DE69330807T2

DE69330807T2 - Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Enzym

Info

Publication number: DE69330807T2
Application number: DE69330807T
Authority: DE
Inventors: Chimanbhai P. Patel; Jayarama K. Shetty
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1992-04-08
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 2002-03-28
Anticipated expiration: 2013-03-31
Also published as: DE69330807D1; CA2093624A1; KR930021781A; FI931582A0; EP0565168B1; DK0565168T3; EP0565168A3; US5405767A; FI109808B; FI931582L; ES2164060T3; EP0565168A2; AR248165A1; CA2093624C; BR9301489A; JPH0646845A; ATE206158T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Rückgewinnung und Reinigung von Enzymen aus Fermentationspräparationen.
Die Verwendung von Enzymen in Detergenzien ist wohl bekannt. Im allgemeinen waren die in Detergenzien verwendeten Enzyme hauptsächlich die alkalistabilen Proteasen, Lipasen und alpha-Amylasen. Von den alkalischen Proteasen sind Serinproteasen, die aus Bacillusspezies, nämlich Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, und aus alkalophilen Bacillusbakterien stammen, verbreitet in Detergenzformulierungen verwendet worden. (Starace, C. und Barfor, H. C., Encyclopedia Chem. Technol. 9, Seiten 138-148 (1980); Koki Horikoshi und Terahiko Akika, A New Microbial World, Springer-Verlag, N. Y., Seite 93 (1982)).
Enzyme machen nur einen kleinen Teil der meisten flüssigen Detergenzformulierungen aus. So ist es notwendig, ziemlich konzentrierte Enzympräparationen herzustellen. Enzymkonzentrate werden üblicherweise hergestellt, indem das Wasser aus wässrigen Lösungen der Enzyme unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie z. B. Ultrafiltration oder Verdunstung entfernt wird.
Anorganische Salze wie z. B. Ammoniumsulfat und Natriumsulfat wurden weithin verwendet, um Enzyme sowohl im Labor als auch in kommerziellem Maßstab aus einer wässrigen Lösung zu präzipitieren. (Dixon, M. und Webb, E. D., Enzymes, Academic Press, N. Y., Seiten 39-41 (1964), Curline, Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, N. Y. (1980)). Die weitverbreitete Verwendung dieser Salze in einem großen Maßstab kann jedoch Umweltprobleme aufwerfen und die Abwasserbehandlung komplizieren. In der Tat haben viele Länder in Europa schon die industrielle Anwendung im großen Maßstab dieser Salze beschränkt. Organische Lösungsmittel wie z. B. Ethanol und Aceton werden ebenfalls als Präzipitationsmittel verwendet (Dixon und Webb, Enzymes, supra, Seiten 37-39; Bauer et al., Israel Journal of Chemistry, 5 (3), Seiten 117-20 (1967)), jedoch war ihre Anwendung aufgrund der Kosten und im Interesse der Sicherheit beschränkt.
Die Farbe und der Geruch von Enzymen können die Qualität der Detergenzformulierungen, in welche diese eingearbeitet werden, nachteilig beeinflussen. Dieses erfordert das Entfernen von Pigmenten aus dem Enzymkonzentrat, wobei von den Pigmenten angenommen wird, dass sie ein Teil eines Enzym-Pigmentkomplexes sind. Dixon, M. und Webb, E. C., Enzymes, supra, berichten über Lösungsmittelpräzipitationsverfahren, um ein Pigment aus einer Proteaselösung zu entfernen. Dieses Verfahren führt jedoch zu einer schlechten Produktausbeute. Die Absorption von Pigmenten mit aktiviertem Kohlenstoff aus einem wässrigen Enzymkonzentrat wird im allgemeinen bei industriellen Anwendungen praktiziert, jedoch stellen Materialverlust, hohe Kosten und Abfallentsorgung die Hauptnachteile dar.
Es ist wünschenswert, dass Enzympräparationen für Anwendungen in Detergenzien von Bestandteilen frei sind, welche eine unerwünschte Farbe, einen Schleier, eine Instabilität und eine allergene Aktivität bei dem Endprodukt bewirken. Diese Bestandteile können aus den Mikroorganismen selbst oder aus verbleibenden Fermentationsrohmaterialien stammen. Bei Präparationen von grampositiven Bacilli werden anionische Zellwandpolymere, Peptidoglycane, Galactosylpolymere und andere Polysaccharidverunreinigungen während des Zellwachstums aufgrund des Zellwandstoffwechsels solubilisiert. Das Vorliegen dieser Bakterienzellwandpolymere in Enzympräparationen kann mehrere unerwünschte Effekte, einschließlich eines Anstiegs des allergenen Potentials, einer Abnahme der Enzymstabilität durch ein Binden von Kationen, z. B. Ca&spplus;&spplus;, verursachen und kann eine Schleierbildung in Detergenzformulierungen bewirken.
In dem US-Patent Nr. 4,659,667 ist ein Verfahren zur Kristallisation eines Enzyms offenbart, in welchem der pH der übersättigten Enzymlösung auf dessen isoelektrischen pH eingestellt wird.
In dem US-Patent Nr. 4,699,882 wird ein Verfahren zur Kristallisation von Glucoseisomerase unter Verwendung von Ammonium- und Magnesiumsulfat offenbart.
In der Anmeldung nach dem Patentzusammenarbeitsvertrag ("PCT") Nr. WO 89/05863, die am 29. Juni 1986 veröffentlicht wurde, wird ein Verfahren zur Trennung des Galactosylpolymers, das mit einer allergenen Aktivität verbunden ist, aus Proteasepräparationen unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie beschrieben.
In dem US-Patent Nr. 5,041,377 wird ein Verfahren zum Erhalten kristallinen Subtilisins beschrieben, worin Subtilisin, das aus Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens stammt, durch die Zugabe eines Halogenidsalzes (Natriumchlorid und Kaliumchlorid) zu einer Lösung einer alkalischen Protease bei niedriger Temperatur kristallisiert wird.
In der PCT-Anmeldung WO 91/09943 wird ein Verfahren zur Kristallisation von Enzymen beschrieben, in welchem eine wässrige enzymhaltige Flüssigkeit mit einer relativ hohen Enzymreinheit und mit einer Konzentration des reinen Enzymproteins von wenigstens 5 g/l als ein Ausgangsmaterial verwendet wird, und ein Kristallisationsmittel, welches ein leicht lösliches Salz vom Nichthalogenidtyp wie z. B. Na-, K-, Ca- oder Mg-Formiat, -Acetat oder -Nitrat ist, zu dem Ausgangsmaterial zugegeben wird. In den Beispielen, welche Proteasen verwenden, wird das Ausgangsmaterial durch Natriumsulfatfällung hergestellt.
Das Dokument WO-A-93 13125 beschreibt ein Verfahren zum Verbessern der Rückgewinnung rekombinanter Proteine, welche über einen Fermentationsprozess hergestellt wurden. Insbesondere wird die Herstellung von gereinigter alkalischer Protease aus einem Fermentationsmedium durch Fällung mit Natriumcitrat während der Fermentation offenbart. Das Dokument WO-A-92 17579 offenbart eine alkalische Protease und deren Verwendung als ein Reinigungspräparat für Kontaktlinsen. Die letzteren zwei Dokumente sind im Hinblick auf Artikel 54(3) und (4) EPÜ relevant.
Die EP-A-0 295 940 offenbart eine flüssige Lösung, welche eine gereinigte Urokinaselösung enthält, die Zitronensäure enthält, wie auch eine feste Zusammensetzung, die aus dieser durch Lyophilisierung erhalten wurde. Die FR-A-2 519 021 beschreibt eine Zusammensetzung, welche stabilisierte Serrapeptase und entweder Asparagin- oder Glutaminsäure enthält. Diese Zusammensetzung kann als eine Flüssigkeit oder nach Lyophilisierung als eine feste Form verwendet werden.
Chemical Abstracts, Band 107, Nr. 15, 1987, Abstract Nr. 129968, F. BALFANZ et al. beschreibt ein Verfahren zur Reinigung eines Enzymkonzentrats durch Fällung über Ultrafiltration und thermische Kompression.
