DE3636825A1

DE3636825A1 - Verfahren zur herstellung von loesungsmittelstabiler (alpha)-amylase

Info

Publication number: DE3636825A1
Application number: DE19863636825
Authority: DE
Inventors: Jack William Brewer; Chong Yol Kim; Curtis Jerry Montgomery; Jayarama Kadangod Shetty
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1985-11-04
Filing date: 1986-10-29
Publication date: 1987-05-07
Anticipated expiration: 2006-10-30
Also published as: CN86107635A; DK168050B1; JPS62111684A; DK523686A; CA1281300C; JPH0437717B2; MX163682B; US4724208A; DE3636825C2; CN1017450B; DK523686D0

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die Herstellung eines im wesentlichen lösungsmittelstabilen Enzymproduktes, enthaltend alpha-Amylase aus Bacillus licheniformis und Stärke, vorzugsweise Maltodextrin.

Enzyme sind Biokatalysatoren, die viele der natürlich im lebenden Organismus ablaufenden biochemischen Reaktionen regulieren. Enzyme werden auf vielen Gebieten eingesetzt, beispielsweise bei Gerb-, Detergens-, Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Industrien. Bei der üblichen Methode zur Herstellung von Enzymen wird ein Enzymniederschlag in Wasser gelöst. Hochwirksame Enzym- in-Wasser-Lösungen (konzentrierte Lösungen mit einer hohen Enzymaktivität) können jedoch bei der Lagerung instabil sein; das Enzym fällt aus der Lösung aus und/oder ist wärmeempfindlich. Gemäss US-PS 32 42 056 wendet man wässrige Polyollösungen an, um die thermische Instabilität von Lysozym zu verhindern. Gemäss US-PS 44 97 897 erhält man eine stabile flüssige Proteinase aus Subtilisin Carlsberg, enthaltend Propylenglykol, Calciumionen und Carboxylatsalz. In US-PS 45 19 934 wird eine stabile flüssige alpha-Amylase aus Bacillus licheniformis, dispergiert in Propylenglykol, offenbart.

Ein flüssiges Enzymprodukt, welches alpha-Amylase aus Bacillus licheniformis in wässriger Lösung enthält, wäre wünschenswert, weil man es direkt seiner industriellen Verwendung zuführen kann, z. B. als flüssiges Detergens, ohne dass man zuerst einen trockenen Enzymniederschlag in Wasser wieder auflösen muss und/oder ohne dass man sich um die Verträglichkeit mit einem Lösungsmittel (z. B. Propylenglykol) Gedanken machen muss. Auch der Enzymstaub aus einem trockenen Produkt wird vermieden. Deshalb haben die Forscher lange nach Methoden gesucht, um dieses Enzym in wässriger Lösung, insbesondere hochaktiven (hochkonzentrierten) Lösungen zu halten. Zwar zeigt der vorher gezeigte Stand der Technik die Verwendung von verschiedenen Lösungsmitteln (z. B. Propylenglykol), jedoch erhält man dabei in keinem Fall ein wässriges Enzymprodukt mit hoher Enzymaktivität, wenn dieses Enzym in Lösung bleibt.

alpha-Amylase kann man beispielsweise erhalten, indem man verschiedene Mikroorganismen, wie Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis in einem geeigneten Nährmittel kultiviert. B. subtilis bildet alpha-Amylase, die physikalisch stabil ist, d. h. das Enzym fällt im wesentlichen nicht aus einer wässrigen Lösung aus, selbst wenn die Aktivität 3 Millionen MWU/ml (Modifizierte Wohlgemut- Einheiten pro Milliliter) oder höher ist. Diese alpha- Amylaselösungen sind jedoch wärmeempfindlich und deshalb gibt man Maltodextrin zur Erhöhung der Thermostabilität zu. Ähnliches berichten Klesov et al in "Substrate Thermostabilization of Soluble und Immobilized Glucoamylase", Department of Chemistry, Moscow State University, Biokhimiya, Bd. 44 (6), Seiten 1084-92 (1979), über die Thermostabilisierung einer Lösung aus Glucoamylase aus Aspergillus niger mit Maltodextrin. Andererseits ist aus Bacillus licheniformis erhaltene alpha-Amylase wärmestabil (siehe beispielsweise Volesky et al, Microbiol Enzymes: Production, Purification and Isolation, Bd. 2, Ausgabe 2, Seite 120 (1985), jedoch ist sie nicht besonders physikalisch stabil, wenn sie in einer wässrigen Lösung bei hoher Konzentration vorliegt.

Die vorliegende Erfindung stellt das nachfolgend beschriebene Verfahren zur Verfügung. In Kombination mit der Herstellung einer wärmestabilen alpha-Amylase durch Fermentation von Bacillus licheniformis unter Erhalt einer Fermentationsbrühe, welche das Enzym und feste Abfallprodukte aus der Fermentation enthält, besteht die Verbesserung darin, dass man zu der Fermentationsbrühe eine Stärke zugibt, die, sofern sie in einer ausreichenden Menge zugegeben wird, die Enzym-Enzym-Agglomerisierung inhibiert und dadurch die Löslichkeit der alpha-Amylase in der wässrigen Lösung erhöht.

In keiner der Literaturstellen wird die vorliegende neue Erfindung vorgeschlagen oder offenbart, gemäss welcher man eine Stärke verwendet, um ein wässriges Produkt mit hoher Enzymaktivität zu erhalten und worin das Enzym eine wärmestabile alpha-Amylase aus B. licheniformis ist und deshalb wurde die Wirkung der Zugabe einer Stärke zum Stabilisieren von wässrigen alpha-Amylaselösungen mit Aktivitäten von bis zu annähernd 1 Million MWU/ml untersucht.

