JPH0748998B2 - 高ｐｈ抽出組成物ならびにクラミジア抗原の抽出および測定方法 - Google Patents

高ｐｈ抽出組成物ならびにクラミジア抗原の抽出および測定方法

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JPH0748998B2
JPH0748998B2 JP26036889A JP26036889A JPH0748998B2 JP H0748998 B2 JPH0748998 B2 JP H0748998B2 JP 26036889 A JP26036889 A JP 26036889A JP 26036889 A JP26036889 A JP 26036889A JP H0748998 B2 JPH0748998 B2 JP H0748998B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、抽出組成物およびクラミジア生菌体の測定
へのその使用に関する。詳細には、適当な抗原の抽出に
有用な組成物、その抗原の抽出方法および測定方法に関
する。
〔従来の技術〕 最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。
イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、クラミジアーレス（Chlamydiales）目、
クラミジアセエ（Chlamydiaceae）属の２つの菌種の１
つであるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia tracho
matis）（本明細書では、「C.トラコマチス」という）
である。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リンパ肉
芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数
のヒトの眼および性器の疾病の原因となるこの種に属す
る15以上の菌株が存在する。C.トラコマチスに由来する
感染症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋菌性
尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると信じ
られる。
ワクチンや各種の抗ウイルス剤による様々なウイルスの
抑制方法の増加にもかかわらず、単純ヘルペスウイルス
（HSV）のような生物体による感染には重大な課題が残
存している。HSVには２つの型が存在し、１型は人体の
口の周辺で主に感染を起こし、一方、２型は人体の性器
周辺で主に感染を起こす。皮膚感染とウイルス性脳障害
は、HSV感染由来の重大な疾病のうちのほんの２種にす
ぎない。
淋病は、ナイセリア（Neisseria）属、特にN.ゴノロエ
エ（N.gonorrhoeae）に属する細菌により惹起される性
器接触で一般に伝播される疾病である。この疾病は年に
数千の人間を疾病にかからせ、たとえ抗生物質がその蔓
延の抑制に役立っているとはいえ、いまだ世界の多くの
地域の流行期にある人々の間に存続している。この生菌
体の検出および処置の重要性は、十分に認識されてい
る。N.メニンギチジス（N.meningitidis）およびN.ラク
タミカ（N.lactamia）もまた医療上および診断上無視で
きない対象の種である。
これらの疾病の広く蔓延する性質のため、これらの原因
となる生物体の検出について迅速、簡便かつ信頼できる
試験を入手することに相当な興味が存在する。これらの
生物体から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い
出すべく相当な研究が行われてきた。
生物学的被験体中の前記生物体からの抗原の抽出は、正
確、迅速かつ感度のよいアッセイを提供する上で重要で
ある。抽出について、超音波、加熱または遠心による細
胞の物理的崩壊を含む多種多様な方法が使用されてき
た。化学的抽出組成物もまた開発されてきている。例え
ば、クラミジア生菌体のリポポリサッカライド抗原は、
フェノールと水の混合物を使用して抽出された。