Keines der Patente, Patentanmeldungen oder Veröffentlichungen, die oben beschrieben wurden, liefert die wichtigen Vorteile eines einfachen und effizienten Verfahrens zur Herstellung einer gereinigten Enzympräparation, die von Verunreinigungen frei ist, wobei eine hohe Ausbeute des gereinigten Enzyms erhalten wird und die Verwendung anorganischer Salze oder anderer nicht biologisch abbaubarer Verbindungen vermieden wird.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein neues Verfahren zum Reinigen von Enzymen bereitzustellen, um so Pigmente und andere Verunreinigungen, welche mit einem Schleier, einer Farbverunreinigung oder einem Geruch verbunden sind, bei kommerziellen Enzympräparationen zu entfernen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein einfaches und neues Verfahren zur Reinigung von Enzymen bereitzustellen, welches Polysaccharide und Oligosaccharide und andere Galactosylpolymere entfernt, welche für Probleme verantwortlich sind, die mit einer allergenen Aktivität zusammenhängen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, die oben erwähnten Aufgaben durch ein neues Verfahren zu lösen, welches sowohl einfach als auch kostengünstig ist, aber dennoch zu einer hohen Rückgewinnung des reinen Enzyms führt.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, die oben erwähnten Aufgaben ohne die Verwendung umweltschädlicher oder teurer Chemikalien oder anorganischer Salze zu lösen.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Enzyms aus einer Fermentationsbrühe bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:
(i) Bilden einer Enzymlösung durch Abtrennen des Enzyms von Zellen und suspendierten Feststoffen in der Fermentationsbrühe,
(ii) Konzentrieren der Enzymlösung,
(iii) Zugeben von einer organischen Verbindung zu der konzentrierten Enzymlösung, wobei die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäuren mit mindestens zwei Carboxylgruppen, Salzen oder Estern dieser Carbonsäuren, Aminosäuren, Salzen oder Estern dieser Aminosäuren und Mischungen aus zwei oder mehr dieser organischen Verbindungen,
(iv) Inkubieren der konzentrierten Enzymlösung, enthaltend die organische Verbindung, und
(v) Sammeln eines gereinigten Enzympräzipitats.
Vorzugsweise verwendet das offenbarte Verfahren eine organische Verbindung, welche Lysin, Lysin-HCl, Asparaginsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Zitronensäure oder ein Natrium- oder Kaliumsalz dieser Säuren umfasst. Noch bevorzugter findet die Zugabe der organischen Verbindung zu der konzentrierten Enzymlösung unter Bedingungen statt, welche ein Rühren und eine Temperatur zwischen ca. 5ºC und ca. 50ºC und am meisten bevorzugt zwischen 30ºC und 40ºC einschließen.
Ein Vorteil einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, dass erstmals ein Verfahren zur Enzymreinigung offenbart wird, bei welchem das Enzym durch eine organische Verbindung gefällt wird, welche ein Bestandteil des Enzyms selbst ist.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit, Enzympräparationen zu reinigen, ohne für die Umwelt schädliche oder gefährliche Chemikalien zu verwenden, was wesentlich zu der Bewahrung der Umwelt beiträgt.
Die Erfindung wird zusammen mit weiteren Aufgaben und begleitenden Vorteilen am besten durch Bezug auf die hierin vorliegende Beschreibung, die Beispiele und Tabellen verstanden. Jedoch ist die Erfindung nicht darauf beschränkt.
Gereinigtes Enzym sollte so verstanden werden, dass es ein Enzym mit wesentlich verminderter Farbe, wahrscheinlich aufgrund der Entfernung des Pigments, definiert. Das gereinigte Enzym weist ebenfalls einen wesentlich verringerten Gehalt an Galactosylpolymer, im allgemeinen weniger als 1,00 Milligramm Galactosylpolymer pro Gramm Enzymprotein und vorzugsweise weniger als 0,65 mg/g auf. Zur Veranschaulichung weist gereinigte alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus eine Extinktion von weniger als 1,3 bei 470 nm auf, wenn diese auf eine Aktivität von 1.000.000 DU/ml konzentriert wird, und gereinigte alkalische Protease aus Bacillus licheniformis weist eine Extinktion von weniger als 0,5 bei 470 nm auf, wenn diese auf eine Aktivität von 440 DAPU/ml konzentriert wird.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein gereinigtes Produkt der alkalischen Protease wie folgt hergestellt.
Eine Fermentationsbrühe von Bacillus alcalohilus wird hergestellt, indem ein geeigneter Stamm in einem flüssigen Kulturmedium, welches die Bestandteile enthält, die zum Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, kultiviert wird.
Nach der Fermentation wird eine Enzymlösung gebildet, indem man das Enzym von den Mikrobenzellen, verschiedenen suspendierten Feststoffen und restlichen rohen Fermentationsmaterialien, die in der Fermentationsbrühe vorliegen, unter Verwendung herkömmlicher Trenntechniken abtrennt. Die resultierende Enzymlösung der alkalischen Protease wird unter Verwendung von Ultrafiltration zu einer konzentrierten Enzymlösung konzentriert, bis eine geeignete Proteaseaktivität erhalten wird, welche im Fall der alkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus ca. 1.000.000 Delfteinheiten/ml ("DU/ml") beträgt.
Zu der konzentrierten Enzymlösung wird eine organische Verbindung, welche Lysin-HCl umfasst, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Die Lösung wird auf einen pH von ca. 5,0 eingestellt, und die Lösung wird bei 30ºC für 24 Stunden unter konstanter Bewegung durch Rühren inkubiert. Bei der Zugabe von Lysin-HCl beginnt sich die alkalische Protease als ein Präzipitat aus der Lösung abzutrennen. Das Enzympräzipitat wird durch Zentrifugation bei 15.000 UpM für 30 Minuten von dem Überstand getrennt. Das Enzympräzipitat liegt vorwiegend in kristalliner Form vor und stellt ein hochgereinigtes Enzymprodukt dar. Die erhaltene gereinigte alkalische Protease in dem Präzipitat stellt eine Rückgewinnung von mehr als 94% der alkalischen Protease dar, welche vor der Präzipitation in der ungereinigten konzentrierten Lösung der alkalischen Protease vorlag.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine gereinigte alkalische Protease, die aus Bacillus licheniformis stammt, erhalten. Eine Fermentationsbrühe von Bacillus licheniformis wird hergestellt, indem ein geeigneter Stamm in einem flüssigen Kulturmedium, welches die Bestandteile enthält, die zum Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, kultiviert wird. Nach der Fermentation wird eine Enzymlösung gebildet, indem das Enzym von den Mikrobenzellen, verschiedenen suspendierten Feststoffen und restlichen rohen Fermentationsmaterialien, die in der Fermentationsbrühe vorliegen, unter Verwendung herkömmlicher Trenntechniken abgetrennt wird. Die resultierende Enzymlösung der alkalischen Protease wird unter Verwendung von Ultrafiltration zu einer konzentrierten Enzymlösung konzentriert, bis eine geeignete Proteaseaktivität erhalten wird, welche im Fall von Bacillus licheniformis ca. 863 alkalische Protease-Detergenzeinheiten/ml ("DAPU/ml") beträgt.
