DE3779906T2 - Bei niedriger temperatur aktive alkalische protease aus paecilomyces marquandii und deren herstellung. - Google Patents
Bei niedriger temperatur aktive alkalische protease aus paecilomyces marquandii und deren herstellung.Info
- Publication number
- DE3779906T2 DE3779906T2 DE8787907943T DE3779906T DE3779906T2 DE 3779906 T2 DE3779906 T2 DE 3779906T2 DE 8787907943 T DE8787907943 T DE 8787907943T DE 3779906 T DE3779906 T DE 3779906T DE 3779906 T2 DE3779906 T2 DE 3779906T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protease
- alkaline
- paecilomyces marquandii
- alcalase
- marquandii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000908214 Metarhizium marquandii Species 0.000 title claims abstract description 49
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 119
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 114
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 30
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 27
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000010410 dusting Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 claims 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 abstract description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004900 laundering Methods 0.000 abstract 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 108
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 86
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 35
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 10
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 10
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 9
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100449439 Drosophila melanogaster grass gene Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 3
- 239000004848 polyfunctional curative Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004453 electron probe microanalysis Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- KJPHTXTWFHVJIG-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-2-[(6-methoxypyridin-3-yl)-(2-methylphenyl)sulfonylamino]-n-(pyridin-3-ylmethyl)acetamide Chemical compound C=1C=C(OC)N=CC=1N(S(=O)(=O)C=1C(=CC=CC=1)C)CC(=O)N(CC)CC1=CC=CN=C1 KJPHTXTWFHVJIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XVGXMXZUJNAGFZ-VOTSOKGWSA-N (e)-1-imidazol-1-yl-3-phenylprop-2-en-1-one Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 XVGXMXZUJNAGFZ-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101710184263 Alkaline serine protease Proteins 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 240000003483 Leersia hexandra Species 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710194948 Protein phosphatase PhpP Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000006787 czapek-dox agar Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000003861 general physiology Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- ZBJVLWIYKOAYQH-UHFFFAOYSA-N naphthalen-2-yl 2-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C=CC=C2)C2=C1 ZBJVLWIYKOAYQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I pentasodium;[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige alkalische Protease, ein Verfahren zur Herstellung derselben und ihre Verwendung in Kombination mit anderen Proteasen. Diese Protease kann vorteilhafterweise als Zusatz zu Reinigungsmitteln verwendet werden. Typische Reinigungsmittel sind Waschmittelzusammensetzungen zum Wäschewaschen.
- Proteolytische Enzyme, hergestellt durch Kultivierung von Mikroorganismenstämmen aus der Gattung Bacillus in geeigneten Nährstoffmedien, werden in weitem Umfang in Waschmittelzusammensetzungen verwendet. Beispiele solcher kommerziell erhältlichen Proteinase-Produkte sind ALCALASE , ESPERASE und SAVINASE , alle erhältlich von NOVO INDUSTRI A/S, Dänemark. Diese und die von Bacillus abgeleiteten ähnlichen Enzymprodukte anderer Lieferanten sind in Waschmittellösungen bei pH-Werten im Bereich von 8 bis 11 und in Gegenwart der normalerweise in Waschmittellösungen vorhandenen Komplexbildner, Tenside und Bleichmittel enzymatisch aktiv.
- Die Protease in ALCALASE wird durch Kultivieren von Stämmen der Spezies Bacillus licheniformis hergestellt. Die Proteasen in ESPERASE und SAVINASE sind durch Kultivierung von alkalophilen Bacillus-Spezies gemäß US-Patent 3,723,250 erhältlich und dadurch gekennzeichnet, daß sie vom Serin-Typ sind und optimale proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb etwa 9 zeigen und 80 bis 100 % maximaler proteolytische Aktivität bei pH 12 beibehalten, wobei besagte Aktivitäten mit der Anson-Methode gegen Hämoglobin gemessen sind.
- Das Temperaturoptimum der obigen kommerziell erhältlichen alkalischen Proteasen ist etwa 60ºC. Diese kommerziellen Enzyme zeigen jedoch eine relativ niedrigere Aktivität bei Raumtemperatur.
- Diese Erfindung betrifft die Herstellung, Isolierung, Charakterisierung und Verwendung einer neuartigen alkalischen Protease, die aus einem Pilz-Mikroorganismus gewonnen wird. Der die Protease produzierende Mikroorganismus ist ein Isolat von Paecilomyces marquandii. Von diesem Mikroorganismus ist bisher nicht bekannt gewesen, daß er eine brauchbare alkalische Protease produziert. Das Temperaturoptimum dieser Protease ist etwa 45ºC, etwa 15ºC niedriger als dasjenige der kommerziell erhältlichen Waschmittelenzyme. Zusätzlich bewirkt die Pilzprotease dieser Erfindung ein anderes Proteinhydrolysemuster als dasjenige, das von Bacillus- Protease erzeugt wird.
- Die Pilzprotease dieser Erfindung ist bei niedrigen Temperaturen, z.B. in kaltem Wasser, also bei 15º bis 25ºC, effektiver als die kommerziell erhältlichen Bacillus- Proteasen.
- Ihr anderes Hydrolysemuster macht die Pilzprotease gegenüber einigen Proteinen wirkungsvoll, die gegenüber der Wirkung der Bacillus-Proteasen widerstandsfähig sind. Zusätzlich ist ein Synergismus bei Mischungen beobachtet worden, die mit der Pilzprotease aus Paecilomyces marquandii und gewissen Bacillus-Proteasen hergestellt worden sind. Daher ist die Verwendung der Pilzprotease in Kombination mit einer Bacillus-Protease attraktiv und wird von den Erfindern in Betracht gezogen.
