KR920009424B1 - 표면상에 하이드록시기를 갖는 막을 사용한 클래미디아(chlamydia) 항원의 검출 방법 및 진단 시험 키트 - Google Patents

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Description

표면상에 하이드록시기를 갖는 막을 사용한 클래미디아(chlamydia) 항원의 검출 방법 및 진단 시험 키트

제1도는 계면활성제-피복 또는 순수한 비개질 나이론막을 사용하는 분석법과 본 발명의 분석법을 비교하여, 그 감도 및 백그라운드(background)에 있어서의 차이를 나타내는 막대 그래프도이다.

제2도는 실시예 3에 기재된 분석법으로 실온 보관한 경우에 있어서의 차이를 나타내는 막대 그래프도이다.

제3도는 실시예 3의 비교분석법으로 백그라운드에 대한 고온 보관의 영향을 도시하는 막대 그래프도이다.

제4도는 실시예 4의 분석법에서 사용된 시약들에 대한 고온 보관의 영향을 도시하는 막대 그래프도이다.

본 발명은 클래미디아(chlamydia) 유기체의 검출을 위한 진단 시험 키트 및 방법에 관한 것이다. 더욱 상세히는, 본 발명은 표면상에 하이드록시기를 갖는 폴리아미드 미세다공성 막(microporous membrane)을 이용하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

근년들어, 감염증의 존재를 검사함에 있어서 면역분석법이 이용되어 왔다. 이 분석법이 유용한 것이 되기 위해서는 특정한 유기체를 높은 신뢰도로 검출할 수 있어야 한다. 대부분의 경우에 있어서, 이것은 그 유기체에 고유한 항원과 상응하는 항체의 분리 및 반응을 필요로 한다. 이 시험이 상업적으로 성공적인 것이 되도록 하기 위해서는, 이것은 또한, 비교적 저렴하고, 장기가 보전가능하며, 사용이 간단하고 신속할 필요가 있다.

면역분석법으로 검출될 수 있는 이러한 유기체중의 하나는, 클래미디알레목 (Chlamydiales), 클래미디아쎄과(Chlamydiaceae), 클래미디아속(Chlamydia)의 두가지의 미생물 종중의 하나인 클래미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)(이하 C. 트라코마티스로 기재)이다. 과립성 결막염, 봉입체성 결막염, 성병성 임파육아종, 비임균성 요도염 및 직장 항문염을 포함하는 수 많은, 사람의 안(ocular) 질환 및 생식기 질환을 야기하는 이 종에 관한 15 또는 그 이상의 혈청형(serotype)이 있다. C. 트라코마티스에 의한 감염은 비임균성 요도염에 대해서만 매년 수백만의 사례가 있는 것으로 믿어질 정도로 일반 대중에 만연되어 있다.

이들 질병들의 만연성으로 인하여, 클래미디아 유기체들에 대한, 신속하고 간단하며 신뢰할 수 있는 검출시험법에 상당한 관심이 집중되고 있다. 고상 지지체를 사용하여 수행되는 C. 트라코마티스에 대한 분석법이 미합중국 특허 제4,497,899호에 기재되어 있다. 기재된 분석법은 이 유기체로부터 항원을 추출하고, 이것을 맨 상태의 고상 지지체상에 피복시켜 수행된다. 이어서, 이 피복된 항원은 하나 또는 두 종류의 항체중 어느 것인가에 의하여 검출되며, 상기의 두 종류의 항체중 하나는 적절히 표지(label)된다. 이 분석법의 비판적인 특징은, 어떠한 물질로도 처리되지 않거나 또는 피복되지 않은, 부착용 고상 지지체가 사용된다는 점일 것이다. 항원의 부착은, 항원이 지지체상에 흡착되기에 충분히 긴 시간동안 피복된 지지체를 인큐베이션(incubation)하는 것에 의하여 의견상 달성된다. 미합중국 특허 제4,497,899호에 기재된 전체적인 분석법을 수행하기 위하여는 적어도 3시간 이상이 소요된다.

높은 신뢰도를 갖으며 실온에서 수행가능한, 클래미디아 유기체에 대한 훨씬 더 신속한 시험법이, 1989년 9월 19일자로 출원된 유럽 특허 출원 번호 89310008.1호에 기재되어 있으며 특허 청구되어 있다. 본 발명자들의 연구 동료들은, 이온적으로 하전된(명확하게는 양이온적으로) 지지체가 클래미디아의 항원을 끌어당기며, 이 항원을 신속하고 민감하게 검출할 수 있다는 것을 발견하였다.

더욱 개선된 방법이 1989년 9월 29일자에 출원된 유럽 특허 출원 번호 89309943.2호에 기재되어 있으며, 이는 클래미디아의 분석법에 있어서의 계면활성제 -피복 비하전(uncharged)막의 사용을 기술하고 있다. 이 발명은, 다량의 전혈, 점액 또는 그 구성 성분들을 함유하는 생물학적 표본내의 항원을 신속하고 민감하게 검출할 수 있게 하고 있다.