Es ist infolgedessen eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine im wesentlichen lösungsmittelstabile alpha-Amylaseformulierung zur Verfügung zu stellen, in welcher die alpha-Amylase aus B. licheniformis erhalten wurde. Unter "im wesentlichen lösungsstabil" wird verstanden, dass das Enzym in Lösung bleibt und nicht aus der Lösung ausfällt, wenn die Lösung sehr stark ist, d. h. wenn sie eine hohe Enzymkonzentration aufweist und eine Aktivität von wenigstens 350.000 MWU/ml. Durch Einstellen der Stärkemenge kann man sehr konzentrierte Lösungen mit einer Aktivität von 1.000.000 MWU/ml oder sogar höher, die im wesentlichen lösungsstabil sind, erhalten.

Die vorliegende flüssige Formulierung kann eine Amylase, die sich von der stabilen alpha-Amylase aus B. licheniformis unterscheidet, und/oder eine Protease enthalten. Verschiedene Mikroorganismen, welche Amylasen und/oder Proteasen produzieren, schliessen Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. stearothermophilus und B. amyloliquefaciens ein, ohne dass dadurch eine Beschränkung ausgesprochen wird. Die vorliegenden Formulierungen werden vorzugsweise in einem Detergens eingesetzt und können deshalb von etwa 0 bis etwa 80% eines oberflächenaktiven Detergens aus der Gruppe amphotere, anionische, kationische, nicht-ionische, zwitterionische oder semipolar- nicht-ionische oberflächenaktive Mittel oder Mischungen davon enthalten. Solche Detergenzien sind bekannt und Beispiele für einige Detergenzien, die bei den vorliegenden flüssigen Enzymformulierungen geeignet sind, werden in den US-PSen 43 18 818 (Letton et al) und 41 11 855 (Barrat et al), die in die vorliegende Offenbarung eingeschlossen werden, beschrieben.

Die nachfolgende Aufstellung zeigt eine bevorzugte Ausführungsform im Vergleich zu den üblichen Verfahrensweisen. Diese Aufstellung soll nur beschreibend sein und ist nicht erforderlich, um die Durchführung der vorliegenden Erfindung zu beschreiben.

AUFSTELLUNG

(A) Fermentation (Biomasse-Abtrennung)
(B) Kulturfiltrat (PM-2-Membran)
(C) UF-Konzentrat

In der Aufstellung wird ein einfaches Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen stabilen hochwirksamen wässrigen alpha-Amylase-Zubereitung beschrieben. Diese Methode umfasst: (A) die Durchführung einer Fermentation; (B) das Abtrennen der Biomasse aus der Fermentationsbrühe, enthaltend das Enzym, durch Filtrieren; (C) Ultrafiltration (UF) unter Erhalt eines Enzymkonzentrates; (D) entweder (i) Ausfällen eines Kuchens, welcher das Enzym enthält, oder (ii) weiteres Konzentrieren durch Vakuumverdampfung oder zusätzliche Ultrafiltration; und dann (E) entweder (i) Extrahieren des ausgefallenen Enzyms aus dem Kuchen und in eine wässrige Lösung, indem man den Kuchen in der Lösung wieder aufschlämmt oder indem man die Lösung durch den Kuchen zirkulieren lässt und die Extraktionslösung Stärke enthält oder Stärke zu dem Extrakt gegeben wird, oder (ii) Direktzugabe von Stärke zu dem Konzentrat unter Erhalt von (F) einem wässrigen stärkehaltigen Endprodukt. Bei den üblichen Verfahren besteht die Stufe (E′) dagegen aus (i) Aufschlämmen der Stärke in Wasser unter Extraktion des Enzyms daraus oder aus (ii) weiterem Eindampfen. Dann fällt ein enzymhaltiger Kuchen wieder aus und die überschüssige Mutterlauge wird abfiltriert, wobei ein trockenes Enzymprodukt (F′) zurückbleibt. Alternativ könnte man die vorliegende Erfindung nach den Stufen (E′) und (F′) anwenden, indem man das Enzym aus dem ausgefallenen Kuchen in eine wässrige, Stärke enthaltende Lösung extrahiert (G).

Nach der Enzymherstellung kann man die Feststoffe (Biomasse aus der Fermentation) von der Gesamtfermentationsbrühe abtrennen, unter Erhalt einer enzymhaltigen Lösung, wobei man Standardverfahren anwendet, wie Filtration und/oder Zentrifugation. Anschliessend wird die zellfreie, enzymhaltige Lösung vorzugsweise auf das etwa 1- bis 10fache konzentriert durch irgendeine Konzentrationsmassnahme, wie Ultrafiltration und/oder Eindampfen. Eine Stärke oder eine wässrige, eine Stärke enthaltende Lösung wird zu der Lösung oder dem Konzentrat in einer Menge von etwa 0,1 bis 50% G/V (Gewicht/ Volumen), vorzugsweise etwa 3 bis 15% G/V, bezogen auf Stärke zu der enzymhaltigen Lösung oder dem Konzentrat, gegeben.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform kann man vor der Zugabe der Stärke ein Ausfällungsmittel zu der zellfreien Enzymlösung (oder dem Konzentrat) geben, wodurch ein Kuchen, welcher das Enzym enthält, ausgefällt wird. Bekannte Ausfällungsmittel sind niedrigmolekulargewichtige organische Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, 1-Propanol, n-Butanol, tert-Butanol und Mischungen daraus, oder Salze, wie Natriumsulfat, Ammoniumsulfat und Mischungen daraus. Dabei soll der Ausdruck "Kuchen" den Begriff "Aufschlämmung" einschliessen, damit auch solche Fälle mit abgedeckt sind, bei denen der Kuchen so feucht ist, dass man ihn als eine Aufschlämmung auffassen könnte. Wenn überschüssige Mutterlauge vorliegt, kann man diese aus der Aufschlämmung oder dem Kuchen entfernen, indem man irgendeine von verschiedenen Methoden anwendet, wie übliche Filtration, Absaugfiltration, Schwerkraftsedimentation oder Zentrifugieren. Dann kann man eine wässrige Lösung, welche etwa 0,1 bis 50% G/V und insbesondere etwa 3 bis 15% G/V Stärke in Wasser enthält, herstellen und verwenden, um das Enzym aus dem Kuchen aufzulösen oder zu extrahieren. Die Extraktion des Enzyms aus dem Kuchen kann man auch mit Wasser durchführen, worauf man dann Stärke in einer Menge von etwa 0,1 bis 50% G/V zu dem Extrakt zugibt.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform werden die festen Abfallprodukte (d. h. Biomasse aus der Fermentation) nicht aus der Fermentationsbrühe nach der Enzymherstellung abgetrennt. Vielmehr gibt man die Stärke oder eine wässrige Lösung von Stärke direkt zu der Gesamtfermentationsbrühe zu. Dadurch verbleibt das Enzym in der Lösung, so dass man dann, wenn man die festen Abfallprodukte entfernt, weniger von dem Enzym in dem Feststoff verliert. Die Stärke soll in einer Menge von etwa 0,1 bis 50% (Gewicht/Volumen) der gesamten Fermentationsbrühe zugegeben werden.