エタノールアミンは、ヨーロッパ特許公開第183383号公
報に記載されるように８を下まわるpHで界面活性剤と組
み合わせ、そして高温（例えば、70〜110℃）に加熱し
てクラミジア抗原を抽出する目的で使用されていた。
高いpHの抽出はヨーロッパ特許公開第174106号公報に記
載されており、その公報では、被験体をpH6〜８にさら
し、次いでpH8〜12.5にさらした後中和している。この
高pH段階中にその被験体は５〜30分のインキュベーショ
ンにかけられ、その一定の時間は高温（100℃まで）で
ある。
〔発明が解決しようとする課題〕
高い信頼性を有しそして室温で実施することが可能なク
ラミジア抗原のためのより一層迅速な試験法を入手する
ことが望まれるだろう。このような試験法は、高温また
は長時間のインキュベーションを必要としない簡便、迅
速かつ効率的な抽出組成物に強く依存するであろう。
〔課題を解決するための手段〕
前記課題は、少なくともpH8を有しそして強塩基および
少なくとも1mg/mlの量で存在するアルコールアミンまた
はその塩を含んでなるクラミジア生菌体から抗原を抽出
するために有用な抽出組成物によって解決される。
この発明は、また、A.クラミジア生菌体を含むことが予
測される被験体を供給する工程、ならびに B.前記被験体を、検出する目的で、少なくともpH8を有
しそして強塩基および少なくとも1mg/mlの量で存在する
アルコールアミンまたはその塩を含んでなる抽出組成物
と接触させ、クラミジア抗原を抽出する工程、 を含んでなるクラミジア生菌体から抗原を抽出するため
の方法も提供する。またさらに、 A.前述の組成物で、クラミジア生菌体を含むことが予測
される被験体から、クラミジア抗原を抽出する工程、 B.前記抽出した抗原を、クラミジア抗体と接触させて免
疫複合体を形成する工程、ならびに C.被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとし
て、前記複合体の存在を測定する工程、 を含んでなる、クラミジア抗原の測定方法も提供する。
本発明は、標準的な医療および微生物学的方法を使用し
て患者から得られた生物学的被験体中のクラミジア生菌
体の存在を測定するための抽出組成物および抽出方法な
らびにその測定方法を含む。このような被験体として
は、例えば、患者の頸管、尿道、眼、咽喉または肛門か
ら得られる綿棒、および滑液または病巣由来の流体のよ
うな体液が挙げられる。こうして得られる生物学的被験
体は、測定されるべき抗原を含むクラミジア生菌体、淋
菌生菌体またはヘルペス生体を含むことが予測される。
当該技術分野の幾つかのアッセイは、細胞またはウイル
ス感染細胞をそのまま検出するようにも設計されてはい
るが、本発明の長所は、細菌細胞またはウイルスを効率
よく溶解して細胞質から完全に抗原を抽出し、比較的短
時間に感度のよいアッセイを提供することにある。抗原
は、感染した宿主細胞全体または試料中の網状体もしく
は基本小体のいずれかから抽出される。
本発明により一般に検出されるクラミジア抗原は、その
生菌体のリポポリサッカライド（糖脂質群）抗原または
主要外層膜蛋白である。ある態様では両抗原が同時に検
出される。しかしながら、好ましい態様では、リポポリ
サッカライドがC.トラコマチスを検出するのに最も興味
のある対象である。
この発明の抽出組成物は、いずれかの適当な緩衝剤、強
塩基またはそれらの混合物を使用して、少なくともpH
8、好ましくは少なくともpH9を有する。少なくともpH10
であることが最も好ましい。一般に、適切なpHは、組成
物中に適当量の強塩基または緩衝剤を含ませることによ
って提供される。本明細書で使用する「強塩基」の語
は、25℃で少なくとも８のpKaを有する化合物を意味す
る。好ましい強塩基は、25℃で少なくとも９のpKaを有
する。当業者には極めて明らかであろうが、利用可能な
塩基としては、水酸化アルカリ金属、水酸化アルカリ土
類金属および水酸化アンモニウム（例えば、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ア
ンモニウムおよび水酸化リチウム）、リン酸塩（例え
ば、リン酸三ナトリウムおよびリン酸三カリウム）、ト
リ（ヒドロキシメチル）アミノエタンおよび類似化合物