클래미디아 분석에 대한 시장거래의 큰 부분은, 시험 키트를 냉장시키기 위한 용적이 제한되어 있는 개인 병원을 목표로 하고 있다. 따라서, 상기한 발명들이 해당 기술 분야에 있어서의 중요한 진전을 이루고 있다 할지라도, 사용전에 내장시키는 일없이 장기간 보관 가능하면서도 분석에 있어서의 감도 및 낮은 바탕을 유지할 수 있는 시약 및 시험 키트에 대한 필요성이 또한 존재하고 있다.

클래미디아 시험 키트인 Surecell^TM로 코닥에 의해서 시판되고 있는 현재의 제품은 시장에서 대단히 긍정적으로 수용되어 왔다. 이것은 계면활성제-피복 Biodyne^TM폴리아미드막을 포함하는 일회용 시험 장치를 이용한다. 이것은, 그 키트내의 시약을 장기간 보관 유지함에 있어서 및, 분석시에 백그라운드를 낮게 유지시킴에 있어서 대단히 바람직하다. 이것은 포괄적으로 냉장시킬 필요없이 달성될 필요가 있다.

위에서 언급된 필요한 개선은, A. 클래미디아 유기체를 함유하고 있을 것으로 예상되는 표본으로부터 추출된 클래미디아 항원을, 이 추출된 항원이 막에 결합되기에 충분한 시간동안, 1-10μm의 평균 포어(pore) 크기를 갖는 폴리아미드 미세 다공성 여과막과 접촉시키고, B. 막상에 면역학적 복합체를 형성시키기 위하여, 막에 결합된 클래미디아 항원을 클래미디아 항체와 접촉시키며, C. 표본내의 클래미디아 유기체의 존재에 대한 척도로서 막상의 복합체의 존재를 검출하는 것으로 구성되는, 클래미디아 항원의 검출 방법에 의하여 제공되며, 이 방법은, 상기의 막이 그 표면상에 다수의 하이드록시기를 갖고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, a) 1-10μm의 평균 포어 크기를 갖는 폴리아미드 미세다공정 여과막과, b) 클래미디아 항원에 대한 항체를 포함하는 시약 조성물로 구성되는, 클래미디아 항원의 검출에 유용한 진단 시험 키트를 제공하며, 이 키트는, 상기의 막이 그 표면상에 다수의 하이드록시기를 갖고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 분석법은, 사용하기에 간단하고, 신속하며, 신뢰성이 있다. 일반적으로, 이 분석법은, 원한다면 실온에서 25분 미만으로 수행될 수 있다. 이 분석법은, 추출된 클래미디아 항원, 특히, 클래미디아 트라코마티스로부터 추출된 리포다당체 (lipopolysaccharide) 항원의 검출에 대한 신뢰성이 높다. 이들 장점은, 유럽 특허 출원 번호 89309943.2호에 기재되어 있는, 특허 청구된 발명으로도 또한 달성될 수 있다.

그러나, 본 발명은, 장기간의 보관후에 있어서도 높은 감도 및 낮은 백그라운드를 유지하는 분석법 및 진단 시험 키트를 제공하므로, 추가적인 장점들을 갖고 있다. 이 분석법을 유럽 특허 출원 번호 89309943.2호의 계면활성제-피복 비이온성 막과는 대조적으로, 표면상에 다수의 하이드록시기를 갖고 있는 미세 다공성 폴리아미드막을 사용하여 수행되기 때문에, 상기한 바와 같은 장점들을 갖고 있다.

본 발명은, 어떤 적절한 의료 또는 진단 기술을 사용하여 환자로부터 얻어진 생물학적 표본내의 C. 트라코마티스(또는, 다른 종류의 클래미디아 종들)의 존재를 검출하기 위한 방법으로 구성된다. 이러한 표본들로서는, 예를 들면 환자의 자궁경부, 요도, 인후 또는 항문으로부터 얻어진 약솜(swab)표본 및, 관절 활액 또는 병소로부터의 액체와 같은 체액을 들 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 생물학적 표본들은, 검출하고자 하는 클래미디아 항원을 포함하는 세균 유기체들(또는, 그 혼합물)을 함유하는 것으로 예상된다. 이 표본들은, 특히, 전혈이나 점액을 포함하기 쉬우며, 때때로는 양자 모두를 다량으로 포함하기도 한다.

이 분석법은 원상태 그대로의 클래미디아 유기체로부터의 항원을 검출하도록 수행될 수도 있으나, 통상적으로, 분석 감도를 증대시키기 위하여 유기체로부터 항원을 추출하는 것이 바람직하다. 항원을 방출하도록 유기체를 용균(lysis)시키기 위하여 사용될 수 있는 표준적인 기법들로서는, 예를 들면, 용매 희석 또는 그 pH 용균 용해, 효소 처리 및, 초음파 처리나 원심분리와 같은 교반법을 들 수 있다. 유럽 특허 공개 번호 0 183 383호에는 용균기법으로서 가열하는 것이 기재되어 있다. 미합중국 특허 제4,497,899호, 미합중국 특허 제4,497,900호 및 미합중국 특허 제4,663,291호에는, 소디움 도데실 설페이트나 데옥시크레이트와 같은 음이온성 계면활성제 또는 염들의 사용이 기재되어 있다.

