-
Die Erfindung betrifft biotechnologische Verfahren, bei denen die Herstellung von rekombinanten Proteinen mit Hilfe gentechnisch veränderter Mikroorganismen erfolgt und bei denen das Protein in einer gelösten Form in den Zellen bzw. im Zytosol vorhanden ist. Ein Hauptanwendungsgebiet der Erfindung ist die Gewinnung der Proteine aus Zellen von Escherichia coli-Zellen. Die Erfindung betrifft nicht den Fall, bei dem die Proteine in den Zellen in einer schwerlöslichen Form, z. B. in Form von Inclusion Bodies vorliegen.
-
Stand der Technik
-
Die rekombinante DNA-Technik gibt die Möglichkeit, eukaryotische Proteine höherer Organismen durch mikrobielle Fermentation herzustellen. Es werden hierzu keine tierischen Zellkulturen oder Gewebe benötigt. Auf diesem Weg gelingt es auch, Proteine in größeren Mengen als mit dem ursprünglichen Bildner herzustellen. Es können auf diesem Weg Proteine wie beispielsweise Enzyme, Wachstumsfaktoren, Hormone oder Interferone gewonnen werden.
-
In vielen Fällen wird das rekombinante Protein in den Zellen entweder in einer unlöslichen inaktiven Form als Inclusion Body akkumuliert oder es liegt in einer aktiven Form im Zytosol gelöst vor. Um die Proteine freizusetzen, müssen in beiden Fällen die Zellen aufgeschlossen und im Fall der Bildung von Inclusion Bodies müssen diese separiert werden. Mit Hilfe von denaturierenden Agentien wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid (
WO 83/04418 A1 ) wird das unlösliche Protein der Inclusion Bodies in lösliches und aktives Protein umgewandelt. Nach
AU 6687486 A wird zur Umwandlung des schwerlöslichen Proteins in die gelöste Form auch die Verwendung von kationischen Tensiden vorgeschlagen.
US 4 992 531 A schlägt darüber hinaus vor, den Zellaufschluss und die Denaturierung in einem Schritt durch Behandlung der mikrobiellen Zellen mit kationischen Tensiden vorzunehmen. Die Anwendung von kationischen Tensiden als auch die Behandlung mit anderen Denaturierungsagentien hat den großen Nachteil, dass von diesen Agentien sehr hohe Konzentrationen eingesetzt werden müssen. So werden in
US 4 992 531 A die Anwendungen von kationischen, anionischen oder amphiphilen Tensiden in Konzentrationen zwischen 2,5 % und 50,0 % (w/v) bzw. 25 g/l bis 500 g/l vorgeschlagen. Diese hohen Konzentrationen müssen jedoch in daran anschließenden kosten- und arbeitsintensiven Aufarbeitungsschritten wieder entfernt werden. Größere Verluste an Protein lassen sich dabei nicht vermeiden.
-
Bei der Gewinnung der im Zytosol gelösten Proteine wird durch (Mikro)Filtration, Zentrifugation oder Separation der Fermentationssuspension ein Zell- bzw. Biomassekonzentrat gewonnen. Das Konzentrat enthält neben den Zellen auch noch anhaftende Kulturlösung bzw. Reste der Waschlösung, wenn die Zellen nach ihrer Konzentrierung gewaschen wurden. Das Biomassekonzentrat weist in der Regel eine hohe Zellkonzentration auf und ist deshalb entsprechend viskos. Die Suspension muss aber auch noch fließfähig sein, damit sie im darauffolgenden Aufarbeitungsschritt durch die gewählte Zellaufschlussvorrichtung fließen kann. Der Zellaufschluss wird z. B. durch Drucküberlagerung in einem Homogenisator, oder durch Ultraschallbehandlung, mechanisches Zerreiben der Zellen oder enzymatische Lyseprozesse bewirkt. Nach dem Aufschließen liegt eine viskose Feststoffsuspension mit einem hohen Feststoffanteil vor. Der Flüssiganteil besteht vorwiegend aus dem Zytosol und Resten von Waschlösung oder Kulturlösung. Sie enthält neben dem zu gewinnenden Protein auch besonders unerwünschte lösliche Begleitstoffe wie polyanionische Verbindungen, darunter RNA und DNA sowie die bei pharmazeutischen Produkten besonders unerwünschten Pyrogene. Der Feststoffanteil besteht aus sehr leichten und kleinen Zellwand- und Membranpartikeln, Zellorganellen und aus mizellar angeordneten Strukturen. Durch Separation, Zentrifugation oder (Mikro-)Filtration sind die Feststoffe bei der Aufarbeitung besonders von größeren Volumina, wie sie bei Aufarbeitungen im Pilotmaßstab oder im technischen Maßstab vorkommen, praktisch nicht abtrennbar. Klassische Adsorptionsmethoden mit Kieselgelen, Tonmineralien, Phosphaten und Cellulosen führen nur zu einer partiellen Entfernung und sind darüber hinaus mit erheblichen Ausbeuteverlusten verbunden.