Bei der vorliegenden Erfindung kann man jede Stärke verwenden und dies bedeutet, dass auch derivatisierte Stärken, wie acetylierte Stärke oder Stärkeglykolate eingeschlossen sind. Die Stärke kann ein Substrat für das Enzym sein. Im allgemeinen wirken Enzyme, die ihre maximale Aktivität bei höheren Temperaturen, z. B. bei 60°C, entwickeln, nicht merklich auf einem Substrat, wenn man nicht erhitzt. Insbesondere beginnt alpha-Amylase aus B. licheniformis im wesentlichen nicht mit der Hydrolyse eines Stärkesubstrates, bis die Temperatur nicht ungefähr 40°C beträgt, während eine wesentliche Hydrolyse nicht eintritt, bis eine Temperatur von annähernd 60°C vorliegt. Daher wird das Stärkesubstrat nicht merklich unter typischen Umgebungs-Lagerungsbedingungen abgebaut. Die bei der vorliegenden Erfindung bevorzugten Stärkesubstrate sind Maissirup und Maltodextrine. Insbesondere bevorzugt werden Maltodextrine. Eine Quelle für Maltodextrin ist MALTRIN®, ein hydrolysiertes Maisprodukt (Cereal-Feststoff), der in unterschiedlichen Dextroseäquivalenten zur Verfügung steht, z. B. von der Grain Processing Corporation of Muscatine, Iowa, USA. MALTRIN ist ein mildes Nahrungsmittelgrad-Kohlenhydrat mit sehr erwünschten Quellungs-Eigenschaften. Es hat eine geringe Süße, löst sich leicht in Wasser und ist gegen Klumpenbildung beständig.

Beispielsweise ist eine typische Analyse von MALTRIN-100 die folgende:

TYPISCHE CHEMISCHE UND PHYSIKALISCHE DATEN:

Dextroseäquivalent9,0-12,0 Feuchtigkeit, % Maximum6,0 pH-Wert, 20%-ige Lösung4,0-4,7 Formweisses Pulver

TYPISCHE KOHLEHADRAT-PROFILE (TROCKENBASIS):

Monosaccharide 1% Disaccharide 4% Trisaccharide 6% Tetrasaccharide 5% Pentasaccharide und höhere Saccharide84%

Es wurde festgestellt, dass eine Konzentration von etwa 3 bis 15% G/V an Maltodextrin besonders vorteilhaft ist, um das Enzym in Lösung zu halten.

Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine umgekehrte Beziehung zwischen den Dextroseäquivalenten (DE) des Maltodextrins und der Aufrechterhaltung der Solubilisierung des Enzyms besteht. Mit anderen Worten heisst dies, dass je niedriger das DE des Maltodextrins ist, umso mehr neigt das Enzym dazu, in Lösung zu bleiben. Vorzugsweise ist der DE etwa 35 oder weniger und noch bevorzugter weniger als etwa 25. Diese Feststellung wird im nachfolgenden Beispiel 4 erläutert.

Andere Stärken mit anderen Dextroseäquivalenten können ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden. Der genaue Mechanismus ist nicht bekannt, jedoch kann man annehmen, dass alle Stärken aufgrund der Bildung eines stabilen Enzym/Substrat-Komplexes wirken.

Gemäss der bevorzugten Ausführungsform wird entweder vor der Zugabe der Stärke oder danach der pH-Wert der enzymhaltigen Lösung auf ein Niveau, das bei oder oberhalb des isoelektrischen Punktes des Enzyms liegt, eingestellt. Der pH-Wert sollte in einem Bereich von annähernd 4,0 pH-Einheiten oberhalb des isoelektrischen Punktes bis zu ungefähr dem isoelektrischen Punkt liegen. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert nicht mehr als ungefähr 3,0 Einheiten oberhalb des isoelektrischen Punktes. Der isoelektrische Punkt von alpha-Amylase variiert zwischen 4,8 und 5,5 und bei solchen sauren pH- Werten bleibt das Enzym in Lösung. Die Aufrechterhaltung eines niedrigen pH-Wertes ist jedoch keine Alternative für die Lagerung der alpha-Amylaselösung, weil durch die Säure das Enzym denaturisiert wird. Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym TAKA-TERM® (hergestellt von Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, USA), eine wärmestabile alpha-Amylase, erhalten durch die Fermentation eines Mutantenstammes von Bacillus licheniformis, wobei der pH ungefähr zwischen 5,5 und 9,0 und noch bevorzugter zwischen etwa 6,0 und 8,2 liegt. Es wurde festgestellt, dass der optimale pH-Wert bei der bevorzugten Ausführungsform mit TAKA-TERM zwischen annähernd 6,5 und 8,0 liegt. Die bevorzugten Mittel zur Einstellung des pH-Wertes sind für die Enzymchemie bekannt und Beispiele hierfür sind Basen, wie NaOH und KOH, und Säuren, wie Salzsäure und Essigsäure.