바람직한 일 구체예에 있어서, 본 발명은, 예를 들면, 유럽 특허 공개 번호 0193431호에 기재되어 있는 바와 같은, 클래미디아 리포다당체(글리코리피드기)항원을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 추출 방법도 또한, 상기에 기재되어 있다. 다른 일 구체예에 있어서는, 검출되는 항원은 결합된 외막 단백질 전체의 60%를 구성하는 클래미디아의 주 외막(major outer membrane) 단백질일 수 있다. 이 항원 및 추출 방법은 미합중국 특허 제4,427,782호에 기재되어 있다. 몇몇 경우에 있어서, 이들 클래미디아 항원들의 혼합물이 본 발명을 사용하여 검출될 것이다.

바람직한 추출 조성물을 실시예와 관련하여 이하에 상세히 설명한다. 이 조성물의 주된 특징은 알콜아민 또는 그 염의 존재 및 그 높은 pH이다.

부가하면, 전혈 및 점액을 분해시키기 위하여, 추출 방법에 있어서 프로테아제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 유용한 프로테아제를 실시예와 관련하여 이하에 기재한다.

일단, 항원이 유기체로부터 추출되면, 비록 필수적인 것은 아니지만, 그 이상의 처리를 수행하기에 앞서서, 세포파편, 입자화된 물질 및 다른 종류의 원하지 않는 물질들을 제거하기 위하여 예비 여과하는 것이 바람직하다. 예비 여과는 임의의 유형의 필터를 갖는 적절한 용기내에서 수행될 수 있다.

추출은, 항원의 추출을 위하여 특별히 설계된 장치를 포함한, 임의의 적절한 용기내에서 수행될 수 있다. 이러한 유용한 장치는 해당기술분야에 공지되어 있으며, 미합중국 특허 제4,746,614호에 기재되어 있는 장치를 들 수 있다.

추출된 항원은, 1-10μm, 바람직하게는 5μm의 평균 포어 크기를 갖는 중합체의 미세 다공성막과 접촉된다. 이 막은 폴리아미드, 즉 중합체 골격내에 반복되는 아미드기를 갖는 긴 사슬의 합성 중합체로부터 제조된다. 이것들은 일반적으로, 디아민과 디카복실산의 공중합체, 또는 아미노산의 락탐으로 된 호모중합체이다. 전형적인 물질들로서는, 제한적인 것은 아니지만, 폴리헥사메틸렌 도데칸디아미드(나일론 612), 폴리헥사메틸렌 아디프아미드(나일론 66), 폴리-ε-카프롤락탐(나일론 6), 폴리헥사메틸렌 세박아미드(나일론 610) 및 폴리-7-아미도헵타노아미드(나일론 7), 그리고 그 혼합물들을 들 수 있다.

이 막 물질들은, 그 표면상에 다수의 하이드록시기를 제공하기 위하여, 몇가지의 방법으로 개질되었다. 표면상의 이러한 기들의 수는 제한적이지는 않지만, 분석에 있어서의 백그라운드를 낮게 유지시키고, 시험키트중의 시약 보존성을 개선시키기 위해서는 충분한 수의 이러한 기들이 존재하여야만 한다. 이러한 기들이 존재하지 않는 막과는 대조적으로 하이드록시기 함유막에 의해서 제공되는 개선에 대한 이유는 명확하지 않다.

일 구체예에 있어서는, 중합체 막이, 늘어진 하이드록시기를 제공하도록 막 형성의 전 또는 후에 화학적으로 개질될 수 있는 물질로 구성된다. 그러나, 바람직하게는, 폴리아미드가 하이드록시기를 제공하는 제2의 중합체 물질로 처리 또는 개질되는 것이다. 이러한 제2의 중합체 물질은 폴리아미드막이 형성된 후 또는 그와 동시에 제공될 수 있다. 이것은 폴리아미드에 공유결합적으로 결합, 또는 어떤 다른 적절한 방식으로 부착될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제2의 중합체는, 단량체중의 적어도 하나가 하이드록시기를 제공하는, 중합가능한 단량체들로 구성된다. 이러한 많은 단량체들이 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 2-하이드록시 아크릴레이트, 1-하이드록시-2-(5-아크릴옥시-3-옥사펜틸)-나프타아미드, 2-(1-하이드록시-2-나프토일아미노에틸)-아크릴아미드, 2-(2-하이드록시-4-m 및 p-비닐벤질옥시페닐)벤조트리아졸, N-하이드록시메틸디아세톤 아크릴아미드, m 및 p-하이드록시메틸스티렌, N-(m-하이드록시페닐)메타크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드, N-메틸롤 아크릴아미드, N,N-디메틸-N-(2-하이드록시프로필)아미노 메타크릴아미드, 1-글리세릴 메타크릴아미드, 1,1-디하이드록시메틸-2-하이드록시에틸 아크릴아미드 및 2-(3,5-디하이드록시벤질옥시에틸)에틸 메타크릴레이트를 들 수 있다.

