DE69220113T2

DE69220113T2 - Verfahren zur Herstellung von menschlichem Serum Albumin

Info

Publication number: DE69220113T2
Application number: DE69220113T
Authority: DE
Inventors: Hirotoshi Fukutsuka; Kaoru Kobayashi; Shinobu Kuwae; Takao Ohmura; Wataru Ohtani; Tomoshi Ooya; Akinori Sumi; Kazumasa Yokoyama
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1991-03-20
Filing date: 1992-03-18
Publication date: 1997-09-25
Anticipated expiration: 2012-03-19
Also published as: JPH0671432B2; EP0504823B1; EP0504823A2; JPH04293495A; KR920018218A; CA2063511C; US5334512A; ES2102420T3; KR100218853B1; TW198683B; DE69220113D1; EP0504823A3; CA2063511A1; DK0504823T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verbesserung des Verfahrens zum Herstellen von Human-Serumalbumin (nachstehend als HSA bezeichnet), das die Kultivierung eines gentechnisch transformierten Wirtes umfaßt, und auf das Verfahren zum Kultivieren des Wirtes.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

HSA ist ein Hauptproteinbestandteil im Plasma und ist als Arzneimittel zur Behandlung von zum Beispiel starken Blutungen, Schock, Verbrennungen, Hyperproteinose, fetaler Erythroblastose und so weiter verwendet worden.
Derzeit wird HSA hauptsächlich als Produkt aus Fraktionen gesammelten Blutes hergestellt. Dieses Herstellungsverfahren ist jedoch unökonomisch und außerdem ist die Versorgung mit Blut, aus dem das HSA hergestellt wird, nicht immer gesichert. Weiter kann das Blut Probleme aufwerfen, da es unerwünschte Substanzen wie etwa den Hepatitisvirus enthält.
In den letzten Jahren ist mit dem Aufkommen der Technologie rekombinanter DNA die Herstellung verschiedener nützlicher Polypeptide durch Mikroorganismen oder Zellen möglich geworden und es sind viele Untersuchungen und Entwicklungen der HSA-Herstellung in großem Maßstab durch rekombinante Gentechnologie durchgeführt worden. Die HSA-Ausbeute ist jedoch niedrig und die Technik der industriellen Herstellung, welche die HSA-Herstellung zu niedrigen Kosten mit hoher Reinheit gestattet, bleibt einzuführen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Im Hinblick auf den vorgenannten technischen Hintergrund ist die vorliegende Erfindung auf das Erhöhen der HSA-Herstellungsmenge durch Verbesserung der Kulturbedingungen gerichtet.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Herstellungsverfahren für HSA, welches den Zusatz einer höheren Fettsäure mit 10-26 Kohlenstoffatomen oder ihres Salzes in einem Kulturmedium beim gentechnischen Kultivieren eines HSA-produzierenden Wirtes umfaßt. Auf diese Weise kann die HSA-Produktion stark erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Kultivieren eines Wirtes, der gentechnisch hergestellt wurde und Human- Serumalbumin produzieren kann, welches das Kultivieren in einem Medium umfaßt, das mit einer Fettsäure mit 10 bis 26 Kohlenstoffatomen oder ihrem Salz ergänzt wurde.
Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende HSA-produzierende Wirt, der gentechnisch hergestellt wird, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er gentechnisch hergestellt wird, und solche, die in der bekannten Literatur offenbart oder in der Zukunft zu entwickeln sind, können in geeigneter Weise verwendet werden. Spezielle Beispiele schließen mit der Fähigkeit, HSA gentechnisch herstellen zu können, ausgestattete Pilze, wie etwa Escherichia coli, Hefen, Bacillus subtilis usw., und Tierzellen ein. In der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Verwendung einer Hefe, genauer die Gattung Saccharomyces oder die Gattung Pichia, als Wirt erwünscht. Ferner können auxotrophe Stämme oder antibiotikaempfindliche Stämme verwendet werden. Außerdem kann vorzugsweise der Saccharomyces cerevisiae-Stamm AH22 oder der Pichia pastoris-Stamm GTS115 verwendet werden.
Das Verfahren zur Herstellung dieser HSA-produzierenden Wirte und das Herstellungsverfahren für HSA durch die Kultivierung eines Wirtes und das Verfahren zur Trennung und zum Ernten von HSA aus Kulturen können bekannte Verfahren oder dazu analoge Verfahren sein. Zum Beispiel schließen die Verfahren zur Herstellung eines HSA-produzierenden Wirtes (oder HSA-produzierenden Stammes) ein Verfahren ein, bei dem ein bekanntes Humanserumalbumin-Gen verwendet wird (europäische Patentveröffentlichung Nrn. 73 646, 79 739 und 206 733), ein Verfahren, bei dem eine synthetische Signalsequenz verwendet wird (europäische Patentveröffentlichung Nr. 329 127), ein Verfahren, bei dem eine Serumalbumin-Signalsequenz verwendet wird (europäische Patentveröffentlichung Nr. 319 641), ein Verfahren, bei dem ein rekombinantes Plasmid in ein Chromosom eingebaut ist (europäische Patentveröffentlichung Nr. 399 455), ein Verfahren&sub1; bei dem Wirte fusioniert werden (europäische Patentveröffentlichung Nr. 409 156), ein Verfahren, bei dem eine Mutation in einem methanolhaltigen Medium verursacht wird, ein Verfahren, bei dem eine Variante des AOX&sub2;-Promotors (erhalten durch Modifizieren des natürlichen AOX&sub2;-Promotors wie etwa durch teilweise Deletion, Substitution oder Addition seiner Basensequenz unter Verbessern seiner Promotorwirksamkeit) verwendet wird, ein Herstellverfahren für HSA mit Hefe (europäische Patentveröffentlichung Nrn. 123 544, 248 637 und 251 744), die Herstellung von HSA mit Pichia (europäische Patentveröffentlichung Nr. 344 459) und dergleichen ein.