Zu der konzentrierten Enzymlösung wird eine organische Verbindung, welche Bernsteinsäure umfasst, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Die Lösung wird auf einen pH von ca. 6,0 eingestellt und für 4 Stunden bei 37ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren inkubiert. Bei Zugabe von Bernsteinsäure beginnt sich die alkalische Protease in Form eines Präzipitats aus der Lösung zu trennen. Das Enzympräzipitat wird durch Zentrifugation bei 20.000 UpM für 20 Minuten von dem überstand getrennt. Das Enzympräzipitat stellt ein hochgereinigtes Enzymprodukt dar und ist teilweise kristallin. Die erhaltene gereinigte alkalische Protease in dem Präzipitat stellt eine Rückgewinnung von ca. 86% der gesamten alkalischen Protease dar, die vor der Präzipitation in der ungereinigten konzentrierten Enzymlösung vorlag.
Verschiedene alternative Ausführungsformen sind möglich. Beispielsweise stammt das Enzym im allgemeinen aus einer Bakterienquelle. Bei einer allgemeinen Ausführungsform der Erfindung wird das Enzym ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Pectinasen, Amidasen, Katalasen, Isomerasen und Oxidasen. Auch einem Proteinengineering unterzogene Varianten dieser Enzyme fallen unter den Umfang der Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Enzym eine Protease, eine alkalische Protease oder eine durch Proteinengineering veränderte Variante dieser Enzyme. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Enzym die alkalische Protease oder die gentechnisch veränderte Variante davon, welche aus einer Bacillus-Spezies stammt. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym eine bakterielle alkalische Protease, die aus Bacillus licheniformis, Bacillus alcalophilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis stammt, ein Derivat von diesen oder eine durch Proteinengineering veränderte Variante dieser Enzyme. Gute Ergebnisse wurden mit bakteriellen alkalischen Proteasen erhalten, die aus Bacillus licheniformis oder Bacillus alcalophilus stammten. Eine alkalische Protease, die aus Bacillus licheniformis oder Bacillus alcalophilus stammt, sollte so verstanden werden, dass diese natürliche Proteasen wie auch deren gentechnisch veränderte Varianten einschließt.
Das Enzym sollte in der konzentrierten Enzymlösung in einer Konzentration vorliegen, die ausreicht, um zu ermöglichen, dass eine Präzipitation auftritt.
Im allgemeinen ist die organische Verbindung, welche in der Zusammensetzung vorliegt, eine organische Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Carbonsäuren mit wenigstens zwei Carboxylgruppen, Salzen oder Estern dieser Carbonsäuren, Aminosäuren, Salzen oder Estern dieser Aminosäuren und Mischungen von zwei oder mehreren dieser organischen Verbindungen.
Die Carbonsäuren werden vorzugsweise ausgewählt aus aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten Carbonsäuren. Die Aminosäuren sind vorzugsweise natürlich vorkommende Aminosäuren, entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs. Die ausgewählte organische Verbindung sollte in Wasser löslich sein, d. h. sie sollte eine Löslichkeit in reinem Wasser über 5 g/l bei 25ºC zeigen.
Die bevorzugten organischen Verbindungen sind die natürlich vorkommenden Aminosäuren, Salze oder Ester dieser Aminosäuren, da diese Bestandteile des Enzyms selbst sind.
Die natürlich vorkommenden Aminosäuren und Salze und Ester dieser Aminosäuren werden im allgemeinen ausgewählt aus den sauren Aminosäuren, basischen Aminosäuren, Salzen dieser Aminosäuren, Estern dieser Aminosäuren und Mischungen von zwei oder mehreren dieser Aminosäuren. Vorzugsweise werden sie ausgewählt aus Lysin, Arginin, Ornithin, Histidin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Serin, deren Natrium- und Kaliumsalzen, deren Chlorhydraten, Lysin-HCl (Chlorhydrat von Lysin), L-Lysinmethylesterdihydrochlorid und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser organischen Verbindungen. Insbesondere bevorzugt werden die natürlich vorkommenden Aminosäuren und Salze oder Ester dieser Aminosäuren, die ausgewählt sind aus Lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, einem Natriumsalz dieser Aminosäuren, Lysin-HCl und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser organischen Verbindungen. Gute Ergebnisse wurden mit Lysin, Lysin-HCl und Asparaginsäure erhalten. Die besten Ergebnisse wurden mit Lysin und Lysin-HCl erhalten.
Die aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten, Carbonsäuren mit wenigstens zwei Carboxylgruppen und die Salze und Ester dieser Carbonsäuren werden im allgemeinen ausgewählt aus den Carbonsäuren, die 2 bis 3 Carboxylgruppen aufweisen und welche wenigstens 3 Kohlenstoffatome enthalten, ihren Natrium-, Calcium-, Kalium- oder Magnesiumsalzen und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser organischen Verbindungen. Vorzugsweise werden sie ausgewählt aus Carbonsäuren, die 2 bis 3 Carboxylgruppen aufweisen und welche 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, ihren Natrium- oder Kaliumsalzen und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser organischen Verbindungen. Noch bevorzugter wird die organische Verbindung ausgewählt aus Malonsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Natrium- oder Kaliumsalzen dieser Säuren und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser organischen Verbindungen. Gute Ergebnisse wurden mit Malonsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, einem Natriumsalz dieser Säuren und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser organischen Verbindungen erhalten. Die besten Ergebnisse wurden mit Bernsteinsäure, Zitronensäure oder einem Natriumsalz dieser Säuren erhalten.
Fermentations-, Trenn- und Konzentrationstechniken sind im Stand der Technik wohl bekannt, und herkömmliche Verfahren können verwendet werden, um die erwünschten Ergebnisse zu erreichen.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung gereinigter alkalischer Protease hergestellt. Die vorliegende Erfindung betrachtet insbesondere Fermentationsmischungen von entweder Bacillus licheniformis oder Bacillus alcalophilus.
Zur Kultivierung von Stämmen, welche das Enzym produzieren, wird gewöhnlich ein festes oder flüssiges Kulturmedium verwendet, welches einen alkalischen Puffer wie auch die Bestandteile, welche zum Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält. Natürlich hängt die optimale Nährstoffmischung von dem bestimmten ausgewählten Mikroorganismenstamm ab, wobei eine solche Information für den Durchschnittsfachmann leicht erhältlich ist. Der Puffer sollte im allgemeinen den pH des Mediums bei einem Niveau zwischen 7,0 und 10,0 halten. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Mannose, Fructose, Mannitol, Maltose, Cellobiose, Sucrose, Dextrin, Stärke, Molassen, Glucose, hydrolysierte Stärke oder eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Kohlenstoffquellen. Stickstoffquellen, welche verwendet werden können, umfassen Sojabohnenmehl, Casein, Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, enzymatische Hydrolysate verfügbarer Proteine, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Fischmehl, Kartoffelmehl oder eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Stickstoffquellen. Beispiele für geeignete alkalische Puffer umfassen Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat und Natriumphosphat.
