DE3779906T2

DE3779906T2 - Bei niedriger temperatur aktive alkalische protease aus paecilomyces marquandii und deren herstellung.

Info

Publication number: DE3779906T2
Application number: DE8787907943T
Authority: DE
Inventors: Marie Beck; Joseph Strobel
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1986-11-25
Filing date: 1987-11-25
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2007-11-26
Also published as: DK563986D0; DK563986A; EP0290569A1; EP0290569B1; JP2609312B2; JPH01502477A; WO1988003948A1; ATE77409T1; DE3779906D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige alkalische Protease, ein Verfahren zur Herstellung derselben und ihre Verwendung in Kombination mit anderen Proteasen. Diese Protease kann vorteilhafterweise als Zusatz zu Reinigungsmitteln verwendet werden. Typische Reinigungsmittel sind Waschmittelzusammensetzungen zum Wäschewaschen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Proteolytische Enzyme, hergestellt durch Kultivierung von Mikroorganismenstämmen aus der Gattung Bacillus in geeigneten Nährstoffmedien, werden in weitem Umfang in Waschmittelzusammensetzungen verwendet. Beispiele solcher kommerziell erhältlichen Proteinase-Produkte sind ALCALASE , ESPERASE und SAVINASE , alle erhältlich von NOVO INDUSTRI A/S, Dänemark. Diese und die von Bacillus abgeleiteten ähnlichen Enzymprodukte anderer Lieferanten sind in Waschmittellösungen bei pH-Werten im Bereich von 8 bis 11 und in Gegenwart der normalerweise in Waschmittellösungen vorhandenen Komplexbildner, Tenside und Bleichmittel enzymatisch aktiv.
Die Protease in ALCALASE wird durch Kultivieren von Stämmen der Spezies Bacillus licheniformis hergestellt. Die Proteasen in ESPERASE und SAVINASE sind durch Kultivierung von alkalophilen Bacillus-Spezies gemäß US-Patent 3,723,250 erhältlich und dadurch gekennzeichnet, daß sie vom Serin-Typ sind und optimale proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb etwa 9 zeigen und 80 bis 100 % maximaler proteolytische Aktivität bei pH 12 beibehalten, wobei besagte Aktivitäten mit der Anson-Methode gegen Hämoglobin gemessen sind.
Das Temperaturoptimum der obigen kommerziell erhältlichen alkalischen Proteasen ist etwa 60ºC. Diese kommerziellen Enzyme zeigen jedoch eine relativ niedrigere Aktivität bei Raumtemperatur.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Herstellung, Isolierung, Charakterisierung und Verwendung einer neuartigen alkalischen Protease, die aus einem Pilz-Mikroorganismus gewonnen wird. Der die Protease produzierende Mikroorganismus ist ein Isolat von Paecilomyces marquandii. Von diesem Mikroorganismus ist bisher nicht bekannt gewesen, daß er eine brauchbare alkalische Protease produziert. Das Temperaturoptimum dieser Protease ist etwa 45ºC, etwa 15ºC niedriger als dasjenige der kommerziell erhältlichen Waschmittelenzyme. Zusätzlich bewirkt die Pilzprotease dieser Erfindung ein anderes Proteinhydrolysemuster als dasjenige, das von Bacillus- Protease erzeugt wird.
Die Pilzprotease dieser Erfindung ist bei niedrigen Temperaturen, z.B. in kaltem Wasser, also bei 15º bis 25ºC, effektiver als die kommerziell erhältlichen Bacillus- Proteasen.
Ihr anderes Hydrolysemuster macht die Pilzprotease gegenüber einigen Proteinen wirkungsvoll, die gegenüber der Wirkung der Bacillus-Proteasen widerstandsfähig sind. Zusätzlich ist ein Synergismus bei Mischungen beobachtet worden, die mit der Pilzprotease aus Paecilomyces marquandii und gewissen Bacillus-Proteasen hergestellt worden sind. Daher ist die Verwendung der Pilzprotease in Kombination mit einer Bacillus-Protease attraktiv und wird von den Erfindern in Betracht gezogen.