Von den vorgenannten Verfahren umfaßt das Verfahren, bei dem in einem methanolhaltigen Medium eine Mutation verursacht wird, die folgenden Schritte. Ein Plasmid mit einer Transkriptionseinheit, wo HSA unter der Kontrolle des AOX&sub1;-Promotors exprimiert wird, wird durch ein herkömmliches Verfahren unter Erhalten einer Transformante (siehe europäische Patentveröffentlichung Nr. 344 459) in einem geeigneten Wirt, vorzugsweise eine Pichia-Hefe, insbesondere eine AOX&sub1;-Genregion des Stammes GTS115 (NRRL-Zugangsnr. Y-15851), exprimiert. Diese Transformante zeigt in einem methanolhaltigen Medium schlechtes Wachstum. Anschließend wird diese Transformante in einem methanolhaltigen Medium unter Verursachen einer Mutation vermehrt und es werden nur lebensfähige Stämme gesammelt. Die Methanolkonzentration ist etwa 0,0001-5%. Das Medium kann künstlich oder natürlich sein und die Inkubation wird 1-1000 Stunden bei 15-40ºC ausgeführt.
Die Verfahren zur Kultivierung eines HSA-produzierenden Wirtes, das HSA-Herstellungsverfahren, schließen außer den in den vorstehenden Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren ein Verfahren ein, bei dem ein zugeführter Ansatz verwendet wird.
Die Verfahren zum Abtrennen, Ernten und Reinigen von HSA schließen außer den in den vorstehenden Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren die Proteaseinaktivierung durch Hitzebehandlung (europäische Patentanmeldung Nr.420 007) und das Anfärbeverhinderungsverfahren ein, das verschiedene chromatographische Behandlungen umfaßt.
Das zur Kultivierung eines Transformantenwirtes zu verwendende Medium ist ein auf diesem Gebiet bekanntes Medium, das mit einer Fettsäure mit 10-26 Kohlenstoffatomen oder ihrem Salz ergänzt ist, und die Kultivierung wird durch ein herkömmliches Verfahren ausgeführt. Das Medium kann synthetisch oder natürlich sein, wobei einem flüssigen Medium der Vorzug gegeben wird. Ein synthetisches Medium kann zum Beispiel verschiedene Zucker als Kohlenstoffquellen, Harnstoff, Ammoniumsalz, Nitrat usw. als Stickstoffquellen, verschiedene Vitamine und Nukleotide als Mikronährstoffe und Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co, Cu usw. als anorganische Salze enthalten und wird durch YNB-Flüssigmedium (0,7% Hefestickstoffgrundlage (Difco), 2% Glucose) veranschaulicht. Beispiele des natürlichen Mediums schließen YPD-Flüssigmedium (1% Hefeextrakt (Difco), 2% Bacto-Pepton (Difco), 2% Glucose) ein. Der pH des Mediums kann neutral, schwach basisch oder schwach sauer sein. Wenn der Wirt Methanol verwertet, kann ein methanolhaltiges Medium verwendet werden. In diesem Fall ist die Methanolkonzentration etwa 0,01-5%.
Die Inkubationstemperatur ist vorzugsweise 15-40ºC (20-30ºC für Hefen und 20-37ºC für Bakterien). Die Inkubation wird etwa 1 bis 1000 Stunden ausgeführt, indem man in Satzkultur, Halbsatzkultur oder kontinuierlicher Kultur unter Belüftung stehen läßt, schüttelt oder rührt. Eine Vorkultur vor der Kultur ist bevorzugt, wobei zum Beispiel YNB- Flüssigmedium oder YPD-Flüssigmedium verwendet wird. Die Vorkultur wird 10 bis 100 Stunden bei 30ºC für Hefen und 37ºC für Bakterien ausgeführt.
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Fettsäure wird durch diejenigen mit 10 bis 26, vorzugsweise 14 bis 20, bevorzugter 14 bis 18 Kohlenstoffatome, wie etwa gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren (z.B. Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, t- Vaccensäure, Linolsäure und Arachidonsäure) I veranschaulicht. Salze dieser Fettsäuren werden durch Alkalimetallsalze wie etwa ein Natriumsalz und Kaliumsalz, Erdalkalimetallsalze wie etwa ein Calciumsalz, und organische Aminsalze veranschaulicht.
Die Fettsäure wird dem Medium in einer Konzentration von etwa 0,005- 0,4% (Gew./Vol.) zugesetzt, wobei 0,01-0,2% der Vorzug gegeben wird. Wenn sie in einer geringeren Konzentration als 0,005% zugesetzt wird, können die gewünschten Wirkungen nicht erhalten werden und wenn sie in einer höheren Konzentration als 0,4% zugesetzt wird, kann die Produktion abnehmen. Obschon die Fettsäure im allgemeinen dem Medium in einer geeigneten Menge vor Beginn der Inkubation zugesetzt wird, kann sie auch im Endstadium der Inkubation zugesetzt werden.
Nach Beendigung der Inkubation kann HSA aus dem Kulturfiltrat, den Pilzen oder Zellen durch ein bekanntes Verfahren abgetrennt und gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden durch erläuternde Beispiele im einzelnen beschrieben.

