 기술된대로 투과 밀도(D_T)로 전환시켰다. 세포 농도의 대수 대 절대D_T의 플로트로서 제2도에 나타내진 결과는 본 발명의 조성물이 미생물의 세가지 항원형 모두를 탐지하기 위하여 직접적인 결합 측정에서 사용할 수 있음을 나타낸다. 측정은 약 3000세포 정도로 낮게 탐지할 수 있다.

본 발명은 바람직한 태양을 특정하게 참고하여 상세히 기술하였지만, 변형 및 변경이 본 발명의 취지 및 범주내에서 가능하다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (24)

1. 본질적으로 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체 및 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성되는, 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)의 세가지 항원형 각각의 적어도 한 항원과 면역학적 복합물을 형성시키는데 유용한 폴리클로날 항체 조성물.
2. 제1항에 있어서, pH 약 6 내지 약 9로 완충된 용액중에 존재하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리클로날 항체들 각각이 중합체 입자상에 고정화된 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리클로날 항체가 상기 입자에 공유적으로 부착된 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 입자가 약 0.1 내지 약 10㎛의 평균 직경을 갖는 조성물.
6. 적어도 제1 및 제2의 대향 외부 표면을 갖고, 상기 표면의 적어도 하나에 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 한항원과 면역학적 복합물을 형성하는데 유용한 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다)을 고정시킨 미세다공성 기재를 포함하는 수-불용성 제품.
7. 제6항에 있어서, 상기 항체 조성물이 상기 기재의 상기 제1 또는 제2표면의 총면적 보다 작은 분리된 영역에 고정된 제품.
8. 제6항에 있어서, 상기 항체 조성물이 친수성의 중성 또는 양으로 하전된 결합제물질과 혼합된 제품.
9. 제8항에 있어서, 상기 결합제물질이 4차 암모늄 염을 함유하는 중합체, 비닐피롤리돈 중합체 또는 아크릴아미드 중합체인 제품.
10. 제6항에 있어서, 상기 미세다공정 기재가 약 0.5 내지 약 10㎛의 평균 세공 크기를 갖는 미세다공성 막인 제품.
11. (A) 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스로부터 추출된 항원과, 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체 및 상기 미생물과 항원형 B에 대한 제2 폴리클로날 항체로 구성되는 폴리클로날 항체 조성물을 접촉시켜, 상기 항원과 상기 폴리클로날 항체사이에 면역학적 복합물을 형성시키고, (B) 상기 항원의 존재 표시로서 상기 복합물의 존재를 탐지하는 것을 포함하는 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 추출된 항원을 접촉 단계(A)전에 고체 지지체 물질위에 고정화시킨 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 제1및 제2폴리클로날 항체가 효소로 표지되고, 복합물 탐지를 상기 효소의 존재하에서 색소를 제공하는 조성물을 사용하여 달성하는 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 폴리클로날 항체가 비표지화되고, 복합물 탐지를 상기 폴리클로날 항체에 대한 효소-표지된 항체를 이용하여 달성하는 방법.
15. (A) 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스로부터 추출된 항원을 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 시료와, 적어도 제1 및 제2대향 외부 표면을 갖고 상기 표면들중의 적어도 하나에 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형의 적어도 하나의 항원과 면역학적 복합물을 형성하기에 유용한 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다)을 고정시킨 미세다공정 기재를 포함하는 수-불용성 제품과 접촉시켜, 상기 항원과 상기 폴리 클로날 항체사이에 면역학적 복합물을 형성시키고, (B) 상기 시료중의 상기 항원의 존재 표시로서 상기 복합물의 존재를 탐지하는 것을 포함하는 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 폴리클로날 항체가 상기 미세다공성 기재에 고정된 중합체 입자상에 고정화된 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 복합물을 상기 미생물의 항원형 A 및 B에 대한 효소-표지된 항체로 탐지하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 항체가 퍼옥시다제로 표시된 방법.
19. 제15항에 있어서, 상기 제품을 함유하는 일회용 시험 디바이스를 사용하여 수행되는 방법.
20. (A) 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스로부터 추출된 항원을 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 시료와, 일회용 시험 디바이스중의 수-불용성 제품[이 제품은 적어도 제1 및 제2대향 외부 표면을 갖고, 상기 표면들중 하나의 표면의 분리된 영역에 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체(이들 두항체 모두 약 0.1 내지 약 10㎛의 평균 직경을 갖고, 친수성 중합체성 결합제물질과 혼합되어 있는 중합체 입자상에 고정되어 있다)로 구성되는 폴리클로날 항체 조성물의 코팅을 고정시킨 미세다공성 막을 포함한다]을 접촉시켜, 상기 항원과 상기 막상의 상기 폴리클로날 항체사이에 면역학적 복합물을 형성시키고, (B) 단계(A)의 접촉전, 접촉과 동시 또는 접촉에 이어서, 상기 시료와 항원형 A및 B에 대한 수용성의 효소 표지된 항체를 접촉시켜 상기 막상에 상기 표지된 항체, 고정화된 항체 및 상기 항원의 표지된 복합물을 형성시키며, (C) 접촉단계 (B)와 동시 또는 이어서, 상기 막을 통하여 상기 비복합물화된 물질을 세척하여 상기 표지된 복합물으로부터 비복합물화된 물질을 분리시키고, (D) 상기 효소의 존재하에서 색소를 제공하는 조성물을 이용하여 탐지함으로써, 상기 시료중의 상기 항원의 존재 표시로서, 상기 막상에 상기 표지된 복합물이 존재함을 탐지하는 것을 포함하는 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 모두를 탐지하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 효소가 퍼옥시다제이고, 상기 색소-제공 조성물이 트리아릴이미다졸 류코 색소를 포함하는 방법.
22. (a) 적어도 제1 및 제2 대향 외부 표면을 갖고, 상기 표면의 적어도 하나에 미생물액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 한 항원과 면역학적 복합물을 형성시키는데 유용한 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다)을 고정시킨 미세다공정 기재를 포함하는 수-불용성 제품, 및 (b) 미생물 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스의 세가지 항원형 각각의 적어도 한 항원과 면역학적 복합물을 형성하는데에 유용한 비고정된 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 둘다 탐지가능하게 표지되어 있는, 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성되어 있다)을 포함하는 액티노바실러스 액티노마이세탬코미탄스를 측정하는데 유용한 진단 시험 키트.
23. (a) 미생물 액티노바실러스 아세토마이세템코미탄스(Actinobacillus acetomycetemcomitans)의 세가지 항원형 각각의 적어도 한 항원과 면역학적 복합물을 형성하는데 유용한 폴리클로날 항체 조성물(이 조성물은 본질적으로 상기 미생물의 항원형 A에 대한 제1폴리클로날 항체와 상기 미생물의 항원형 B에 대한 제2폴리클로날 항체로 구성된다), 및 (b) 미생물 액티노바실러스 아세토마이세템코미탄스의 상기 제1및 제2폴리클로날 항체, 또는 세가지 항원형 모두에 대한 탐지가능하게 표지된 항체를 포함하는 액티노바실러스 아세토마이세템코미탄스를 결정하는데 유용한 진단 시험 키트.
24. 제23항에 있어서, 상기 폴리클로날 항체 조성물이 완충된 용액으로 공급되는 시험 키트.

Images