DISKUSSION DER ERFINDUNG

Obgleich viele kommerzielle Verwendungen für Proteasen existieren, stellt die Verwendung in Waschmitteln einen Hauptmarkt dar, und dementsprechend ist die folgende detaillierte Diskussion der Paecilomyces marquandii-Protease in den Zusammenhang der Nützlichkeit für die Verwendung in Waschmitteln gestellt. Es sollte jedoch anerkannt werden, daß die vielen anderen existierenden Verwendungen für proteolytische Enzyme von den Erfindern in Betracht gezogen werden.
Es sollte auch anerkannt werden, daß Enzyme oft besonders empfindlich gegenüber den Anwendungsbedingungen sind, als wichtigstes gegenüber pH, Temperatur und, für die Verwendung in Waschmitteln, gegenüber der Gegenwart üblicher Komplexbildner, wie z.B. EDTA. Folglich wird eine Protease, die an die üblichen amerikanischen Waschbedingungen zum Waschen von Baumwollgeweben, die zum Beispiel bei pH 8-9 und bei 60ºC liegen können, gut angepaßt ist, unter den Niedertemperatur-Waschbedingungen, die für das Waschen vieler moderner Gewebe empfohlen werden, weniger wirkungsvoll sein. Das niedrigere Temperaturoptimum der Paecilomyces marquandii- Protease ist somit ein Hauptvorteil dieses Enzyms. In praktischer Hinsicht bedeutet das niedrigere Temperaturoptimum, daß von diesem Enzym weniger benötigt wird, um bei 45ºC ein gewünschtes Niveau an enzymatischer Aktivität in Waschmittellösung zu erzeugen (als z.B. von einer heutzutage für Waschmittelzusatzzwecke verwendeten Bacillus-Protease erforderlich wäre). Ein verwandtes praktisches Ergebnis ist, daß Waschmittelhersteller nunmehr eine Enzymkombination der Paecilomyces marquandii-Protease mit einer Bacillus-Protease, z.B. ALCALASE , ESPERASE oder SAVINASE , zur Verfügung stellen können, die über den gesamten Temperaturbereich für das Waschen in kaltem Wasser bis zum (standardmäßigen) Waschen in heißem Wasser wirkungsvoll ist. Darüber hinaus bewirkt die Kombination der Paecilomyces marquandii-Protease mit gewissen Bacillus-Proteasen einen synergistischen Effekt in der Weise, daß eine Mischung wirkungsvoller ist als jedes Enzym für sich allein. Dies trifft sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Dosierungen zu, wie in den im folgenden angeführten Beispielen X bzw. XI nachgewiesen ist. Eine Proteasezubereitung, die die alkalische Protease aus Paecilomyces marquandii umfaßt, zeigt etwa eine um 40 % höhere Fähigkeit beim Bleichen von auf Proteinen beruhenden Flecken auf Baumwolle (EMPA 116) unter simulierten Waschbedingungen bei 15ºC als die gut bekannte ALCALASE -Protease.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung der neuartigen alkalischen Protease zur Verfügung gestellt, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Protease produzierender Stamm von Paecilomyces marquandii unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert wird, das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen enthält, gefolgt von der Gewinnung des Proteasepräparats aus der Fermentationsbrühe.
Gemäß einem anderen Modus der Erfindung wird die Protease aus Paecilomyces marquandii zu einem gemischten Enzymprodukt formuliert, das eine von Bacillus abgeleitete Protease und die Paecilomyces marquandii-Protease umfaßt. Bevorzugte von Bacillus abgeleitete Proteasen sind ALCALASE , ESPERASE und SAVINASE .
Zum weiteren Verständnis dieser Erfindung wird Bezug genommen auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Figur 1 das Elutionschromatogramm von Verdauungsprodukten zeigt, erhalten nach Behandlung von oxidierter β-Kette von Insulin mit der Protease aus Paecilomyces marquandii für zwei Stunden, und, zum Vergleich, von Verdauungsprodukten, erhalten nach Behandlung mit den bekannten Proteasen, ALCALASE und SAVINASE .
Figur 2 eine graphische Darstellung der Aktivität von Protease von Paecilomyces marquandii bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten, in Abwesenheit und bei Vorhandensein von Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 1 mM) oder EDTA (10 mM), ist.
Figur 3 eine graphische Darstellung einer Waschuntersuchung ist, die mit ALCALASE allein und zusammen mit ein wenig von der Paecilomyces marquandii-Protease, mit einer relativ hohen Dosierung, durchgeführt worden ist.
Die Daten für die Veränderung des Reflexionsvermögens, als Figur 3 graphisch dargestellt, beweist, daß das Kombinieren der Protease von Paecilomyces marquandii mit einer Bacillus- Protease zu einer verbesserten Waschwirkung führt. Das Erhöhen der Dosierung von ALCALASE allein von 0,4 auf 0,6 AU/l bewirkt wenig Verbesserung in der Veränderung des Reflexionsvermögens. Die Verwendung einer Enzymmischung derselben proteolytischen Gesamtaktivität, z.B. 0,6 AU/l, bewirkt eine wesentlich verbesserte Veränderung des Reflexionsvermögens.
Figur 4 eine graphische Darstellung des synergistischen Effektes ist, erhalten in Waschtests mit einer Mischung der Pilz-Protease aus Paecilomyces marquandii und einer anderen Bakterien-Protease, SAVINASE . Die Gesamtenzymdosierung, 0,1 KOU/Liter, ist ähnlich derjenigen, die durch Verwendung kommerzieller proteasehaltiger Waschmittel erreicht wird. Im oberen Diagramm stellen die ersten zwei Säulen die Veränderung des Reflexionsvermögens dar, erhalten für SAVINASE bzw. Paecilomyces marquandii allein. Die dritte Säule stellt den (theoretischen) ΔR-Wert dar, der für die 90:10- Kombination von SAVINASE und die Paecilomyces marquandii- Protease, d.h. 90 % des ΔR für SAVINASE allein plus 10% des ΔR für Paecilomyces marquandii allein, erwartet werden kann. Die vierte Säule stellt den experimentellen ΔR-Wert dar, der erhalten wird, wenn solch eine 90:10-Mischung in einem Waschvorgang verwendet wird. Der beobachtete ΔR-Wert ist 50 % größer als der theoretische Wert, wodurch gezeigt ist, daß Synergismus aufgetreten ist.
Zum Vergleich wurde auch eine Mischung zweier Bakterienproteasen getestet, SAVINASE und ALCALASE . Die Ergebnisse sind in der unteren Hälfte von Figur 4 dargestellt. In diesem Fall war der experimentelle ΔR, der für die 90:10-Mischung von SAVINASE und ALCALASE herhalten wurde, geringer als der vorhergesagte, d.h. keine Synergie.

Der Mikroorganismus

Der Mikroorganismus dieser Erfindung ist ein aerobes Pilz- Isolat von Paecilomyces marquandii.
Optimale Temperatur für das Wachstum: 20ºC bis 30ºC, kein Wachstum bei oder oberhalb 35ºC.
Optimaler pH für das Wachstum: 7,5-10.
Grau-weiße Kolonien auf Czapek-Dox-Agar-Schrägplatten; reichliche Sporenbildung, die für die rötlich-graue Farbe reifer Kolonien verantwortlich ist.
Ein gewisser Grad an Stammspezifizität kann im Fall des Paecilomyces marquandii bestehen. Das Isolat, das das Enzym dieser Erfindung hervorbringt, ist NRRL 18048. Soweit die Erfinder in der Lage gewesen sind, dies festzustellen, ist kein Stamm von Paecilomyces marquandii als der Typstamm identifiziert worden. Das Isolat, das am ehesten einem Typ- Stamm entspricht, scheint NRRL 901 zu sein (identisch mit ATCC 10525), und dieser Stamm bringt die Protease dieser Erfindung nicht hervor. Man nimmt an, daß NRRL 18048 und NRRL 901 verschiedene Varianten von Paecilomyces marquandii sind.

Test auf proteolytischer Aktivität

Die proteolytische Aktivität in Paecilomyces marquandii- Kulturen wurde mit der gut bekannten Anson-Hämoglobin- Methode, vgl. Journal of General Physiology, 22, 79-89 (1959), bestimmt. Eine Anson-Einheit ist die Menge an proteolytischem Enzym, die Hämoglobin bei einem pH-Wert von 9,0 und einer Temperatur von 25ºC während einer Reaktionszeit von 10 Minuten mit so einer Anfangsgeschwindigkeit verdaut, daß pro Minute eine solche Menge an Spaltprodukten gebildet wird, die nicht mit Trichloressigsäure ausgefällt werden kann, daß diese Spaltprodukte dieselbe Farbe mit Phenolreagenz ergeben, wie dies ein Milliäquivalent Tyrosin tut.
Proteolytische Aktivität wurde auch durch die Hydrolyse von Casein und anschließende Reaktion von in TCA löslichen Peptiden mit o-Phthaldialdehyd und β-Mercaptoethanol bestimmt. Die Extinktion des resultierenden Komplexes wird bei 340 nm gemessen und mit einem Serin-Standard verglichen. Reaktionsmischungen enthalten 3 ml 0,8 % (w/v) Hammerstein- Casein und 0,5 ml einer geeigneten Enzymverdünnung, beide in Universalpuffer 1 von Britton und Robinson, pH 9,5 (J. Chem. Soc. 1931, S. 1451). Die Mischungen werden für 30 Minuten bei 25ºC inkubiert, dann wird die Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml Stopreagenz (3,6 % w/v TCA, 6,0 % w/v Natriumacetat und 3,78 % w/v Eisessig) abgebrochen. In Kontrollreaktionen wird das Stopreagenz vor Enzymzugabe zugegeben. Nach 20 Minuten bei 25ºC werden die Reaktionsmischungen durch Whatman - Filterpapier Nr. 42 filtriert oder zentrifugiert.
Ein aliquoter Teil (200 ul) des Filtrats wird zu 3 ml OPA- Reagenz zugegeben, das 0,05M Natriumtetraborat, 1 % w/v Natriumdodecylsulfat, 0,8 mg/ml o-Phthaldialdehyd (OPA) (ursprünglich gelöst als eine 40 mg/ml-Lösung in Ethanol) und 0,2 % w/v β-Mercaptoethanol enthält. Nach 2 Minuten wird die Extinktion bei 340 nm bestimmt. In ähnlicher Weise wird ein aliquoter Teil von 200 ul eines Serin-Standards (0,2 mg/ml) zu 3 ml OPA-Reagenz zugegeben und die A&sub3;&sub4;&sub0; bestimmt. Die Aktivität wird in KOU (Kilo-OPA-Einheiten) ausgedrückt, wobei 1 KOU definiert ist als die Menge an proteolytischem Enzym, die zur Freisetzung von 1 mmol -NH&sub2; führt, freigesetzt pro Minute unter definierten Bedingungen.

Herstellung von Protease-Konzentrat

Der Paecilomyces marquandii-Stamm NRRL 18048 wird unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, wobei das Medium gemäß den Prinzipien des bekannten Standes der Technik zusammengesetzt ist.
Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie etwa Saccharose, Glucose und Maltose, oder kohlehydrathaltige Materialien, wie etwa Getreidekörner, Malz, Reis und Sorghum. Die Kohlehydratkonzentration, die im Medium enthalten ist, kann in weitem Umfang variieren, z.B. von 1 bis 15 %, aber normalerweise werden 8-10 % geeignet sein, wobei die Prozentanteile als Glucose-Äquivalente berechnet sind.
Die Stickstoffquelle im Nährstoffmedium sollte organischer Natur sein. Unter den organischen Stickstoffquellen wird eine ziemliche Anzahl regelmäßig bei Fermentationsprozessen verwendet, die die Kultivierung von Pilzen mit sich bringen. Veranschaulichende Beispiele sind Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakt und Albumin. Zusätzlich sollte das Nährstoffmedium auch die üblichen Spurenelemente enthalten.
Da Paecilomyces marquandii psychrophil ist, indem er nicht in der Lage ist, bei Temperaturen oberhalb 35ºC zu wachsen, wird die Kultivierung vorzugsweise im Temperaturbereich von 20ºC bis 30ºC und bei alkalischen pH-Werten durchgeführt. Der alkalische pH kann durch Zugabe geeigneter Puffer erreicht werden, wie etwa Natriumcarbonat oder Mischungen von Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat (nach Sterilisierung des Wachstumsmediums). Zur Kultivierung in Tankfermentern ist es notwendig, künstliche Belüftung anzuwenden. Die Belüftungsrate kann diejenige sein, die bei herkömmlicher Tankfermentation verwendet wird.
Nach der Fermentation kann ein flüssiges Enzymprodukt durch Entnahme von Rohmaterial aus der Brühe und, falls erwünscht, durch Konzentration der Brühe durch Eindampfen bei niedriger Temperatur oder durch Umkehrosmose hergestellt werden. Schließlich können Konservierungsstoffe und/oder Enzymstabilisatoren, wie etwa Propylenglykol, zum Konzentrat zugesetzt werden. Ein flüssiges Produkt ist für das Einbringen in flüssige Waschmittel geeignet.
Feste Enzympräparate können aus der gereinigten und/oder konzentrierten Brühe durch Ausfällung mit Salzen, wie etwa Na&sub2;SO&sub4;, oder mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie etwa Ethanol oder Aceton, hergestellt werden. Entfernung des Wassers in der Brühe durch geeignete Trocknungsmethoden, wie etwa Sprühtrocknung, kann ebenfalls durchgeführt werden. Die proteolytische Aktivität eines so gewonnenen Proteasepräparats liegt üblicherweise im Bereich von 0,1-2,0 AU/g.
Nicht-staubende Granulate können mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. gemäß GB- Patent 1,362,365 oder US-Patent 4,106,991. Solche Granulate sind zum Einbringen in Pulverwaschmittel geeignet.

Peptidkartierung

Die Peptide, die durch von Protease katalysierter Verdauung der oxidierten β-Kette von Insulin hergestellt worden waren, wurden durch Umkehrphasen-HPLC getrennt. Chromatogramme von Peptid-Verdauungsprodukten, erhalten durch die Wirkung der Paecilomyces marquandii-Protease, gereinigt, wie in Beispiel VII beschrieben, sind in Figur 1 dargestellt. Zum Vergleich sind auch die Peptide angegeben, die durch Verdauung mit den bekannten alkalischen Proteasen, ALCALASE und SAVINASE , erzeugt worden sind. Man kann sehen, daß die Protease dieser Erfindung im Hinblick auf ihr Muster der Verdauung der oxidierten β-Kette von Insulin deutlich verschieden ist von jeder der alkalischen Bacillus-Proteasen; es zeigt sich ein mehr zufälliges Verdauungsmuster.

Immunchemische Eigenschaften

Ouchterlony-Doppel-Immundiffusionstests zeigten keine Kreuzreaktion zwischen den Paecilomyces marquandii- und den alkalischen Serin-Proteasen, ALCALASE und SAVINASE , wenn gegen diese Proteasen hergestellte Antikörper als Referenzstandards verwendet wurden.

BEISPIEL I

Paecilomyces marquandii-Stamm NRRL 18048 wurde bei 26ºC auf einem Dreh-Rütteltisch (250 UPM) in unterteilten 250ml- Erlenmeyer Kolben, die 25 ml Medium der folgenden Zusammensetzung enthielten, kultiviert:

Zusammensetzung des Mediums in Gramm pro Liter:

Glucose 100
Sojabohnenmehl 75
Hefeextrakt 1
Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O 10
Pluronic R 25R2 0,1
Natriumcaseinat 5
Nach Sterilisierung wurde der pH des Mediums durch Zugabe von 5 ml einer 1M Lösung Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer auf 9,2 eingestellt.
Nach 7-9 Tagen Inkubation wurde die proteolytische Aktivität der Kultur unter Verwendung der oben beschriebenen Anson- Methode bestimmt. Die Enzymaktivität der Brühe betrug 16-18 AU/l.

BEISPIEL II

Paecilomyces marquandii-Stämme NRRL 18048 wurden in einem Medium kultiviert, das aus folgendem bestand (Gramm/Liter):
Maltodextrin 20
Sojabohnenmehl 20
K&sub2;HPO&sub4; 9
CaCO&sub3; 5
Hefeextrakt 2
Pluronic 25R2 1
Nach Autoklavieren wurde der pH durch Zugabe von NaCO&sub3;/NaHCO&sub3;-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1M auf 9,2 eingestellt. Die Kultur wurde bei 250 UPM, 30ºC, für 24 Stunden inkubiert. Nach dieser Wachstumsperiode wurde die Kultur (600 ml) verwendet, um einen Fermenter zu beimpfen, der 10 Liter des folgenden Mediums enthielt (Gramm/Liter):
Glucose 50
Sojabohnenmehl 100
K&sub2;HPO&sub4; 5
CaCO&sub3; 5
Nach Sterilisierung wurde das Medium mit 2M Na&sub2;CO&sub3; auf pH 8,2 eingestellt. Der pH fiel während der frühen Wachstumsstadien im Fermenter auf etwa 7,0. Die Temperatur wurde anfangs bei 30ºC eingeregelt und auf 25ºC abgesenkt, als der pH begann, über 7,0 zu steigen. Von diesem Punkt an wurde der pH so kontrolliert, daß er nicht unter 7,0 fiel, durch Zugabe von KOH oder Na&sub2;CO&sub3;, oder 7,6 nicht überstieg, durch Zugabe von H&sub3;PO&sub4;. Pluronic wurde zur Schaumsteuerung verwendet. Rühren und Belüften wurden gesteigert, wenn der O&sub2;-Bedarf anstieg; der Fermenter wurde über 24 Stunden bei maximaler Sauerstoff- Transferrate gefahren. Nach 120 Stunden wurde der Protease- Titer unter Verwendung der Anson-Testmethode bestimmt, der einen Wert von 25 Anson-Einheiten/Liter anzeigte.
Die Kulturbrühe wurde filtriert, um das in den folgenden Beispielen verwendete Proteaseprodukt zu ergeben.

BEISPIEL III

Die Aktivität der Protease aus Beispiel II als eine Funktion von pH und Temperatur wurde unter Verwendung von Casein als Substrat gemäß der oben beschrieben Testmethode bestimmt. Zusätzlich wurden die Wirkungen von EDTA (10 mM) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 1 mM) auf die Proteaseaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind graphisch in Figur 2 dargestellt. Wie man in dieser Figur sieht, ist das Temperaturoptimum 45ºC, wenigstens 15ºC niedriger als dasjenige der kommerziellen Proteasen ALCALASE und SAVINASE . Die Protease zeigt auch nahezu maximale Aktivität über den gesamten pH-Bereich 7-10,5. Zusätzlich wird die Proteaseaktivität in Gegenwart von PMSF, nicht von EDTA, fast vollständig gehemmt, was zeigt, daß das Enzym eine Serin-Protease ist.

BEISPIEL IV

Die Stabilität der Protease von Beispiel II in Gegenwart verschiedener Waschmittelkomponenten bei 25ºC oder 40ºC wurde wie folgt untersucht:
Die Protease wurde in 0,01M Boratpuffer, pH 9,5, mit den oder ohne die zusätzlichen in Tabelle I dargestellten Komponenten auf 0,5 AU/l verdünnt. Die Proben wurden bei 25ºC oder 40ºC für 30 Minuten inkubiert, dann bei 25ºC, wie vorher beschrieben, auf Proteaseaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.
Die Protease behält wenigstens 83 % ihrer Aktivität bei entweder 25ºC oder 40ºC in jeder der getesteten Waschmittelkomponenten bei, was sie für Wäschewaschzwecke geeignet macht. Tabelle 1 Stabilität der Proteasen aus Paecilomyces marquandii in Gegenwart von Waschmitteln Komponenten Restaktivität (% des 25ºC-Puffer-Werts) CaCl&sub2; (10 mM) EDTA (10 mM) Natriumtripolyphosphat (STPP, 0,1 %) "Tide" (kein Phosphat, 0,15 %)

BEISPIEL V

Die Fähigkeit der Protease, verschiedene proteinhaltige Substrate in Gegenwart von Waschmittel zu verdauen, wurde getestet und mit der kommerziellen Protease, ALCALASE , verglichen. Die verwendeten Substrate waren Vollblut, Casein und Gras.
Rindervollblut, das als sprühgetrocknetes Pulver erhalten wurde, und Casein (Hammerstein) wurden in 0,05M Borat-Puffer, pH..., bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % (w/v) in Gegenwart von Waschmittel (0,15 % w/v, kein Phosphat) und Wasserhärtern (150 ppm) gelöst. Die Protease von Beispiel II und zum Vergleich ALCALASE wurden bei dem angegebenen Aktivitätsniveau zugegeben, und die Reaktionsmischungen wurden bei 15ºC für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von TCA abgebrochen und die Anzahl an in TCA löslichen Aminogruppen, wie oben beschrieben, unter Verwendung von o-Phthaldialdehyd bestimmt.
Ein Grasextrakt wurde durch Homogenisieren von frisch geschnittenem Gras (10 g) in destilliertem Wasser (50 ml) für 5 Minuten und anschließendes Pressen durch Gaze hergestellt. Der Extrakt wurde gründlich in 50 mM Borat-Puffer, pH 10, dialysiert. Tide (kein Phosphat) und Wasserhärter wurden direkt zum Extrakt zugegeben, so daß sich Konzentrationen von 0,15 % bzw. 150 ppm ergaben. Die Protease von Beispiel II oder ALCALASE wurde zugegeben und die Reaktionen, wie oben beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Reaktionsbedingungen 25ºC und 30 Minuten waren.
Der Grad, zu dem die Protease jedes Substrat relativ zu ALCALASE hydrolysierte, ist in Tabelle II dargestellt.
Aus den Ergebnissen in Tabelle II wird deutlich, daß bei demselben Dosierungsniveau der Paecilomyces marquandii beim Verdauen von Blut-, Casein- und Gras-Proteinen in Gegenwart von üblicherweise verwendeten Waschmitteln wirkungsvoller als ALCALASE ist. Tabelle II Proteolytische Verdauung von Blut, Casein und Gras in Gegenwart von Waschmittel Substrat Enzym-Dosisniveau (AU/l) Verdauungsgrad (% des ALCALSE -Werts) Vollblut Casein Gras

BEISPIEL VI

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen verschiedener kommerzieller Waschmittel auf die Fähigkeit von Protease aus Beispiel II, Blut-Protein zu verdauen. Ein Vergleich wird auch zu kommerzieller Protease ALCALASE in denselben Waschmitteln angestellt.
Die Reaktionsmischungen enthielten denaturiertes Vollblut (0,1 % w/V), 0,15 % Waschmittel, 150 ppm Wasserhärter, 8,2 mM Natriumborat und 0,05 AU/l Protease. Die Verdauungen wurden für 15 Minuten bei 15ºC durchgeführt, dann wurden die in TCA löslichen Reaktionsprodukte, wie vorher beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II dargestellt. Tabelle III Proteolytische Verdauung von Blut in der Gegenwart von fünf kommerziell erhältlichen Waschmitteln aus der folgenden Liste: Tide, All, Bold 3, Wisk, Dynamo, Era plus und Cheer. Waschmittela Protease % Verdauung relativ zu ALCALASE P. marquandii ALCALASE
a Der pH jeder Reaktionsmischung beruhte weitgehend auf dem Waschmittel und schwankte von pH 7,8-10,4.

BEISPIEL VII

Die in Beispiel II hergestellte Protease wurde wie folgt gereinigt:
Die Kulturbrühre wurde zunächst extensiv in 25 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5, hineindialysiert. Ausgefälltes Material, das sich während der Dialyse bildete, wurde durch Zentrifugation entfernt. Die dialysierte Probe wurde auf eine Carboxymethylcellulose-(CM-52)-Säule geladen, die in 25 mM Natriumacetat, pH 5, äquilibriert worden war. Proteaseaktivität band sich an das Harz und wurde anschließend in 25 mM Natriumacetat,pH 5, das 0,2M NaCl enthielt, eluiert. Die Fraktionen, die Proteaseaktivität enthielten, wurden gepoolt und mit einer Amicon-UM-2-Membran konzentriert. Die Probe wurde dann auf eine Sephadex-G-100-Säule geladen, die in 50 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,0, äquilibriert worden war. Die Protease wurde unter Verwendung desselben Puffers aus der Säule eluiert und die aktiven Fraktionen wurden gepoolt. Die Proteaseprobe wurde weiter auf einer Hydroxylapatitsäule gereinigt, die in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, äquilibriert worden war. In diesem Puffer adsorbierte die Protease an die Säule, wurde dann mit einem Gradienten eluiert, in dem die Ionenstärke von Tris abnahm und die von Phosphat-Puffer anstieg. Die Proteaseaktivität wurde bei einer Phosphatpuffer-Konzentration von 10 mM, pH 7,0, eluiert. Die resultierende spezifische Aktivität der Protease betrug 47 Anson-Einheiten/Gramm. Tabelle IV Tabelle IV faßt die Reinigung von Protease aus Beispiel II zusammen Schritt Protease-Aktivität (AU/l) Volumen (mls) Protein Konzentration (mg/ml) Spezifische Aktivität (AU/g) Gesamte Ausbeute % x-fache Reinigung Dialysierter Kulturüberstand Sephadex G-100 Hydroxylapatit

BEISPIEL VIII

Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die spezifische Aktivität der gereinigten Protease zu bestimmen.
Auf der Protease, die, wie in Beispiel VII beschrieben, gereinigt worden war, wurde Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß das Molekulargewicht der Hauptbande 38.000 betrug, und zeigten weiter, daß das Präparat für Aktivstellentitration geeignet war, eine Technik, die verwendet wird, um die spezifische Aktivität der vollständig gereinigten (homogenen) Protease abzuschätzen. Die aktiven Zentren der Protease wurden mit N-trans-Cinnamoylimidazol gemäß der Methode von Bender, M.L. et al., 1966, J. Amer. Chem. Soc., 88:5899-5913, titriert. Die spezifische Aktivität der reinen Protease betrug 62 AU/Gramm Protein.
Die spezifische Aktivität ist etwas höher als diejenige, die für die bekannte Protease ALCALASE gefunden wurde (45 AU/Gramm).

BEISPIEL IX

Waschtests wurden durchgeführt in einem Terg-O-Tometer für 10 Minuten bei 15ºC mit EMPA116-Testgewebe-Stoffproben, 5 cm x 5 cm, (Baumwolle, verschmutzt mit Blut, Milch und Ruß), geliefert von der Eidgenössischen Materialprüfungs- und Versuchsanstalt, Sankt Gallen, Schweiz, unter Verwendung von Dosierungen von 0,025, 0,05 und 0,10 AU/l Enzym von Beispiel II in Gegenwart von Tide ohne Phosphat (< 0,5 %).
Zu Vergleichszwecken wurden dieselben Versuche bei Dosierungen von 0,025, 0,05 und 0,10 AU/l ALCALASE durchgeführt.
Das Reinigungsvermögen der Proteasen wurden durch Veränderung des Reflexionsvermögens (ΔR) gemessen, wobei der Reflexionswert von mit Enzym gewaschenen Teststoffproben mit Stoffproben verglichen wurde, die ohne Enzym gewaschen worden waren. Die Reflexionswerte wurde mit Hilfe eines Gardiner Reflektometers XL 800 (Bethesda, MD) abgelesen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt. TABELLE V Enzym Enzymdosis (AU/l) ΔR Veränderung des Reflexionsvermögens P. marquandii ALCALASE
Die Ergebnisse zeigen, daß Paecilomyces marquandii-Protease in einem Waschtest bei 15º eine größere Waschwirkung besitzt als ALCALASE .

BEISPIEL X

Auf der Grundlage von Unterschieden in den Hydolysemustern für die Paecilomyces marquandii-Protease und Bacillus- Proteasen (d.h. ALCALASE ) wurde postuliert, daß die Zugabe der Pilz-Protease zu ALCALASE eine erhöhte Entfernung von Proteinflecken bei einer Waschung bewirken würde.
Waschtests wurden durchgeführt, wie in Beispiel IX beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Dosierungen von ALCALASE und Paecilomyces marquandii-Protease variiert wurden. ALCALASE wurde entweder allein (0-0,6 AU/l) oder in Mischungen mit der Paecilomyces-Protease verwendet (0,4 AU/l ALCALASE plus 0,05-0,4 AU/l Paecilomyces-Protease).
Die Ergebnisse sind in Tabelle VI (und Figur 3) dargestellt. Die Zugabe der Pilz-Protease führte zu Veränderungen im Reflexionsvermögen (bessere Waschwirksamkeit), die signifikant höher war als diejenigen, die mit ALCALASE allein bei derselben Gesamtdosis erhalten wurden. TABELLE VI Verbesserte Waschergebnisse durch Zugabe von Paecilomyces marquandii-Protease zu ALCALASE unter Verwendung von EMPA 116-Schmutz ALCALASE Dosis (AU/l) Paecilomyces marquandii-Protease-Dosis (AU/l) ΔR(Veränderung im Reflexionsvermögen)

BEISPIEL XI

Zusätzlich zur Mischung von Bakterien-Proteasen und Paecilomyces marquandii-Protease bei hohen Dosierungen (s. Beispiel X) wurden auch Mischungen bei niedrigeren Dosisraten getestet. Die in diesem Experiment verwendete Dosierung (0,1 KOU/l) spiegelt besser die Enzymmenge wieder, die unter tatsächlichen Waschbedingungen eingesetzt wird.
Paecilomyces marquandii-NRRL 18048-Protease wurde in Kombination mit der Bacillus-Protease, SAVINASE verwendet, um blutverschmutzte Baumwolle zu waschen, Die Waschtests wurden in einem Waschmittel der folgenden Zusammensetzung durchgeführt (Gramm/Liter): NANSA S80S, 0,4; Berol 065, 0,15; Talgseife, 0,15; Natriumtripolyphosphat, 1,75; Natriumsilicat, 0,5; Carboxymethylcellulose, 0,05; EDTA, 0,01; und Na&sub2;SO&sub4;, 2,1. Die Wasserhärte wurde auf 9º dH (deutsche Härte) eingestellt. Luftgetrocknete Blut-Stoffproben wurden bei 15ºC für 10 Minuten gewaschen. Die Veränderung im Reflexionsvermögen wurde bei 460 nm unter Verwendung eines Elrephotometers 600 bestimmt.
Die Ergebnisse mit den Paecilomyces-Mischungen sind in Tabelle VII und Figur 4 dargestellt. SAVINASE , bei einer Dosis von 0,1 KOU/l allein verwendet, führte zu einem ΔR von 2,7. Paecilomyces marquandii, verwendet bei derselben Dosisrate, ergab einen ΔR-Wert von 3,5. Wenn eine vergleichbare Dosis an Protease, die aus einer Mischung von 90 % SAVINASE und 10 % Paecilomyces marquandii bestand, verwendet wurde, wurde der ΔR-Wert auf 4,2 verbessert. Der beobachtete ΔR- Wert von 4,2 ist 50 % größer als derjenige, der durch Addieren der zwei Proteasen vorhergesagte. Es ist offensichtlich, daß durch Mischen von SAVINASE und Paecilomyces marquandii-Protease ein synergistischer Effekt erzielt wird. Die Kombination von 90 % SAVINASE plus 10 % Paecilomyces marquandii wurde allein in den Waschexperimenten verwendet. Mischungen von SAVINASE mit einer zweiten Bakterien-Protease, ALCALASE , sind zum Vergleich dargestellt. TABELLE VII Dosis (KOU/l) 0,1 (allein verwendet) 0,075 SAVINASE + 0,025 andere 0,09 SAVINASE + 0,01 andere SAVINASE P. marquandii ALCALASE *beobachtet **Vorhergesagt

Claims

1. Alkalische Protease, erhältlich durch Fermentation eines Protease produzierenden Stammes von Paecilomyces marquandii.

2. Alkalische Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm NRRL 18048 ist.

3. Proteaseprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es die alkalische Protease nach Anspruch 1 in Kombination mit einer alkalischen Bacillus-Protease umfaßt.

4. Proteaseprodukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Bacillus-Protease durch Fermentation von B. licheniformis erhältlich ist.

5. Proteaseprodukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Bacillus-Protease vom Serin-Typ ist, optimale proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb von etwa 9 zeigt und 80 bis 100 % maximaler proteolytischer Aktivität bei pH 12 beibehält, wobei besagte Aktivitäten mit der Anson-Methode gegen Hämoglobin gemessen sind.

6. Verfahren zur Herstellung der alkalischen Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protease produzierender Stamm von Paecilomyces marquandii aerob unter Submers-Bedingungen, die geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen beinhalten, bei einem alkalischen pH kultiviert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei Temperaturen unter 35ºC durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei Temperaturen im Bereich 20-30ºC durchgeführt wird.

9. Enzymatisches Waschmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es die alkalische Protease nach Anspruch 1 enthält.

10. Enzymatisches Waschmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es das Proteaseprodukt nach Anspruch 3 enthält.

11. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 1 in flüssiger Konzentratform.

12. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 1 in nichtstaubender Granulatform.

13. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 3 in flüssiger Konzentratform.

14. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 3 in nichtstaubender Granulatform.