Beispiel 1

1. Zu verwendender Stamm: Pichia pastoris GCP101

PC4130 kann durch das in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 344 459 beschriebene Verfahren durch Ersatz der AOX&sub1;-Genregion von Pichia pastoris GTS150 (his 4) (NRRL Y-15851) durch die Fraktionen erhalten werden, die mit Not 1 des Plasmids pPGP1 mit einer Transkriptionseinheit gespalten wurden, wo HSA unter der Kontrolle eines AOX&sub1;-Promotors exprimiert wird. Aufgrund der Abwesenheit des AOX&sub1;-Gens zeigt dieser Stamm schlechtes Wachstum in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium (Mut-Stamm).
PC4130 wurde in 3 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Glucose) eingeimpft und 24 Stunden später wurde in 50 ml YPD-Medium in einer Konzentration eingeimpft, welche die Anfangs-OD&sub5;&sub4;&sub0; auf 0,1 brachte. Nach 3 Tagen Inkubation bei 30ºC wurde in 50 ml YPD-Medium in einer Konzentration eingeimpft, welche die Anfangs-OD&sub5;&sub4;&sub0; auf 0,1 brachte. Dieselbe Subkultur wurde alle drei Tage wiederholt. Bei jeder Subkultur wurden die Zellen mit sterilisiertem Wasser verdünnt, um die Zellkonzentration auf 10&sup7; Zellen/Platte zu bringen, und auf eine Platte mit 2% MeOH-YNB ohne AS (0,7% Hefestickstoffgrundlage ohne Aminosäuren, 2% Methanol, 1,5% Agarpulver) aufgetragen. Nach 5 Tagen Inkubation bei 30ºC wurde die Anwesenheit oder Abwesenheit von Kolonien beobachtet. Zwanzig Kolonien wurden auf einer Platte mit 2% MeOH-YNB ohne AS gebildet, die mit Zellen nach 12 Tagen Subkultur überzogen worden war. Der (Mut-)-Stamm wuchs auf dieser Platte kaum, aber der (Mut+)-Stamm konnte wachsen. Das heißt, die Koloniebildung auf dieser Platte zeigt die Zunahme der Verwendung von Methanol an und daß ein in Mut+ überführter Stamm erhalten werden konnte. Eine der gebildeten Kolonien wurde mit sterilisiertem Wasser entsprechend verdünnt und auf einer Platte mit 2% MeOH-YNB ohne AS zu einer einzigen Kolonie vermehrt, die GCP101 genannt wurde.