Die alpha-Amylase-Aktivität wurde in den Beispielen gemessen, indem man die Hydrolyse von löslicher Stärke bestimmte und dabei die Blauwertverminderung des Stärke-Jod- Komplexes anwendete, wie es in dem "Manual of Liquefying Alpha-Amylase Assay" beschrieben wird, welches eine Modifizierung der Methode darstellt, die von Wohlgemuth in Biochem. 29:1 (1908) beschrieben wird. In einem typischen Ansatz werden 5 ml einer 2%-igen, löslichen Stärke, gepuffert auf einen pH-Wert von 5,4, und 4 ml Wasser mit 1 ml eines ausreichend verdünnten Enzyms auf einem Wasserbad, welches bei 40°C gehalten wird, inkubiert. In Zeitabständen (5 bis 30 Minuten nach der Zugabe des Enzyms), werden Aliquote (1 ml) abgezogen und in ein Rohr, welches 5 ml einer verdünnten Jodlösung enthält, eingespritzt und durch Inversion vermischt. Die entwickelte Farbe wurde dann gegenüber einem Vergleichsstandard verglichen, um dadurch die Annäherung des Reaktionsendpunktes zu überwachen. Die Enzymaktivität wurde als modifizierte Wohlgemuth-Einheiten pro Milliliter (MWU/ml) berechnet.

Eine modifizierte Wohlgemuth-Einheit (MWU) stellt die Aktivität dar, bei welcher 1 ml löslicher Stärke auf einen bestimmten Blauwert innerhalb von 30 Minuten unter den Versuchsbedingungen dextrinisiert wird. Für die Berechnung wird angenommen, dass die Dichte der von Wasser entspricht, so daß die Aktivität pro ml gleich der Aktivität pro g unterstellt wird. Die Berechnung ist die folgende: darin bedeuten:
100= Milligramm Stärke in jeder Inkubationsmischung; 30= definierte Dextrinisierungszeit in Minuten; T= Zeit in Minuten, die erforderlich ist, um den Endpunkt zu erreichen; W= Gewicht in Gramm des Enzyms, welches zu der Inkubationsmischung in 1 ml Aliquot der Enzymverdünnung gegeben wird.

Eine schematische Darstellung der Theorie über die Stabilisierung von alpha-Amylase bei hohen Konzentrationen unter Verwendung von Maltodextrinen als Stärkesubstrat verläuft wie folgt:

Es wurde unerwarteterweise entdeckt, dass Faktoren, welche die Konzentration des freien Enzyms in Lösung verringern, auch die Aggregation des Enzyms bei höheren Enzymaktivitäten verhindern. Die Entfernung von Wasser aus einer verdünnten Enzymlösung begünstigt Enzym-Enzym-Zwischenreaktionen, anstatt Enzym-Wasser- Zwischenreaktionen. Die erhöhten Enzym-Enzym-Zwischenreaktionen verursachen, dass das Enzym durch nichtkovalente Anziehung assoziiert, wodurch das Enzym dann ausfällt.

Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Stärke (S) entweder zu dem Enzymextrakt oder während der Konzentrierung des Enzyms die Insolubilisierung des Enzyms bei hohen Konzentrationen umgeht, wie durch die folgende Formel gezeigt wird:

n(E) + m(S) → (ES)_x + S _(n-m) + E _n-x , wenn n ≦λτ m

Im Gleichgewicht umfasst die Lösung im allgemeinen x Mole Enzym/Stärke-Komplex (ES), die Stärke (S _n-m) und freies Enzym (E _n-x).

Die Versuchsdaten zeigen, dass in Abwesenheit von irgendeiner Stärke eine Ausfällung des Enzyms eintrat, wenn die Konzentration des freien Enzyms (E _n-x) grösser als 35.000 MWU/ml Aktivität, bezogen auf das Gewicht des Enzyms in der Lösung, war. Bei den in den nachfolgenden Beispielen gezeigten Ausführungsformen wurde in allen Fällen TAKA-TERM, eine wärmestabile alpha-Amylase, die aus B. licheniformis erhalten wurde, verwendet, wobei die Erfindung jedoch nicht darauf beschränkt ist.

FERMENTIERUNG VON BACILLUS LICHENIFORMIS UNTER AUSBILDUNG VON WÄRMESTABILER ALPHA-AMYLASE (TAKE-TERM)

Ein Fermentationsmedium, welches für die Kultivierung eines Stammes von B. licheniformis unter Erhalt einer wärmestabilen alpha-Amylase geeignet ist, kann man für einen 1.000 Liter-Fermentator wie folgt herstellen:

Calciumchloriddihydrat (Flocken)0,2-1,0 kg Mono- und Dikaliumphosphat15-24 kg Ammoniumsulfat2-7 kg geeignete Kohlenstoffquelle100-200 kg Baumwollsamenmehl25-40 kg Sojamedium (Sojamehl)30-50 kg Mazu DF 6000 (ein organischer Entschäumer, hergestellt
von der Mazu Company, in welchem die Hauptbestandteile
Polypropylenglykol und Silicon sind.)8-13 l Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von1000 l

Das Medium wurde mit lebenden Zellen eines Stammes von Bacillus licheniformis inokuliert und 70 bis 90 Stunden bei 40 bis 50°C bei Aufrechterhaltung eines annähernd neutralen pH-Wertes fermentiert. Nach dieser Fermentierung wurde das Medium mittels eines geeigneten Ausfällungsmittels, um die Entfernung der Biomasse zu erleichtern, ausgeflockt. Die Biomasse kann man durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernen und die Flüssigkeit wird zur weiteren Reinigung durch ein Trommelfilter geleitet, wodurch man eine zellfreie Lösung (hauptsächlich Kulturfiltrat oder überstehende Lösung) erhält. Typischerweise ist das Trommelfilter mit einer Filterhilfe überzogen, wie Superaid®, um das primäre Kulturfiltrat bzw. die überstehende Lösung zu reinigen (d. h. zu klären).