하이드록시 함유 단량체들은 표준적인 기법들을 사용하여 호모 중합체를 형성하도록 중합될 수 있으며, 또는, 결과로서 얻어지는 공중합체가 하이드록시기에 대한 해로운 영향을 미치지 않는 한, 스티렌이나 그 유도체, 아크릴 및 메타크릴산 에스테르, 아크릴아미드, 메타크릴아미드 및 어떠한 비닐 부가 공단량체와 같은 한 종류 또는 그 이상의 공단량체들과 유사하게 공중합될 수 있다.

표면상에 하이드록시기를 갖는 막에 대한 예 및 이러한 막의 제조에 관한 상세한 가르침이 유럽 특허 공개 번호 0 173 500에 제공되어 있다.

필수적인 다공성 및 표면상의 하이드록시기를 갖는 특히 유용한 미세 다공성 막은 Loprodyne^TM미세 다공성 막이다.

이 막은, 중합체 입자들과 같은 입자화된 물질들이 실질적으로 제거되어 있으며, 예를 들면, 유럽 특허 공개 번호 0 264 036호에 기재된 바와 같이, 항원의 포획에 유용할 수 있다.

본 발명을 실시함에 있어서, 막은 예를 들면, 유럽 특허 출원번호 제89309943.2호(위에서 언급)에 기재되어 있는 바와 같이, 적절한 비이온성 계면활성제로 더욱 피복 처리될 수 있지만, 이러한 계면활성제로 피복시키지 않는 것이 바람직하다.

여기에 기재된 막은, 분석을 수행하기 위한 다른 비품(병, 시험관, 약솜, 비이커 또는 컵)과 조합하여 사용될 수 있다. 선택적으로 및 바람직하게는, 상기 비품이, 분석이 수행될 수 있으며 모든 유체들이 수용되는 일회용 시험 장치내로 끼워 맞춰지는 것이다. 시험 장치의 유용한 배치는 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 미합중국 특허 제3,825,410호, 미합중국 특허 제3,888,629호, 미합중국 특허 제3,970,429호 및 미합중국 특허 제4,446,232호를 들 수 있다. 특히 유용한 장치는, 미합중국 특허 제4,833,087호 및 유럽 특허 공개 번호 0 308 231호에 기재되어 있으며 특허 청구되어 있다.

접촉은, 항원이 막에 직접적으로 결합되기에 충분한 시간동안 수행된다. 일반적으로, 피복된 막에 대하여 항원을 접촉시킨 후 거의 즉각적으로 항원이 막에 결합된다. 항원은, 분석에 있어서 사용되는 시약이나 시험표본중에 존재할 수도 있는 다른 종류의 단백질, 세포 구성성분들, 전혈이나 점액, 또는 다른 파편들과는 대조적으로, 막에 우선적으로 결합된다.

일반적으로 접촉 후 10분 이내, 바람직하게는 접촉후 1-5분내에, 지지체상에 결합되는 면역학적 복합체를 형성하도록, 결합된 항원은 클래미디아 항체를 포함하는 반응성 조성물과 접촉된다. 동시에, 유체 및 미결합 물질들은 신속히 제거된다. 일회용 시험 장치를 사용하여 분석이 수행되는 경우에는, 표본내의 유체 및 미결합 물질들(전혈 및 점액 성분들과 같은)은, 항원이 막에 결합되는 시간 동안에 막을 통하여 흘러나가 적당한 격실내에 모아지도록 한다.

이 분석법에서 사용되는 항체는 한 종류 또는 그 이상의 클래미디아의 혈청형(어떠한 유기체가 관심의 대상인가에 따라 결정)에 대하여 특이적인 면역반응성이 있다. 이것은 다클론성 또는 단일 클론성일 수 있다. 다클론성인 경우에는, 이것은 상업적으로 입수가능하며, 또는, 검출하고자 하는 유기체에 관한 균주에 대하여 통상적인 항원을 적용시키는 공지의 기법을 사용하여 각종 동물내에서 제조된다. 단일 항체 또는 그 혼합물이 사용될 수 있다. 예를 들면, 클래미디아의 리포다당체 또는 주 외막 단백질 항체 중 어느 것인가에 대한 항체, 또는 양자의 항원 모두에 대한 항체들이 분석에 있어서 사용될 수 있다. 바람직하게는 항체가 상업적으로 입수가능한 단일 클론성 항체이거나, 또는 표준적인 하이브리도마 기법을 사용하여 제조되는 단일 클론성 항체인 것이다. 항체들을 제조하기 위한 유용한 방법은, 예를 들면, 유럽 특허 공개 번호 0 193 431호 및 미합중국 특허 번호 제4,427,782호에 기재되어 있다.