が挙げられる。組成物中の強塩基量は、塩基のpKaに応
じて変化し得るが、一般に１〜30mg/mlが有用であり、
そして２〜20mg/mlが好ましい。
抽出組成物は、さらにアルコールアミンまたはその塩を
１〜30mg/ml、好ましくは２〜30mg/mlの量で含む。有用
なアルコールアミンとしては、エタノールアミン、ジエ
タノールアミン、プロパノールアミン、トリエタノール
アミンおよびそれらの塩が挙げられる。その他について
は当業者に明らかであろう。
本発明の抽出組成物に、カチオン界面活性剤（特に、主
要外層膜蛋白の抽出の際に望ましい）、１種以上の還元
剤、過酸化水素活性を抑制する保恒剤、キレーティング
剤および消泡剤を含む他の添加剤が好ましくは含まれ
る。
好ましくは、少なくとも1mg/ml、好ましくは２〜10mg/m
lの１種以上の界面活性剤を加える。このような化合物
は電荷がポジティブである。また、全体の化合物の電荷
がポジティブである限り、各化合物がネガティブ電荷を
有していてもよい。ポジティブ電荷は、四級アンモニウ
ム塩、四級ホスホニウム塩、四級スルホニウム塩、四級
ピリジニウム塩または当該技術分野で既知の他のものに
よって付与することができる。
この発明の抽出組成物は、さらに、適当量の還元剤、例
えばジチオスレイトール、システインおよびβ−メルカ
プトエタノールを含めてもよい。ジチオスレイトールが
好ましい。この還元剤は、一般に少なくとも５ミリモル
濃度、好ましくは20〜50ミリモル濃度で存在する。
試験の被験体が全血または粘液を含む場合には、この発
明の抽出組成物は１種以上のプロテアーゼ（以下に記載
する）と共に好ましくは使用される。プロテアーゼは、
蛋白質のペプチド結合を加水分解してより小さなペプチ
ドを生成する一群の酵素である。それらは、多様な起源
から得ることができ、起源としては、細菌およびカビの
ような微生物、動物またはヒトの器官（例えば、膵臓）
植物（例えば、パパイア）ならびに当該技術分野で既知
の他のものが挙げられる。プロテアーゼは、また、遺伝
的に変異した微生物からも得ることができる。多くのプ
ロテアーゼが市販されている。
抽出は、クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス
生体を含有することが予測される生物学的被験体を供給
し、次いでこの発明の抽出組成物をそれと、アッセイの
ために前記細胞を溶解し抗原を抽出するのに十分な時間
適当な容器中で接触することによって行うことができ
る。一般に、抽出工程には10分未満かかるが、特定の被
験体ではより長時間要する場合もある。接触は、一般に
室温（すなわち、18〜25℃）で実施されるが、必要があ
れば40℃までの高温を使用することができる。しかしな
がら、従来技術で要求されるより高い温度は、この発明
を実施することによって避けることができる。被験体の
攪拌が好ましい場合もある。好ましくは、抽出の目的に
特別に設計された適当な抽出装置で抽出を行うことがで
きる。多数のこのような装置が、当該技術分野で知られ
ている。
適当なインキュベーション後、抽出された抗原を含有す
る溶液は、必要により、pH6〜８まで適当な酸を用いて
中和してもよい。また、内因性のペルオキシダーゼを除
去するために処理を行ってもよい。生物体から抗原が抽
出されると、必要により次の操作を行う前に、その溶液
を予備濾過して細胞残屑、微粒子物および不要物を除去
することが望ましい。予備濾過は、ある型のフィルター
を備えた適当な容器で行うことができる。
次に、抽出された抗原の存在を測定するために、濾過さ
れた被験体をいくつかある分析法のいずれかにかける。
この工程には、好ましくないかも知れないが、特定の場
合にだけ選択される可能性のある培養法、カウンター免
疫電気泳動法および血清試験が含まれる。
好ましくは、抽出された抗原は、１種以上の適当な抗体
と免疫学的にそれが反応するイムノアッセイを使用して
検出される。得られた免疫複合体は、適する放射線、比
色、蛍光または酵素標識試薬を使用して検出される。あ
る場合には、試薬は抗原に対する標識抗体であり、別の
場合には、抗原と反応する未標識抗体に向けられる標識
抗−抗体である。このようなイムノアッセイは、一般
に、塗布されているかまたは塗布されていないある型の