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform kann man das primäre Kulturfiltrat durch Ultrafiltration, z. B. mit einer PM-10-Membran (zur Entfernung eines Molekulargewichtes von 10.000) und/oder im Vakuum konzentrieren. Dann wird das Enzym aus dem konzentrierten Kulturfiltrat quantitativ bei einem pH-Wert von 6 bis 8 unter Ausbildung eines enzymhaltigen Kuchens ausgefällt, vorzugsweise indem man 20%-iges G/V Natriumsulfat, 28%-iges G/V Ammoniumsulfat oder 80%-iges V/V Ethanol zugibt, worauf man dann das Enzym aus dem Kuchen mit Wasser extrahiert und Maltodextrin zu dem Extrakt gibt.

BEISPIEL 1

Ein primäres alpha-Amylase-Kulturfiltrat, das wie oben beschrieben erhalten wurde und das gereinigt worden war, indem man es über ein Trommelfilter, welches mit Superaid® beschichtet worden war, geleitet hatte, wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Romicon® 20HF-4-Filtervorrichtung mit einer ein Molekulargewicht von 10.000 abschneidenden Membran bei 10°C konzentriert und in verschiedene Aliquote aufgeteilt. Der pH-Wert eines jeden Aliquots wurde mit 20% G/V wässriger KOH auf 7,6 eingestellt. Dann wurde Maltrin-20 zu den verschiedenen Proben in unterschiedlichen Prozenten G/V zugegeben und die Proben wurden unter gleichmässiger Durchmischung gerührt. Einige Proben wurden als Kontrolle (0% G/V Maltrin-20) aufbewahrt. Anschliessend wurde auf einem Drehverdampfer (Brinkman-Buchi Rotovapor®) im Vakuum bei 35°C weiter auf die gewünschte Amylaseaktivität und Maltrinkonzentration für die jeweilige Probe konzentriert. Alle Proben wurden vor einer mikrobiellen Verunreinigung geschützt durch Zugabe von 0,5% G/V Kaliumsorbat und anschliessender Lagerung bei 25°C während eines Monats. Nach der angegebenen Zeit wurden die Proben zentrifugiert. Die Menge des Enzyms (anfangs, in der überstehenden Flüssigkeit verbleibend oder ausgefällt) kann bestimmt werden, indem man die Aktivität in MWU/ml in der vorher beschriebenen Art misst. So wurde die Menge des in der überstehenden Flüssigkeit vorhandenen Enzyms gemessen und von der Anfangsmenge des Enzyms abgezogen, wodurch man die Menge des Enzyms erhielt, die in dem Niederschlag verloren ging und dies wurde auf den Prozentgehalt des ausgefällten Enzyms umgerechnet, unter Anwendung der Formel 100 x (Enzymausfällung/Anfangsenzym). Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.

TABELLE 1

WIRKUNG VON MALTRIN-20 AUF DAS AUSMASS DER AUSFÄLLUNG VON ALPHA-AMYLASE WÄHREND EINER 1-MONATIGEN LAGERUNG BEI 25°C

FORTSETZUNG TABELLE 1

Die Ergebnisse von Tabelle 1 zeigen, dass Maltrin die Ausfällung des Enzyms in einem konzentrierten Kulturfiltrat inhibierte. Allerdings wurde das Enzym nicht in einer hochkonzentrierten Lösung aufbewahrt, wie es eine bevorzugte Ausführungsform, die in dem nachfolgenden Beispiel 3 beschrieben wird, ist.

BEISPIEL 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch die Konzentration, die pH-Einstellung und die Maltrin-Zugabe unterschiedlich waren. Das gesamte Kulturfiltrat wurde durch Ultrafiltration auf das 7-fache konzentriert und dann auf eine Konzentration von annähernd 700.000 MWU/ml eingedampft. Der pH-Wert des Konzentrats wurde auf 7,6 eingestellt und das Konzentrat in 4 Anteile aufgeteilt. Maltrin-20 wurde zu jeder der Konzentrationen gegeben. Die Proben wurden mässig bei 25°C während 40 Stunden gerührt und dann zentrifugiert. Der prozentuale Enzymverlust in dem Niederschlag wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 berechnet und die Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammengefasst.

TABELLE 2

WIRKUNG VON MALTRIN-20 BEI 700.000 MWU/ml

Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die verschiedenen Mengen an Maltrin-20, die bis zu 8,0% G/V betrugen, eine drastische Verringerung des Enzymverlustes während der Ausfällung ergaben. Die Aktivität wird jedoch in einer hochkonzentrierten Lösung nicht so gut beibehalten wie bei der bevorzugten Ausführungsform in dem nachfolgenden Beispiel 3.

BEISPIEL 3

Eine alpha-Amylaselösung wurde durch Ultrafiltration auf das 4-fache mit einer PM-10-Membran konzentriert und anschliessend wurde, wie vorher beschrieben, mit Na₂SO₄ ausgefällt (20% G/V) und diese alpha-Amylaselösung wurde im vorliegenden Beispiel verwendet.