일 구체예에 있어서는, 항원에 대한 항체가 검출을 위하여 표지된다. 유용한 표지는 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 적절한 방법 및 장치를 사용하여 직접적으로 검출가능한 화학적 또는 생물학적 화합물들 뿐만 아니라, 검출가능한 화학종들을 제공하도록 그 이상의 화학적 또는 특이적 결합 반응들을 통하여 검출될 수 있는 화합물들을 들 수 있다. 유용한 표지의 예로서는, 방사성 동위원소들, 효소류, 형광성 잔기류, 화학적 발광성 잔기류, 인광성 잔기류, 바이오틴(biotin) 또는 그 유도체류, 아비딘 또는 그 유도체류, 페리틴, 자성화될 수 있는 입자류, 염색된 입자류, 금의 졸, 염료졸류, 채색된 스타필로코카스 오레우스(staphylococcus aureus) 세포 및 해당분야에 숙련자에 있어서 용이하게 명백한 다른 것들을 들 수 있다. 방사성 동위원소류나 효소류가 바람직한 표지이다. 이 표지는 공지의 기법을 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 표지가 직접적으로 검출될 수 없는 경우에는, 검출가능한 반응 생성물 또는 특이적 결합생성물을 제공하도록 그 이상의 시약들 또는 화합물들이 필요하다. 예를 들면, 표지가 바이오틴인 경우에는, 검출가능한 화학종을 제공하도록 효소와 접합(conjugate)되는 아비딘과 반응시킬 수 있다. 표지가 글루코오스 옥시다제, 우레아제, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 및 그외의 다른 것들과 같은 효소인 경우에는 발색(dye-providing) 조성물중의 기질이 또한 필요하다.

특히 바람직한 일 구체예에 있어서는 표시가 퍼옥시다제이며, 분석에 있어서의 어떤 시점에서, 과산화수소 및 적절한 발색조성물이 검출 가능한 색조를 제공하도록 첨가된다. 예를 들면, 유용한 발색 시약들로서는 트리아릴아미다졸 류코 염료(leuco dye)(미합중국 특허 제4,089,747호에 기재되어 있는 바와 같은)와 같은 류코염료, 또는 퍼옥시다제와 과산화수소의 존재하에 발색되도록 반응하는 다른 종류의 화합물들(즉, 퍼옥시다제의 촉매 작용에 따라 발색되도록 반응하는 화합물들)을 들 수 있다.

바람직한 일 구체예에 있어서는, 클래미디아 항체가 표시되지 않으며, 막에 결합되는 형성된 항체-항원 복합체의 검출이, 표지되지 않은 항체에 특이적이며 적절히 표지된 제2의 항체를 사용하여 달성된다.

이러한 클래미디아 항체는, 지지체에 대한 비특이적 상호작용을 감소시키는 한 종류 또는 그 이상의 단백질로 더욱 구성되는 시약 조성물(봉쇄(blocking) 조성물로서 또한 공지되어 있는)내에 제공될 수 있다. 유용한 단백질들은 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 카제인, α-카제인, 송치(fetal bovine) 혈청 및 돼지의 감마 글로불린을 들 수 있다. 특히 유용한 시약 조성물은, 이하의 실시예와 관련하여 설명하는 바와 같은, 단백질 및 양성의 계면활성제로 구성된다.

일단, 결합된 항체가 클래미디아 항체와 접촉되면, 결합된 면역학적 복합체가 막 상에 형성된다. 이 복합체의 형성을 촉진시키기 위해서, 이 항체와 항원은, 일반적으로, 15-30℃의 온도에서 10분이하 동안 인큐베이션된다. 바람직하게는, 18-25℃(즉, 실온)에서 1-5분간 인큐베이션하는 것이다.

인큐베이션후 및 일반적으로 항체-항원 접촉후 10분 이내에, 일반적으로 7-12의 pH를 갖는 세정 용액으로 결합된 복합체를 일회 또는 그 이상 세정한다. 이 용액은 결합된 복합체로부터 결합되지 않은 물질들의 분리를 돕기 위하여 한 종류 또는 그 이상의 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하다. 특히 유용한 계면활성제는, 이하의 실시예에 관련하여 기재되는 바와 같은 양이온성 계면활성제이다.

클래미디아 항체가 표지되는 경우의 상기한 구체예에 있어서, 세정후의 분석절차는 적절한 시약의 첨가 후에 직접적 또는 간접적으로 표지를 검출해야 한다. 이것은 결합된 복합체를 세정한 후 비교적 신속하게, 즉, 일반적으로 10분 이내, 바람직하게는 1-5분 이내에 수행한다. 원한다면, 표지 검출은 시약들이 그 검출을 보증할 수 있다면, 인큐베이션하면서 급하게 행할 수 있다. 이어서, 표지는 표준적인 비품 및 절차를 사용하여 검출된다.