固体支持体上での検出可能な免疫複合体の形成、それに
続く適当な検出法を含む。別のアッセイは、免疫複合体
の少なくとも１種の反応体（例えば、抗体）が複合体形
成中に一緒に凝集するようなある型の標識または未標識
粒子に付着された場合、免疫複合体の凝集を伴う。
有用なアッセイの例としては、コンペティティブイムノ
アッセイまたはエンザイム・リンクト・イムノアブソー
ベント・アッセイ（ELISA）が挙げられる。これらのア
ッセイは、米国特許第4,427,782号明細書およびSchmeer
らにより、J.Clin.Microbiol.,15（５）,830〜834ペー
ジ（1982）に既述されている。使用されるクラミジア抗
体、淋菌抗体またはヘルペス抗体は、それらの生物体か
ら抽出される数種の抗原のどれかに向けることができ
る。ある態様では、抗体が単一抗原、例えば、C.トラコ
マチスのリポポリサッカライドに向けられる。もう一つ
の態様では、種々の抗体混合物が、種々の淋菌株から抽
出されるような数種の抗原に向けられる。
好ましいイムノアッセイは、複数の正荷電基を表面上に
有するポリマー固体支持体に抽出抗原を接触することに
より行われる。この支持体は、抽出抗原とイオン的に結
合し得る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの
天然または合成ポリマーから構築することができる。利
用可能なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリ
エステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレ
ンイミン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビ
ニルモノマーから製造される付加ポリマーならびに当該
技術分野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、
カチオン基としては、四級アンモニウム塩、四級ホスホ
ニウム塩、四級スルホニウム塩、四級ピリジニウム塩、
四級ピリミジニウム塩または四級イミダゾリウム塩が挙
げられ、四級アンモニウム塩が好ましいものである。
ポリマー支持体（塗布または未塗布）は、いずれかの適
当な形状、例えばビーズ、ゲル、フィルムまたは膜に成
形することができる。これらは、アッセイの性能を高め
るために界面活性剤を塗布してもよい。以下に記載する
ような微孔質膜が好ましい。
本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体がアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しうる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。利用可能な試験装置の構成は、当該技術
分野で知られている。特に有用な装置は、特開昭63−22
3563号公報（昭和63年９月19日公開）および特願昭63−
234692号明細書（昭和63年９月18日出願）に記載されて
いる。界面活性剤塗布またはイオン荷電支持体と抗原の
接触によりほとんど瞬間的に抗原は支持体に直接結合す
る。「直接」とは、支持体に付着している結合性生物学
的化合物（例えば、抗体）を介して結合されるものでな
いことを意味する。
従って、接触の10分以内、好ましくは１〜５分以内に結
合抗原は、適当な抗体（クラミジア抗原、淋菌抗原また
はヘルペス抗原のいずれかに向けられた）と接触され、
こうして支持体上に免疫複合体が形成される。アッセイ
が使い捨て装置を使用して実施される場合、その支持体
は、被験体中の流体および複合体化していない物質を通
過させ、膜に抗原が結合するような微孔質膜であっても
よい。
このアッセイで使用される抗体は、市販または既知法を
使用して調製されうるポリクロナルまたはモノクロナル
であることができる。
一の態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であり、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するさらなる化学的または特異的なバインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。有用な標識の例としては、放射性同位体、酵素、蛍