- Obgleich viele kommerzielle Verwendungen für Proteasen existieren, stellt die Verwendung in Waschmitteln einen Hauptmarkt dar, und dementsprechend ist die folgende detaillierte Diskussion der Paecilomyces marquandii-Protease in den Zusammenhang der Nützlichkeit für die Verwendung in Waschmitteln gestellt. Es sollte jedoch anerkannt werden, daß die vielen anderen existierenden Verwendungen für proteolytische Enzyme von den Erfindern in Betracht gezogen werden.
- Es sollte auch anerkannt werden, daß Enzyme oft besonders empfindlich gegenüber den Anwendungsbedingungen sind, als wichtigstes gegenüber pH, Temperatur und, für die Verwendung in Waschmitteln, gegenüber der Gegenwart üblicher Komplexbildner, wie z.B. EDTA. Folglich wird eine Protease, die an die üblichen amerikanischen Waschbedingungen zum Waschen von Baumwollgeweben, die zum Beispiel bei pH 8-9 und bei 60ºC liegen können, gut angepaßt ist, unter den Niedertemperatur-Waschbedingungen, die für das Waschen vieler moderner Gewebe empfohlen werden, weniger wirkungsvoll sein. Das niedrigere Temperaturoptimum der Paecilomyces marquandii- Protease ist somit ein Hauptvorteil dieses Enzyms. In praktischer Hinsicht bedeutet das niedrigere Temperaturoptimum, daß von diesem Enzym weniger benötigt wird, um bei 45ºC ein gewünschtes Niveau an enzymatischer Aktivität in Waschmittellösung zu erzeugen (als z.B. von einer heutzutage für Waschmittelzusatzzwecke verwendeten Bacillus-Protease erforderlich wäre). Ein verwandtes praktisches Ergebnis ist, daß Waschmittelhersteller nunmehr eine Enzymkombination der Paecilomyces marquandii-Protease mit einer Bacillus-Protease, z.B. ALCALASE , ESPERASE oder SAVINASE , zur Verfügung stellen können, die über den gesamten Temperaturbereich für das Waschen in kaltem Wasser bis zum (standardmäßigen) Waschen in heißem Wasser wirkungsvoll ist. Darüber hinaus bewirkt die Kombination der Paecilomyces marquandii-Protease mit gewissen Bacillus-Proteasen einen synergistischen Effekt in der Weise, daß eine Mischung wirkungsvoller ist als jedes Enzym für sich allein. Dies trifft sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Dosierungen zu, wie in den im folgenden angeführten Beispielen X bzw. XI nachgewiesen ist. Eine Proteasezubereitung, die die alkalische Protease aus Paecilomyces marquandii umfaßt, zeigt etwa eine um 40 % höhere Fähigkeit beim Bleichen von auf Proteinen beruhenden Flecken auf Baumwolle (EMPA 116) unter simulierten Waschbedingungen bei 15ºC als die gut bekannte ALCALASE -Protease.
- Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung der neuartigen alkalischen Protease zur Verfügung gestellt, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Protease produzierender Stamm von Paecilomyces marquandii unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert wird, das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen enthält, gefolgt von der Gewinnung des Proteasepräparats aus der Fermentationsbrühe.
- Gemäß einem anderen Modus der Erfindung wird die Protease aus Paecilomyces marquandii zu einem gemischten Enzymprodukt formuliert, das eine von Bacillus abgeleitete Protease und die Paecilomyces marquandii-Protease umfaßt. Bevorzugte von Bacillus abgeleitete Proteasen sind ALCALASE , ESPERASE und SAVINASE .
- Zum weiteren Verständnis dieser Erfindung wird Bezug genommen auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
- Figur 1 das Elutionschromatogramm von Verdauungsprodukten zeigt, erhalten nach Behandlung von oxidierter β-Kette von Insulin mit der Protease aus Paecilomyces marquandii für zwei Stunden, und, zum Vergleich, von Verdauungsprodukten, erhalten nach Behandlung mit den bekannten Proteasen, ALCALASE und SAVINASE .
- Figur 2 eine graphische Darstellung der Aktivität von Protease von Paecilomyces marquandii bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten, in Abwesenheit und bei Vorhandensein von Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 1 mM) oder EDTA (10 mM), ist.
- Figur 3 eine graphische Darstellung einer Waschuntersuchung ist, die mit ALCALASE allein und zusammen mit ein wenig von der Paecilomyces marquandii-Protease, mit einer relativ hohen Dosierung, durchgeführt worden ist.
- Die Daten für die Veränderung des Reflexionsvermögens, als Figur 3 graphisch dargestellt, beweist, daß das Kombinieren der Protease von Paecilomyces marquandii mit einer Bacillus- Protease zu einer verbesserten Waschwirkung führt. Das Erhöhen der Dosierung von ALCALASE allein von 0,4 auf 0,6 AU/l bewirkt wenig Verbesserung in der Veränderung des Reflexionsvermögens. Die Verwendung einer Enzymmischung derselben proteolytischen Gesamtaktivität, z.B. 0,6 AU/l, bewirkt eine wesentlich verbesserte Veränderung des Reflexionsvermögens.
- Figur 4 eine graphische Darstellung des synergistischen Effektes ist, erhalten in Waschtests mit einer Mischung der Pilz-Protease aus Paecilomyces marquandii und einer anderen Bakterien-Protease, SAVINASE . Die Gesamtenzymdosierung, 0,1 KOU/Liter, ist ähnlich derjenigen, die durch Verwendung kommerzieller proteasehaltiger Waschmittel erreicht wird. Im oberen Diagramm stellen die ersten zwei Säulen die Veränderung des Reflexionsvermögens dar, erhalten für SAVINASE bzw. Paecilomyces marquandii allein. Die dritte Säule stellt den (theoretischen) ΔR-Wert dar, der für die 90:10- Kombination von SAVINASE und die Paecilomyces marquandii- Protease, d.h. 90 % des ΔR für SAVINASE allein plus 10% des ΔR für Paecilomyces marquandii allein, erwartet werden kann. Die vierte Säule stellt den experimentellen ΔR-Wert dar, der erhalten wird, wenn solch eine 90:10-Mischung in einem Waschvorgang verwendet wird. Der beobachtete ΔR-Wert ist 50 % größer als der theoretische Wert, wodurch gezeigt ist, daß Synergismus aufgetreten ist.