바람직한 구체예에 있어서, 클래미디아 항체는 표지되지 않으면, 결합된 복합체를 세정한 후, 표지되지 않은 항체를 통제하는 항체와 접촉된다. 이 제2의 항체(즉, 항-항체)는 상기한 표지들 중 어느 하나로 적절히 표지된다. 이 항체는 단일 클론성 또는 다클론성일 수 있으며, 시장에서 구입하거나 또는 공지의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 클래미디아의 분석에 있어서, 항-항체는 리포다당체나 주 외막 단백질 항체들의 어느 것인가에 대하여 반응성이 있는 다클론성 항체인 것이 바람직하다.

접촉후, 피복된 막에 결합되는 결과의 항원-항체-항체 복합체, 일반적으로 15-30℃의 온도에서 10분이하 동안, 바람직하게 18-25℃에서 1-5분간 인큐베이션된다.

복합체화되지 않은 물질들을 제거하기 위하여 그 이상의 세정이 수행되며, 적절한 효소 기질들 또는 다른 필요한 시약들이 검출 가능한 화학종들을 제공하도록 첨가된다. 결합된 항원-항체-표지된 항체 복합체는 이어서, 표준적인 방사 에너지 측정, 비색측정, 형광 또는 다른 종류의 검출기술을 사용하여 막상에서 검출된다.

본 발명의 진단 시험 키트는 여기에서 기재하는 막, 분석을 수행하기 위한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예를 들면, 이것을 클래미디아 항원에 대한 항체(표지되거나 또는 표지되지 않은)로 구성되는 시약 조성물을 포함한다. 이 키트내의 부가적인 선택적 물질들로서는, 세정용액, 발색 조성물, 표지된 항-항체조성물, 추출 조성물, 추출 장치, 약솜 또는 다른 표본 수집 수단, 일회용 시험 장치 및, 해당 기술분야의 숙련자에게는 공지인 다른 것들을 들 수 있다. 바람직하게는 이 키트가 일회용 시험 장치의 일부로서 제공되는 막을 포함하는 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 설명할 목적으로 제공되며, 본 발명의 영역을 제한하기 위한 것이 아니다. 모든 %는 달리 지적되지 않는 한 중량 %이다.

물질 :

이 분석법에서 사용된 Surecell^TM시험장치는 5μm의 미세다공성 여과막을 포함하였다. 본 발명의 분석법에 사용된 장치는 피복되지 않은 Loprodyne^TM막을 포함하였으며, 반면에 대조 분석(control assays)에 사용된 장치는 Biodyne^TMA막을 포함하였으며, 몇 개의 막은 Zonyl^TMFSN 비이온성 계면활성제로 피복되었고, 다른 것은 피복시키지 않고 사용하였다.

간섭(interferent)용액은, 전혈(25μl), 어린 돼지 뮤신(포스페이트 완충 식염수 용액 중의 125mg/ml의 20μl), HL 60 세포(5μl, 5×10⁷세포/ml의 포스페이트 완충 식염수 용액, pH 7.2)를 포함하였다. 총 부피는 50μl이었다.

사용된 예비필터는 10μm의 HDC필터였다.

미합중국 특허 제4,746,614호에 기재된 것과 같은 추출 장치를 사용하였다. 이것은 (1) 티메로살 보존제(0.01%)가 함유된 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충용액(20μl의 1.65몰 용액으로부터의 pH 11.1) 및, (2) 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충 용액(10밀리몰, pH 6), 소디움아지드(1.54 밀리몰), 에틸렌디아민 테트라아세트산(5.4밀리몰), 디메돈(21.4밀리몰) 및 폴리(아크릴아미드)(6.35%)의 용액(50μl)으로부터의 디티오쓰레이톨(0.188몰) 혼합액의, 2가지의 분리된 건조 피복제를 포함하였다.

추출 조성물은, 에탄올아민 하이드로클로라이드(0.47몰), 염화나트륨(0.27몰), 보존제(30밀리몰), 디소디움 에틸렌디아민 테트라아세트산(45밀리몰), Emcol^TMCC-36 양이온성 계면활성제(10% 메탄올 용액으로부터의 폴리프로폭시-t-아민 중의 0.45% 4차 염화암모늄 혼합물), 소디움 아지드(0.027몰) 및 수산화나트륨(0.06몰, pH 13)으로 구성되었다.

항원 제조 : 기본 소체(elementary body)로부터 정제된 혈청형 J항원을 사용하였다. 항원용액(2900ng 항원/μl를 함유하는 5μl)을 포스페이트 완충 식염수 용액(0.1mg/ml, pH 7.2) 중의 송아지 혈청 알부민으로 희석하여 500pg의 최종 용액을 얻었으며, 이것이 각각의 시험 웰에 통상적으로 첨가된 양이었다.

클래미디아의 리포다당체의 대한 쥐의 단일클론 항체는 표준적인 하이브리도마 기법의 쥐의 셀 라인을 사용하여 제조하였으며, 소디움 아지드(0.01%)를 함유하는 포스페이트 완충 식염수 용액(pH 7.2)중에 보관하였다. 항체 시약 조성물은 항체 용액 시료(19μl)를 저해(blocking)단백질로서의 카제인(0.5%)과 Lonzaine^TMC 양성계면활성제(0.01%)를 포함하는 포스페이트 완충 식염수 용액(1 : 800 희석)에 첨가하여 제조하였으며, 이어서, 0.22μm의 필터를 통하여 여과해서 작업용액을 얻었다.