光化合物、化学発光化合物、リン光化合物、ビオチンま
たはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フェリチ
ン、磁性粒子、着色粒子および当業者に極めて明らかな
他の物質が挙げられる。放射性同位体または酵素が好ま
しい標識である。標識は、既知の方法を使用して抗体に
付着させることができる。標識が直接検出できない場合
には、検出できる反応または特異的バインディング生成
物を生ずる試薬または化合物がさらに必要である。例え
ば、標識がビオチンであるならば、それは酵素で接合さ
れたアビジンと反応して検出可能な種を提供することが
できる。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダー
ゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホス
ファターゼなどである場合には、基質および色素生成試
薬もまた必要である。
特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであ
り、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例え
ば、有用な色素生成試薬には、テトラメチルベンジジン
およびその誘導体、ならびにトリアリールイミダゾール
ロイコ染料（米国特許第4,089,747号明細書に記載され
るような）またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素の
存在下で反応して色素を提供する他の化合物（すなわ
ち、ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色素を
提供する化合物）のようなロイコ染料が含まれる。
最も好ましい態様では、クラミジア抗体、淋菌抗体また
はヘルペス抗体は標識されておらず、そして形成され支
持体に結合されている抗体−抗原複合体の検出は、それ
ぞれ前記クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペス抗体
に特異性を有し、かつ適当に標識されている第二の抗体
（以下に記載する）を使用して行われる。
抗原−抗体の複合体は、支持体上での非特異的相互作用
を減少させた阻止（blocking）蛋白質１種以上の存在下
で形成することができる。利用可能な蛋白質は周知であ
り、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎仔血清お
よびブタガンマ（γ）グロブリンを含む。特に有用な阻
止組成物は、非免疫蛋白質および両性界面活性剤を含ん
でなる。
支持体に結合した免疫複合状の形成を促進するには、一
般に、15〜30℃の温度で10分未満前記抗体と抗原がイン
キュベーションされる。好ましくは、インキュベーショ
ンは室温で５分未満である。
抗体−抗原の接触後10分以内に、結合した複合体は、一
般にpH7〜11の緩衝化洗浄溶液で１度以上洗浄される。
この洗浄溶液は、支持体上の複合体から複合体化してい
ない物質を分離するのに役立つ界面活性剤１種以上を含
めるのが好ましい。特に、有用な界面活性剤は、カチオ
ン界面活性剤である。好ましい洗浄溶液はカチオン界面
活性剤を含んでなる。
前述の態様で、クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペ
ス抗体が標識されている場合には、洗浄後のアッセイ手
順は、直接その標識の検出か、または適当な試薬添加後
の間接的な検出となる。検出は、結合複合体の洗浄後、
比較的速やかに行われる。場合により、標識の検出は、
試薬が許容するならばインキュベーションにより促進し
てもよい。次に標準的な装置および方法を使用して標識
が検出される。
好ましい態様では、クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘ
ルペス抗体は標識されておらず、そして結合複合体の洗