2. Medium

a) Medium für die Vorkultur

Bacto-Hefestickstoffgrundlage (Difco, 6,7 g) wurde in Wasser gelöst, um die Gesamtmenge auf 100 ml zu bringen und 10xYNB, die sterilisiert und filtriert war, 20% Glucose, die in einem Autoklaven sterilisiert war, und sterilisiertes Wasser wurden im Verhältnis 1:1:8 (Vol.) gemischt und verwendet.

b) Kulturmedium

Verschiedene in Tabelle 2 dargestellte Fettsäuren wurden einem Methanol und Glycerin als Kohlenstoffquellen (Tabelle 1) enthaltenden Medium zugesetzt und als Kulturmedium (pH 6,0) verwendet. Tabelle 1

3. Kulturverfahren

a) Vorkultur

Ein ml gefroren in einem Gläschen aufbewahrtes 20%iges Glycerin wurde in 100 ml YNB-Brühe eingeimpft und die Brühe wurde in einem mit einem Stromstörer ausgestatteten 300-ml- Erlenmeyerkolben bei 30ºC 24 Stunden der Schüttelkultur unterzogen.

b) Kultur

Nachdem 100 ml Vorkultur dem Ernten durch Zentrifugieren unterzogen wurden, wurde in 10 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. Die Zellsuspension (0,5 ml) wurde in 50 ml Kultur eingeimpft. Die Kultur (50 ml) wurde in einem mit einem Stromstörer ausgestatteten 300-ml-Erlenmeyerkolben bei 30ºC und 125 Upm 120 Stunden der Schüttelkultur unterzogen.
Die Änderungen der HSA-Produktionsmenge und der Zellmenge, die sich aus der Kultivierung in einem fettsäurehaltigen Medium ergaben, werden in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
In der Tabelle stellt *a relative, auf die HSA-Produktion der Kontrolle (Kultivierung ohne Fettsäure) bezogene Werte dar, welche als 100 angenommen wird, und *b stellt relative, auf die Zellzunahme der Kontrolle bezogene Werte dar, welche als 100 angenommen wird.

Messung der HSA-Konzentration

Aus der Kultur wurden Proben genommen und nach 5 Minuten Zentrifugieren bei 15 000 Upm wurde der erhaltene Kulturüberstand der Messung durch einen Test der umgekehrten passiven Blutgerinnung (RPHA) unterzogen und die HSA-Konzentration in der Probe wurde aus dem Vergleich mit Standard-HSA (Miles) berechnet.

Messung der Zellkonzentration

Aus der Kultur wurden Proben genommen und nach entsprechender Verdünnung mit destilliertem Wasser wurde die Absorption bei 540 nm mit einem Spektralphotometer (Shimazu, UV 240) gemessen.
Wie im vorstehenden beschrieben, erhöht die vorliegende Erfindung die HSA-Produktion durch Kultivieren eines gentechnisch erhaltenen Wirtes in einem Medium, dem eine höhere Fettsäure mit 10 bis 26 Kohlenstoffatomen oder ihr Salz zugesetzt wurde.