Das Medium, welches die obigen Bestandteile enthält, wird auf eine herkömmliche Weise sterilisiert und mit einem der Stämme der vorliegenden Erfindung, welche das Enzym produzieren, inokuliert. Die Kultivierung kann aerob unter Schütteln oder unter belüfteter Bewegung vorzugsweise bei 30ºC bis 40ºC für 30 bis 120 Stunden durchgeführt werden, um eine Kultur zu erhalten.
Wenn eine hohe Ausbeute eines bestimmten Enzyms gewünscht wird, kann es vorteilhaft sein, die Fermentationsbrühe mit einem Mikroorganismenstamm herzustellen, in welchem die Expression dieses bestimmten Enzyms amplifiziert wurde. Solche Mikroorganismen sind im allgemeinen Bakterien, und diese werden im allgemeinen hergestellt, indem Techniken wie z. B. Gentechnologie und bakterielle Transformation oder selektive Mutation verwendet werden, wobei die Techniken dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt sind.
Nach der Fermentation werden die Mikrobenzellen und verschiedene suspendierte Feststoffe, einschließlich restlicher roher Fermentationsmaterialien, durch herkömmliche Trenntechniken entfernt. Filtration, Zentrifugation, Mikrofiltration, Rotationsvakuumfiltration, Ultrafiltration, Zentrifugation gefolgt von Ultrafiltration oder dergleichen werden im allgemeinen ausreichen. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Zentrifugation, Ultrafiltration oder Zentrifugation gefolgt von Ultrafiltration verwendet. Die besten Ergebnisse werden mit einer Zentrifugation erhalten.
Es ist wünschenswert, die Enzymlösung zu konzentrieren, um die Rückgewinnung zu optimieren. Die Verwendung unkonzentrierter Lösungen erfordert eine verlängerte Inkubationsdauer, um das gereinigte Enzympräzipitat zu sammeln.
Die Enzymlösung wird zu einer konzentrierten Enzymlösung konzentriert, indem herkömmliche Konzentrierungstechniken verwendet werden, bis die gewünschte Enzymaktivität erhalten wird. Eine Konzentrierung der Enzymlösung kann durch irgendeine einer Vielzahl herkömmlicher Techniken einschließlich Filtration, Zentrifugation, Mikrofiltration, Rotationsvakuumfiltration, Ultrafiltration, Zentrifugation gefolgt durch Ultrafiltration, Verdampfung, Extraktion oder Chromatographie erreicht werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Zentrifugation und/oder Ultrafiltration verwendet. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Ultrafiltration verwendet. Das Enzym sollte in der konzentrierten Enzymlösung in einer Konzentration vorliegen, die ausreicht, um zu erlauben, dass eine Präzipitation stattfindet. Für die alkalische Protease, die aus Bacillus alcalophilus stammt, wird die Enzymlösung zu einer konzentrierten Enzymlösung konzentriert, bis die Enzymaktivität gewöhnlich wenigstens ca. 250.000 DU/ml und vorzugsweise wenigstens ca. 750.000 DU/ml beträgt. Die besten Ergebnisse wurden mit einer Enzymaktivität von ca. 1.000.000 DU/ml erhalten. Für die alkalische Protease, die aus Bacillus licheniformis stammt, wird die Enzymlösung zu einer konzentrierten Enzymlösung konzentriert, bis die Enzymaktivität ca. 250 DAPU/ml und vorzugsweise wenigstens ca. 300 DAPU/ml beträgt. Die besten Ergebnisse wurde mit einer Enzymaktivität von wenigstens ca. 400 DAPU/ml erhalten.
Die konzentrierte Enzymlösung wird mit der organischen Verbindung gemäß der Erfindung kombiniert.
Die Auswahl wenigstens einer wirksamen Menge und einer optimalen Menge der organischen Verbindung, welche wirksam ist, um die Präzipitation des Enzyms zu bewirken, und der Bedingungen der Präzipitation für eine maximale Rückgewinnung einschließlich Inkubationsdauer, pH, Temperatur und Konzentration des Enzyms sind für den Durchschnittsfachmann im Licht der vorliegenden Offenbarung nach einfachen Routinetests leicht feststellbar.
Im allgemeinen beträgt die Konzentration der organischen Verbindung wenigstens 0,06 M, gewöhnlich zwischen ca. 0,07 M und 1 M. Für die alkalischen Proteasen wird die organische Verbindung gewöhnlich bis zu einer Endkonzentration zwischen ca. 0,08 M und 0,9 M und vorzugsweise bis zu einer Endkonzentration zwischen ca. 0,09 M und 0,8 M zugegeben. Für die alkalischen Proteasen, die aus Bacillus licheniformis stammen, wird die organische Verbindung vorzugsweise bis zu einer Endkonzentration zwischen ca. 0,09 M und 0,75 M zugegeben. Für die alkalischen Proteasen, die aus Bacillus alcalophilus stammen, wird die organische Verbindung vorzugsweise bis zu einer Endkonzentration zwischen ca. 0,25 M und 0,8 M zugegeben.
Die optimale Konzentration der organischen Verbindung, welche zugegeben wird, um ein gewünschtes Enzym zu reinigen, hängt von der Natur des bestimmten Enzyms, seiner Struktur, Stabilität und Chemie ab. Beispielsweise benötigt die alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus im allgemeinen Lysin in einer Konzentration von 0,5 M, um aus der Lösung zu präzipitieren, wogegen die aus Bacillus licheniformis im wesentlichen bei Zugabe von so wenig wie 0,1 M aus der Lösung präzipitiert werden kann. Ebenso hängen die optimale Konzentration der organischen Verbindung und die Reaktionsbedingungen für die Reinigung eines gewünschten Enzyms von der bestimmten verwendeten organischen Verbindung, ihrer Struktur und Chemie und insbesondere ihrer Hydrophobie ab.
Die Lösung wird auf einen pH eingestellt, welcher notwendigerweise von dem Enzym, das gereinigt werden soll, und der verwendeten organischen Verbindung abhängt, wie oben erklärt wurde. Für alkalische Proteasen wird die Lösung gewöhnlich auf einen pH zwischen ca. 3,5 und 10,5 eingestellt. Vorzugsweise wird die Lösung auf einen pH zwischen ca. 4 und 10 eingestellt. Für alkalische Protease, die aus Bacillus licheniformis stammt, wurden gute Ergebnisse mit einem pH zwischen ca. 5,5 und 9,5 erhalten. Für die alkalische Protease, die aus Bacillus alcalophilus stammt, wurden gute Ergebnisse mit einem pH zwischen ca. 4 und 9,5 erhalten.
Im allgemeinen liegt die Temperatur während der Präzipitation zwischen ca. 5ºC und ca. 50ºC, wobei das Verfahren gewöhnlich bei einer Temperatur zwischen ca. 20ºC und ca. 45ºC und vorzugsweise zwischen ca. 28ºC und ca. 40ºC durchgeführt wird. Die optimale Temperatur zur Einleitung der Präzipitation variiert entsprechend den Lösungsbedingungen und dem Enzym oder der verwendeten organischen Verbindung. Beispielsweise wird alkalische Protease, die aus Bacillus alcalophilus stammt, im wesentlichen nach Inkubation für 6 Stunden bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 40ºC präzipitiert.
Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können hydrolytische Enzyme zu der konzentrierten Enzymlösung zugegeben werden. Somit kann Schritt (iii) weiterhin das Zugeben zu der konzentrierten Enzymlösung wenigstens eines hydrolytischen Enzyms umfassen. Die Zugabe dieser hydrolytischen Enzyme kann vor oder gleichzeitig mit der Zugabe der organischen Verbindung stattfinden, und die enzymatische Hydrolyse und die Zugabe der organischen Verbindung können nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden. Der Zweck der Zugabe hydrolytischer Enzyme ist es, polymere Verunreinigungen, welche unerwünscht sind, wie beispielsweise anionische Zellwandpolymere, Peptidoglycane, Galactosepolymer und andere Poly- und Oligosaccharidverunreinigungen, welche während der Fermentation der Mikroorganismen solubilisiert werden, zu hydrolysieren. Geeignete hydrolytische Enzyme sind Enzyme, welche Polysaccharide einschließlich Oligosacchariden, hydrolysieren, Amylasen, alpha- Amylasen, Pullulanasen, Transferasen, Polysacchardhydrolasen, Glycohydrolasen, Galactosylhydrolasen, Pectinasen, Gluconasen, Glucoamylasen oder Mischungen aus zwei oder mehreren dieser hydrolytischen Enzyme. Beispiele der bevorzugten hydrolytischen Enzyme sind CLAREX-Pectinase und DIAZYME L-200-Glucoamylase, welches Enzyme sind, die von der Solvay Enzymes, Inc., Elkhart, Indiana erhältlich sind.