浄後にそれが、標識されていない抗体に向けられた抗体
と接触される。この第二の抗体（すなわち、抗−抗体）
は、前述した標識のいずれかにより適当に標識される。
この抗体は、市販または既知の方法を使用して調製され
るモノクロナルまたはポリクロナルであることができ
る。
この接触後、支持体に結合されている得られた抗原−抗
体−抗体複合体は、15〜30℃の温度で10分未満インキュ
ベーションされる。このインキュベーションは、室温で
５分未満が好ましい。
さらに洗浄を行って複合体化していない物質を除去し、
次いで適当な酵素基質または他の必要な試薬を添加して
検出可能な種を提供する。次に、この抗原−抗体−標識
抗体複合体は、標準的な放射線、比色、蛍光または他の
検出法を使用して支持体上で検出される。
〔実施例〕
以下の例は、本発明を具体的に説明する目的で提供する
ものであって、本発明の範囲を限定するものでない。
なお、本明細書で特定の名称に「TM」が付されている場
合には、その名称が商品名または商標名であることを意
味する。
抗原の調製 血液型亜型Ｈ抗原精製基本小体は、Indiana University
のW.J.Newhall教授から入手した。保存抗原溶液（５μ
l,3240ng抗原／μｌを含有）を、リン酸緩衝溶液（PB
S）（0.1mg/ml）中ウシ血清アルブミン溶液（50μｌ）
に加え−80℃に貯蔵して溶液Ａを得た。この溶液を解凍
し、超音波攪拌により混合し、次いで15μｌを攪拌しな
がらウシ血清アルブミン溶液（945μｌ）と混合して溶
液Ｂを得た（抗原濃度は、4.6×105pg/100μｌであ
る）。次に、溶液Ｂ（100μｌ）を、PBS（900μｌ）中
ウシ血清アルブミンと混合して、抗原濃度4.6×104pg/1
00μｌの溶液Ｃを得た。
抗体の調製 クラミジアリポポリサッカライド（LPS）抗原に対する
マウスモノクロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法お
よびマウス細胞系を使用して調製し、防腐剤としてアジ
ド0.01重量％を含有するPBS（pH7.4）溶液として貯蔵し
た。保護蛋白質としてカゼイン（0.5重量％）および両
性界面活性剤（0.01重量％）含有PBSに前記抗体溶液試
料（19μｌ）を添加することにより抗体溶液（1:800希
釈物）を調製し、次いで0.22μｍのフィルターで濾過し
て使用液を得た。
クラミジア主要外層膜蛋白（MOMP）に対するマウスモノ
クロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法およびマウス
細胞系を使用して調製し、アジド0.01重量％含有PBS（p
H7.4）の溶液として貯蔵した。阻止蛋白質としてカゼイ
ン（0.5重量％）およびLonzaineTMC両性界面活性剤（0.
01重量％）含有PBSに前記抗体溶液試料（14μｌ）を添
加することにより抗体溶液（1:1100希釈物）を調製し、
次いで0.22μｍのフィルターで濾過して使用液を得た。
使用された標識ポリクロナル抗体は、ワサビペルオキシ
ダーゼに接合させたヤギ抗マウスIgG抗体であった。こ
の接合体を、カゼイン（0.5重量％）およびLonzaineTMC
両性界面活性剤含有PBSで1:2000に希釈し、次いで0.22
μｍフィルターで濾過して使用液を得た。
例1:抽出組成物 抗原抽出溶液は、以下の成分から調製した。すなわち、
アジ化ナトリウム（0.027モル濃度）、塩化ナトリウム
（0.27モル濃度）、塩酸エタノールアミン（0.47モル濃
度）、エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム（0.045
モル濃度）、EmcolTMCC−36カチオン界面活性剤（10％
メタノール溶液由来のポリプロポキシ−ｔ−アミンの塩
化四級アンモニウムの0.45重量％）および水酸化ナトリ
ウム（0.66モル濃度、pH11） 例2:抽出組成物を使用するクラミジア・トラコマチス
（Chlamydia trachomatis）抗原の測定 この例は、C.トラコマチスのリポポリサッカライドおよ
び主要外層膜蛋白抗原の抽出に関する本発明の実施例を
示す。
基本小体蛋白質（ウシ血清アルブミン/PBS81.5μｌ中蛋