Da Natriumsulfat als Ausfällungsmittel verwendet wurde, wurde auf oberhalb Raumtemperatur, d. h. auf annähernd 40°C, erwärmt, um die Klumpenbildung des Natriumsulfats zu erleichtern. Filterhilfe FW-6 (1% G/V) wurde zugegeben und der Enzym enthaltende Kuchen wurde durch Vakuumfiltration gesammelt. Der Enzym enthaltende Kuchen wurde von der Filtervorrichtung entfernt und in einer minimalen Menge an Wasser zur Auflösung des darin enthaltenen Enzyms wieder aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert unter Erhalt einer konzentrierten Enzymlösung und dann mit Wasser auf eine Anfangsenzymkonzentration, bestimmt durch Messung der Aktivität, von 1.000.000 MWU/ml eingestellt und in 7 Aliquote aufgeteilt. Maltrin-250 (pulverisiert) wurde zu 6 der Aliquote in Mengen von 1%, 2%, 3%, 4%, 5% und 10% G/V gegeben und 1 Aliquot wurde als Kontrolle (0% Maltrin- 250) aufbewahrt. Nach der Zugabe wurden die Proben für eine gleichmässige Durchmischung gut gerührt und der pH- Wert wurde mit KOH auf 8,0 eingestellt. Die Anfangsaktivität wurde aufgrund der durch die Zugabe von Maltrin erfolgten Verdünnung korrigiert, d. h. es wurden geeignete Blindproben, welche die jeweiligen Mengen an Maltrin- 250 enthielten, ebenfalls hergestellt, um jeden Fehler aufgrund der Wirkung des Maltrins in der untersuchten Lösung zu eliminieren. Alle Proben wurden 24 Stunden bei 10°C aufbewahrt. Nach der angegebenen Zeit wurden die Proben filtriert. Wie vorher angegeben, wird die Menge des Enzyms bestimmt, indem man die Aktivität misst. Es wurde somit die Menge des in dem Filtrat enthaltenen Enzyms gemessen und von der korrigierten Anfangsmenge des Enzyms abgezogen, wobei man den Enzymverlust in der Ausfällung erhielt und diese wurde auf die Prozente des ausgefällten Enzyms umgerechnet nach der Formel 100 x (Enzym ausgefällt/korrigiertes Anfangsenzym). Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt.

TABELLE 3

WIRKUNG DER MALTRIN-250-KONZENTRATION AUF DIE WÄSSRIGE STABILISIERUNG VON ALPHA-AMYLASE BEI EINER HOHEN ANFANGS- ENZYMKONZENTRATION VON 1.000.000 MWU/ml, EINEM pH-WERT VON 8,0 UND EINER LAGERUNG VON 24 STUNDEN BEI 10°C

Die wässrige Enzymlösung war viel reiner als das konzentrierte Kulturfiltrat das im vorhergehenden Beispiel 1 beschrieben wurde, da die Ausfällung mit Na₂SO₄ die Verunreinigungen entfernte. Es wurden daher nicht mehr als 3% G/V Maltrin-250 benötigt, um im wesentlichen die gesamte Enzymaktivität in der Lösung beizubehalten.

Wie ersichtlich ist, wurde kein Enzym ausgefällt, wenn die Konzentration an Maltrin-250 3% G/V und höher war und somit bleiben 100% der Amylase, gemessen durch deren Aktivität, in dem Filtrat.

BEISPIEL 4

Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei jedoch dieses Mal die Menge des zugegebenen Maltrins konstant gehalten wurde und dessen Dextroseäquivalente variiert wurden. Es wurde somit die Auswirkung des Polymerisationsgrades (DP) von Maltrodextrinen auf die Stabilisierung von alpha-Amylase bei hoher Aktivität untersucht. Maltrodextrine mit verschiedenen Dextroseäquivalenten (DE) wurden in einer Menge von 1% (G/V) zu acht wässrigen konzentrierten alpha-Amylase-Aliquoten, enthaltend 1.000.000 MWU/ml Anfangsaktivität, gegeben. Der pH-Wert jeder Probe wurde durch KOH auf 8,0 eingestellt und die Aktivität bezüglich der Zugabe von Matrin korrigiert. Die Proben wurden 24 Stunden bei 10°C gelagert. Nach der angegebenen Zeit wurden die gelagerten Proben filtriert. Das Filtrat wurde auf alpha-Amylaseaktivität untersucht und der Prozentsatz des ausgefällten Enzyms wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 3 berechnet. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 4 zusammengefasst.

TABELLE 4

WIRKUNG DES DE AUF DIE STABILISIERUNG VON ALPHA-AMYLASE MIT ANFANGSENZYMKONZENTRATION VON 1.000.000 MWU/ml BEI EINER LAGERUNG BEI 10°C WÄHREND 24 STUNDEN

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass die Stabilisierung des Enzyms mit der Abnahme des DE des Maltodextrins zunahm. Ebenfalls erfolgte durch die Zugabe von Maltose oder Glucose keine Verringerung des ausgefällten Enzyms im Vergleich zu der Kontrolle, sondern vielmehr eine leichte Erhöhung.

VERGLEICHSBEISPIEL A (OHNE MALTRIN)

Eine durch Ultrafiltration und mittels der Na₂SO₄-Ausfällungsmethode (20% G/V) erhaltene, konzentrierte alpha- Amylaselösung, wie sie in Beispiel 2 beschrieben wird, wurde in diesem Beispiel verwendet.

Der pH-Wert der konzentrierten Enzymlösung wurde mit KOH auf 8,0 eingestellt und dann wurde die Lösung in 3 Proben aufgeteilt. Die Anfangskonzentration des Enzyms in jeder der Proben wurde mit Wasser auf eine Aktivität von 1.000.000 MWU/ml, 700.000 MWU/ml bzw. 350.000 MWU/ml eingestellt. Jede der drei Proben wurde in vier Teile aufgeteilt und während 18 Stunden bei 5°C, 10°C, 24°C und 37°C gelagert. Nach der angegebenen Zeit wurden die Proben unter Verwendung von Whatman Nr. 3-Filterpapier filtriert und die Menge des in dem Filtrat enthaltenen Enzyms wurde bestimmt, indem man die Aktivität mass und der Prozentsatz des ausgefällten Enzyms wurde berechnet mittels der Gleichung 100x (Anfangsenzym - Filtratenzym)/ Anfangsenzym. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle A gezeigt.