- Zum Vergleich wurde auch eine Mischung zweier Bakterienproteasen getestet, SAVINASE und ALCALASE . Die Ergebnisse sind in der unteren Hälfte von Figur 4 dargestellt. In diesem Fall war der experimentelle ΔR, der für die 90:10-Mischung von SAVINASE und ALCALASE herhalten wurde, geringer als der vorhergesagte, d.h. keine Synergie.
- Der Mikroorganismus dieser Erfindung ist ein aerobes Pilz- Isolat von Paecilomyces marquandii.
- Optimale Temperatur für das Wachstum: 20ºC bis 30ºC, kein Wachstum bei oder oberhalb 35ºC.
- Optimaler pH für das Wachstum: 7,5-10.
- Grau-weiße Kolonien auf Czapek-Dox-Agar-Schrägplatten; reichliche Sporenbildung, die für die rötlich-graue Farbe reifer Kolonien verantwortlich ist.
- Ein gewisser Grad an Stammspezifizität kann im Fall des Paecilomyces marquandii bestehen. Das Isolat, das das Enzym dieser Erfindung hervorbringt, ist NRRL 18048. Soweit die Erfinder in der Lage gewesen sind, dies festzustellen, ist kein Stamm von Paecilomyces marquandii als der Typstamm identifiziert worden. Das Isolat, das am ehesten einem Typ- Stamm entspricht, scheint NRRL 901 zu sein (identisch mit ATCC 10525), und dieser Stamm bringt die Protease dieser Erfindung nicht hervor. Man nimmt an, daß NRRL 18048 und NRRL 901 verschiedene Varianten von Paecilomyces marquandii sind.
- Die proteolytische Aktivität in Paecilomyces marquandii- Kulturen wurde mit der gut bekannten Anson-Hämoglobin- Methode, vgl. Journal of General Physiology, 22, 79-89 (1959), bestimmt. Eine Anson-Einheit ist die Menge an proteolytischem Enzym, die Hämoglobin bei einem pH-Wert von 9,0 und einer Temperatur von 25ºC während einer Reaktionszeit von 10 Minuten mit so einer Anfangsgeschwindigkeit verdaut, daß pro Minute eine solche Menge an Spaltprodukten gebildet wird, die nicht mit Trichloressigsäure ausgefällt werden kann, daß diese Spaltprodukte dieselbe Farbe mit Phenolreagenz ergeben, wie dies ein Milliäquivalent Tyrosin tut.
- Proteolytische Aktivität wurde auch durch die Hydrolyse von Casein und anschließende Reaktion von in TCA löslichen Peptiden mit o-Phthaldialdehyd und β-Mercaptoethanol bestimmt. Die Extinktion des resultierenden Komplexes wird bei 340 nm gemessen und mit einem Serin-Standard verglichen. Reaktionsmischungen enthalten 3 ml 0,8 % (w/v) Hammerstein- Casein und 0,5 ml einer geeigneten Enzymverdünnung, beide in Universalpuffer 1 von Britton und Robinson, pH 9,5 (J. Chem. Soc. 1931, S. 1451). Die Mischungen werden für 30 Minuten bei 25ºC inkubiert, dann wird die Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml Stopreagenz (3,6 % w/v TCA, 6,0 % w/v Natriumacetat und 3,78 % w/v Eisessig) abgebrochen. In Kontrollreaktionen wird das Stopreagenz vor Enzymzugabe zugegeben. Nach 20 Minuten bei 25ºC werden die Reaktionsmischungen durch Whatman - Filterpapier Nr. 42 filtriert oder zentrifugiert.
- Ein aliquoter Teil (200 ul) des Filtrats wird zu 3 ml OPA- Reagenz zugegeben, das 0,05M Natriumtetraborat, 1 % w/v Natriumdodecylsulfat, 0,8 mg/ml o-Phthaldialdehyd (OPA) (ursprünglich gelöst als eine 40 mg/ml-Lösung in Ethanol) und 0,2 % w/v β-Mercaptoethanol enthält. Nach 2 Minuten wird die Extinktion bei 340 nm bestimmt. In ähnlicher Weise wird ein aliquoter Teil von 200 ul eines Serin-Standards (0,2 mg/ml) zu 3 ml OPA-Reagenz zugegeben und die A&sub3;&sub4;&sub0; bestimmt. Die Aktivität wird in KOU (Kilo-OPA-Einheiten) ausgedrückt, wobei 1 KOU definiert ist als die Menge an proteolytischem Enzym, die zur Freisetzung von 1 mmol -NH&sub2; führt, freigesetzt pro Minute unter definierten Bedingungen.
- Der Paecilomyces marquandii-Stamm NRRL 18048 wird unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, wobei das Medium gemäß den Prinzipien des bekannten Standes der Technik zusammengesetzt ist.
- Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie etwa Saccharose, Glucose und Maltose, oder kohlehydrathaltige Materialien, wie etwa Getreidekörner, Malz, Reis und Sorghum. Die Kohlehydratkonzentration, die im Medium enthalten ist, kann in weitem Umfang variieren, z.B. von 1 bis 15 %, aber normalerweise werden 8-10 % geeignet sein, wobei die Prozentanteile als Glucose-Äquivalente berechnet sind.