白質25,000pg）を、本発明の抽出組成物（1418.5μｌ）
に添加し、室温に持続しながら約５分間混合した。抗原
を含まない２種の対応する抽出溶液を調製した。
各抽出溶液に過酸化水素溶液（８重量％、1500μｌ）を
加えて、内因性カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびミ
エロペルオキシダーゼを除去した。得られた混合物を、
再び室温に５分間維持した。
各抽出溶液の一部（120μｌ）を、同時係属の米国特許
願第19,810号（前述）明細書に記載されるのと同様に設
計された使い捨て装置それぞれのウェルに加え、次いで
流体を排出した。この装置は、Pall BiodyneTM膜として
市販されている表面上に四級アンモニウム基を有する５
μｍの微孔質膜を備えている。使用前に、この膜はZony
lTMFSM（非イオンフッ化界面活性剤）で処理した。
流体を排出しながら、抗LPSおよび抗MOMP溶液それぞれ
の１部（120μｌ）、ならびに組み合わせた両抗体溶液
の１部（120μｌ）を前記装置の各ウェルに添加した。
室温で約５分間インキュベーションを行った。インキュ
ベーション後、得られた抗原−抗体複合体を、PBS（pH
7.2）中EmcolTMCC−９カチオン界面活性剤（0.75重量
％）溶液（160μｌ）で２度洗浄した。
ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス抗体溶液（12
0μｌ）を、各ウェルに添加しそして接触させながら膜
を通過させた。室温におけるインキュベーションを再び
５分間行い、膜にイオン結合した抗原−抗体−標識抗体
複合体を形成させた。
前述の洗浄溶液で２度洗浄後、色素生成組成物を各試験
ウェルに添加した。この組成物は、過酸化水素（10ミリ
モル濃度）、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェ
ニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾ
ールロイコ染料（0.005重量％）、ポリ（ビニルピロリ
ドン）（１重量％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド
（５ミリモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸
（10ミリモル濃度）を含めた。
約10分以内に被験体由来のクラミジア抗原の存在を示す
赤色色素が試験ウェル中に観察された。透過濃度を測定
し、その結果を抗原を含む抽出溶液と抗原を含まないも
のと差（ΔDT）として以下の第Ｉ表に示した。それら
は、この発明の抽出組成物がクラミジア生菌体から効率
的に両抗原を抽出し、特に主要外層膜蛋白抗原の抽出に
有効であることを示す。
第Ｉ表 抗原 抽出組成物についてのΔDT LPS単独 0.085 MOMP単独 0.179 LPS＋MOMP 0.165 例3:クラセミジア抗原抽出におけるpHの効果 血液型亜型Ｋ基本小体は、J.Hewhall教授（Indiana Uni
versity）から得、使用液は以下のように調製した。
前記溶液Ｂ（18μｌ）を、抽出溶液（1982μｌ）と混合
して5000pg抗原/120μｌを含有する試験溶液を調製し
た。
溶液Ｂ（９μｌ）を、抽出溶液（1991μｌ）と混合して
2500pg抗原/120μｌを含有する試験溶液を調製した。
溶液Ｃ（36μｌ）を、抽出溶液（1964μｌ）と混合して
1000pg抗原/120μｌを含有する試験溶液を調製した。
抗原を含まない抽出溶液（2000μｌ）含有の対照溶液も
調製した。
マウス抗LPSモノクロナル抗体組成物は、抗体溶液（10
μｌ）、カゼイン（0.5重量％）およびLonzaineTMC界面
活性剤（14.99μｌ中0.01重量％）を用いて調製した。
ワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスモノクロナル抗体
は、組成物（100μｌ）中にカゼイン（0.5重量％）およ
びLonzaineTMC界面活性剤（9.9μｌ中0.01重量％）を含
ませた。
血液型亜型Ｋ基本小体を、各種pH（9.5,10.25および11.