Gemäß dieser Ausführungsform kann die Enzymlösung während der Inkubationsperiode, welche auf die Zugabe der organischen Verbindung folgt, bei konstantem pH und Temperatur gehalten werden. Während der Inkubationsperiode wird das Enzym von hydrolysierten polymeren Verunreinigungen getrennt und von Pigmenten abgetrennt. Bei dieser Ausführungsform ist es wünschenswert, zu ermöglichen, dass die konzentrierte Enzymlösung, welche hydrolytische Enzyme einschließt, zwischen 48 und 72 Stunden inkubiert, um eine vollständige Hydrolyse des Glactosylpolymers sicherzustellen.
Die Zeit der Inkubation, welche notwendig ist, um ein gereinigtes Enzympräzipitat gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wird nicht nur von der Natur des bestimmten Enzyms und seiner Konzentration, sondern ebenfalls von der bestimmten organischen Verbindung, die zugegeben wurde, und deren Konzentration abhängen. Im allgemeinen wird eine Inkubationsperiode von 1 bis 48 Stunden, gewöhnlich eine Periode von 2 bis 32 Stunden, und vorzugsweise eine Periode von 3 bis 25 Stunden zur Präzipitation benötigt. Beispielsweise wird alkalische Protease, die aus Bacillus alcalophilus stammt, im allgemeinen im wesentlichen nach Inkubation für 15 bis 20 Stunden präzipitiert, wenn das Präzipitationsmittel Lysin in einer Konzentration von 0,5 M ist, und die Inkubationsbedingungen einen pH von 5,0 und eine Temperatur von 30ºC einschließen. Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis präzipitiert in einem ähnlichen Zeitraum, wenn das Präzipitationsmittel Lysin in einer Konzentration von 0,5 M ist und die Inkubationsbedingungen einen pH von 6,0 und eine Temperatur von 25ºC einschließen. Wenn das Präzipitationsmittel Bernsteinsäure in einer Konzentration von 0,5 M ist, präzipitiert alkalische Protease aus Bacillus licheniformis in ca. 4 Stunden unter Inkubationsbedingungen, welche einen pH von 6,0 und eine Temperatur von 37ºC einschließen.
Die gesamte Rückgewinnung des gereinigten Enzympräzipitats und die Effizienz, mit welcher das Verfahren durchgeführt wird, werden durch Bewegen der Lösung, welche das Enzym und die zugegebene organische Verbindung umfaßt, sowohl während der Zugabe der organischen Verbindung als auch während der anschließenden Inkubationsperiode verbessert. Geeignete Verfahren zur Bewegung umfassen mechanisches Rühren oder Schütteln, kräftige Belüftung oder irgendeine ähnliche im Stand der Technik anerkannte Technik.
Nach der Inkubationsperiode wird das gereinigte Enzym von dem abgetrennten Pigment und anderen Verunreinigungen getrennt und durch herkömmliche Trenntechniken wie z. B. Filtration, Zentrifugation, Mikrofiltration, Rotationsvakuumfiltration, Ultrafiltration, Druckfiltration, Membranmikrofiltration, Querstrom- Membranmikrofiltration, Zentrifugation gefolgt von Ultrafiltration oder dergleichen gesammelt. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Filtration verwendet. Eine Membranmikrofiltration wurde zu diesem Zweck mit ausgezeichneten Ergebnissen verwendet. Eine weitere Reinigung des gereinigten Enzympräzipitats kann erhalten werden, indem das Präzipitat mit Wasser, vorzugsweise mit Wasser, welches die organische Verbindung enthält, gewaschen wird.
Wie oben angegeben wird, ist das resultierende gereinigte Enzymprodukt, wenn die organische Verbindung, welche zugegeben wird, um das Enzym zu präzipitieren, eine Aminosäure ist, vorwiegend kristallin. In ähnlicher Weise enthält das Enzymprodukt, welches erhalten wird, wenn eine Dicarbonsäure zugegeben wird, ein bestimmtes Maß an Kristallinität. Als solche können Standardtechniken zur Erhöhung der Kristallausbeute angewendet werden. Beispielsweise führt die Verwendung von Impfkristallen zu einer günstigeren Kinetik für den Kristallisationsprozess. Die Verwendung eines Reaktionsgefäßes mit gewissen Oberflächeneigenschaften ist ebenfalls vorteilhaft, wobei diese Eigenschaften für einen Durchschnittsfachmann ersichtlich sind. Das Kristallwachstum kann ebenfalls vorteilhaft durch Bewegung des Kristallisationsgefäßes gefördert werden. Die Förderung eines größeren Anteils an Kristallinität in dem Präzipitat ist vorteilhaft, da kristalline Produkte in Bezug auf die Einarbeitung in kommerzielle Produkte leichter anzuwenden und zu handhaben sind.
Gereinigte Enzymfeststoffe oder Zusammensetzungen sind nützlich für alle Anwendungen, bei welchen Enzyme entweder in fester oder flüssiger Form verwendet werden. Diese Präparationen können zu einem Endprodukt verarbeitet werden, das entweder eine flüssige Lösung, fest, granulär, ein Pulver oder eine Aufschlämmung ist. Beispielsweise können diese in Waschmitteln und Fleckentfernern, als enzymatische Kontaktlinsenreinigungssysteme, als ein Enthaarungsmittel beim Gerben, in der Nahrungsmittelindustrie und in Testverfahren für Blutserum zum Nachweis unvollständiger Antikörper verwendet werden.
Alkalische Proteasen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, sind aufgrund des verringerten Pigmentgehalts in Detergenzien und Reinigungsmitteln besonders nützlich und weisen somit einen verringerten Grad an Schleierbildung, Geruch und Farbverunreinigung auf. Darüberhinaus ist die Entfernung von Galactosylpolymeren und deren allergener Eigenschaften aus Enzympräparationen, welche gemäß den Ausführungsformen dieser Erfindung hergestellt wurden, besonders nützlich bei der Herstellung von enzymatischen Kontaktlinsenprodukten und anderen kommerziellen Anwendungen, und ebenfalls in der Nahrungsmittel-, Futter- und Detergenzindustrie.
Bei den Anwendungen in Detergenzien werden alkalische Proteasen, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, gewöhnlich in einer flüssigen Zusammensetzung, welche Propylenglycol enthält, verwendet. Die alkalische Protease wird vorzugsweise in Propylenglycol solubilisiert, indem diese in einer 25% Volumen/Volumen Propylenglycollösung, die 10% Calciumchlorid enthält, zirkuliert wird. Bei den Anwendungen in enzymatischen Kontaktlinsenreinigungssystemen werden die Enzyme, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, gewöhnlich getrocknet. Vorzugsweise werden diese durch Lyophilisierung getrocknet. Das Produkt kann ebenfalls in granulierter Form hergestellt werden, wie beispielsweise der, welche in dem US-Patent Nr. 4,689,297 von Good et al. mit dem Titel "Dust Free Particulate Enzyme Formulation", welches am 25. August 1987 erteilt wurde, auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben wird. Weiterhin kann das Produkt in Form einer Aufschlämmung vorliegen, welche suspendiertes unlösliches Enzym in Wasser einschließt.
Die folgenden Beispiele und die damit zusammenhängenden Tabellen sollen dazu dienen, die Erfindung besser zu veranschaulichen. Man wird jedoch verstehen, dass die Erfindung nicht auf diese bestimmten Beispiele oder die darin ausgedrückten Ausführungsformen beschränkt ist.