사용된 표지 다클론 항체는 서양 고추냉이 퍼옥시다제에 염소의 항-쥐 IgG항체를 접합시킨 것이었다. 이 접합물(conjugate)을, 카제인(0.5%)과 Lonzaine^TMC 양성 계면활성제(0.01%)를 함유하는 포스페이트 완충 식염수 용액으로 1 : 1000으로 희석하였다.

프로테아제 용액은, 2-(N-모르폴리노)에탄 설폰산 완충용액(10밀리몰, pH 6), 염화나트륨(50밀리몰), 염화칼슘(5밀리몰), 1,2-프로판디올(10% w/v) 및 보존제(0.01%) 중에 Amideck^TM프로테아제(4mg/ml, 170단위/mg)를 함유하였다.

다른 용액은 과산화수소(물중의 12%), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(10μ몰) 및 보존제(0.01%)를 함유하였다.

세정 용액은 3-사이클로헥실아미노-2-하이드록시-1-프로판설폰산 완충용액(0.05몰, pH 10), Emcol^TMCC-9 양이온성 계면활성제(0.75%) 및 보존제(0.01%)로 구성되었다.

대조 시약 용액은, 포스페이트 완충 식염수 용액(pH 7.2)중의 크레아틴 키나제-MB 항체(5μg/ml), 카제인(0.5%), Lonzaine^TMC 양성 계면활성제(0.01%) 및 보존제(0.01%)로 만들어졌다.

발색 조성물은, 2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-4,5-비스(4-메톡시페닐)이미다졸 류코 염료(0.008%), 폴리(비닐 피롤리돈)(1%), 인산 나트륨(10밀리몰, pH 6.8), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(10μ몰), 4-하이드록시아세트아닐리드(2밀리몰) 및 과산화수소(10밀리몰)로 구성되었다.

[실시예 1]

각종 막 물질을 사용한 클래미디아의 리포다당체 항원에 대한 분석

이 실시예는, 종래의 기술에 의한 막을 포함하는 일회용 시험장치를 사용하는 C. 트라코마티스에 대한 분석법과 본 발명의 실시를 비교한다. 피복되지 않은 Biodyne^TMA막의 2가지의 다른 샘플 및 Loprodyne^TM의 2가지의 다른 샘플이 시험장치내에서 시험되었다.

프로테아제 용액(약 280μl)을 몇 개의 추출 장치에 첨가하였으며, 이어서, 각종 농도의 기본 소체 용액 샘플(25μl)를 가하거나, 또는 단지 포스페이트 완충 식염수 용액(25μl)을 함유하는 대조(control)를 가하였다. 혼합후, 이 장치를 실온에서 3분간 유지하였으며, 각각에 대하여 추출 조성물(280μl)을 가하고, 이어서, 실온에서 3분간 더욱 인큐베이션시켰다. 그 다음, 과산화수소 용액(280μl)을 가하고, 다시 3분간 인큐베이션을 계속하였다.

결과의 혼합액(웰당 160μl)을 추출장치로부터 제거하고, 필요한 막을 갖고 있는 Surecell^TM일회용 시험장치내로 예비 여과시켰다. 웰(well)에 첨가된 기본 소체의 최종 농도는 0(대조), 100,250 및 500pg였다.

웰을 2회 세정(각각 160μl)하였으며, 항-클래미디아 항체 조성물(80μl)은 샘플과 각 장치중 양성 대조웰에만 첨가하였고, 반면에, 항-크레아틴 키나제-MB 항체 조성물(80μl)은 각 장치중 음성 대조 웰에 첨가하였다. 실온에서 2분간 인큐베이션 한 후, 웰을 다시 2회 세정하였다. 그 다음, 퍼옥시다제-표지 항-항체 조성물(80μl)을 모든 웰에 첨가하고, 실온에서 5분간 인큐베이션시켰다.

각 웰을 2회 이상 세정한 후, 발색 조성물(80μl)을 모든 웰에 첨가하고 5분간 실온에서 인큐베이션시켰다.

막상에서의 류코 염료, 과산화수소 및 퍼옥시다제의 반응으로부터 나타나는 색조는 육안으로 0-10의 등급(0은 색조 없음이며, 10은 최고의 농도이다)으로 정하였다. 그 결과는, 제1도에 그래프로 나타낸 바와 같이, 시험 장치중에서의 Loprodyne^TM막의 사용은 더욱 낮은 백그라운드(기본 소체의 ＂0＂수준 참조)로 귀결되는 한편, 허용가능한 검출 한계 및 감도를 유지한다는 것을 나타내고 있다.