- Die Stickstoffquelle im Nährstoffmedium sollte organischer Natur sein. Unter den organischen Stickstoffquellen wird eine ziemliche Anzahl regelmäßig bei Fermentationsprozessen verwendet, die die Kultivierung von Pilzen mit sich bringen. Veranschaulichende Beispiele sind Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakt und Albumin. Zusätzlich sollte das Nährstoffmedium auch die üblichen Spurenelemente enthalten.
- Da Paecilomyces marquandii psychrophil ist, indem er nicht in der Lage ist, bei Temperaturen oberhalb 35ºC zu wachsen, wird die Kultivierung vorzugsweise im Temperaturbereich von 20ºC bis 30ºC und bei alkalischen pH-Werten durchgeführt. Der alkalische pH kann durch Zugabe geeigneter Puffer erreicht werden, wie etwa Natriumcarbonat oder Mischungen von Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat (nach Sterilisierung des Wachstumsmediums). Zur Kultivierung in Tankfermentern ist es notwendig, künstliche Belüftung anzuwenden. Die Belüftungsrate kann diejenige sein, die bei herkömmlicher Tankfermentation verwendet wird.
- Nach der Fermentation kann ein flüssiges Enzymprodukt durch Entnahme von Rohmaterial aus der Brühe und, falls erwünscht, durch Konzentration der Brühe durch Eindampfen bei niedriger Temperatur oder durch Umkehrosmose hergestellt werden. Schließlich können Konservierungsstoffe und/oder Enzymstabilisatoren, wie etwa Propylenglykol, zum Konzentrat zugesetzt werden. Ein flüssiges Produkt ist für das Einbringen in flüssige Waschmittel geeignet.
- Feste Enzympräparate können aus der gereinigten und/oder konzentrierten Brühe durch Ausfällung mit Salzen, wie etwa Na&sub2;SO&sub4;, oder mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie etwa Ethanol oder Aceton, hergestellt werden. Entfernung des Wassers in der Brühe durch geeignete Trocknungsmethoden, wie etwa Sprühtrocknung, kann ebenfalls durchgeführt werden. Die proteolytische Aktivität eines so gewonnenen Proteasepräparats liegt üblicherweise im Bereich von 0,1-2,0 AU/g.
- Nicht-staubende Granulate können mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. gemäß GB- Patent 1,362,365 oder US-Patent 4,106,991. Solche Granulate sind zum Einbringen in Pulverwaschmittel geeignet.
- Die Peptide, die durch von Protease katalysierter Verdauung der oxidierten β-Kette von Insulin hergestellt worden waren, wurden durch Umkehrphasen-HPLC getrennt. Chromatogramme von Peptid-Verdauungsprodukten, erhalten durch die Wirkung der Paecilomyces marquandii-Protease, gereinigt, wie in Beispiel VII beschrieben, sind in Figur 1 dargestellt. Zum Vergleich sind auch die Peptide angegeben, die durch Verdauung mit den bekannten alkalischen Proteasen, ALCALASE und SAVINASE , erzeugt worden sind. Man kann sehen, daß die Protease dieser Erfindung im Hinblick auf ihr Muster der Verdauung der oxidierten β-Kette von Insulin deutlich verschieden ist von jeder der alkalischen Bacillus-Proteasen; es zeigt sich ein mehr zufälliges Verdauungsmuster.
- Ouchterlony-Doppel-Immundiffusionstests zeigten keine Kreuzreaktion zwischen den Paecilomyces marquandii- und den alkalischen Serin-Proteasen, ALCALASE und SAVINASE , wenn gegen diese Proteasen hergestellte Antikörper als Referenzstandards verwendet wurden.
- Paecilomyces marquandii-Stamm NRRL 18048 wurde bei 26ºC auf einem Dreh-Rütteltisch (250 UPM) in unterteilten 250ml- Erlenmeyer Kolben, die 25 ml Medium der folgenden Zusammensetzung enthielten, kultiviert:
- Glucose 100
- Sojabohnenmehl 75
- Hefeextrakt 1
- Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O 10
- Pluronic R 25R2 0,1
- Natriumcaseinat 5
- Nach Sterilisierung wurde der pH des Mediums durch Zugabe von 5 ml einer 1M Lösung Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer auf 9,2 eingestellt.
- Nach 7-9 Tagen Inkubation wurde die proteolytische Aktivität der Kultur unter Verwendung der oben beschriebenen Anson- Methode bestimmt. Die Enzymaktivität der Brühe betrug 16-18 AU/l.
- Paecilomyces marquandii-Stämme NRRL 18048 wurden in einem Medium kultiviert, das aus folgendem bestand (Gramm/Liter):
- Maltodextrin 20
- Sojabohnenmehl 20
- K&sub2;HPO&sub4; 9
- CaCO&sub3; 5
- Hefeextrakt 2
- Pluronic 25R2 1
- Nach Autoklavieren wurde der pH durch Zugabe von NaCO&sub3;/NaHCO&sub3;-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1M auf 9,2 eingestellt. Die Kultur wurde bei 250 UPM, 30ºC, für 24 Stunden inkubiert. Nach dieser Wachstumsperiode wurde die Kultur (600 ml) verwendet, um einen Fermenter zu beimpfen, der 10 Liter des folgenden Mediums enthielt (Gramm/Liter):
- Glucose 50
- Sojabohnenmehl 100
- K&sub2;HPO&sub4; 5
- CaCO&sub3; 5
- Nach Sterilisierung wurde das Medium mit 2M Na&sub2;CO&sub3; auf pH 8,2 eingestellt. Der pH fiel während der frühen Wachstumsstadien im Fermenter auf etwa 7,0. Die Temperatur wurde anfangs bei 30ºC eingeregelt und auf 25ºC abgesenkt, als der pH begann, über 7,0 zu steigen. Von diesem Punkt an wurde der pH so kontrolliert, daß er nicht unter 7,0 fiel, durch Zugabe von KOH oder Na&sub2;CO&sub3;, oder 7,6 nicht überstieg, durch Zugabe von H&sub3;PO&sub4;. Pluronic wurde zur Schaumsteuerung verwendet. Rühren und Belüften wurden gesteigert, wenn der O&sub2;-Bedarf anstieg; der Fermenter wurde über 24 Stunden bei maximaler Sauerstoff- Transferrate gefahren. Nach 120 Stunden wurde der Protease- Titer unter Verwendung der Anson-Testmethode bestimmt, der einen Wert von 25 Anson-Einheiten/Liter anzeigte.