-
Ein Beispiel für ein rekombinantes Protein ist eine Hyaluronatlyase, welche durch einen gentechnisch veränderten Escherichia coli-Stamm gebildet wird. Hyaluronatlyase (EC 4.2.2.1) ist ein Enzym, welches Hyaluronsäure durch β-Eliminierung spaltet (Gase K, Ozegowski J, Malke H (1998) The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate lyase: completion of the sequence and expression analysis. BBA 1398, 86-98).
-
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von den Anwendungen kationischer Tenside im Fall des Vorliegens von sogenannten Inclusion Bodies. Bei diesen Anwendungen werden sehr hohe Tensidkonzentrationen (bis zu 500 g/l, wie in
US 4 992 531 A beschrieben) eingesetzt, damit die als Inclusion Bodies strukturierten Proteine alleine oder zusammen mit den Zellwänden durch die chaotrope Wirkung der hochkonzentrierten Tenside denaturiert bzw. löslich werden. Die nachfolgend notwendige Entfernung der in großem Überschuss angewendeten Tenside ist nur mit erheblichem Aufwand möglich.
-
Ziel
-
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, einen effektiven Reinigungs- bzw. Isolierungsschritt für solche rekombinanten Proteine aufzufinden, welche in der Biomasse in einer löslichen Form vorliegen. Die Reinigungsschritte sollen vor allem die Aufarbeitung größerer Volumina, wie sie bei halbtechnischen und technischen biotechnologischen Verfahren auftreten, anwendbar sein. Fremdstoffe sollen dabei nur in einer Art und Menge eingesetzt werden, welche die weitere Proteinreinigung nicht behindern.
-
Beschreibung
-
Es wurde überraschend gefunden, dass aus Suspensionen aufgeschlossener rekombinanter Mikroorganismen, insbesondere rekombinanter Escherichia coli-Zellen, bei Zugabe von quartären Tensiden sich ein leicht separierbarer Niederschlag bildet.
-
Die vorliegende Erfindung setzt deshalb kationische Tenside zur schonenden und nachhaltigen Durchführung eines Reinigungsschrittes ein, welcher bei den aus der Literatur bekannten Aufarbeitungen die Qualität und Quantität der Proteingewinnung auf dem wirtschaftlich bedeutenden Gebiet der halbtechnischen und technischen Produktion rekombinanter Proteine limitierte und zudem mit erheblichen Kostenaufwand verbunden war.
-
Erfindungsgemäß erfolgt die Entfernung der Feststoffe, insbesondere der Zelltrümmer und unerwünschter Begleitstoffe aus Suspensionen aufgeschlossener Biomassen rekombinanter Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli-Zellen, durch Zugabe eines oder mehrerer kationischer Tenside enthaltend quartäre Ammonium- und Pyridinium-Kationen bis zu Endkonzentrationen zwischen 0,5 g/l und 10 g/l. Die Tenside werden als wässrige und gegebenenfalls gepufferte Lösungen oder als Feststoff zugesetzt. Es werden zum Beispiel Cetyltrimethyl-, Cetylpyridinium-, Tetradecyltrimethylammonium und/oder Dodecyltrimethylammoniumkationen eingesetzt. Die so behandelte Feststoffsuspension wird anschließend durch Filtration oder Separation von den ausgefällten Bestandteilen befreit. Das gewonnene Klarfiltrat enthält die rekombinanten Proteine.