[실시예 2]

실온 보관 시험후의 분석에 있어서의 각종 막에 대한 영향

이 실시예는, 시험 키트를 실온에서 10주간 보관한 후에, 실시예 1에서와 같이 분석을 수행하여 그 결과를 비교하며, 이 보관기간은 종래의 기술에 의한 제품에 대한 통상적인 보관 한계의 약 2배이다

이 분석법은 단지 하나의 농도의 기본 소체(500pg)로 수행하였으며, 샘플은 간섭(interferent)용액중에 포함시켰다. 제2도에 그래프로 도시된 결과는, Biodyne^TMA막을 사용한 분석법에 대해서는 백그라운드 수준(등급 4)이 허용될 수 없는 것이나, 본 발명의 분석법에 대해서는 허용가능한 것임을 나타낸다. 부언하면, 본 발명의 분석법은 새로운 시약들을 사용한 대조와 비교하여 감도에 있어서의 손실이 전혀 없음을 나타낸다.

[실시예 3]

시약들에 대한 수명촉진보관(Accelerated Keeping)후의 시험키트의 비교

이 실시예는, 14일간 다양한 온도에서 보관된 표지 항-항체를 사용하고, Zonyl^TMFSN 비이온성 계면활성제로 피복된 Biodyne^TMA막을 사용하여 수행한 분석법과 본 발명의 분석법을 비교한다.

분석은 0℃, 35℃ 및 42℃에서 14일간 보관된 포옥시다제-표지 염소 항-쥐 항체를 사용하여, 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 여기서, 42℃에서의 14일간 보관은 실온에서의 60일간 보관에 해당된다. 포스페이트의 완충 식염수 용액을 백그라운드 대조(background control)로서 사용하였으며, 모든 분석에 있어서의 기본 소체의 농도는 500pg이었다.

분석 결과를 제3도에 그래프로 도시한다. 이 결과는 Biodyne A막이 사용되는 경우, 항체 접합물이 고온에서 유지됨에 따라, 분석에 있어서의 백그라운드도 증대된다는 것을 나타낸다. 본 발명의 분석법은 42℃에 있어서 조차도 낮은 백그라운드를 나타낸다.

[실시예 4]

각종 시약들에 대한 수명 촉진 보관후의 각종 막들의 비교

이 비교는, 표시되지 않은 항-클래미디아 항체 및 항-크레아틴 키나제-MB 시약들은 42℃에서 7일간 보관한 것을 제외하고는, 실시예 3의 비교와 유사하다. 분석은, 백그라운드 대조를 위한 포스페이트 완충식염수 용액, 500pg의 기본소체 및 간섭용액을 사용하여 조작되었다.

제4도에 제공된 결과는 백그라운드가 Biodyne^TMA막의 두 시료를 사용한 분석법에 있어서는 허용될 수 없으나, Loprodyne^TM막을 사용한 분석법에 있어서는 대단히 바람직하다는 것을 나타낸다.

Claims (10)

1. A. 클래미디아(chlamydia) 유기체를 함유하고 있는 것으로 예상되는 표본으로부터 추출된 클래미디아 항원을, 이 추출된 항원이 막(membrane)에 결합되기에 충분한 시간동안 1-10μm의 평균 포어(pore) 크기를 갖는 상기의 폴리아미드 미세다공성 여과막과 접촉시키고, B. 막상의 면역학적 복합체를 형성시키기 위하여, 막에 결합된 클래미디아 항원을 클래미디아 항체와 접촉시키며, C. 표본내의 클래미디아 유기체의 존재에 대한 척도로서, 막상의 복합체의 존재를 검출하는 것으로 구성되는 클래미디아 항원의 검출 방법에 있어서, 막이 그 표면상에 다수의 하이드록시기를 갖고 있는 것을 특징으로 하는 검출방법.
2. 제1항에 있어서, 클래미디아 유기체로부터의 리포다당체를 검출하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 클래미디아 항체가 효소-표지(enzyme-label)되며, 복합체의 검출이 상기 효소에 대한 기질로 구성되는 발색(dye-providing) 조성물을 사용하여 이루어지는 검출방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 클래미디아 항체가 표지되지 않으며, 면역학적 복합체가 클래미디아 항체를 통제하는 효소-표지 항체를 사용하여 검출하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 25분 이내에 수행되는 검출방법.
6. a) 1-10μm의 평균 포어 크기를 갖는 폴리아미드 미세다공정 여과막과, b) 클래미디아 항원에 대한 항체를 포함하는 시약 조성물로 구성되는 클래미디아 항원의 검출에 유용한 진단 시험 키트에 있어서, 막이 그 표면상에 다수의 하이드록시기를 갖고 있는 것을 특징으로 하는 진단 시험 키트.
7. 제6항에 있어서, 막이 일회용 시험 장치의 일부로서 제공되는 진단 시험 키트.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 막이, 그 표면상에 하이드록시기를 부가하도록 처리되어진 폴리핵사메틸렌 아디프아미드로 구성되는 키트.
9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 막이, 적어도 하나 이상의 하이드록시기를 갖는 적어도 한 종류이상의 중합성 단량체로 제조되는 중합물로 처리되어진 폴리핵사메틸렌 아디프아미드로 구성되는 키트.
10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 막이 4-8μm의 평균 포어 크기를 갖는 키트.

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