- Die Kulturbrühe wurde filtriert, um das in den folgenden Beispielen verwendete Proteaseprodukt zu ergeben.
- Die Aktivität der Protease aus Beispiel II als eine Funktion von pH und Temperatur wurde unter Verwendung von Casein als Substrat gemäß der oben beschrieben Testmethode bestimmt. Zusätzlich wurden die Wirkungen von EDTA (10 mM) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 1 mM) auf die Proteaseaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind graphisch in Figur 2 dargestellt. Wie man in dieser Figur sieht, ist das Temperaturoptimum 45ºC, wenigstens 15ºC niedriger als dasjenige der kommerziellen Proteasen ALCALASE und SAVINASE . Die Protease zeigt auch nahezu maximale Aktivität über den gesamten pH-Bereich 7-10,5. Zusätzlich wird die Proteaseaktivität in Gegenwart von PMSF, nicht von EDTA, fast vollständig gehemmt, was zeigt, daß das Enzym eine Serin-Protease ist.
- Die Stabilität der Protease von Beispiel II in Gegenwart verschiedener Waschmittelkomponenten bei 25ºC oder 40ºC wurde wie folgt untersucht:
- Die Protease wurde in 0,01M Boratpuffer, pH 9,5, mit den oder ohne die zusätzlichen in Tabelle I dargestellten Komponenten auf 0,5 AU/l verdünnt. Die Proben wurden bei 25ºC oder 40ºC für 30 Minuten inkubiert, dann bei 25ºC, wie vorher beschrieben, auf Proteaseaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.
- Die Protease behält wenigstens 83 % ihrer Aktivität bei entweder 25ºC oder 40ºC in jeder der getesteten Waschmittelkomponenten bei, was sie für Wäschewaschzwecke geeignet macht. Tabelle 1 Stabilität der Proteasen aus Paecilomyces marquandii in Gegenwart von Waschmitteln Komponenten Restaktivität (% des 25ºC-Puffer-Werts) CaCl&sub2; (10 mM) EDTA (10 mM) Natriumtripolyphosphat (STPP, 0,1 %) "Tide" (kein Phosphat, 0,15 %)
- Die Fähigkeit der Protease, verschiedene proteinhaltige Substrate in Gegenwart von Waschmittel zu verdauen, wurde getestet und mit der kommerziellen Protease, ALCALASE , verglichen. Die verwendeten Substrate waren Vollblut, Casein und Gras.
- Rindervollblut, das als sprühgetrocknetes Pulver erhalten wurde, und Casein (Hammerstein) wurden in 0,05M Borat-Puffer, pH..., bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % (w/v) in Gegenwart von Waschmittel (0,15 % w/v, kein Phosphat) und Wasserhärtern (150 ppm) gelöst. Die Protease von Beispiel II und zum Vergleich ALCALASE wurden bei dem angegebenen Aktivitätsniveau zugegeben, und die Reaktionsmischungen wurden bei 15ºC für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von TCA abgebrochen und die Anzahl an in TCA löslichen Aminogruppen, wie oben beschrieben, unter Verwendung von o-Phthaldialdehyd bestimmt.
- Ein Grasextrakt wurde durch Homogenisieren von frisch geschnittenem Gras (10 g) in destilliertem Wasser (50 ml) für 5 Minuten und anschließendes Pressen durch Gaze hergestellt. Der Extrakt wurde gründlich in 50 mM Borat-Puffer, pH 10, dialysiert. Tide (kein Phosphat) und Wasserhärter wurden direkt zum Extrakt zugegeben, so daß sich Konzentrationen von 0,15 % bzw. 150 ppm ergaben. Die Protease von Beispiel II oder ALCALASE wurde zugegeben und die Reaktionen, wie oben beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Reaktionsbedingungen 25ºC und 30 Minuten waren.
- Der Grad, zu dem die Protease jedes Substrat relativ zu ALCALASE hydrolysierte, ist in Tabelle II dargestellt.
- Aus den Ergebnissen in Tabelle II wird deutlich, daß bei demselben Dosierungsniveau der Paecilomyces marquandii beim Verdauen von Blut-, Casein- und Gras-Proteinen in Gegenwart von üblicherweise verwendeten Waschmitteln wirkungsvoller als ALCALASE ist. Tabelle II Proteolytische Verdauung von Blut, Casein und Gras in Gegenwart von Waschmittel Substrat Enzym-Dosisniveau (AU/l) Verdauungsgrad (% des ALCALSE -Werts) Vollblut Casein Gras
- Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen verschiedener kommerzieller Waschmittel auf die Fähigkeit von Protease aus Beispiel II, Blut-Protein zu verdauen. Ein Vergleich wird auch zu kommerzieller Protease ALCALASE in denselben Waschmitteln angestellt.