0）で抽出した。この抽出抗原を使用して例１に記載し
たようにアッセイを実施し、得られた透過濃度を以下の
第II表に示した。データは、アルコールアミンを使用す
るpH11における抽出が低いバックグランドを有する最高
の感度を提供することを示す。
例4:標識クラミジア抗体を使用するクラミジア抗原につ
いてのアッセイ この例は、標識クラミジア抗体を使用するC.トラコマチ
スについてのアッセイ例を示す。既知の方法（Yoshitak
e,Eur.J.Biochem.,101,395ページ、1979）で使用外層膜
蛋白に対する２種の抗体をワサビペルオキシダーゼに接
合させた。この接合体を、アッセイで使用するまでチメ
ロサール0.01重量％含有PBS（pH7.4）中に維持した。
血液型亜型Ｈ基本小体は、前述のようにして得た。抗原
溶液Ｂ（前記に同じ、24.5μｌ）を、室温で５分間例１
の抽出組成物（1475.5μｌ）と混合して抗原1.13×105p
gを含有する第１抽出溶液を得た（このものは、アッセ
イで試験試料120μｌ中約4500pgの最終抗原濃度をもた
らす）。第２抽出溶液は、第１抽出溶液の適当な希釈に
よって調製し、アッセイで試験試料120μｌ中1500pgの
最終抗原濃度をもたらす。
過酸化水素（８％溶液1.5ml）を、前記の各抗原抽出溶
液に添加して混合し、室温で５分間維持した。
次に、ZonylTMFSN界面活性剤（0.05重量％）を予め塗布
したBiodyneTMナイロン微孔質膜を備えた使い捨て試験
装置に前記各溶液（120μｌ）を加え、次いで膜を通し
て排液した。
ペルオキシダーゼ標識抗体は、以下のようにカゼインお
よびLonzaineTM両性界面活性剤の組み合わせ物（120μ
ｌ）が添加された。接合体１は、カゼイン1.25重量％お
よび界面活性剤0.025重量％が添加され、接合体２は、
カゼイン２重量％および界面活性剤0.04重量％が添加さ
れた。次に、室温で５分間インキュベーションした。
その後、PBS中EmcolTMCC−９カチオン界面活性剤溶液
（0.75重量％、160μｌ）で２度、膜を洗浄した。
ロイコ染料溶液（120μｌ）を各試験装置に添加し、次
いで室温で10分間インキュベーションをした後、色素濃
度を測定した。
試験された抗原を含まない対照溶液は、バックグランド
と同様な濃度を示した。
結果を、試験溶液と対照溶液との間の透過濃度差（Δ
DT）として次の第III表に示す。
〔発明の効果〕 この発明の抽出組成物は、生物学的被験体中のクラミジ
ア生菌体を迅速かつ効率よく溶解し、感度のよいアッセ
イについて十分な抗原を遊離する。溶解は、標準的な装
置を使用して、室温で一般に10分未満で、非常に迅速に
行うことができる。実施者に要求される熟練度は一般に
必要でなく、かつ高温抽出が避けられる。主要な興味の
対象はリポポリサッカライドにあるが、クラミジアアッ
セイではリポポリサッカライド抗原および主要外層膜蛋
白抗原の両者とも抽出される。
これらの利点は、高pHを有しそしてアルコールアミンま
たはその塩を少なくとも1mg/ml量含む抽出組成物の使用
によって達成される。この組成物のpHは最低８である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン チャールズ モーク アメリカ合衆国，ニューヨーク 14610, ロチェスター，クロイドン ロード 184 (72)発明者 アラン デビッド プロノボスト アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サン ディエゴ，サーモン リバー ロー ド 12864 (72)発明者 シェリル サンフォード サリバン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14468, ヒルトン ノース グリース ロード 343

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくともpH8を有しそして強塩基および
    少なくとも1mg/mlの量で存在するアルコールアミンまた
    はその塩を含んでなるクラミジア生菌体から抗原を抽出
    するために有用な抽出組成物。
  2. 【請求項２】A.クラミジア生菌体を含むことが予測され
    る被験体を供給する工程、ならびに B.前記被験体を、検出する目的で、少なくともpH8を有
    しそして強塩基および少なくとも1mg/mlの量で存在する
    アルコールアミンまたはその塩を含んでなる抽出組成物
    と接触させ、クラミジア抗原を抽出する工程、 を含んでなるクラミジア生菌体から抗原を抽出するため
    の方法。
  3. 【請求項３】A.少なくともpH8を有しそして強塩基およ
    び少なくとも1mg/mlの量で存在するアルコールアミンま
    たはその塩を含んでなる抽出組成物で、クラミジア生菌
    体を含むことが予測される被験体から、クラミジア抗原
    を抽出する工程、 B.前記抽出した抗原を、クラミジア抗体と接触させて免
    疫複合体を形成する工程、ならびに C.被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとし
    て、前記複合体の存在を測定する工程、 を含んでなる、クラミジア抗原の測定方法。
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