TABELLE A

WIRKUNG DER TEMPERATUR UND DER ANFANGSENZYMKONZENTRATION AUF DAS BEI EINEM pH-WERT VON 8,0 AUSGEFÄLLTE ENZYM BEI EINER LAGERUNG BEI VERSCHIEDENEN TEMPERATUREN WÄHREND 18 STUNDEN

Die Ergebnisse in der obigen Tabelle zeigen deutlich die Beziehung zwischen dem Anfangsenzym und dem Ausmass der Enzymausfällung in Abwesenheit von Maltrin. Eine Lagerung der wässrigen Enzymlösung, enthaltend 1.000.000 MWU/ml, also mit einer hohen Anfangsaktivität, bei einem pH-Wert von 8,0 während 18 Stunden, ergab eine Ausfällung des Enzyms von 75 bis 81,3%, während bei einer niedrigen Anfangsaktivität von 350.000 MWU/ml lediglich 7,3% oder weniger Enzymverlust in dem Präzipitat erfolgte. Mit anderen Worten heisst dies, dass in dem Masse, wie die Konzentration der Enzymlösung anstieg, d. h. wenn die Lösung eine höhere Konzentration an alpha-Amylase aufweist, das Enzym dann dazu neigt auszufällen, anstatt in Lösung zu bleiben.

VERGLEICHSBEISPIEL B (OHNE MALTRIN)

Beispiel A wurde wiederholt, wobei dieses Mal die Aktivität konstant gehalten und der pH-Wert variiert wurde.

Ein Aliquot wie in Beispiel A der konzentrierten Lösung, welche mit Wasser auf eine hohe Anfangsaktivität von 1.000.000 MWU/ml eingestellt worden war, wurde in 6 Aliquote aufgeteilt. Jedes wurde mit KOH auf einen pH- Wert von 5,5, 6,5, 7,5, 8,5, 9,5 bzw. 10,5 eingestellt und 18 Stunden bei 5°C gelagert. Nach der Lagerung wurden die Proben durch ein Whatman Nr. 3-Filterpapier filtriert und das zurückbleibende Enzym in dem Filtrat wurde bestimmt und dann wurde der Prozentsatz des ausgefällten Enzyms in gleicher Weise wie in Beispiel A berechnet.

Die Ergebnisse werden in Tabelle B gezeigt.

TABELLE B

WIRKUNG DES PH-WERTES AUF ALPHA-AMYLASEENZYM, AUSGEFÄLLT MIT HOHER ANFANGSAKTIVITÄT BEI EINER LAGERUNG BEI 5°C WÄHREND 18 STUNDEN

Das Ausmass, in welchem das Enzym aus der Lösung ausfiel, erhöhte sich mit einer Erhöhung des pH-Wertes von 6,5 auf 8,5 und erreichte ein Maximum bei einem pH-Wert von 8,5. Oberhalb des pH-Wertes von 8,5 wurde eine Verringerung des Enzymverlustes in dem Niederschlag festgestellt, was auf eine Wiederauflösung des ausgefällten Enzyms bei hohem alkalischen pH zurückzuführen sein kann. Von Interesse ist es, dass die maximale Löslichkeit des Enzyms bei hoher Anfangskonzentration bei einem pH-Wert von 5,5 eintrat, welches annähernd dem isoelektrischen Punkt des Enzyms enspricht. Dennoch wird, wie vorher angegeben, bei einem solchen sauren pH-Wert das Enzym während einer längeren Lagerungszeit denaturiert.

VERGLEICHSBEISPIEL C (OHNE MALTRIN)

Wirkung der Temperatur auf die Ausfällungsrate von alpha-Amylase bei einem pH-Wert von 8,0:

Ein Aliquot einer konzentrierten wässrigen Enzymlösung, enthaltend 1.000.000 MWU/ml Anfangsaktivität, wie in Beispiel B, wurde in zwei unterschiedliche Kolben (150 ml für jede Probe) aufgeteilt, wobei jedoch der pH-Wert in beiden Fällen unter Verwendung von Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt wurde. Die beiden Proben wurden dann bei 10°C bzw. 37°C aufbewahrt. Ein 10 ml Aliquot wurde aus jedem der Kolben in unterschiedlichen Intervallen von 2,5 Stunden, 4 Stunden, 7 Stunden, 10 Stunden, 12 Stunden und 20 Stunden abgezogen. Unmittelbar nach dem Abziehen wurde jeder Aliquot durch ein Whatman Nr. 3-Filterpapier filtriert und das Filtrat wurde auf alpha-Amylase untersucht. Der Prozentsatz des ausgefällten Enzyms wurde in gleicher Weise wie in Beispiel A berechnet und die Ergebnisse werden in Tabelle C zusammengefasst.

TABELLE C

WIRKUNG DER TEMPERATUR AUF DIE AUSFÄLLUNGSRATE VON ALPHA- AMYLASE BEI EINEM pH-WERT VON 8,0

Die Ergebnisse in Tabelle C zeigen, dass niedrige Temperaturen die Ausfällung des Enzyms begünstigen, während bei 37°C die Solubilisierung begünstigt war.