Beispiel 1

Die Wirkung variierender Konzentrationen an Lysin auf die Enzympräzipitation wurde untersucht. Eine Fermentationsbrühe wurde in einer Tauchkultur von Bacillus alcalophilus in einem geeigneten Medium erzeugt. Nach der Fermentation wurde eine Enzymlösung gebildet, indem das Enzym von den Mikrobenzellen, suspendierten Feststoffen und anderem restlichem Fermentationsrohmaterial unter Verwendung herkömmlicher Mittel wie z. B. Zentrifugation und Vakuumtrommelfiltration getrennt wurde. Eine konzentrierte Enzymlösung wurde dann aus der resultierenden Lösung der alkalischen Protease durch Ultrafiltration bis zu einer Aktivität von 1.000.000 DU/ml gebildet. Lysin wurde mit variierenden Endkonzentrationen zu der konzentrierten Enzymlösung zugegeben. Der pH der konzentrierten Enzymlösung wurde auf 5,0 eingestellt, indem verdünnte Essigsäure bei 10% Volumen/Volumen verwendet wurde. Die behandelten Proben wurden dann bei 30ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren mit einem Magnetrührer inkubiert.
Nach einer Inkubation für 24 Stunden wurde das vorwiegend kristalline Enzympräzipitat durch Zentrifugation bei 15.000 UpM für 30 Minuten von dem Überstand getrennt. Das Präzipitat wurde dann in Propylenglycol bei einem pH von 5,0 solubilisiert und für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die prozentuale Rückgewinnung in dem gereinigten Präzipitat von alkalischer Protease aus Bacillus alcalophilus wurde durch einen Test bestimmt, welcher auf der Hydrolyse eines Caseinsubstrats basierte.
Die Enzymaktivität wurde auf der Grundlage der Delft-Einheit (DU) bestimmt. Eine Caseinlösung wurde durch die nicht präzipitierte alkalische Protease in dem Überstand bei einer Temperatur von 40ºC und in einem Boratpuffer bei einem pH von 8,5 hydrolysiert. Nichthydrolysiertes Casein wurde mit Trichloressigsäure präzipitiert und durch Zentrifugation entfernt. Die Extinktion des trichloracetatlöslichen Caseinhydrolysats wurde in einem Spektrophotometer bei 275 nm gemessen. Wenn 1 ml einer 2%igen Lösung einer Enzympräparation unter den Testbedingungen einen Unterschied in der Extinktion von 0,4 ergibt, dann weist die Proteasepräparation eine Aktivität von 1000 DU auf. Der Gesamtaktivitätswert der alkalischen Protease (DU/ml) der Überstandslösung wurde mit der Aktivität einer nicht präzipitierten Kontrolle verglichen, um die prozentuale Rückgewinnung in dem Präzipitat zu bestimmen.
Die Wirkung der Lysinkonzentration auf die Menge des Proteasepräzipitats ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Rückgewinnung des gereinigten Präzipitats von alkalischer Protease unter Verwendung von Lysin

Lysinkonzentration Molarität Prozentuale Rückgewinnung im gereinigten Präzipitat
0.1 1.5
0.2 1.7
0.3 68.0
0.4 85.0
0.5 88.0

Beispiel 2

Die Zugabe von Lysin zu der konzentrierten Enzymlösung aus Beispiel 1 bewirkte einen Anstieg des pH, was eine Einstellung des pH nötig machte, um den pH bei 5,0 zu halten. Lysin-HCl wurde verwendet, um das Enzym zu reinigen, und die Rückgewinnung wurde mit einer Probe verglichen, die unter Verwendung von nur Lysin präzipitiert wurde. Eine konzentrierte Enzymlösung der alkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus mit einer Aktivität von 1.000.000 DU/ml wurde hergestellt. Lysin und Lysin-HCl wurden zu getrennten Aliquots bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Der pH wurde auf 5,0 eingestellt, und die Lösung wurde bei 30ºC für 24 Stunden unter konstanter Bewegung durch Rühren inkubiert. Die vorwiegend kristallinen Präzipitate der alkalischen Protease wurden durch Zentrifugation abgetrennt, und die Aktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Vergleich der Präzipitationswirkung von Lysin und Lysin-HCl

Organische Verbindung Prozentuale Rückgewinnung im Präzipitat
Lysin > 94
Lysin -HCl > 94
Der Unterschied in der Menge an kristallisiertem Enzym, welches erhalten wurde, variierte unwesentlich zwischen der Reinigung mit Lysin und der Reinigung mit dem Lysin-HCl. Somit kann es vorteilhaft sein, Lysin-HCl zu verwenden, um die Notwendigkeit einer erneuten Einstellung des pH zu vermeiden.

Beispiel 3

Die Wirkung des pH auf die Enzympräzipitation wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung der alkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus mit einer Aktivität von 1.000.000 DU/ml wurde hergestellt. Lysin-HCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M zugegeben. Der pH der getrennten Aliquots der Lösung wurde auf 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 und 10,0 unter Verwendung von 20% Gewicht/Volumen Natriumhydroxid eingestellt.
Nach einem Stabilisieren des pH wurden die behandelten Proben für 24 Stunden bei 30ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren inkubiert. Die vorwiegend kristallinen Präzipitate der alkalischen Protease wurden durch Zentrifugation von den Überständen abgetrennt, und die Aktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Wirkung des pH auf die Reinigung der alkalischen Protease

pH während der Inkubation Prozentuale Rückgewinnung im Präzipitat
4.5 85
5.0 88
5.5 93
6.0 83
7.0 73
8.0 63
9.0 69
10.0 5
Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, trat die maximale Präzipitation der alkalischen Protease von Bacillus alcalophilus in den sauren pH-Bereichen auf.

Beispiel 4

Die Wirkung von L-Lysinmethylesterdihydrochlorid auf die Enzympräzipitation wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung der alkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus mit einer Aktivität von 1.000.000 DU/ml, welche gemäß den Bedingungen aus Beispiel 1 erhalten wurde, wurde hergestellt. L-Lysin und L-Lysinmethylesterdihydrochlorid wurden getrennt bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben.
Der pH der Lösungen wurde auf pH 5,5 eingestellt, und die Lösungen wurden für 24 Stunden bei 30ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren inkubiert. Die Proteasepräzipitate wurden durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 15.000 UpM von den Überständen abgetrennt, und die Enzymaktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4

Wirkung des Lysinderivats auf die Enzympräzipitation

Organische Verbindung Prozentuale Rückgewinnung im Präzipitat
L-Lysin 95
L-Lysinmethylesterdihydrochlorid 76

Beispiel 5

Die Wirkung verschiedener Konzentrationen an Lysin auf die Präzipitation des Enzyms wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung von alkalischer Protease aus Bacillus licheniformis mit einer Aktivität von 500 DAPU/ml wurde hergestellt. Lysin wurde zu den konzentrierten Enzymlösungen bis zu Endkonzentrationen von 0,01 M, 0,05 M, 0,1 M, 0,2 M und 0,5 M zugegeben. Der pH jeder Lösung wurde auf 6,0 eingestellt, und die Lösungen wurden für 24 Stunden bei 25ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren inkubiert. Die vorwiegend kristallinen Präzipitate der alkalischen Protease wurden durch Zentrifugation von den Überständen abgetrennt, und die Aktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Die prozentuale Rückgewinnung in dem Präzipitat der alkalischen Protease von Bacillus licheniformis wurde durch einen Test bestimmt, welcher auf der Hydrolyse eines Caseinsubstrats bei 40ºC bei pH 8,5 (Boratpuffer) basierte. Casein wurde durch die nicht präzipitierte alkalische Protease in dem Überstand hydrolysiert. Nichthydrolysiertes Casein wurde mit Trichloressigsäure präzipitiert und durch Zentrifugation entfernt. Die Extinktion des trichloracetatlöslichen Caseinhydrolysats wurde in einem Spektrophotometer bei 275 nm gemessen. Eine alkalische Protease-Detergenzeinheit (DAPU) ist die Aktivität, welche das Äquivalent zu 4 Mikromolen Tyrosin pro Minute unter den Testbedingungen freisetzt. Der Gesamtwert der alkalischen Proteaseaktivität (DAPU/ml) der Überstandslösung wurde mit der Aktivität einer nicht präzipitierten Kontrolle verglichen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen.

Tabelle 5

Wirkung der Lysinkonzentration auf die Enzympräzipitation

Lysinkonzentration Molarität Prozentuale Rückgewinnung im Präzipitat
0.01 3
0.05 29
0.10 45
0.2 67
0.5 89

Beispiel 6

Die Wirkung von organischen Säuren, welche Dicarbonsäuren enthielten, auf die Enzympräzipitation wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung von alkalischer Protease aus Bacillus licheniformis mit einer Aktivität von 863 DAPU/ml wurde hergestellt. Zu getrennten Aliquots der konzentrierten Enzymlösung wurden Malonsäure (HOOC-CH&sub2;-COOH), Bernsteinsäure (HOOC-(CH&sub2;)&sub2;- COOH) und Glutarsäure (HOOC-(CH&sub2;)&sub3;-COOH) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Die Lösungen wurden auf einen pH von 6,0 eingestellt und für 4 Stunden bei 37ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren inkubiert. Die Enzympräzipitate wurden von den Überständen abgetrennt, und die Aktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Wirkung gewisser Dicarbonsäuren auf die Enzympräzipitation

Beispiel 7

Die Wirkung der Zugabe von organischen Säuren, welche mehrere Carboxylgruppen enthielten, auf die Präzipitation des Enzyms wurde untersucht. Eine konzentrierte Lösung der alkalischen Protease aus Bacillus licheniformis mit einer Aktivität von 440 DAPU/ml wurde hergestellt. Zu getrennten Aliquots der konzentrierten Enzymlösung wurden Natriumsalze einer Monocarbonsäure (Essigsäure), zweier Dicarbonsäuren (Malonsäure und Bernsteinsäure) und einer Tricarbonsäure (Zitronensäure) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Die Lösungen wurden auf einen pH von 6,0 eingestellt und für 4 Stunden bei 37ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren inkubiert. Die Enzympräzipitate wurden von dem Überstand abgetrennt, und der Proteingehalt, die Proteaseaktivität und die prozentuale Rückgewinnung wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Ein Proteinfarbstoffbindungsverfahren wurde verwendet, um die Gesamtproteine zu quantifizieren. (Bradford, Anal. Biochim; 72, 248, 1976). Ein Aliquot der Proteinlösung (0,1 ml) wurde in ein Teströhrchen pipettiert, und 5 ml eines Proteinfarbstoffreagenzes wurden dazu zugegeben und auf einem Vortex-Mischer gemischt. Die Extinktion bei 595 nm wurde nach 5 Minuten gegen einen Leerwert des Reagenzes gemessen, welcher aus 0,1 ml Wasser und 5 ml des Proteinfarbstoffreagenzes hergestellt wurde. Die Menge des Proteins wurde dann nach einer Standardkurve bestimmt, die mit Rinder-gamma-Globulin hergestellt wurde. Tabelle 7 Wirkung eines steigenden Grads an Carboxylgruppensubstitution auf die Enzympräzipitation
Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, stieg die Präzipitation des Enzyms mit einem steigenden Niveau der Substitution der Säure mit Carboxylgruppen. Bessere Ergebnisse wurden mit Dicarbonsäuren und Tricarbonsäuren erhalten als mit Monocarbonsäuren.

Beispiel 8

Die Wirkung des Zugebens von Carbonsäuren, welche eine Doppelbindung enthielten, auf die Präzipitation des Enzyms wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung der alkalischen Protease aus Bacillus licheniformis mit einer Aktivität von 453 DAPU/ml wurde hergestellt. Natriumsalze von Acrylsäure, Maleinsäure und Fumarsäure wurden zu getrennten Aliquots der konzentrierten Enzymlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Die Lösungen wurden auf einen pH von 6,0 eingestellt und für 4 Stunden bei 37ºC unter konstantem Bewegen durch Rühren inkubiert. Die Enzympräzipitate wurden von dem Überstand abgetrennt, und das Gesamtprotein, die Proteaseaktivität und die prozentuale Rückgewinnung wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Maleinsäure und Fumarsäure, beide ungesättigte Carbonsäuren, präzipitierten das Enzym. Jedoch wies Acrylsäure, eine ungesättigte Monocarbonsäure, keine Wirkung auf die Löslichkeit der alkalischen Protease auf und es wurde kein Präzipitat erhalten. Tabelle 8 Wirkung ungesättigter Carbonsäuren auf die Enzympräzipitation

Beispiel 9

Die Wirkung des pH auf die Fähigkeit von Bernsteinsäure, das Enzym zu präzipitieren, wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung der alkalischen Protease aus Bacillus licheniformis mit einer Aktivität von 750 DAPU/ml wurde hergestellt. Bernsteinsäure wurde zu der konzentrierten Enzymlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M zugegeben. Getrennte 100 ml Aliquots wurden auf pH-Niveaus von 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 und 9,0 unter Verwendung von 20% Natriumhydroxid eingestellt, und die Lösungen wurden für 20 Stunden bei einer Temperatur von 30ºC unter konstanter Bewegung durch Rühren inkubiert. Die Enzympräzipitate wurden von dem Überstand abgetrennt, und die Aktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.

Tabelle 9

Wirkung des pH auf die Enzympräzipitation

pH der Präzipitation Prozentuale Rückgewinnung im Präzipitat
4.0 0.8
5.0 5.7
6.0 71
7.0 81
8.0 92
9.0 94
Wie in Tabelle 9 gezeigt ist, trat die maximale Präzipitation der alkalischen Protease, die aus Bacillus licheniformis stammte, in den basischen pH-Bereichen auf.

Beispiel 10

Die Wirkung der Zeit auf die Präzipitation des Enzyms mit Lysin wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung der alkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus mit einer Aktivität von 1.000.000 DU/ml wurde hergestellt. Lysin wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Die Lösung wurde auf einen pH von 5,0 eingestellt und bei 30ºC inkubiert. Die Enzympräzipitate wurden von dem Überstand abgetrennt, und die Aktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.

Tabelle 10

Inkubationsdauer in Stunden Prozentuale Rückgewinnung im Präzipitat
10 73
15 90
24 89.5
36 91
48 94
Wie in Tabelle 10 gezeigt ist, erschien ein wesentlicher Teil des Enzyms nach 10-20 Stunden in dem Präzipitat.

Beispiel 11

Die Wirkung der Temperatur auf die Präzipitation des Enzyms mit Lysin wurde untersucht. Eine konzentrierte Enzymlösung der alkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus mit einer Aktivität von 1.000.000 DU/ml wurde hergestellt. Lysin wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Getrennte Aliquots der Lösung wurden auf einen pH von 5,0 eingestellt und bei variierenden Temperaturen für 6 Stunden inkubiert. Die Enzympräzipitate wurden von dem Überstand abgetrennt, und die Aktivität wurde gemessen, um die prozentuale Rückgewinnung zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.

Tabelle 11

Temperatur der Inkubation ºC Prozentuale Rückgewinnung im Präzipitat
5 1
20 65
30 73
35 94
40 91
Wie in Tabelle 11 gezeigt ist, trat die wesentliche Präzipitation unter diesen Bedingungen zwischen 20ºC und 40ºC auf.