- Die Reaktionsmischungen enthielten denaturiertes Vollblut (0,1 % w/V), 0,15 % Waschmittel, 150 ppm Wasserhärter, 8,2 mM Natriumborat und 0,05 AU/l Protease. Die Verdauungen wurden für 15 Minuten bei 15ºC durchgeführt, dann wurden die in TCA löslichen Reaktionsprodukte, wie vorher beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II dargestellt. Tabelle III Proteolytische Verdauung von Blut in der Gegenwart von fünf kommerziell erhältlichen Waschmitteln aus der folgenden Liste: Tide, All, Bold 3, Wisk, Dynamo, Era plus und Cheer. Waschmittela Protease % Verdauung relativ zu ALCALASE P. marquandii ALCALASE
- a Der pH jeder Reaktionsmischung beruhte weitgehend auf dem Waschmittel und schwankte von pH 7,8-10,4.
- Die in Beispiel II hergestellte Protease wurde wie folgt gereinigt:
- Die Kulturbrühre wurde zunächst extensiv in 25 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5, hineindialysiert. Ausgefälltes Material, das sich während der Dialyse bildete, wurde durch Zentrifugation entfernt. Die dialysierte Probe wurde auf eine Carboxymethylcellulose-(CM-52)-Säule geladen, die in 25 mM Natriumacetat, pH 5, äquilibriert worden war. Proteaseaktivität band sich an das Harz und wurde anschließend in 25 mM Natriumacetat,pH 5, das 0,2M NaCl enthielt, eluiert. Die Fraktionen, die Proteaseaktivität enthielten, wurden gepoolt und mit einer Amicon-UM-2-Membran konzentriert. Die Probe wurde dann auf eine Sephadex-G-100-Säule geladen, die in 50 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,0, äquilibriert worden war. Die Protease wurde unter Verwendung desselben Puffers aus der Säule eluiert und die aktiven Fraktionen wurden gepoolt. Die Proteaseprobe wurde weiter auf einer Hydroxylapatitsäule gereinigt, die in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, äquilibriert worden war. In diesem Puffer adsorbierte die Protease an die Säule, wurde dann mit einem Gradienten eluiert, in dem die Ionenstärke von Tris abnahm und die von Phosphat-Puffer anstieg. Die Proteaseaktivität wurde bei einer Phosphatpuffer-Konzentration von 10 mM, pH 7,0, eluiert. Die resultierende spezifische Aktivität der Protease betrug 47 Anson-Einheiten/Gramm. Tabelle IV Tabelle IV faßt die Reinigung von Protease aus Beispiel II zusammen Schritt Protease-Aktivität (AU/l) Volumen (mls) Protein Konzentration (mg/ml) Spezifische Aktivität (AU/g) Gesamte Ausbeute % x-fache Reinigung Dialysierter Kulturüberstand Sephadex G-100 Hydroxylapatit
- Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die spezifische Aktivität der gereinigten Protease zu bestimmen.
- Auf der Protease, die, wie in Beispiel VII beschrieben, gereinigt worden war, wurde Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß das Molekulargewicht der Hauptbande 38.000 betrug, und zeigten weiter, daß das Präparat für Aktivstellentitration geeignet war, eine Technik, die verwendet wird, um die spezifische Aktivität der vollständig gereinigten (homogenen) Protease abzuschätzen. Die aktiven Zentren der Protease wurden mit N-trans-Cinnamoylimidazol gemäß der Methode von Bender, M.L. et al., 1966, J. Amer. Chem. Soc., 88:5899-5913, titriert. Die spezifische Aktivität der reinen Protease betrug 62 AU/Gramm Protein.
- Die spezifische Aktivität ist etwas höher als diejenige, die für die bekannte Protease ALCALASE gefunden wurde (45 AU/Gramm).
- Waschtests wurden durchgeführt in einem Terg-O-Tometer für 10 Minuten bei 15ºC mit EMPA116-Testgewebe-Stoffproben, 5 cm x 5 cm, (Baumwolle, verschmutzt mit Blut, Milch und Ruß), geliefert von der Eidgenössischen Materialprüfungs- und Versuchsanstalt, Sankt Gallen, Schweiz, unter Verwendung von Dosierungen von 0,025, 0,05 und 0,10 AU/l Enzym von Beispiel II in Gegenwart von Tide ohne Phosphat (< 0,5 %).
- Zu Vergleichszwecken wurden dieselben Versuche bei Dosierungen von 0,025, 0,05 und 0,10 AU/l ALCALASE durchgeführt.
- Das Reinigungsvermögen der Proteasen wurden durch Veränderung des Reflexionsvermögens (ΔR) gemessen, wobei der Reflexionswert von mit Enzym gewaschenen Teststoffproben mit Stoffproben verglichen wurde, die ohne Enzym gewaschen worden waren. Die Reflexionswerte wurde mit Hilfe eines Gardiner Reflektometers XL 800 (Bethesda, MD) abgelesen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt. TABELLE V Enzym Enzymdosis (AU/l) ΔR Veränderung des Reflexionsvermögens P. marquandii ALCALASE
- Die Ergebnisse zeigen, daß Paecilomyces marquandii-Protease in einem Waschtest bei 15º eine größere Waschwirkung besitzt als ALCALASE .
- Auf der Grundlage von Unterschieden in den Hydolysemustern für die Paecilomyces marquandii-Protease und Bacillus- Proteasen (d.h. ALCALASE ) wurde postuliert, daß die Zugabe der Pilz-Protease zu ALCALASE eine erhöhte Entfernung von Proteinflecken bei einer Waschung bewirken würde.