Zusammenfassend zeigen die Tabellen A, B und C deutlich die Beziehung zwischen dem Anfangsenzym in der Lösung unter dem Ausmass des Enzymverlustes im Niederschlag bei unterschiedlichen pH-Werten und Temperaturen. Die Entfernung von Wasser aus der Enzymlösung, d. h. bei der Herstellung von konzentrierten Lösungen hoher Aktivität, verursacht eine erhöhte Protein-Protein-Zwischenreaktion, durch welche die Neigung zur Aggregation des Enzyms begünstigt wird und dadurch eine Ausfällung eintritt. Ein Vergleich der Beispiele 1, 2, 3 und 4 zeigt deutlich, dass durch die Zugabe von Maltrin zu konzentrierten Lösungen hoher Aktivität die Protein-Protein- Zwischenreaktion inhibiert und die Löslichkeit des Enzyms begünstigt wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von wärmestabiler alpha- Amylase durch Fermentation von Bacillus licheniformis unter Ausbildung einer Fermentationsbrühe, enthaltend das Enzym und feste Abfallprodukte aus der Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man zu der Fermentationsbrühe eine Stärke in einer ausreichenden Menge gibt, um die Enzym-Enzym- Agglomeration zu inhibieren und dadurch die Löslichkeit der alpha-Amylase in wässriger Lösung zu erhöhen.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentationsbrühe behandelt, unter Entfernung der festen Abfallprodukte vor der Zugabe der Stärke unter Erhalt einer zellfreien, Enzym enthaltenden Lösung, zu welcher man dann die Stärke gibt und dadurch ein wässriges, im wesentlichen lösungsstabiles alpha-Amylase-Produkt erhält.

3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stärke direkt zugibt, indem man die Stärke zu der enzymhaltigen Lösung in einer Menge von etwa 0,1 bis 50% (Gewicht/Volumen) der Stärkelösung direkt zugibt oder indem man die Stärke zunächst in H₂O auflöst und die erhaltene Stärkelösung zugibt.

4. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymhaltige Lösung auf das etwa 1- bis 10-fache konzentriert und die Stärke während oder nach der Konzentrierung zugibt.

5. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man vor oder nach der Zugabe der Stärke den pH-Wert auf einen Punkt einstellt, der innerhalb eines Bereiches von annähernd dem isoelektrischen Punkt des Enzyms bis annähernd 4,0 pH-Einheiten oberhalb des isoelektrischen Punktes liegt.

6. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des wässrigen Produktes 350.000 MWU/ml ist.

7. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke ein Substrat für die alpha-Amylase ist.

8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkesubstrat Maissirup oder Maltodextrin ist.

9. Verfahren gemäss den Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkesubstrat Maltodextrin mit einem Dextroseäquivalent unterhalb etwa 35 ist.

10. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man nach der Entfernung der festen Abfallprodukte unter Ausbildung einer zellfreien, enzymhaltigen Lösung und vor der Zugabe der Stärke ein Ausfällungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Salzen und niedrigmolekulargewichtigen organischen Lösungsmitteln, zu der enzymhaltigen Lösung zugibt und dadurch einen das Enzym enthaltenden Kuchen ausfällt und dann das Enzym von dem Enzym enthaltenden Kuchen in (i) Wasser extrahiert und anschliessend zu dem Extrakt eine Stärke in einer Menge von etwa 0,1 bis 50% (Gewicht/Volumen) der Stärke zu Wasser gibt oder in (ii) Wasser, welches Stärke in einer Menge von etwa 0,1 bis 50% (Gewicht/Volumen) Stärke zu Wasser, enthält, extrahiert.

11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion des Enzyms aus dem Kuchen im wesentlichen darin besteht, dass man Wasser oder eine Wasserlösung der Stärke durch den Kuchen zirkulieren lässt oder den Kuchen in Wasser oder in einer Wasserlösung der Stärke wieder aufschlämmt.

12. Verfahren gemäss den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass man vor oder nach der Zugabe der Stärke den pH-Wert des Extraktes auf einen Punkt einstellt, der innerhalb des Bereiches von annähernd dem isoelektrischen Punkt des Enzyms bis annähernd 4,0 pH-Einheiten oberhalb des isoelektrischen Punktes liegt.

13. Verfahren gemäss den Ansprüchen 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausfällungsmittel verwendete Salz aus der Gruppe Natriumsulfat, Ammoniumsulfat und einer Mischung davon ausgewählt ist und dass das als Ausfällungsmittel verwendete organische Lösungsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Methanol, Ethanol, 1-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, tert-Butanol und einer Mischung daraus, ausgewählt ist.

14. Verfahren gemäss den Ansprüchen 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Zugabe des Ausfällungsmittels die Enzym enthaltende Lösung um das etwa 1- bis 10-fache konzentriert worden ist.

15. Verfahren gemäss den Ansprüchen 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des wässrigen Produktes 350.000 MWU/ml ist.

16. Verfahren gemäss den Ansprüchen 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke ein Substrat für die alpha-Amylase ist.

17. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkesubstrat Maissirup oder Maltodextrin ist.

18. Verfahren gemäß den Ansprüchen 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß Stärkesubstrat Maltodextrin mit einem Dextroseäquivalent unterhalb etwa 35 ist.

19. Ein wässriges, im wesentlichen lösungsmittelstabiles alpha-Amylaseprodukt, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 18.

20. Wässrige, im wesentlichen lösungsmittelstabile alpha-Amylaseformulierung, umfassend wärmestabile alpha-Amylase aus Bacillus licheniformis und eine Stärke in einer Menge von etwa 0,1 bis 50% (Gewicht/ Volumen).

21. Formulierung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin eine Amylase, die sich von der wärmestabilen alpha-Amylase aus B. licheniformis unterscheidet, eine Protease oder eine Mischung davon enthält.

22. Formulierung gemäß den Ansprüchen 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin etwa 0 bis etwa 80% eines oberflächenaktiven Detergens aus der Gruppe amphotere, anionische, kationische, nicht-ionische, zwitterionische oder semipolar-nicht-ionische, oberflächenaktive Mittel oder eine Mischung daraus enthält.