Beispiel 2

Kultivierung von transformiertem Saccharcinyces cerevisiae AH22, das zur sekretorischen Expression von Humanserumalbumin befähigt ist
Saccharomyces cerevisiae A124-35 (FERM BP-2527) wurde in der folgenden Weise kultiviert. Eine Öse der vorgenannten rekombinanten Hefe, die man auf einer Platte vermehrte, welche 0,7% Hefestickstoffgrundlage, 2% Glucose und 3% Bacto-Agar umfaßte, wurde in 50 ml YNB-Medium (0,7% Hefestickstoffgrundlage und 2% Glucose) eingeimpft und 2 Tage bei 30ºC kultiviert. Die gesamte Kultur wurde anschließend in 500 ml YNB-Medium eingeimpft und 2 Tage bei 30ºC kultiviert. Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in 500 ml YPG-Medium (YPG wurde durch Lösen von 10 g Hefeextrakt und 20 g Bacto-Pepton in Wasser, was 900 ml ergab. Die Lösung wurde autoklaviert und, als sie abgekühlt war, mit 100 ml getrennt autoklavierter 20%iger Galactose gemischt) mit 0,1% (Gew./Vol.) Ölsäure suspendiert und bei 30ºC 5 Tage schüttelkultiviert. Die HSA-Produktion betrug das 1,5-fache der durch Kultivierung ohne Ölsäure erhaltenen.

Beispiel 3

Transformierter Bacillus subtilis, der zur sekretorischen Expression von Humanserumalbumin befähigt ist (siehe europäische Patentveröffentlichung Nr. 229 712), wurde in 10 ml 2% Hefeextrakt (Gifco), der 50 Jµg/ml Erythromycin und 0,1% Ölsäure (Gew./Vol.) enthielt, 24 Stunden bei 37ºC kultiviert. Die HSA-Produktion betrug das 2-fache der durch Kultivierung ohne Ölsäure erhaltenen.

Beispiel 4

Pichia pastoris GTS115 wurde durch den mutanten AOX&sub2;-Promotor, der durch Abändern der 255. Basensequenz des natürlichen AOX&sub2;- Promotors [Yeast, Bd. 5, 167-177 (1989)] von T in C erhalten wurde, unter Erhalt des HSA-produzierenden Stammes UHG42-3 transformiert. Dieser HSA-produzierende Stamm wurde in YPD- Medium eingeimpft und über Nacht bei 30ºC kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde in 50 ml 2% MeOH-YP-Medium (0,5% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% MeOH) in einer Konzentration eingeimpft, welche die Anfangs-OD&sub5;&sub4;&sub0; auf 0,1 brachte, und 3 Tage bei 30ºC kultiviert. Als Ergebnis betrug die HSA-Produktion mit 0,1% (Gew./Vol.) Ölsäure das 1,2-fache der durch Kultivierung ohne Ölsäure erhaltenen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Human-Serumalbumin, umfassend das Kultivieren eines gentechnisch hergestellten, Human- Serumalbumin erzeugenden Wirtes in einem Medium, das eine Fettsäure mit 10 bis 26 Kohlenstoffatomen oder deren Salz enthält.

2. Verfahren zur Herstellung von Human-Serumalbumin gemäß Anspruch 1, wobei die Fettsäure in einer Konzentration von 0,005-0,4% (w/v) zu dem Medium gegeben wird.

3. Verfahren zur Herstellung von Human-Serumalbumin gemäß Anspruch 1, wobei die Fettsäure oder deren Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Oleinsäure, t-Vaccensäure, Linoleinsäure, Arachidonsäure und deren Salzen besteht.

4. Verfahren zur Herstellung von Human-Serumalbumin gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Human-Serumalbumin erzeugenden Wirt um einen Pilz handelt.

5. Verfahren zur Herstellung von Human-Serumalbumin gemäß Anspruch 4, wobei der Pilz eine Hefe ist.

6. Verfahren zur Herstellung von Human-Serumalbumin gemäß Anspruch 5, wobei die Hefe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Gattung Saccharomyces und der Gattung Pichia besteht.

7. Verfahren zur Herstellung von Human-Serumalbumin gemäß Anspruch 1, wobei das Medium ein flüssiges Medium ist.

8. Verfahren zum Kultivieren eines gentechnisch hergestellten, Human-Serumalbumin erzeugenden Wirtes, wobei der Wirt in einem Medium kultiviert wird, dem eine Fettsäure mit 10 bis 26 Kohlenstoffatomen oder deren Salz zugesetzt ist.