- Waschtests wurden durchgeführt, wie in Beispiel IX beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Dosierungen von ALCALASE und Paecilomyces marquandii-Protease variiert wurden. ALCALASE wurde entweder allein (0-0,6 AU/l) oder in Mischungen mit der Paecilomyces-Protease verwendet (0,4 AU/l ALCALASE plus 0,05-0,4 AU/l Paecilomyces-Protease).
- Die Ergebnisse sind in Tabelle VI (und Figur 3) dargestellt. Die Zugabe der Pilz-Protease führte zu Veränderungen im Reflexionsvermögen (bessere Waschwirksamkeit), die signifikant höher war als diejenigen, die mit ALCALASE allein bei derselben Gesamtdosis erhalten wurden. TABELLE VI Verbesserte Waschergebnisse durch Zugabe von Paecilomyces marquandii-Protease zu ALCALASE unter Verwendung von EMPA 116-Schmutz ALCALASE Dosis (AU/l) Paecilomyces marquandii-Protease-Dosis (AU/l) ΔR(Veränderung im Reflexionsvermögen)
- Zusätzlich zur Mischung von Bakterien-Proteasen und Paecilomyces marquandii-Protease bei hohen Dosierungen (s. Beispiel X) wurden auch Mischungen bei niedrigeren Dosisraten getestet. Die in diesem Experiment verwendete Dosierung (0,1 KOU/l) spiegelt besser die Enzymmenge wieder, die unter tatsächlichen Waschbedingungen eingesetzt wird.
- Paecilomyces marquandii-NRRL 18048-Protease wurde in Kombination mit der Bacillus-Protease, SAVINASE verwendet, um blutverschmutzte Baumwolle zu waschen, Die Waschtests wurden in einem Waschmittel der folgenden Zusammensetzung durchgeführt (Gramm/Liter): NANSA S80S, 0,4; Berol 065, 0,15; Talgseife, 0,15; Natriumtripolyphosphat, 1,75; Natriumsilicat, 0,5; Carboxymethylcellulose, 0,05; EDTA, 0,01; und Na&sub2;SO&sub4;, 2,1. Die Wasserhärte wurde auf 9º dH (deutsche Härte) eingestellt. Luftgetrocknete Blut-Stoffproben wurden bei 15ºC für 10 Minuten gewaschen. Die Veränderung im Reflexionsvermögen wurde bei 460 nm unter Verwendung eines Elrephotometers 600 bestimmt.
- Die Ergebnisse mit den Paecilomyces-Mischungen sind in Tabelle VII und Figur 4 dargestellt. SAVINASE , bei einer Dosis von 0,1 KOU/l allein verwendet, führte zu einem ΔR von 2,7. Paecilomyces marquandii, verwendet bei derselben Dosisrate, ergab einen ΔR-Wert von 3,5. Wenn eine vergleichbare Dosis an Protease, die aus einer Mischung von 90 % SAVINASE und 10 % Paecilomyces marquandii bestand, verwendet wurde, wurde der ΔR-Wert auf 4,2 verbessert. Der beobachtete ΔR- Wert von 4,2 ist 50 % größer als derjenige, der durch Addieren der zwei Proteasen vorhergesagte. Es ist offensichtlich, daß durch Mischen von SAVINASE und Paecilomyces marquandii-Protease ein synergistischer Effekt erzielt wird. Die Kombination von 90 % SAVINASE plus 10 % Paecilomyces marquandii wurde allein in den Waschexperimenten verwendet. Mischungen von SAVINASE mit einer zweiten Bakterien-Protease, ALCALASE , sind zum Vergleich dargestellt. TABELLE VII Dosis (KOU/l) 0,1 (allein verwendet) 0,075 SAVINASE + 0,025 andere 0,09 SAVINASE + 0,01 andere SAVINASE P. marquandii ALCALASE *beobachtet **Vorhergesagt
Claims (14)
1. Alkalische Protease, erhältlich durch Fermentation eines
Protease produzierenden Stammes von Paecilomyces marquandii.
2. Alkalische Protease nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Stamm NRRL 18048 ist.
3. Proteaseprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es die
alkalische Protease nach Anspruch 1 in Kombination mit einer
alkalischen Bacillus-Protease umfaßt.
4. Proteaseprodukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die alkalische Bacillus-Protease durch Fermentation von
B. licheniformis erhältlich ist.
5. Proteaseprodukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die alkalische Bacillus-Protease vom Serin-Typ ist,
optimale proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb
von etwa 9 zeigt und 80 bis 100 % maximaler proteolytischer
Aktivität bei pH 12 beibehält, wobei besagte Aktivitäten mit
der Anson-Methode gegen Hämoglobin gemessen sind.
6. Verfahren zur Herstellung der alkalischen Protease nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protease
produzierender Stamm von Paecilomyces marquandii aerob unter
Submers-Bedingungen, die geeignete Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen beinhalten, bei einem alkalischen pH kultiviert
wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Kultivierung bei Temperaturen unter 35ºC durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die
Kultivierung bei Temperaturen im Bereich 20-30ºC durchgeführt
wird.
9. Enzymatisches Waschmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es
die alkalische Protease nach Anspruch 1 enthält.
10. Enzymatisches Waschmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es
das Proteaseprodukt nach Anspruch 3 enthält.
11. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 1 in flüssiger
Konzentratform.
12. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 1 in
nichtstaubender Granulatform.
13. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 3 in flüssiger
Konzentratform.