-
Der Niederschlag wird gegebenenfalls noch einmal mit einer bevorzugt gepufferten tensidfreien Lösung gewaschen. Die Waschlösung kann nach nochmaligem Abtrennen der Feststoffe mit der Hauptfraktion des Klarfiltrats vereinigt werden. Der pH-Wert der Lösungen des kationischen Tensids wird so gewählt, das der pH-Wert nach Zugabe im Bereich zwischen pH 6,0 und pH 8,6, bevorzugt pH 6,5 bis pH 7,5 liegt.
-
Erfindungsgemäß kann ein möglicherweise im Klarfiltrat vorhandener Anteil an überschüssigem Tensid in Form eines Polyelektrolytkomplexes ausgefällt werden, indem dem Filtrat eine möglichst kleine Menge einer wässrigen Lösung zugesetzt wird, die ein polyanionisches Polysaccharid, bevorzugt werden Alginsäure, Xanthan, Pektin oder Hyaluronsäure, enthält. Der entstandene Niederschlag, welcher das Tensid enthält, wird durch Separation entfernt.
-
Überraschend an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass ohne größere Verdünnung ein von Feststoffen freies Konzentrat des gewünschten Proteins erhalten wird. Es ist vorteilhaft, dass die Mengen an zugesetztem kationischem Tensid begrenzt und sie außerdem mit dem abgetrennten Niederschlag weitgehend vollständig wieder ausgefällt werden.
-
Darüber hinaus ist vorteilhaft, dass mit der erfindungsgemäßen Methode nicht nur feste Bestandteile und mizellare Strukturen sondern auch gelöste polyanionische Verbindungen wie Nukleinsäuren und Pyrogene ausgefällt werden.
-
Weiterhin ist es für die Reinigung vorteilhaft, dass weder der pH-Wert noch die Leitfähigkeit in den Lösungen verändert werden, so dass der Fällung und Separation ohne Dialyse weitere Reinigungsschritte wie Ionenaustauschchromatografie oder Affinitätschromatografie folgen können.
-
Erfindungsgemäß erfolgt die Entfernung der Feststoffe bzw. Zelltrümmer und unerwünschten Begleitstoffe aus der aufgeschlossenen Biomasse- bzw. Feststoffsuspension durch Zugabe und Untermischen einer gepufferten wässrigen Lösung des kationischen Tensids in einer Weise, dass eine Azidität zwischen pH 6,5 bis 8,6 erreicht wird. Die zugesetzten Mengen führen zu Tensid-Konzentrationen in den Feststoffsuspensionen zwischen 0,5 g/l und 10 g/l. Bei einer optischen Dichte der Zellsuspension vor dem Aufschluss von OD600 = 250 bis 350, welches einer Biomassekonzentration von bis zu etwa X = 60 g/l Trockengewicht entspricht, werden Endkonzentrationen von 4 g/l Tensid nicht überschritten. Der nach Zugabe und Untermischen entstandene feste Niederschlag wird nach etwa einstündigem Stehen unter Bildung des Klarfiltrates I mit einer großvolumigen, langsam laufenden technischen Zentrifuge bei 5000 U/min separiert. Zum Vergleich wurde eine Probe einer FeststoffSuspension in einer kleinvolumigen hochdrehenden Zentrifuge bei 25.000 U/min ohne Tensid-Behandlung klar zentrifugiert. Es entsteht ein Filtrat, welches nur noch eine leichte Trübung und Opaleszenz aufweist. Das erfindungsgemäß unter technischen Bedingungen behandelte Filtrat und das hochtourig behandelte besitzen praktisch keinen Aktivitätsunterschied.
-
Der Niederschlag kann noch einmal mit einer gegebenenfalls tensidhaltigen und gepufferten Lösung von pH 6,5 bis 8,6 gewaschen werden und die Waschlösung kann nach nochmaligem Abtrennen der Feststoffe mit der Fraktion I vereinigt werden.
-
Um zu erkennen, ob die zugesetzte Tensidkonzentration für ein vollständiges Ausfällen des Niederschlags ausreicht, kann ein orientierender Versuch in Form einer Konzentrationsreihe mit gestaffelten zugesetzten Tensidmengen durchgeführt werden. An Hand der nach Zentrifugieren erhaltenen Sedimenthöhe der einzelnen Proben in den Zentrifugenröhrchen kann beispielsweise die notwendige Endkonzentration geschätzt werden. Eine andere Prüfmöglichkeit ist der Nachweis nichtausgefällten Tensids im Klarfiltrat durch Zugabe eines polyanionischen Polysaccharids. Wenn eine Trübung entsteht, befindet sich nichtumgesetztes Tensid im Klarfiltrat. Entsprechend des Ergebnisses werden die Klarfiltrate behandelt.
-
Befindet sich zu viel Tensid im Klarfiltrat, wird der Überschuss erfindungsgemäß durch Zugabe einer Lösung enthaltend das polyanionische Polysaccharid, bevorzugt Alginsäure, ausgefällt.
-
Die Biomasse oder die Zellen des Wirtsorganismus, insbesondere Escherichia coli-Zellen, werden nach Kultivierung in einem Fermenter aus der Fermentationssuspension in bekannter Weise durch Zentrifugation, Mikrofiltration, Filtration oder Separation gewonnen. Es entsteht eine Biomassesuspension, welche entsprechend ihres Wassergehaltes eine mehr oder weniger viskose Konsistenz aufweist. Der Aufschluss der Zellen erfolgt durch die bekannten Methoden wie Behandlung mit Hochdruck, Ultraschall, mechanisches Zerreiben oder auch enzymatisch durch Versetzen mit Lysozymen in Anwesenheit von komplexbildenden und reduzierenden Substanzen. Es entsteht eine Feststoffsuspension. Diese wird erforderlichenfalls durch Zugabe eines Puffers soweit verdünnt, dass sie durch die Aufschlussapparatur fließen kann.
-
Ausführungsbeispiele
-
Die Durchführung des Verfahrens soll, ohne dass aber dadurch die Erfindung eingeengt werden soll, beispielhaft erläutert werden.
-
Ausführungsbeispiel 1
-
Der rekombinante Escherichia coli-Stamm TG1 (pHYB307), welcher ein rekombinantes Protein mit der Aktivität einer Hyaluronatlyase bildet, wurde als Submersfermentation in einem 50-1-Fermenter kultiviert. Es wurden 301 einer Kultursuspension mit einer optischen Dichte von OD600 = 158 (gemessen bei 600 nm) erhalten. Das entsprach einer Biomassekonzentration von 26 g/l Trockengewicht. Die Biomasse wurde abzentrifugiert und das erhaltene pastöse Biomassekonzentrat mit einem Volumen von etwa 6 l bei -20 °C eingefroren. Es besaß eine Biomassekonzentration von etwa 130 g/l. Nach 10 Stunden wurde das Biomassekonzentrat aufgetaut und in 14 l 0,1 M Acetatpuffer pH 7,5, der 0,2 M NaCl enthielt, suspendiert. Durch die Verdünnung mit dem Puffer wurde eine Biomassekonzentration von etwa 56 g/l erreicht, so dass das Biomassekonzentrat fließfähig wurde.
-
Danach wurden die Zellen der Suspension im Gaulin Homogenisator (AVP LAB40) bei 500 bar 2x aufgeschlossen und nach dem Aufschluss der pH-Wert mit 10 % NaOH auf pH 7,6 eingestellt. Zur Entfernung der Zellwandbestandteile wurden der Suspension 1,4 l einer 6 %igen (w/v) Cetyltrimethylammoniumbromidlösung hinzugefügt und für eine weitere Stunde gerührt. Nach zwei Stunden wurde der ausgefallene Niederschlag durch Zentrifugation bei 7500 U/min entfernt und der Überstand mit 200 g/l Ammoniumsulfat versetzt. Nach Abtrennung des ausgefallenen Niederschlages wurde dem klaren Überstand 1 kg Phenylsepharose hinzugefügt, mit 3 l 40 % Ammoniumsulfatlösung gewaschen und anschließend mit 2 l 0,05 M Tris-HCl Puffer pH 7,5 eluiert. Das Eluat wurde durch Zugabe von 500 g Ammoniumsulfat/l gefällt, das Präzipitat abgetrennt, in 0,05 M Tris-HCl-Puffer pH 8,7 gelöst und gegen diesen Puffer dialysiert. Anschließend wurde die Lösung auf eine 500 ml Aminophenyloxaminsäure-Sepharose-Säule aufgetragen, die Säule mit dem Auftragepuffer gewaschen und die gereinigte Hyaluronatlyase mit 0,05 M Na2CO3-HCl Puffer pH 9,8 eluiert. Das gereinigte Enzym wurde durch Sättigung mit 80 % Ammoniumsulfat gefällt.
-
Der Pyrogengehalt einer hochtourig zentrifugierten Probe lag bei etwa 2000 EU/ml, nach Behandlung mit dem Tensid und Zentrifugation bei 20-30 EU/ml. Die Bestimmung erfolgte mit dem Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test. Der Gehalt an DNA, RNA und Lipopolysacchariden wurde um jeweils etwa 80 bis 95 % erniedrigt.
-
Ausführungsbeispiel 2
-
In einem Versuch wurde die Aktivität der Hyaluronatlyase in Proben der Feststoffsuspension aus derselben Fermentation wie in Ausführungsbeispiel 1 nach Zugabe unterschiedlicher Mengen von Cetylpyridiniumchlorid sowie bei unterschiedlichen pH-Werten bestimmt. Die ausgefällten Substanzen wurden durch hochtourige Zentrifugation entfernt. Der durchschnittliche Verlust beträgt etwa 8-9 %. Ein niedriger pH-Wert bei der Behandlung mit dem Tensid führt zu größeren Verlusten.
| pH-Wert | Cetylpyridiniumchlorid-Menge (mg/ml) | Aktivität in U/ml |
| 6,7 | 0 | 200.000 |
| | 1 | 203.000 |
| | 2 | 188.300 |
| | 3 | 183.700 |
| | 4 | 177.400 |
| | 5 | 187.500 |
| | 10 | 175.880 |
| 8,2 | 0 | 198.000 |
| | 1 | 195.800 |
| | 2 | 201.800 |
| | 3 | 167.100 |
| | 4 | 163.500 |
| | 5 | 192.500 |
| 6,0 | 0 | 198.000 |
| | 5 | 130.000 |
-
Ausführungsbeispiel 3
-
Bei einer entsprechend Beispiel 1 durchgeführten Aufarbeitung-wurde anstelle von 1,4 l einer 6 %igen (w/v) Cetyltrimethylammoniumbromidlösung 2,0 l dieser Lösung zugesetzt. Nach Zentrifugation wurden als orientierende Vorproben mehrere 5 ml-Proben des Klarfiltrates mit abgestuften Mengen von 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 4,0 und 8,6 g Alginsäure in fester Form in den Proben gelöst. Die in den Proben entstandenen Niederschläge wurden abzentrifugiert. Bei Zugabe von Mengen größer als 0,2 g Alginsäure wurde kein abtrennbarer Niederschlag mehr beobachtet.
-
Deshalb wurden die 6 l Klarfiltrat mit insgesamt 40 g Alginsäure, gelöst in Wasser und eingestellt auf eine Azidität von pH 7,2, versetzt und der entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt. Die weitere Aufarbeitung wurde entsprechend Beispiel 1 durchgeführt.