Beispiel 12

Alkalische Protease wird aus einer Fermentationsbrühe einer Tauchkultur von Bacillus licheniformis in einem geeigneten Medium erzeugt. Nach der Fermentation werden die Mikrobenzellen und suspendierte Feststoffe durch Zentrifugation von der alkalischen Protease abgetrennt. Die resultierende Lösung der alkalischen Protease wird dann unter Verwendung von Ultrafiltration konzentriert. Eine wässrige Lösung des Konzentrats der alkalischen Protease mit einer enzymatischen Aktivität von 880 DAPU/ml wird erhalten.
Unterschiedliche Mengen von Aminosäuren werden zu 30 ml dieser konzentrierten Enzymlösung bei einem pH von 6,0 zugegeben. Der pH der Lösung wird unter Verwendung von Natriumhydroxid bei einem pH von 6,0 gehalten. Das Volumen der Lösung wird mit Wasser auf 50 ml eingestellt und für 4 Stunden bei 37ºC unter konstantem Bewegen inkubiert. Das Enzympräzipitat wird durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 5ºC und 20.000 UpM abgetrennt.
Der klare Überstand wird im Hinblick auf Protein und Enzymaktivität analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Tabelle 12 Wirkung von Aminosäuren auf die Enzympräzipitation

Beispiel 13

Die Wirkung des Zugebens von Monocarbonsäuren auf die Präzipitation des Enzyms wurde untersucht. Eine konzentrierte Lösung der · alkalischen Protease aus Bacillus licheniformis mit einer Aktivität von 440 DAPU/ml wurde hergestellt. Natriumsalze von zwei Monocarbonsäuren, Essigsäure und Ameisensäure, wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Der pH der Lösung wurde auf 6,0 eingestellt, und die Lösung wurde für 4 Stunden bei 37ºC unter Bedingungen eines konstanten Bewegens durch Rühren inkubiert. Das Enzympräzipitat wurde durch Zentrifugation von dem Überstand abgetrennt, und der Proteingehalt, die Proteaseaktivität und die prozentuale Rückgewinnung wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13
Der Vergleich der Ergebnisse von Vergleichsbeispiel 13 mit denen aus Beispiel 7, das unter identischen Bedingungen durchgeführt wurde, zeigt, dass sehr viel bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn eine organische Verbindung gemäß der Erfindung als Präzipitationsmittel verwendet wird.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Enzym aus einer Fermentationsbrühe, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Bilden einer Enzymlösung durch Abtrennen des Enzyms von den Zellen und suspendierten Feststoffen in der Fermentationsbrühe,

(ii) Konzentrieren der Enzymlösung,

(iii) Zugeben von einer organischen Verbindung zu der konzentrierten Enzymlösung, wobei die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäuren mit mindestens zwei Carbonsäuregruppen, Salzen oder Estern dieser Carbonsäuren, Aminosäuren, Salzen oder Estern dieser Aminosäuren und Mischungen aus zwei oder mehr dieser organischen Verbindungen,

(iv) Inkubieren der konzentrierten Enzymlösung, enthaltend die organische Verbindung, und

(v) Sammeln eines gereinigten Enzympräzipitats.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem Schritt (iii) bei einem pH von 3,5 bis 10,5 ausgeführt wird.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem die Schritte (iii) und (iv) unter Bedingungen ausgeführt werden, die Schütteln einschließen.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem während Schritt (iii) die organische Verbindung bis zu einer Endkonzentration von mindestens 0,06 M zugegeben wird.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem Schritt (iii) bei einer Temperatur zwischen etwa 5ºC und etwa 50ºC ausgeführt wird.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, welches nach dem Schritt (v) einen Schritt (vi) umfaßt, der aus Waschen des gereinigten Enzympräzipitats mit Wasser, enthaltend die organische Verbindung, besteht.

7. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem die organische Verbindung ausgewählt ist aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, Salzen oder Estern dieser Aminosäuren ausgesucht unter sauren Aminosäuren, basischen Aminosäuren, deren Salze, deren Ester und Mischungen aus zwei oder mehr dieser organischen Verbindungen.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, in dem die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, deren Natriumsalze, Lysin-HCl und Mischungen aus zwei oder mehr dieser organischen Verbindungen.

9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, in dem die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Lysin und Lysin-HCl.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem die organische Verbindung ausgewählt ist aus Carbonsäuren und Salzen dieser Carbonsäuren ausgesucht unter Carbonsäuren mit 2 bis 3 Carbonsäuregruppen und enthaltend mindestens 3 Kohlenstoffatome, deren Natrium-, Calcium-, Kalium- oder Magnesiumsalze und Mischungen aus zwei oder mehr dieser organischen Verbindungen.

11. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, in dem die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malonsäure, Succinsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, deren Natrium- oder Kaliumsalze und Mischungen aus zwei oder mehr dieser organischen Verbindungen.

12. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, in dem die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Succinsäure, Zitronensäure und einem Natriumsalz dieser Säuren.

13. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Pectinasen, Amidasen, Katalasen, Isomerasen und Oxidasen.

14. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem das Enzym eine alkalische Protease umfaßt.

15. Das Verfahren gemäß Anspruch 14, in dem das Enzym die alkalische Protease abgeleitet vom Bacillus alcalophilus ist und in dem während Schritt (ii) die Enzymlösung zu einer konzentrierten Enzymlösung konzentriert wird, bis die Enzymaktivität mindestens etwa 250000 DU/ml beträgt.

16. Das Verfahren gemäß Anspruch 14, in dem das Enzym die alkalische Protease abgeleitet vom Bacillus licheniformis ist und in dem während Schritt (ii) die Enzymlösung zu einer konzentrierten Enzymlösung konzentriert wird, bis die Enzymaktivität mindestens etwa 250 DAPU/ml beträgt.

17. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem Schritt (iii) ferner die Zugabe von mindestens einem hydrolytischen Enzym zu der konzentrierten Enzymlösung umfaßt.

18. Ein Verfahren zur Herstellung von gereinigter alkalischer Protease abgeleitet vom Bacillus alcalophilus oder Bacillus licheniformis aus einer Fermentationsbrühe, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Bilden einer alkalischen Proteaselösung durch Abtrennen der alkalischen Protease von den Zellen und suspendierten Feststoffen in der Fermentationsbrühe,

(ii) Konzentrieren der alkalischen Proteaselösung,

(iii) Zugeben von einer organischen Verbindung zu der konzentrierten alkalischen Proteaselösung, wobei die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäuren mit mindestens zwei Carbonsäuregruppen, Salzen oder Estern dieser Carbonsäuren, Aminosäuren, Salzen oder Estern dieser Aminosäuren und Mischungen aus zwei oder mehr dieser organischen Verbindungen,

(iv) Inkubieren der konzentrierten alkalischen Proteaselösung, enthaltend die organische Verbindung, und

(v) Sammeln eines gereinigten alkalischen Proteasepräzipitats, in dem die alkalische Protease einen Galactosylpolymergehalt von weniger als 1,00 mg/g Enzymprotein definiert.

19. Das Verfahren gemäß Anspruch 18, in dem die alkalische Protease abgeleitet ist von Bacillus alcalophilus Fermentationsbrühe und diese während Schritt (v) gesammelte gereinigte alkalische Protease eine Absorption von weniger als 1, 3 bei 470 nm aufweist, wenn sie auf eine Aktivität von etwa 1000000 DU/ml konzentriert wurde.

20. Das Verfahren gemäß Anspruch 18, in dem die gereinigte alkalische Protease abgeleitet ist von einer Bacillus licheniformis Fermentationsbrühe und diese während Schritt (v) gesammelte gereinigte alkalische Protease eine Absorption von weniger als 0,5 bei 470 nm aufweist, wenn sie auf eine Aktivität von 440 DAPU/ml konzentriert wurde.