14. Alkalisches Proteaseprodukt nach Anspruch 3 in
nichtstaubender Granulatform.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK563986A DK563986A (da) | 1986-11-25 | 1986-11-25 | Fremstilling af en lav-temperatur-aktiv protease |
PCT/DK1987/000146 WO1988003948A1 (en) | 1986-11-25 | 1987-11-25 | Low-temperature active akaline protease from paecilomyces marquandii and its preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3779906D1 DE3779906D1 (de) | 1992-07-23 |
DE3779906T2 true DE3779906T2 (de) | 1992-12-24 |
Family
ID=8144128
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE8787907943T Expired - Lifetime DE3779906T2 (de) | 1986-11-25 | 1987-11-25 | Bei niedriger temperatur aktive alkalische protease aus paecilomyces marquandii und deren herstellung. |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0290569B1 (de) |
JP (1) | JP2609312B2 (de) |
AT (1) | ATE77409T1 (de) |
DE (1) | DE3779906T2 (de) |
DK (1) | DK563986A (de) |
WO (1) | WO1988003948A1 (de) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5288627A (en) * | 1988-01-07 | 1994-02-22 | Novo Nordisk A/S | Endoprotease from Fusarium oxysporumDSM 2672 for use in detergents |
DK65891D0 (da) * | 1991-04-12 | 1991-04-12 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte proteaser |
EP0623672A1 (de) * | 1993-05-04 | 1994-11-09 | Research Institute For Plant Protection | Alkalische Serine-Protease von Paecilomyces lilacinus |
CA2212456C (en) * | 1995-02-10 | 2012-12-04 | Novo Nordisk A/S | Bacillus proteases |
US5928929A (en) * | 1995-02-10 | 1999-07-27 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease from bacillus sp.I612 |
US6544941B1 (en) * | 2001-08-27 | 2003-04-08 | Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. | Dishwashing composition |
KR20030032605A (ko) | 2001-10-19 | 2003-04-26 | 씨제이 주식회사 | 비브리오 메치니코프 유도체로부터 얻어진 단백질분해효소및 이를 포함하는 세탁용 세제 조성물 |
FI121711B (fi) | 2009-04-30 | 2011-03-15 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö |
FI121712B (fi) | 2009-04-30 | 2011-03-15 | Ab Enzymes Oy | Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö |
FI121851B (fi) | 2009-07-08 | 2011-05-13 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö |
FI123942B (fi) | 2010-10-29 | 2013-12-31 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja |
FI123425B (fi) | 2011-03-31 | 2013-04-30 | Ab Enzymes Oy | Proteaasientsyymi ja sen käytöt |
KR101948039B1 (ko) | 2017-09-06 | 2019-02-14 | 충북대학교 산학협력단 | 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 패실로마이세스 마르콴디이 364 균주 및 이의 용도 |
CN112205422B (zh) * | 2020-10-14 | 2021-05-07 | 黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院 | 一种昆虫病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1234445A (de) * | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
US3557002A (en) * | 1967-11-15 | 1971-01-19 | Procter & Gamble | Stabilized aqueous enzyme preparation |
US3655570A (en) * | 1968-02-08 | 1972-04-11 | Takeda Chemical Industries Ltd | Detergent containing alkali protease |
FR1585121A (de) * | 1968-07-24 | 1970-01-09 | ||
US3652399A (en) * | 1969-04-30 | 1972-03-28 | Takeda Chemical Industries Ltd | Alkali protease |
US4511490A (en) * | 1983-06-27 | 1985-04-16 | The Clorox Company | Cooperative enzymes comprising alkaline or mixtures of alkaline and neutral proteases without stabilizers |
-
1986
- 1986-11-25 DK DK563986A patent/DK563986A/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-11-25 JP JP63500218A patent/JP2609312B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-25 WO PCT/DK1987/000146 patent/WO1988003948A1/en active IP Right Grant
- 1987-11-25 AT AT87907943T patent/ATE77409T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-25 DE DE8787907943T patent/DE3779906T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-25 EP EP87907943A patent/EP0290569B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK563986D0 (da) | 1986-11-25 |
DK563986A (da) | 1988-06-17 |
EP0290569A1 (de) | 1988-11-17 |
EP0290569B1 (de) | 1992-06-17 |
JP2609312B2 (ja) | 1997-05-14 |
JPH01502477A (ja) | 1989-08-31 |
WO1988003948A1 (en) | 1988-06-02 |
ATE77409T1 (de) | 1992-07-15 |
DE3779906D1 (de) | 1992-07-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3779753T2 (de) | Bei niedriger temperatur aktive alkalische protease aus nocardiopsis dassonvillei und deren herstellung. | |
DE68911131T2 (de) | Cellulosezubereitung. | |
DE69333902T2 (de) | Neuartige proteasen | |
DE68924654T2 (de) | Spezifische Protease. | |
US5648263A (en) | Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric | |
DE3117250C2 (de) | ||
DE69203345T2 (de) | Neuartige proteasen. | |
DE3779906T2 (de) | Bei niedriger temperatur aktive alkalische protease aus paecilomyces marquandii und deren herstellung. | |
USRE30602E (en) | Alkaline protease produced by a bacillus | |
DE3787009T2 (de) | Von bazillen abgeleitete alkalinprotease und deren benutzung. | |
US3652399A (en) | Alkali protease | |
DE69328487T2 (de) | Alkalische protease und verfahren zu ihrer herstellung | |
DE1906001C3 (de) | Alkaliproteasen und sie enthaltende Waschmittel | |
DE69109685T2 (de) | Neue protease. | |
DE69232152T2 (de) | Neuartige proteasen | |
DE3834550A1 (de) | Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung | |
DE3328619C2 (de) | ||
DE69231575T2 (de) | Waschmittelenzyme | |
DE69227844T2 (de) | Waschmittelzusammensetzungen | |
DE69223777T2 (de) | Proteasen aus dendryphiella | |
AT394574B (de) | Hauptwaschmittel | |
FI57973B (fi) | Anvaendning av ett proteolytiskt enzym i tvaettmedelskompositioner | |
JPH0387177A (ja) | アルカリプルラナーゼz―i、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼz―iの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |