FI123425B - Proteaasientsyymi ja sen käytöt - Google Patents

Proteaasientsyymi ja sen käytöt Download PDF

Info

Publication number
FI123425B
FI123425B FI20115310A FI20115310A FI123425B FI 123425 B FI123425 B FI 123425B FI 20115310 A FI20115310 A FI 20115310A FI 20115310 A FI20115310 A FI 20115310A FI 123425 B FI123425 B FI 123425B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
enzyme
protease
serine protease
seq
sequence
Prior art date
Application number
FI20115310A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20115310L (fi
FI20115310A0 (fi
FI20115310A (fi
Inventor
Marja Paloheimo
Kari Juntunen
Leena Valtakari
Pentti Ojapalo
Original Assignee
Ab Enzymes Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ab Enzymes Oy filed Critical Ab Enzymes Oy
Publication of FI20115310A0 publication Critical patent/FI20115310A0/fi
Priority to FI20115310A priority Critical patent/FI123425B/fi
Priority to US13/433,984 priority patent/US9404164B2/en
Priority to ES12722084.6T priority patent/ES2585652T3/es
Priority to RU2013146665A priority patent/RU2611043C2/ru
Priority to DK12722084.6T priority patent/DK2691520T3/en
Priority to PCT/EP2012/055762 priority patent/WO2012131023A2/en
Priority to JP2014501649A priority patent/JP2014511681A/ja
Priority to KR1020137029011A priority patent/KR102010747B1/ko
Priority to CN201280026496.9A priority patent/CN103890172B/zh
Priority to EP12722084.6A priority patent/EP2691520B1/en
Priority to BR112013025238A priority patent/BR112013025238A2/pt
Publication of FI20115310L publication Critical patent/FI20115310L/fi
Publication of FI20115310A publication Critical patent/FI20115310A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI123425B publication Critical patent/FI123425B/fi
Priority to US15/196,716 priority patent/US10221377B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/20—Organic compounds containing oxygen
    • C11D3/2003—Alcohols; Phenols
    • C11D3/2065—Polyhydric alcohols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C11D2111/12—
    • C11D2111/14—

Description

PROTEAASIENTSYYMI JA SEN KÄYTÖT
Keksinnön ala 5
Esillä olevan keksinnön kohteena on seri i n i proteaasientsyymi, erityisesti sienen seriini-proteaasientsyymi, joka on käyttökelpoinen monissa erilaisissa sovelluksissa, erityisesti pesuaineissa. Keksintö kohdistuu mainittua entsyymiä koodaavaan nukleiinihappomole-kyyliin, yhdistelmä-DNA-tekniseen vektoriin, isäntäsoluun mainitun entsyymin 10 tuottamista varten, mainittua entsyymiä sisältävään entsyymikoostumukseen sekä menetelmään tällaisen koostumuksen valmistamiseksi. Tämä keksintö kohdistuu myös mainitun entsyymin ja mainittua entsyymiä sisältävien koostumusten erilaisiin käyttöihin.
15 Taustaa
Mikrobeista saadut proteaasit kuuluvat tärkeimpiin hydrolyyttisiin entsyymeihin ja niitä voidaan käyttää monilla erilaisilla teollisuuden aloilla kuten pesuaineissa, elintarvikkeissa, nahassa, lääkkeissä, diagnostisissa aineissa, jätteiden hallinnassa ja 20 hopean talteenotossa. Mikrobiperäiset, solun ulkopuoliset proteaasit muodostavat suuren osan teollisten entsyymien kokonaismyynnistä koko maailmassa (Cherry ja
Fidantsef, 2003). Arviolta 90 % kaupallisista proteaaseista on pesuaine-entsyymejä (Gupta et ai., 2002). Nykyään käytettävissä olevat pesuaineiden kaupalliset valmisteet ^ sisältävät luonnossa esiintyviä, subtilisiinien perheeseen kuuluvia aikalisiä ^ 25 seriiniproteaaseja (EC 3.4.21) tai subtilisiineja (EC 3.4.21.62), jotka ovat peräisin ^ Bacillus-\'dj\st'd, tai jotka ovat sen yhdistelmä-DNA-teknisiä proteaasivalmisteita ^ (Maurer, 2004).
ir
CL
? Kaupallisten proteaasien esimerkkejä ovat muun muassa Subtilisin Carlsberg ^ 30 (Alcalase®), Subtilisin 309 (Savinase®), Subtilisin 147 (Esperase®), Kannase®, o cm Everlase®, Ovozyme® sekä kylmäpesuun soveltuva proteaasi Polarzyme® (Novozymes A/S, DK), Purafect®, Purafect® Ox, Purafect® Prime ja Properase® (Genencor Int., Inc., USA) sekä BLAP S-ja X-sarjat (Henkel, DE).
2
Lukuisia aikalisiä seriiniproteaaseja ja näitä entsyymejä koodaavia geenejä on myös eristetty eukarioottisista eliöistä, mukaan lukien hiiva ja säikeiset sienet. Patenttijulkaisuissa US 3,652,399 ja EP 519229 (Takeda Chemical Industries, Ltd., JP) esitetään 5 alkalinen proteaasi, joka on peräisin Fusarium-suvusta (suvuton tila, teleomorfi) tai Gibberella-svmista (suvullinen tila, anamorfi), erityisesti eliöistä Fusarium sp. S-19-5 (ATCC 20192, IFO 8884), F. oxysporum f. sp. lini (IFO 5880) tai G. saubinetti (ATCC 20193, IFO6608), jotka ovat käyttökelpoisia pesuaine- ja muiden puhdistusainekoostumusten valmistuksessa. Patenttijulkaisussa WO1994025583 10 (NovoNordisk A/S, DK) esitetään aktiivinen, trypsiinin kaltainen proteaasientsyymi, jota voidaan saada Fusarium-lajista, erityisesti eräästä F. oxysporum-kannasta (DSM 2672), sekä sitä koodaava DNA-sekvenssi. mikrobeista F. equiseti ja F. acuminatum peräisin olevien seriiniproteaasien aminohappo- ja nukleotidisekvenssit on esitetty vastaavasti patenttijulkaisuissa WO 2010125174 ja WO 2010125175 (AB Enzymes Oy, 15 FI). Samoin on kuvattu sellaisista sienilajeista kuten Tritirachium ja Conidiobolus peräisin olevat alkaliset proteaasit (yleiskatsauksen ovat esittäneet Anwar ja Saleemuddin, 1998).
Suuri ongelma, johon törmätään, kun proteaaseja käytetään nestemäisissä pesuaineissa, 20 on niiden pysymättömyys. Nestemäisissä pesuaineissa entsyymit ovat suorassa kosketuksessa veden ja kaotrooppisten aineiden kuten anionisten pinta-aktiivisten aineiden ja kompleksoivien aineiden kanssa, mikä saattaa johtaa palautumattomaan denaturoitumiseen. Proteaasit hajottavat proteiineja sekä muita pesuainevalmisteissa ^ olevia entsyymejä ja itseään. Autoproteolyysiä edistävät pinta-aktiiviset aineet ja lämpö.
^ 25 Näin ollen proteaasia sisältävien nestemäisten pesuaineiden pysyvyys on suuri haaste ° tuotteen kehityksessä (Maurer, 2010).
(M
X
cc
Erilaisia menetelmiä on käytetty teollisten seriiniproteaasien pysyvyyden
? parantamiseksi. Patenttijulkaisuissa WO 92/03529 (NovoNordisk A/S, DK), US
£ 30 2009/096916 (Genencor Int. Inc., US) ja WO 2007/145963 (Procter & Gamble Co., US) o cvj esitetään peptidin tai proteiinin tyyppisen palautuvan proteaasi-inhibiittorin käyttö.
Proteaaseja sisältävät nestemäiset pesuainekoostumukset sisältävät usein proteaasin inhibiittoria kuten boorihappoa mahdollisesti yhdessä polyolien kanssa proteaasien 3 aktiivisuuden estämiseksi. Tällaisten inhibiittoreiden eräs esimerkki on 4-formyylifcnyyliboronihappo (4-FPBA), joka on esitetty patenttijulkaisussa US 2010/0120649 (Novozymes A/S, DK). Proteaasien pysyvyyttä on myös parannettu käyttämällä halogenidisuolojen ja polyolien yhdistelmää (WO 02/08398, Genencor Int. 5 Inc., US). Patenttijulkaisussa EP 0352244A2 (NovoNordisk A/S, DK) ehdotetaan Bacillus.ista peräisin olevien entsyymien pysyvyyden parantamista käyttäen amfoteerisia yhdisteitä kuten pinta-aktiivisia aineita.
Homologisten proteiinien kiderakenteista ja sekvenssien samankaltaisuuden vertailuista 10 saadun informaation perusteella voidaan toteuttaa muunnoksia, joiden pysyvyys on parantunut ja/tai suorituskyky on parantunut. Luonnollisten seriiniproteaasien muunnoksia, joiden katalyyttinen tehokkuus on parantunut ja/tai jotka ovat paremmin pysyviä ajatellen lämpötilaa, hapettavia aineita ja erilaisia pesuolosuhteita ja joiden pysyvyys niitä nestemäisissä pesuaineissa varastoitaessa on parantunut, on kehitetty 15 kohdennetulla j a/tai satunnaisella mutageneesillä.
Termomykoliinia EC 3.4.21.65, joka on eristetty solun ulkopuolisena alkalisena endo- peptidaasina, tuottaa termofiilinen sieni Malbranchea pulcella var. sulfurea. Termomy- koliini on kuvattu proteiiniksi, jossa on 325 jäännöstä ja vain yksi ketju. Sen aktiivisen 20 kohdan sekvenssi on -Leu-Ser-(Gly)-Thr-Ser*-Met-, joka on tyypillinen subtilisiiniperheen jäsenelle. Termomykoliinissa on yksi disulfidisilta, mikä on poikkeuksellista. Termomykoliini ei ole yhtä lämpöpysyvää kuin termofiilisten bakteereiden solujen ulkopuoliset seriiniproteinaasit, mutta se on pysyvämpi kuin useimmat sieniperäiset proteinaasit (Gaucher ja Stevenson, 2004). Ong:in ja Gaucher:in ^ 25 (1975) mukaan termomykoliinin inaktivoituminen lämmön vaikutuksesta tapahtuu 73 1 °C:ssa, kun läsnä on 10 mM Ca :ta. Termomykoliini hydrolysoi kaseiinia laajalla pH- c\i alueella. Optimaalinen pH kaseiinin hydrolyysille on noin 8,5. cc
CL
o ^ Abu-Shady et ai. (2001) esittävät Malbranchea sulfurea\st&, joka on egyptiläisistä m ^ 30 teurastamoista kerätyistä maaperänäytteistä peräisin oleva paikallinen eriste ja jota on δ ^ viljelty proteaasientsyymin saamiseksi, peräisin olevan proteaasin ominaisuuksia. Tässä julkaisussa kuvataan M. sulphurea:n proteaasin suhteellinen aktiivisuus tiettyjen pesuaineiden ollessa läsnä alhaisina pitoisuuksina (0,7 %) 30-90 °C:ssa, käyttäen 15-60 4 minuutin esi-inkubointiaikaa, eli pesuolosuhteita muistuttavissa olosuhteissa. Siinä ei esitetä kuitenkaan mitään tämän proteaasin likaa poistavasta suorituskyvystä tai sen pysyvyydestä sitä itse pesuaineessa varastoitaessa, jotka ovat olennaisia ominaisuuksia ajatellen proteaasin soveltuvuutta pesuainevalmisteisiin. Julkaisussa kuvataan myös 5 osittain puhdistetun proteaasin lämpötila- ja pH-profiilit. Proteaasin optimaalinen lämpötila on 50 °C ja sen optimi-pH on 9,0.
Huolimatta siitä, että alalla on julkaistu lukuisia patenttijulkaisuja, yleiskatsauksia ja artikkeleita, joissa esitetään monista erilaisista pieneliöistä peräisin olevia sieniperäisiä 10 seriiniproteaaseja, esimerkiksi alhaisen lämpötilan alkaliset proteaasit sellaisista pieneliöistä kuten aktinomykeeteistä (Nocardiopsis dassonvillei) ja sienistä (Paecilomyces marquandii), esimerkiksi julkaisuissa EP 0290567 ja EP 0290569 (Novo Nordisk A/S, DK), alalla ilmenee edelleen huomattavaa tarvetta löytää uusia proteaaseja, jotka soveltuvat erilaisten likojen sisältämien proteiinimateriaalien muokkaukseen, hajotukseen ja 15 poistoon ja jotka ovat tehoavia tällaisessa muokkauksessa, hajotuksessa ja poistossa erityisesti alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla ja jotka ovat pysyviä ominaisuuksiltaan hyvin erilaisten pesuaineiden läsnä ollessa. Seriiniproteaasien autokatalyyttisesta ominaisuudesta johtuen pysyvyys säilytyksen aikana on myös hyvin tärkeää.
20
Toivottavaa on myös se, että seriiniproteaasia kyetään tuottamaan suurina määrinä ja että sen jälkikäsittely tuotantovaiheen jälkeen voidaan toteuttaa kustannustehokkaasti helpolla erotuksella fermentointialustasta ja rihmastosta.
C\J
δ
(M
25 Yhteenveto keksinnöstä
CO
o
(M
CM
Esillä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan sienestä peräisin olevaa seriinipro-cc “ teaasia, joka on aktiivista laajoilla pH-alueilla ja joka toimii erityisen hyvin alhaisissa ja o ^ kohtalaisissa lämpötiloissa. Pesuainesovellukseen tarkoitettujen seriiniproteaasien on
LO
^ 30 oltava pysyviä myös pesuaineiden läsnä ollessa ja niiden on oltava yhteensopivia pesu- δ ^ aineiden kanssa. Esillä olevan keksinnön tavoitteena on erityisesti saada aikaan seriini proteaasia, joka kykenee poistamaan proteiinimateriaalia, mukaan lukien pestävässä pyykissä ja tiskeissä olevat liat, alemmissa lämpötiloissa kuin kaupallinen entsyymi- 5 valmiste, jolloin voidaan esimerkiksi pestä herkempiä materiaaleja ja energiaa voidaan säästää. Keksinnön muina tavoitteina on saada aikaan mainittua entsyymiä koodaava nukleiinihappomolekyyli, yhdistelmä-DNA-tekninen vektori, isäntäsolu mainitun entsyymin tuottamiseksi, mainittua entsyymiä sisältävä koostumus, menetelmä mainitun 5 koostumuksen valmistamiseksi sekä mainitun entsyymin ja mainittua entsyymiä sisältävien koostumusten käytöt.
Keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan tuottaa suuria saantoja tuottavissa sieni-isännissä ja sen jälkikäsittely tuotantovaiheen jälkeen, esimerkiksi 10 fermentointialustan j a rihmaston erotus on vaivaton toteuttaa.
Esillä olevan keksinnön kohteena on sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jolla on se-riiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 66-pro-senttisesti samanlainen kuin sekvenssinä SEQ ID No: 18 määritelty aminohapposek-15 venssi. Edullinen seriiniproteaasi on peräisin eliöstä Malbranchea cinnamomea (Lib.) Oorschot de Hoog.
Esillä olevassa asiayhteydessä ilmauksella "peräisin" ei ole tarkoitus viitata vain seriini-proteaasiin, jota kyseessä olevan eliön kanta tuottaa tai voi tuottaa, vaan myös tällaisesta 20 kannasta eristetyn DNA-sekvenssin koodaamaan seriiniproteaasiin, jota on tuotettu mainitulla DNA-sekvenssillä transformoidussa isäntäeliössä. Lopuksi tällä käsitteellä on tarkoitus viitata seriiniproteaasiin, jota synteettistä ja/tai cDNA-alkuperää oleva DNA koodaaja jolla on kyseessä olevalle seriiniproteaasille tunnusomaiset piirteet.
C\J
δ ^ 25 Keksintö kohdistuu edullisesti sieniperäiseen scri iniprotcaasientsyymiin, jolla on ^ seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 66- ^ prosenttisesti samanlainen kuin sekvenssinä SEQ ID No: 18 määritelty, kypsän ^ Malbranchea ALK04122-proteaasin aminohapposekvenssi tai jolla on sekvenssinä ? SEQ ID No: 18 määritelty, kypsän Malbranchea ALK04122-proteaasin amino- ί 30 happosekvenssi.
δ
CM
Keksinnön mukainen, sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi voidaan saada eliöstä Malbranchea, edullisesti lajista Malbranchea cinnamomea (Lib.) Oorschot de Hoog 6 (jonka synonyymi on Malbranchea pulchella var. sulfurea (Miehe) Cooney & R. Emers.). Erään erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan keksinnön mukaista scriiniproteaasientsyymiä voidaan saada talletusnumerolla CBS 128533 talletetusta Malbranchea ALK04122-kannasta tai talletusnumerolla CBS 128564 talletetusta 5 Malbranchea ALK04178-kannasta. Malbranchea ALK04178-kannan proteaasientsyymi on olennaisesti samanlainen kuin Malbranchea ALK04122-kannan proteaasientsyymi.
Sieniperäisen proteaasientsyymi n molekyylimassa on alueella 20-35 kDa. Entsyymin 10 lämpötilaoptimi on alueella 30-80 °C, kun pH on 8,5, edullisesti 70 °C:n lämpötilassa. Entsyymin pH-optimi 50 °C:ssa on alueella, joka alkaa vähintään pH-arvosta 6 ja ulottuu pH-arvoon 10, edullisesti pH 10. Lämpötila- ja pH-ominaisuudet määritettiin käyttäen 30 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina.
15 Keksinnön mukainen sieniperäinen seriiniproteaasi kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiineja sisältäviä likoja pesuaineiden läsnä ollessa alueella 0-90 °C olevassa lämpötilassa, edullisesti 5-60 °C:n lämpötilassa, erityisen edullisesti 10-40 °C:n lämpötilassa.
Keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä koodaa eristetty poly-20 nukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa plasmidin pALK3092 sisältämään polynukleotidisekvenssiin, jossa on nukleotidisekvenssi SEQ ID No:ll, talletettuna E. coli RF8758:ssa talletusnumerolla DSM 24426, tai kypsää ALK04122-proteaasia koodaavaan sekvenssiin SEQ ID No: 17. Vaihtoehtoisesti c\i o keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä koodaa eristetty c\i οό 25 polynukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa plasmidin
O
c\j pALK3093 sisältämään polynukleotidisekvenssiin, jossa on nukleotidisekvenssi SEQ
OJ
x ID No: 12, talletettuna E. coli RF8759:ssä talletusnumerolla DSM 24427.
tr
CL
o cö Mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka koodaa ^ 30 polypeptidiä, jolla on sekvenssissä SEQ ID No: 18 määritelty kypsän Malbranchea ALK04122-proteaasin aminohapposekvenssi, tai jolla on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin sekvenssissä SEQ ID No: 18 määritelty kypsän Malbranchea ALK04122-proteaasin aminohapposekvenssi. Edullisessa 7 tapauksessa mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka sisältää nukleotidisekvenssin SEQ ID No: 17.
Keksinnön mukainen täysipituinen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi on 5 koodautunut muodosteen pALK3094 sisältämään polynukleotidisekvenssiin, joka muodoste on talletettu Escherichia coli RF8791-kannassa talletusnumerolla DSM 24410.
Sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä tuotetaan yhdistelmä-DNA-teknisestä 10 ilmentämisvektorista, joka sisältää keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniproteaasia koodaavan nukleiinihappomolekyylin kytkettynä toiminnallisesti säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan seriiniproteaasientsyymin ilmentymistä sopivassa isännässä. Sopivia isäntiä ovat mm. heterologiset isännät, edullisesti sukuihin Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium, 15 Myceliophthora ja Mortiriella kuuluvat mikrobi-isännät.
Edullisessa tapauksessa mainittua entsyymiä tuotetaan Trichoderma- tai Aspergillus-suvuissa, T. ree.se/-lajissa.
20 Esillä olevan keksinnön kohteena on myös eristetty nukleiinihappomolekyyli, jossa on seriiniproteaasientsyymiä koodaava polynukleotidisekvenssi ja joka on valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: a) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaamalla polypeptidillä on seriiniproteaasin ^ aktiivisuutta ja sekvenssinä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi; o ^ 25 b) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaamalla polypeptidillä on seriiniproteaasin ^ aktiivisuutta ja joka polypeptidi on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin ^ sekvenssinä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi; £ c) nukleiinihappomolekyylistä, jossa on sekvenssinä SEQ ID No: 17 esitetyn ? nukleotidisekvenssin mukainen koodaava sekvenssi; co 30 d) nukleiinihappomolekyylistä, jossa on DSM 24410-tallenteeseen sisällytetyn poly-nukleotidisekvenssin mukainen koodaava sekvenssi; 8 e) nukleiimhappomolekyylistä, jonka koodaava sekvenssi eroaa jommankumman kohdan (c)-(d) mukaisen nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneroitumisesta johtuen; sekä
f) nukleiimhappomolekyylistä, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa DSM
5 24426-tallenteeseen sisältyvään nukleiinihappomolekyyliin tai sekvenssiin SEQ ID
No: 17, ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin sekvenssissä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi.
10 Keksinnön kohteena on lisäksi yhdistelmä-DNA-tekninen ilmentämisvektori, joka sisältää keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin kytkettynä toiminnallisesti sääteleviin sekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan mainitun seriiniproteaasigeenin ilmentymistä sopivassa isännässä. Sopivia isäntiä ovat mm. heterologiset isännät, edullisesti mikrobi-isännät, jotka kuuluvat sukuihin Trichoderma, Aspergillus, 15 Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium, Myceliophthora ja Mortiriella. Edullisessa tapauksessa mainittu entsyymi tuotetaan suvussa Trichoderma tai Aspergillus, kaikkein edullisimmin T. reese/-lajissa.
Keksinnön kohteena on myös isäntäsolu, joka sisältää edellä kuvatun kaltaisen 20 yhdistelmä-DNA-teknisen ilmentämisvektorin. Isäntäsolu on edullisessa tapauksessa mikrobisolu, kuten rihmasieni. Edulliset isännät kuuluvat sukuun Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium, Myceliophthora ja Mortiriella. Edullisemmassa tapauksessa isäntä on Trichoderma tai Aspergillus, kaikkein edullisimmin rihmasieni T. reesei.
(M
, 25
CO
^ Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä polypeptidin tuottamiseksi, jolla 0X1 polypeptidillä on seriiniproteaasin aktiivisuutta, johon menetelmään kuuluvissa cc vaiheissa viljellään keksinnön mukaista isäntäsolua ja polypeptidi otetaan talteen. ° Keksinnön piiriin kuuluu myös polypeptidi, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja
LO
>- 30 jota koodaa keksinnön mukainen nukleiinihapposekvenssi ja jota voidaan saada edellä o cm kuvatulla menetelmällä.
9
Keksinnön kohteena on menetelmä entsyymivalmisten saamiseksi, johon menetelmään kuuluvissa vaiheissa viljellään keksinnön mukaista isäntäsolua ja polypeptidi otetaan talteen joko soluista tai solut erotetaan viljelyalustasta ja supematantti saadaan. Keksinnön piiriin kuuluu myös entsyymivalmiste, jota voidaan saada esillä kuvatulla 5 menetelmällä.
Keksintö kohdistuu entsyymivalmisteeseen, joka sisältää keksinnön mukaista seriini-proteaasientsyymiä.
10 Keksinnön kohteena on edelleen keksinnön mukaista seriiniproteaasientsyymiä sisältävä koostumus.
Keksinnön mukaista proteaasientsyymiä sisältävä entsyymivalmiste tai -koostumus (esimerkiksi pesuainevalmiste) voi lisäksi sisältää muitakin entsyymejä, jotka on valittu 15 ryhmästä, joka koostuu proteaaseista (muista kuin keksinnön mukaisesta proteaasista), amylaaseista, sellulaaseista, lipaaseista, ksylanaaseista, mannaaseista, kutinaaseista, pektinaaseista ja oksidaaseista yhdessä välittäjän kanssa tai ilman sitä, sekä sopivia lisäaineita, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu stabilisaattoreista, puskureista, pinta-aktiivisista aineista, valkaisuaineista, välittäjistä, korroosiota estävistä aineista, runko-20 aineista, lian uudelleenkiinnittymistä torjuvista aineista, optisista kirkasteista, väriaineista, pigmenteistä, hajusteista, emäksisistä aineista, hankausaineista ja säilöntäaineista, jne.
g Tuotantoisännän käytettyä viljelyalustaa voidaan käyttää sellaisenaan tai isäntäsolut ^ 25 voidaan poistaa ja/tai alusta voidaan väkevöidä, suodattaa tai jakaa jakeiksi. Se voidaan ^ myös kuivata. Keksinnön mukainen entsyymivalmiste ja seriiniproteaasientsyymiä ^ sisältävä koostumus voivat olla nestemäisiä, jauheita, rakeita tai tabletteja. Valmisteessa
E
tai koostumuksessa entsyymi voi olla immobilisoidussa muodossa, o cö
LO
>- 30 Keksinnön piiriin kuuluu samoin keksinnön mukaisen seriiniproteaasientsyymin tai o ^ entsyymivalmistccn käyttö pesuaineissa, kuitujen käsittelyyn, proteiinipitoisen materiaalin kuten villan, hiusten/karvojen, nahan, silkin käsittelyyn, elintarvikkeiden ja eläinravinnon käsittelyyn tai mihin tahansa muihin sellaisiin sovelluksiin, joihin liittyy 10 proteiinipitoisen materiaalin muokkausta, hajotusta tai poistoa. Tämä entsyymi tai entsyym i valmiste on erityisen käyttökelpoinen pesuaineen lisäaineena pesuainenesteissä, pesuainejauheissa ja pesuainetableteissa.
5 Piirustusten lyhyt kuvaus
Kuvio 1 (IA ja IB) esittää nukleotidisekvenssiä, johon sisältyvät Malbranchea ALK04122-proteaasin geeni, sen osittainen promoottorisekvenssi (50 nukleotidiä ennen ATG:tä) ja päättäjäsekvenssi (60 nukleotidiä pysäytyskodonin jälkeen), sekä 10 koodautuneen proteaasin pääteltyä aminohapposekvenssiä. Oletettu signaalipeptidi, joka on analysoitu SignalP V3.0-ohjelmalla, on esitetty pienin kiijäimin ja se on alleviivattu. Pro-sekvenssi ja pro-sekvenssin päätellyt aminohapot on esitetty pienin kirjaimin. Kypsät nukleotidi- ja peptidisekvenssit on esitetty suurin kirjäimin. Kolme oletettua intronisekvenssiä on esitetty pienin kirjaimin kursivoituna ja merkitty 15 nukleotidisekvenssin alla olevalla katkoviivalla. Pysäytyskodoni on esitetty sekvenssin alla olevalla tähdellä. Alukkeiden DET27 (5'-sense-aluke, s) ja DET28 (3'-antisense-aluke, as), joita käytetään Malbranchea ALK04178-proteaasin geenin PCR-kloonauksessa, sijainnit on alleviivattu kaksinkertaisella viivalla.
20 Kuvio IA esittää nukleotidisekvenssiä, johon sisältyy Malbranchea ALK04122- proteaasin geeni ja ja sen osittainen promoottori. Proteaasigeenin sekvenssiin sisältyvät nukleotidit 51-960, aminohaposta Met 1 alkavaa ja aminohappoon Vai 279 päättyvää aminohapposekvenssiä koodaava sekvenssialue ja proteaasin Ala 280:n ensimmäinen ^ kodoni.
o
CM
, 25
CO
^ Kuvio IB esittää nukleotidisekvenssiä, johon sisältyvät Malbranchea ALK04122- ^ proteaasin geeni ja sen osittainen päättäjä. Proteaasigeenin sekvenssiin sisältyvät ^ nukleotidit 961-1486 (mukaan lukien pysäytyskodoni TAA), proteaasin aminohaposta 2 Ala 280 alkavaa (kaksi viimeistä kodonia) ja aminohappoon Arg 401 päättyvää amino- ^ 30 happosekvenssiä koodaava sekvenssialue.
δ
CM
Kuvio 2 esittää kaavamaisesti pALK2777-plasmidin karttaa, jota plasmidia käytetään runkona pALK3097-ilmentämiskasetin muodostuksessa. Afo/hra«cAea-proteaasin geeni 11 ligatoitiin cbhl (cel7A )-promoottorisekvenssin (tarkka fuusio bc/cll-kohdan kautta) ja päättäjäsekvenssin (kytkijässä olevan 5amHI-kohdan kautta) välissä Sacll - BamHI-pilkottuun muodosteeseen pALK2777. Lisäyksityiskohtia on esitetty esimerkissä 2. pALK2777-plasmidi sisältää synteettisen amc/S-mcrkkigeenin transformanttien seulo-5 miseksi. pcbhl, cbhl-promoottori; tcbhl, cö/z/-päättäjä; s_amdS, synteettinen amdS-merkkigeeni (cDNA); Kytkijä, kytkijäsekvenssi, sisältäen mm. RamHI-kohdan.
Kuvio 3 esittää kaavamaisesti pALK3097-kasettia, joka on eristetty vektorirungosta sulattamalla Notl:llä, ja jota käytetään Malbranchea ALK04122-proteaasin geenin 10 ilmentämiseen Trichoderma reesei:ssa. pcbhl, cbhl -promoottori; tcbhl, cM/-päättäjä; s amdS, synteettinen amc/S-merkkigeeni (cDNA); Kytkijä, kytkijäsekvenssi.
Kuvio 4 esittää osittain puhdistettua yhdistelmä-DNA-teknistä proteiinia, joka on analysoitu 12 % SDS PAGE-geelin avulla. Kaista 1. Näyte osittain puhdistetusta 15 Malbranchea-proteaasista; Kaista 2. Molekyylipainon merkkiaine (Page Ruler Unstained Protein Ladder, Fermentas).
Kuvio 5 (5A ja 5B) esittää entsyymin suhteellista aktiivisuutta erilaisissa lämpötiloissa japH-arvoissa.
20
Kuvio 5A kuvaa yhdistelmä-DNA-teknisen Malbranchea-proteaasin ja Savinase® 16L:n lämpötilaprofiilia määritettynä 8,5 olevassa pH:ssa käyttäen 30 minuuttia olevaa reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina. Tulospisteet ovat kolmen erillisen mittauksen keskiarvoja.
cv , 25
CO
^ Kuvio 5B kuvaa pH:n vaikutusta yhdistelmä-DNA-teknisen Malbrachea-proteaasin ja ^ Savinase® 16L:n aktiivisuuteen. Käytetty puskuri oli Britton-Robinson-puskuri, jonka ^ väkevyys oli 40 mM, substraattina käytettiin kaseiinia, reaktioaika oli 30 min ja ° reaktion lämpötila oli 50 °C. Tulospisteet ovat kolmen erillisen mittauksen keskiarvoja, tn ^ 30 δ 00 Kuvio 6 (6A, 6B, 6C ja 6D) esittää yhdistelmä-DNA-teknisellä Malbranchea ALK04122-proteaasilla olevaa likaa poistavaa suorituskykyä käyttäen likana verta/maitoa/mustetta (tuote. 117, CO+PES, sarjanro 11-08, uusi erä, EMPA) 10 - 50 12 °C:n lämpötilassa, pH:n ollessa suurin piirtein 8, 60 minuutin aikana kaupallisen nestemäisen pesuaineen ollessa läsnä 5 g/1 olevana pitoisuutena. Vertailuun käytettiin kaupallisia proteaasivalmisteita Savinase® 16L ja Savinase® Ultra 16L.
5 Kuvio 6A esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 10 °C.
Kuvio 6B esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 20 °C.
Kuvio 6C esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 30 °C.
10
Kuvio 6D esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 50 °C.
Kuvio 7 (7A, 7B, 7D ja 7C) esittää yhdistelmä-DNA-teknisellä Malbranchea ALK04122-proteaasilla olevaa likaa poistavaa suorituskykyä käyttäen likana 15 verta/maitoa/mustetta (tuote.117, CO+PES, sarjanro 10-07, vanha erä, EMPA) 10 - 50 °C:n lämpötilassa, pH:n ollessa suurin piirtein 8, 60 minuutin aikana kaupallisen nestemäisen pesuaineen ollessa läsnä 5 g/1 olevana pitoisuutena. Vertailuun käytettiin tuotetta Savinase® Ultra 16L.
20 Kuvio 7A esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 10 °C.
Kuvio 7B esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 20 °C.
Kuvio 7C esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 30 °C.
(M
, 25
CO
' Kuvio 7D esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 50 °C.
(M
cc
Kuvio 8 (8A, 8B, 8C ja 8D) esittää yhdistelmä-DNA-teknisellä Malbranchea 2 ALK04122-proteaasilla olevaa likaa poistavaa suorituskykyä käyttäen likana ^ 30 verta/maitoa/mustetta (tuote. 117, CO+PES, sarjanro 11-08, uusi erä, EMPA) 10 - 50 o <m °C:n lämpötilassa, pH:n ollessa suurin piirtein 8, 60 minuutin aikana kaupallisen nestemäisen pesuaineen läsnä ollessa, 5 g/1 olevana pitoisuutena. Vertailuun käytettiin tuotteita Savinase® 16L ja Savinase® Ultra 16L.
13
Kuvio 8A esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 10 °C (entsyymin annostus laskettu proteiinina).
5 Kuvio 8B esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 20 °C (entsyymin annostus laskettu proteiinina).
Kuvio 8C esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 30 °C (entsyymin annostus laskettu proteiinina).
10
Kuvio 8D esittää likaa poistavaa suorituskykyä, kun lämpötila on 50 °C (entsyymin annostus laskettu proteiinina).
Kuvio 9 (9A, 9B, 9C, 9D, 9E, 9F, 9G ja 9H) esittää yhdistelmä-DNA-teknisen 15 Malbranchea ALK04122-proteaasin suorituskykyä erilaisten likojen suhteen Launder Ometer-kokeissa kaupallisen nestemäisen pesuaineen ollessa läsnä 5 g/1 olevana pitoisuutena 30 ja 60 °C:ssa, 60 min, noin 8 olevassa pH:ssa. Kaupallista valmistetta Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailuun.
20 Kuvio 9A esittää suorituskykyä ruoho-puuvillanäytteen suhteen, tuote 164 (Sarjanro 23-03), EMPA30 °C:ssa.
Kuvio 9B esittää suorituskykyä ruoho-puuvillanäytteen suhteen, tuote 164 (Saijanro 23- ^ 03), EMPA 60 °C:ssa.
o
CM
, 25
CO
^ Kuvio 9C esittää suorituskykyä veri/maito/muste-puuvillanäytteen suhteen, tuote 116 ^ (Saijanro 18-16), EMPA 30 °C:ssa.
ir
CL
2 Kuvio 9D esittää suorituskykyä veri/maito/muste-puuvillanäytteen suhteen, tuote 116 ^ 30 (Saijanro 18-16), EMPA 60 °C:ssa.
δ
CM
Kuvio 9E esittää suorituskykyä veri/maito/muste-CO+PES-näytteen suhteen, tuote 117 (Sarjanro 11-08, uusi erä), EMPA 30 °C:ssa.
14
Kuvio 9F esittää suorituskykyä veri/maito/muste-CO+PES-näytteen suhteen, tuote 117 (Sarjanro 11-08, uusi erä), EMPA 60 °C:ssa.
5 Kuvio 9G esittää suorituskykyä veri/maito/muste-CO+PES-näytteen suhteen, tuote 117 (Saijanro 10-07, vanha erä), EMPA 30 °C:ssa.
Kuvio 9H esittää suorituskykyä veri/maito/muste-CO+PES-näytteen suhteen, tuote 117 (Sarjanro 10-07, vanha erä), EMPA 60 °C:ssa.
10
Kuvio 10 (10A ja 10B) esittää proteaasin suorituskykyä pesuainejauheen läsnä ollessa.
Kuvio 10A esittää yhdistelmä-DNA-teknisellä Malbranchea ALK04122-proteaasilla olevaa suorituskykyä vereen/maitoon/musteeseen, CO+PES, tuote.117 (saijanro 11-08), 15 EMPA kaupallisen perinteisen pesuainejauheen (kuvattu esimerkissä 8) ollessa läsnä, 5 g/1, 50 °C:n lämpötilassa, pH:n ollessa suurin piirtein 10,5. Tuotetta Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailuun.
Kuvio 10B esittää yhdistelmä-DNA-teknisellä Malbranchea ALK04122-proteaasilla 20 olevaa suorituskykyä vereen/maitoon/musteeseen, CO+PES, tuote. 117 (saijanro 11-08), EMPA pesuainejauheen läsnä ollessa, tuote 601, EMPA 5 g/1, 50 °C, 60 min, pH noin 10. Tuotetta Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailuun.
^ Kuvio 11 (llAja 11B) esittää proteaasin pysyvyyttä varastoitaessa 37°C:ssa.
CVJ
. 25 00 o ...
^ Kuvio 11A esittää yhdistelmä-DNA-teknisen Malbranchea ALK04122-proteaasin
Ovi pysyvyyttä varastoitaessa 37 C:ssa, säilöttynä/stabiloituna tuotteella Proxel LV tai cc “ propyleeniglykolilla (PG).
o cö LO ...
^ 30 Kuvio 11B esittää yhdistelmä-DNA-teknisen proteaasin Fe_RF6318 δ 0X1 (W02010125174A1) pysyvyyttä varastoitaessa 37 °C:ssa, säilöttynä/stabiloituna tuotteella Proxel LV tai propyleeniglykolilla.
15
Kuvio 12 (12A ja 12B) esittää proteaasin pysyvyyttä pesuaineessa.
Kuvio 12 A esittää yhdistelmä-DNA-teknisen Malbranchea ALK04122-proteaasin pysyvyyttä viitepesuaineena toimivassa tuotteessa Ecolabel Reference Detergent, 37 5 °C:ssa, pH noin 7. Vertailuun käytettiin kaupallista valmistetta Savinase® Ultra 16L ja yhdistelmä-DNA-teknistä proteaasia Fe_RF6318 (W02010125174A1). Pesuaineessa käytetyn entsyymival m i stccn määrä oli 4 % (p/p).
Kuvio 12B esittää Malbranchea AFK04122-proteaasin pysyvyyttä kaupallisessa 10 nestemäisessä pesuaineessa 37 °C:ssa (pH noin 8). Vertailuun käytettiin tuotetta Savinase® Ultra 16F ja yhdistelmä-DNA-teknistä proteaasia Fe_RF6318 (W02010125174A1). Pesuaineessa käytetyn entsyymivalmisteen määrä oli 4% (p/p).
Sekenssiluettelo 15 SEQ ID NO:l DETl-sense-alukkeen, jota käytettiin PCR-reaktiossa Malbranchea-proteaasikoettimen synteesiä varten, sekvenssi.
SEQ ID NO:2 DET2-sense-alukkeen, jota käytettiin PCR-reaktiossa Malbranchea-20 proteaasikoettimen synteesiä varten, sekvenssi.
SEQ ID NO:3 DET3-antisense-alukkeen, jota käytettiin PCR-reaktiossa Malbranchea-proteaasikoettimen synteesiä varten, sekvenssi.
C\J
δ
(M
^ 25 SEQ ID NO:4 DET4-antisense-alukkccn, jota käytettiin PCR-reaktiossa Malbranchea- ° proteaasikoettimen synteesiä varten, sekvenssi.
(M
CC
SEQ ID NO:5 DET5-sense-alukkeen, jota käytettiin PCR-reaktiossa Malbranchea-o ^ proteaasikoettimen synteesiä varten, sekvenssi.
LO
T- 30 δ ^ SEQ ID NO:6 DETl-sense-PCR-alukkeen toteutukseen käytetyn yleispätevän peptidisekvenssin sekvenssi.
16 SEQ ID NO:7 DET2-sense-PCR-alukkeen toteutukseen käytetyn yleispätevän peptidisekvenssin sekvenssi.
SEQ ID NO:8 DET3-antisense-PCR-alukkeen toteutukseen käytetyn yleispätevän 5 peptidisekvenssin sekvenssi.
SEQ ID NO:9 DET4-antisense-PCR-alukkeen toteutukseen käytetyn yleispätevän peptidisekvenssin sekvenssi.
10 SEQ ID NO: 10 DET5-sense-PCR-alukkeen toteutukseen käytetyn peptidisekvenssin sekvenssi.
SEQ ID NO: 11 PCR-fragmentin sekvenssi, joka PCR-fragmentti saatiin käyttäen alukkeita DET5 ja DET4 PCR-reaktiossa ja Malbranchea ALK04122:n perimän 15 DNA:ta mallineena. Tämä fragmentti sisältää osittaisen Malbranchea-protca&sm geenin ja se on istute plasmidissa pALK3092.
SEQ ID NO: 12 PCR-fragmentin sekvenssi, joka PCR-fragmentti saatiin käyttäen alukkeita DET5 ja DET4 PCR-reaktiossa ja Malbranchea ALK04178:n perimän 20 DNA:ta mallineena. Tämä fragmentti sisältää osittaisen Ma/öranc/zea-proteaasin geenin ja se on istute plasmidissa pALK3093.
SEQ ID NO: 13 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Malbranchea ALK04122- ^ proteaasin täysipituista aminohapposekvenssiä. Täysipituinen geeni sisältyy plasmidiin ^ 25 pALK3094. Malbranchea ALK04178:sta PCR-reaktion avulla kloonattu ^ proteaasigeenin sekvenssi oli täysin samanlainen tämän sekvenssin kanssa.
(M
X
SEQ ID NO: 14 Malbranchea ALK04122-proteaasin täysipituinen 2 aminohapposekvenssi, joka sisältää täysipituisen proteaasin aminohapot Met 1 -Arg 401.
LO
30 S SEQ ID NO: 15 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Malbranchea ALK04122- proteaasin proentsyymimuodon aminohapposekvenssin.
17 SEQ ID NO: 16 Malbranchea ALK04122-proteaasin proentsyymimuodon aminohapposekvenssi, joka sisältää täysipituisen proteaasin aminohapot Gly 21-Arg 401.
5 SEQ ID NO: 17 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Malbranchea ALK04122-proteaasin kypsän muodon aminohapposekvenssiä.
SEQ ID NO: 18 Malbranchea ALK04122-proteaasin kypsän muodon aminohappo-sekvenssi, joka sisältää täysipituisen entsyymin aminohapot Ala 121-Arg 401.
10 SEQ ID NO:19 Malbranchea ALK04178-proteaasigeenin kloonaukseen käytetyn PCR-sense-alukkeen DET27 sekvenssi.
SEQ ID NO:20 Malbranchea ALK04178-proteaasigeenin kloonaukseen käytetyn 15 PCR-antisense-alukkeen DET28 sekvenssi.
SEQ ID NO:21 PCR-sense-alukkeen DET 17, jota käytetään ilmentämiskasetin muodostamiseksi muodosteeseen pALK3097, sekvenssi.
20 SEQ ID NO:22 PCR-antisense-alukkeen DET18, jota käytetään ilmentämiskasetin muodostamiseksi muodosteeseen pALK3097, sekvenssi.
Talletukset
C\J
δ ^ 25 Malbranchea ALK04122 talletettiin homeviljelmien kokoelmaan Centraalbureau Voor ° Schimmelcultures, Uppsalahan 8, 3508 AD, Utrecht, Alankomaat, 20. joulukuuta 2010,
CM
ia siihen liitettiin talletusnumero CBS 128533.
X
en
CL
? Malbranchea ALK04178 talletettiin homeviljelmien kokoelmaan Centraalbureau Voor ί 30 Schimmelcultures, Uppsalalaan 8, 3508 AD, Utrecht, Alankomaat, 5. tammikuuta 2011, cm ja siihen liitettiin talletusnumero CBS 128564.
18 E. coli-kanta RF8791, joka sisälsi plasmidin pALK3094, talletettiin kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),
Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Saksa, 20. joulukuuta 2010, ja siihen liitettiin talletusnumero DSM 24410.
5 E. coli-kanta RF8758, joka sisälsi plasmidin pALK3092, talletettiin kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),
Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Saksa, 3. tammikuuta 2010 ja siihen liitettiin talletusnumero DSM 24426.
10 E. co/z-kanta RF8759, joka sisälsi plasmidin pALK3093, talletettiin Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Saksa, 3. tammikuuta 2010 ja siihen liitettiin talletusnumero DSM 24427.
15
Yksityiskohtainen kuvaus
Esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan sienestä peräisin oleva seriiniproteaasientsyymi. Tämä proteaasi on aktiivinen laajoilla pH-alueilla ja sillä on 20 leveä lämpötilaoptimi pesussa ja erityisen hyvä suorituskyky alhaisten lämpötilojen alueilla sekä kohtalaisissa ja korkeissa lämpötiloissa. Entsyymi on ihanteellinen pesuainesovelluksiin, sen kestäessä tyypillisiä pesuainekoostumuksia ja sen ollessa tehokas silloinkin, kun entsyymitasot pesuaineliuoksissa ovat alhaisia. Proteaasi on ^ erityisesti aktiivinen alueella 0-90 °C:n käyttölämpötiloissa, edullisen alueen ollessa 5-
<M
^ 25 60 °C, edullisemmin 10-40 °C. Keksinnön mukainen proteaasi on myös hyvin pysyvä o ^ nestemäisissä pesuainekoostumuksissa. Näin ollen esillä olevassa keksinnössä saadaan
CM
aikaan uusi seriiniproteaasi käytettäväksi pesuaine- ja muissa sovelluksissa, erityisesti cc nestemäisissä valmisteissa. Sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan tuottaa suuria o ^ saantoja tuottavissa sieni-isännissä ja sen jälkikäsittely tuotantovaiheen jälkeen, m 30 esimerkiksi fermentointialustan ja myseelin erotus on helppoa, o
CM
Esillä olevassa keksinnössä saadaan erityisesti aikaan seriiniproteaasientsyymi, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jonka aminohapposekvenssi on vähintään 66- 19 prosenttisesti samanlainen kuin sekvenssissä SEQ ID No: 18 määritelty aminohapposekvenssi. Edullisessa tapauksessa esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on sekvenssissä SEQ ID No: 18 määritelty aminohapposekvenssi. Edullinen 5 seriiniproteaasi on peräisin eliöstä Malbranchea cinnamomea (Lib.) Oorschot de Hoog.
Tämän keksinnön puitteissa käsitteellä "seriiniproteaasi" tai "seriiniendopeptidaasi" tai "seriiniendoproteinaasi" tarkoitetaan entsyymiä, jonka Nomenclature of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology sijoittaa luokkaan EC 10 3.4.21. Proteaasit voidaan luokitella ryhmäspesifisten inhibiittoreiden avulla.
Seriiniproteaasin inhibiittoreiden monimuotoiseen ryhmään kuuluu synteettisiä kemiallisia inhibiittoreita ja luonnollisia proteiinimaisia inhibiittoreita. Näin ollen seriiniproteaasin aktiivisuus voidaan määrittää määrityksellä, joka perustuu spesifisen substraatin pilkkoutumiseen, tai määrityksellä, jossa käytetään mitä tahansa proteiinia 15 sisältävää substraattia yhdessä seriiniproteaasien spesifisen inhibiittorin kanssa tai ilman sitä sopivissa olosuhteissa.
Esillä olevassa keksinnössä käytetyllä käsitteellä "seriiniproteaasin aktiivisuus" tarkoitetaan hydrolyyttista vaikutusta proteiinia sisältäviin substraatteihin, esimerkiksi 20 kaseiiniin, hemoglobiiniin ja naudan seerumin albumiiniin, BSA. Menetelmät proteolyyttisen aktiivisuuden analysoimiseksi tunnetaan kirjallisuudessa hyvin ja niihin ovat viitanneet esim. Gupta et ai. (2002).
^ Seriiniproteaasit syntetisoidaan preproentsyymin muotoisina inaktiivisina c\] ^ 25 tsymogeenisina esiasteina tai tsymogeeneina, jotka saadaan aktivoiduiksi poistamalla ^ signaalisekvenssi (erittymisen signaalipeptidi tai prepeptidi) ja prosekvenssi ^ (propeptidi), jolloin saadaan entsyymin aktiivinen kypsä muoto (Chen ja Inouye, 2008).
E
Tähän aktivoitumistapahtumaan liittyy proteaasien vaikutusta ja se voi olla tuloksena ? seriiniproteaasin rajallisesta itsesulattavasta tai autokatalyyttisesta muokkautumisesta,
LO
>- 30 esimerkiksi tuotannossa esiintyvien, luennan jälkeisten vaiheiden aikana tai o «m loppuunkäytetyssä viljelyalustassa tai viljelyalustaa säilytettäessä tai entsyymin valmistuksen aikana. Proentsyymin aktivoitumiseen voidaan päästä myös niin, että viljelyalustaan lisätään isäntäeliön viljelyn aikana tai sen jälkeen proteolyyttistä 20 entsyymiä, joka kykenee muuntamaan inaktiivisen proentsyymin aktiiviseksi kypsäksi entsyymiksi. Entsyymin lyhenemiseen voidaan päästä myös esimerkiksi katkaisemalla polypeptidiä koodaava geeni ennen sen transformointia tuotantoisäntään. Esillä olevan keksinnön puitteissa seriiniproteaasin "prepro-muoto" tarkoittaa entsyymiä, jossa on 5 pre- ja propeptidit. "Pro-muoto" tarkoittaa entsyymiä, joka sisältää propeptidin, mutta josta puuttuu prepeptidi (signaalisekvenssi).
Käsite "kypsä" tarkoittaa seriiniproteaasientsyymin muotoa, joka signaalisekvenssin (prepeptidin) ja propeptidin poiston jälkeen sisältää entsymaattiselle tai katalyyttiselle 10 aktiivisuudelle olennaiset aminohapot. Säikeisissä sienissä se on viljelyalustaan erittynyt luonnonmukainen muoto. Kypsän sekvenssin ensimmäinen aminohappo voidaan määrittää selvittämällä erittyneen proteaasin N-päätteen sekvenssi. Siinä tapauksessa, ettei saatavilla ole biokemiallista tietoa, N-päätteen sijainti voidaan arvioida sijoittamalla rinnakkain yhden tai useamman homologisen proteiinin 15 aminohapposekvenssi yhden tai useamman kypsän aminohapposekvenssin kanssa. Tämä rinnastus voidaan toteuttaa käyttäen esimerkiksi rinnastusmenettelyä ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
Kaupallisten seriiniproteaasien suurimman ryhmän muodostavat "alkaliset seriinipro-20 teaasit", mikä tarkoittaa sitä, että entsyymit ovat aktiivisia ja pysyviä pH-alueella 9-11 tai jopa pH-alueella 10-12,5 (Shimogaki et ai., 1991) ja niiden isoelektrinen piste on noin pH 9. Katalyyttisen aktiivisuuden optimaalisen pH:n määritys voidaan toteuttaa sopivassa puskurissa, erilaisissa pH-arvoissa seuraamalla proteiinisubstraatin ^ aktiivisuutta. Tyypillisessä tapauksessa pesuaineen proteaasien suorituskyky on ^ 25 parhaimmillaan, kun pesuaineliuoksen, jossa se toimii, pH-arvo on suurin piirtein sama ^ kuin pl-arvo entsyymille, pl voidaan määrittää isoelektrisellä fokusoinnilla ^ polyakryyliamidistä, tärkkelyksestä tai agaroosista koostuvan geelin, jossa on cc immobilisoitu pH-gradientti, päällä tai arvioimalla pl aminohapposekvenssistä, ° esimerkiksi käyttämällä pEMW-työkalua, joka löytyy palvelimelta ExPASy
LO
T- 30 (http://expasv.orgd.ools/pi tool.html; Gasteiger et ai., 2003).
δ
(M
Kypsien aikalisien seriiniproteaasien molekyyli massat vaihtelevat välillä 15-35 kDa, tyypillisesti alueella 25-30 kDa (Rao et ai. 1998). Seriiniproteaasin molekyylimassa 21 voidaan määrittää massaspektrometrisesti tai SDS-PAGE:lla, kuten Laemmli (1970) on esittänyt. Molekyylimassa voidaan ennustaa myös entsyymin aminohapposekvenssistä.
Useimpien luonnollisten seriiniproteaasien lämpötilaoptimit ovat noin 60 °C (Rao et ai., 5 1998). Seriiniproteaasin lämpötilaoptimi voidaan määrittää sopivassa puskurissa erilaisissa lämpötiloissa käyttäen kaseiinisubstraattia, kuten on kuvattu esimerkissä 3, tai käyttäen muita substraatteja ja puskurijärjestelmiä, joita on kuvattu kirjallisuudessa (Gupta et ai, 2002).
10 Keksinnön mukaisen kypsän yhdistelmä-DNA-teknisen Malbranchea: n seriiniproteaasin molekyylipaino on arviolta 29 kDa, sen optimilämpötila on noin 70 °C kun pH on 8,5, käytettäessä 30 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina, sen ollessa aktiivinen alkalisella pH-alueella kuten 10 olevassa pH:ssa ja 50 °C:ssa käytettäessä 30 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina. Yhdistelmä-DNA-15 teknisen Malbranchea:n seriiniproteaasin suorituskyky on hyvä ominaisuuksiltaan hyvin erilaisten pesuaineiden läsnä ollessa, laajalla lämpötila-alueella, esimerkiksi alhaisista lämpötiloista kohtalaisiin lämpötiloihin ulottuvalla lämpötila-alueella ja jopa korkeiden lämpötilojen alueella. Yhdistelmä-DNA-tekninen Malbranchea: n seriiniproteaasi on käyttökelpoinen erityisesti 60 °C:n tai sen alla olevissa lämpötiloissa, 20 riippuen pesuolosuhteista ja muista ainesosista ja lisäaineista.
Malbranchea:n seriiniproteaasin suorituskyvyn parantamiseksi erilaisissa teollisuuden sovelluksissa kuten pesuaineissa, toivottavaa on parantaa luonnonmukaisen entsyymin o ominaisuuksia. Näitä ominaisuuksia ovat esimerkiksi pysyvyys varastoitaessa, pysyvyys g 25 pesuaineen läsnä ollessa tai ilman sitä, pH-pysyvyys, hapettumispysyvyys tai kyky g sietää valkaisevia aineita sekä spesifisyys substraatin suhteen. Entsyymillä olevalla x autoproteolyyttisella aktiivisuudella on vaikutusta pysyvyyteen varastoitaessa, ja sen
CL
tulisi olla mahdollisimman heikko. Itsestään selvää on myös se, että ensimerkiksi g pyykin ja tiskin pesuun tarkoitetuissa koostumuksissa muokatun proteaasin pesevä ^ 30 suorituskyky ei saisi heikentyä alkuperäiseen tai esiasteena toimineeseen C\J ...
proteaasrentsyymrm verrattuna. Torsm sanoen toivottavaa on se, että entsyymimuunnoksilla on samankaltainen tai jopa parantunut pesevä suorituskyky ja likaa poistavat ominaisuudet kuin alkuperäisellä seriiniproteaasilla.
22
Tuotetut protcaasicntsyymit, erityisesti seriiniproteaasit voidaan puhdistaa käyttäen entsyymikemian tavanomaisia menetelmiä kuten suolan valmistusta, ultrasuodatusta, ioninvaihtoon perustuvaa kromatografiaa, affiiteettikromatografiaa, geelisuodatukseen 5 ja hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvaa kromatografiaa. Puhdistusta voidaan seurata proteiinimäärityksillä, entsyymiaktiivisuuden määrityksillä ja SDS- polyakryyliamidigeeliä käyttävällä elektroforeesilla. Puhdistetun entsyymin entsyymiaktiivisuus ja pysyvyys erilaisissa lämpötiloissa ja pH-arvoissa sekä molekyy 1 i massa j a isoelektrinen piste voidaan määrittää.
10
Esillä olevan keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA-teknisen seriiniproteaasin puhdistus on esitetty esimerkissä 4. Sentrifugoitu ja suodatettu viljelmän supematantti laitettiin suolaa poistavaan HiPrep 26/10-pylvääseen (yhtiöstä GE Healthcare), jota oli tasapainotettu puskurissa: 20 mM MES pH 5,3. Geelisuodatettu näyte laitettiin S Sepharose HP-15 pylvääseen (yhtiöstä GE Healthcare), jonka tilavuus oli 1 ml ja jota oli tasapainotettu puskurissa: 20 mM MES pH 5,3. Proteiinit eluoitiin käyttäen suurenevia NaCl-pitoisuuksia (0,5 M). Proteaasia sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin käyttäen Amicon Ultra-4 10,000 CO Centrifugal -suodatuslaitteita, MILLIPORE. Näytettä puhdistettiin edelleen geelisuodattavaa Superdex 75-pylvästä, jota oli tasapainotettu 20 puskurilla: 20 mM MES, 150 mM NaCl pH 5,3. Proteaasia sisältävät jakeet yhdistettiin. Lopullinen näyte analysoitiin SDS PAGE-geelillä. Kuvio 4. Luonnollisestikin on mahdollista erottaa esillä olevan keksinnön mukainen entsyymi käyttäen muita tunnettuja puhdistusmenetelmiä ohessa kuvattujen menetelmien sijasta tai niiden lisäksi. ^ Yhdistelmä-DNA-tekninen seriiniproteaasi puhdistettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla ^ 25 ja sitä käytettiin pH- ja lämpötilaprofiilien luonnehtimiseen esimerkissä 5 kuvatulla ° tavalla.
(M
C\l
X
Proteaasin aktiivisuus perustuu yleisesti liukoisten substraattien hajotukseen. Pesuaine-? sovelluksissa proteaasien on kyettävä vaikuttamaan aineisiin, jotka ovat vähintään
LO
1- 30 osittain liukenemattomia. Näin ollen pesuaineen proteaasin tärkeä parametri on kyky o <n adsorboida ja hydrolysoida näitä liukenemattomia aineita.
23
Keksinnön mukainen seriiniprotcaasicntsyymi voi olla peräisin mistä tahansa eliöstä, mukaan lukien bakteerit, arkkieliöt (archea), sienet, hiivat ja korkeammatkin eukariootit kuten kasvit. Edullisessa tapauksessa mainittu entsyymi on peräisin sienestä, mukaan lukien säikeiset sienet ja hiivat, esimerkiksi ryhmästä, johon kuuluu Malbranchea, 5 valitusta suvusta. Sieniperäiset alkaliset proteaasit ovat edullisia bakteeriproteaaseihin verrattuna johtuen tuotantovaihetta seuraavan jälkikäsittelyn helppoudesta mikrobeja sisältävän entsyymin tai entsyymikoostumuksen tuottamiseksi. Myseeli voidaan poistaa edullisesti suodatustekniikoilla ennen entsyymin puhdistusta.
10 Esillä olevan keksinnön mukaisten sieniperäisten fermentointituotteiden heikko tuoksu on etu verrattuna Bacillus·.ista peräisin oleviin tuotteisiin, joilla on tyypillisesti epämiellyttävä tuoksu. Tästä syystä tarvitaan vähemmän hajustetta lopullista koostumusta varten tämän tuoksun peittämiseksi, ja näin ollen tuote soveltuu myös sovelluksiin, joissa hajusteiden käyttö ei ole toivottavaa.
15
Esillä olevan keksinnön kohteena on sieniperäinen seriiniproteaasi, jolla on hyvä suorituskyky ominaisuuksiltaan hyvin erilaisten pesuaineiden läsnä ollessa, laajalla lämpötila-alueella, esimerkiksi alhaisista lämpötiloista kohtalaisiin lämpötiloihin ulottuvilla lämpötila-alueilla 0-90 °C, edullisesti lämpötiloissa, jotka vaihtelevat 20 alueella 5-60 °C, ja erityisen edullisesti 10-40 °C olevilla lämpötila-alueilla.
Esillä olevassa keksinnössä hyvä suorituskyky pesuaineen läsnä ollessa tarkoittaa sitä, että entsyymi, tässä tapauksessa keksinnön mukainen yhdistelmä-DNA-tekninen
C\J
^ sieniperäinen seriiniproteaasi, toimii alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin monet
(M
^ 25 kaupalliset subtilisiinit. Toisin sanoen, hyvä suorituskyky tarkoittaa sitä, että entsyymi o ^ kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia likoja tai materiaalia alhaisilla tai
CM
kohtalaisilla lämpötila-alueilla, olennaisesti kuitenkin alemmilla lämpötila-alueilla kuin
CC
tämänhetkiset kaupalliset subtilisiinituotteet, esimerkkinä kaupallinen o ^ subtilisiinientsyymituote Savinase® tai Savinase®Ultra 16L (Novozymes A/S, DK).
m y: 30 o
0X1 Keksinnön mukainen sieniperäinen seriiniproteaasi on käyttökelpoinen erityisesti 60 °C
tai sen alla olevissa lämpötiloissa riippuen pesuolosuhteista ja pesuaineissa olevista ylimääräisistä ainesosista ja lisäaineista. Entsyymi toimii myös 50 °C:ssa tai sen 24 alapuolella, 40 °C:ssa tai sen alapuolella, 30 °C:ssa tai sen alapuolella, 20 °C:ssa tai sen alapuolella ja 10 °C:ssa tai sen alapuolella. Erityisesti yllättävää on se, että termofiilinen entsyymi, jonka lämpötilaoptimi on noin 70 °C on tehokas ja käyttökelpoinen alle 40 °C:n lämpötiloissa, jopa alle 30 °C:n lämpötiloissa.
5
Pesuaineen läsnä ollessa keksinnön mukainen sieniperäinen seriiniproteaasi toimii edellä määritellyissä lämpötiloissa, ja erityisesti mainitulla sieniperäisellä seriiniproteaasilla on hyvä suorituskyky pesuaineen läsnä ollessa 40 °C:ssa tai sen alapuolella. Malbranchea: sta peräisin olevan sieniperäisen seriiniproteaasin 10 suorituskyky lian poistoa ajatellen erilaisissa koeolosuhteissa ja erilaisten likojen tapauksessa, deltaL* -arvona mitattuna, on huomattavasti parempi kuin kaupallisten tuotteiden Savinase® ja Savinase® Ultra 16L (Novozymcs A/S, DK) suorituskyky. Tulokset on esitetty esimerkeissä 6-8 ja kuvioissa 6-10.
15 Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan yhdistelmä-DNA-tekninen sieniperäinen scri i n i proteaasientsyymi on polypeptidi, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on sekvenssissä SEQ ID No: 18 määritelty kypsän Malbranchea ALK04122-proteaasin aminohapposekvenssi tai sillä on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin sekvenssissä SEQ ID No: 18 määritelty kypsän 20 Malbranchea ALK04122-proteaasin aminohapposekvenssi. Edullisten entsyymien samanlaisuus on vähintään 66 %, edullisesti vähintään 70 %, edullisemmin vähintään 75 %, samanlaisuuden ollessa tätäkin edullisemmin vähintään 80 %. Edelleen edullisemmalla tavalla aminohapposekvenssit ovat vähintään 8 5-prosenttisesti tai o vähintään 90-prosenttisesti tai 95-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 98-
oo 25 prosenttisesti, kaikkein edullisimmin 99-prosenttisesti samanlaisia kuin sekvenssin SEQ
c\j ID No: 18 mukainen aminohapposekvenssi. Entsyymien samanlaisuuksia verrataan x sopivalla tavalla käyttäen vastaavia kypsiä sekvenssialueita.
CL
O
co Esillä olevan keksinnön mukainen seriiniproteaasi on saatavissa eliöstä Malbranchea, ^ 30 edullisesti lajista Malbranchea cinnamomea (Lib.) Oorschot de Hoog (jonka synonyymi
CM
on Malbranchea pulchella var. sulfurea (Miehe) Cooney & R. Emers.), joka on luokan EC3.4.21. jäsen. Erään erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan keksinnön mukainen scriiniproteaasientsyymi on saatavissa Malbranchea ALK04122-kannasta, joka on 25 talletettu talletusnumerolla CBS 128533, tai Malbranchea ALK04178-kannasta, joka on talletettu talletusnumerolla CBS 128564. Malbranchea ALK04178:n proteaasi on olennaisesti samanlainen kuin Malbranchea ALK04122-kannan proteaasi.
5 Ohessa käsitteellä "samanlaisuus" tarkoitetaan samanlaisuutta kahden aminohappo-sekvenssin välillä, joita sekvenssejä verrataan toisiinsa vastaavassa sekvenssialueessa, jossa on arviolta sama määrä aminohappoja. Esimerkiksi kahden aminohapposekvenssin täysipituisen tai kypsän sekvenssin samanlaisuutta voidaan verrata. Kahden verrattavan molekyylin aminohapposekvenssit voivat erota yhden tai useamman aseman suhteen, 10 mikä ei kuitenkaan muuta näiden molekyylien biologista toimintaa tai rakennetta. Tällaista vaihtelua voi esiintyä luonnostaan johtuen eri isäntäeliöistä tai aminohapposekvenssissä olevista mutaatioista tai sitä voidaan saada spesifisellä mutageneesillä. Vaihtelu voi olla tulosta aminohapposekvennin yhden tai useamman aseman poistosta, substitutiosta, istutuksesta, lisäyksestä tai niiden yhdistelmästä. 15 Sekvenssien samanlaisuus mitataan käyttäen ClustalW2-rinnastusta (httD://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2A ja oletusasetuksia (proteiinin painomatriisi: Gonnet, aukko avoin: 10, aukkolaajennus: 0,20, aukkoetäisyydet 5).
Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on kypsä sieniperäinen 20 seriiniproteaasientsyymi, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on sekvenssissä SEQ ID No: 18 määritelty, Malbranchea ALK04122-proteaasin aminohapposekvenssi.
Kypsästä entsyymistä puuttuu signaalisekvenssi eli propeptidi sekä prosekvenssi eli propeptidi. Keksinnön mukainen kypsä seriiniproteaasi sisältää täysipituisen proteasin, ^ jonka tunnuspiirteet on esitetty sekvenssissä SEQ ID No: 14, aminohapot Alal21- ^ 25 Arg401. Näin ollen esillä olevan keksinnön piiriin kuuluu myös täysipituinen ^ Malbranchea ALK04122-proteaasientsyymi, jolla on SEQ ID No: 14 ja jossa on ^ signaalisekvenssi (prepeptidi) ja propeptidi, sekä proentsyymimuoto, josta puuttuu cc signaalisekvenssi (prepeptidi) ja jolla on näin ollen SEQ ID No:16. o cö
LO
>- 30 Esillä olevan keksinnön kohteena on sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jonka o «m kypsällä muodolla on alueella 20-35 kDa, edullisesti 25-33 kDa, edullisemmin 28-30 kDa oleva molekyyli massa tai molekyyli paino. Edullisin molckyylipaino on kypsälle 26 polypeptidille ennustettu, 29 kDa oleva molckyylipaino, joka on saatu käyttäen työkalua Compute pI/MW, joka on palvelimella ExPASy (Gasteiger et ai., 2003).
Keksinnön mukainen entsyymi hajottaa tehokkaasti proteiinipitoista materiaalia laajalla 5 lämpötila-alueella. Sieniperäisen seriiniproteaasin lämpötilaoptimi on alueella 30-80 °C (vähintään noin 10 % suurimmasta aktiivisuudesta), edullisesti alueella 40-80 °C (vähintään noin 20 % suurimmasta aktiivisuudesta) ja edullisemmin alueella 50-80 °C (vähintään noin 40 % suurimmasta aktiivisuudesta), kaikkein edullisimmin noin 60-80 °C (vähintään noin 65 % suurimmasta aktiivisuudesta), joka suurin aktiivisuus on 70 10 °C:ssa, mitattuna 8,5 olevassa pH:ssa käyttäen 30 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina, kuten on kuvattu esimerkissä 5.
Entsyymin pH-optimi on alueella, joka alkaa pH-arvosta 6 ja ulottuu vähintään pH-arvoon 10, 50 °C:ssa, käytettäessä 30 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina, 15 kuten on kuvattu esimerkissä 5. pH-optimi on erityisesti arvojen pH 6 ja pH 10 välissä (vähintään noin 60 % suurimmasta aktiivisuudesta) ja edullisemmin arvojen pH 9 ja pH 10 välissä (vähintään noin 70 % suurimmasta aktiivisuudesta), kaikkein edullisimmin noin pH 10.
20 Seriiniproteaasilla, sopivasti keksinnön mukaisella sieniperäisellä seriiniproteaasilla, on "hyvä suorituskyky pesuaineen läsnä ollessa", eli se kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia likoja tai materiaalia pesuaineen läsnä ollessa alhaisilla lämpötila-alueilla, erityisesti alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin nykyiset kaupalliset o subtilisiinituotteet, esimerkiksi kaupallinen entsyymituote Savinase® tai g 25 Savinase®Ultra 16L (Novozymes A/S, DK). Pesuaineen läsnä ollessa keksinnön g mukainen entsyymi toimii hyvin 5-60 °C olevalla lämpötila-alueella, edullisesti 50 g °C:ssa tai sen alla. Entsyymi toimii myös lämpötiloissa, jotka ovat 40 °C tai sen alle tai
CL
o 30 °C tai sen alle.
cö
LO
o 30 Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa polynukleotidi- tai koetinsekvenssiin, joka sisältyy 27 plasmidiin pALK3092 ja jolla on nukleotidisekvenssi SEQ ID No: 11 E. coli RF8758:ssa, joka on talletettu kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) talletusnumerolla DSM 24426.
5 Samankaltaisella tavalla keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniprotcaasicntsyymiä (joka on saatu eliöstä Malbranchea ALK04178) koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK3093 ja jolla on nukleotidisekvenssi SEQ ID No: 12, talletettuna E. coli RF8759:ssa talletusnumerolla 10 DSM 24427.
Edelleen, keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniprotcaasicntsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK3094 ja jolla on 15 nukleotidisekvenssi SEQ ID No:17, talletettuna E. coli RF8791:ssa talletusnumerolla DSM 24410.
Esillä olevassa keksinnössä Malbranchea-proteaasin geeni erotettiin koettimella, joka oli valmistettu PCR-reaktiolla käyttäen hydridisointia tarkoin rajatuissa olosuhteissa, 20 esimerkissä Id kuvatulla tavalla. Molekyylibiologian standardimenetelmiä voidaan käyttää cDNA:n tai isäntäeliön perimän DNA:n eristämiseen, esimerkkeinä molekyylibiologian käsikirjoissa kuten Sambrook and Russell, 2001, kuvatut menetelmät.
C\J
δ ^ 25 Hybridisointi DNA-koettimeen, kuten esimerkiksi useammasta kuin 100-200 ^ nukleotidista koostuvaan sekvenssiin SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ta SEQ ID NO: 17 ^ tapahtuu tavallisesti "hyvin tiukoiksi" valituissa olosuhteissa, eli hybridisointi tapahtuu
Ee lämpötilassa, joka on 20-25 °C täydelliselle hybridille lasketun sulamislämpötilan (Tm) o ^ alapuolella, joka Tm lasketaan Boltonin ja McCarthyn (1962) esittämällä tavalla.
LO
^ 30 Tavallisesti esihybridisointi ja hybridisointi toteutetaan vähintään 65 °C:ssa puskurissa, o ^ jonka koostumus on 6xSSC (tai 6xSSPE), 5xDenhardtin reagenssia, 0,5 % (p/t) SDS, 100 pg/ml denaturoitua, fragmentoitua lohen sperman DNA:ta. 50 % formamidin lisäys alentaa esihybridisoinnin ja hybridisoinnin lämpötiloja 42 °C:seen. Pesut toteutetaan 28 olosuhteissa, joissa suolan pitoisuus on alhainen, esim. olosuhteissa 2xSSC-0,5 % SDS (paino/til) 15 minuuttia huoneen lämpötilassa (RT), tämän jälkeen olosuhteissa 2xSSC-0,1 % SDS (p/t) huoneen lämpötilassa, ja lopulta olosuhteissa 0,lxSSC-0,l% SDS (paino/til) vähintään 65 °C:ssa, tai esimerkissä Id kuvatuissa olosuhteissa.
5
Erään edullisen suoritusmuodon mukaan keksinnön mukaista sieniperäistä seriini-proteaasientsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli jonka tunnuspiirteet on esitetty sekvenssissä SEQ ID No: 18, tai polypeptidi, joka on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin aminohapposekvenssi SEQ ID No: 18. Edullisten entsyymien 10 samanlaisuus on vähintään 66 %, edullisesti vähintään 70 %, edullisemmin vähintään 75 %, tätäkin edullisemmin samanlaisuus on vähintään 80 %. Edelleen edullisemmalla tavalla aminohappojen samanlaisuus on vähintään 85 % tai vähintään 90 % tai 95 %, edullisemmin vähintään 98 %, kaikkein edullisimmin samanlaisuus on 99 % aminohapposekvenssiin SEQ ID No: 18 nähden. Entsyymien samanlaisuuksia verrataan 15 käyttäen vastaavia kypsän sekvenssin alueita.
Näin ollen keksinnön piiriin kuuluu polypeptidisekvenssi, jota koodaa nukleiinihappomolekyyli, johon on koodautunut keksinnön mukaisen täysipituisen seriiniproteaasin aminohapposekvenssi, sisältäen prepeptidin (signaalisekvenssi) ja propeptidin 20 entsyymin kypsän muodon lisäksi, ja jonka aminohapposekvenssin tunnuspiirteet on esitetty sekvenssissä SEQ ID No: 14.
Keksinnön piiriin kuuluu myös polypeptidisekvenssi, jota koodaa nukleiinihappomole- kyyli, johon on koodautunut keksinnön mukaisen scri iniproteaasientsyymin propeptidi- ^ 25 muoto, sisältäen propeptidin entsyymin kypsän muodon lisäksi ja jonka aminohappo- ° sekvensin tunnuspiirteet on esitetty sekvenssissä SEQ ID No: 16.
cv
X
cc
Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen scri iniproteaasientsyymi, jota ? koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, jonka sisältämä nukleotidisekvenssi koodaa
LO
>- 30 Malbranchea ALK04122-seriiniproteaasin kypsää muotoa, j olla on SEQ ID No: 18.
δ cv
Erään edullisen suoritusmuodon mukaan keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, jossa on 29
Malbmnchea A LK04122-entsyymin kypsää muotoa (SEQ ID No:18) koodaava nukleotidisekvenssi SEQ ID No: 17.
Näin ollen keksinnön piiriin kuuluu polypeptidi, jota koodaa nukleiinihappomolekyyli, 5 jolla on nukleotidisekvenssi SEQ ID No: 13, jossa on "koodaava sekvenssi" entsyymiä varten. Ilmaus "koodaava sekvenssi" tarkoittaa nukleotidisekvenssiä, joka käynnistää luennan aloituskodonista (ATG) alkaen ja pysäyttää luennan pysäytyskodoniin (TAA, TAG tai TGA). Luennan tuloksena syntynyt täysipituinen polypeptidi alkaa tavallisesti metioniinista ja siinä voi olla intronialueita.
10
Keksinnön piiriin kuuluu samoin sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jota koodaa nukleiinihappomolekyyli, jonka sisältämä nukleotidisekvenssi SEQ ID NO: 15 koodaa Malbranchea ALK04122-proentsyymimuotoa.
15 Keksinnön erään muun edullisen suoritusmuodon mukaan sieniperäistä seriiniproteaasi-entsyymiä koodaa polynukleotidisekvenssi, joka sisältyy plasmidiin pALK3094, sen sisältäessä nukleotidisekvenssin SEQ ID No:13 E. coli RF8791:ssa, joka on talletettu talletusnumerolla DSM 24410.
20 Keksinnön eräs suoritusmuoto on seriiniproteaasientsyymi, joka on tuotettu yhdistelmä- DNA-teknisestä ilmentämisvektorista, jonka sisältämä nukleiinihappomolekyyli koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jonka tunnuspiirteet on esitetty edellä, nukleiini- happomolekyylin ollessa kytketty toimivasti sääteleviin sekvensseihin, jotka kykenevät ^ ohjaamaan mainitun scriiniproteaasientsyymin ilmentymistä sopivassa isännässä.
^ 25 Mainitun yhdistelmä-DNA-teknisen ilmentämisvektorin muodostus ja mainitun ° vektorin käyttö on kuvattu yksityiskohtaisemmin esimerkissä 2.
cv
X
cc
Sopivat isännät sieniperäisen sen ι n ι proteaas i entsyymin tuottamiseksi ovat homologisia ? tai heterologisia isäntiä kuten mikrobi-isäntiä, mukaan lukien bakteerit, hiivat ja sienet.
ί 30 Säikeiset sienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium o cv Neurospora, Rhizopus, Penicillium, Myceliophthora ja Mortiriella ovat edullisia tuotantoisäntiä tuotantovaiheen jälkeisen jälkikäsittelyn ja entsyymituotteen talteenoton helppoudesta johtuen. Sopivia isäntiä ovat sellaiset lajit kuten lajityypit T. reesei, A.
30 niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonicus, F. venenatum tai F. oxysporum, H. insolens tai H. lanuginosa, N. crassa and C. lucknowense, joista eräät on lueteltu entsyymiä tuottavina isäntäeliöinä esimerkiksi kaupallisten entsyymien AMFEP 2009-luettelossa. Edullisemmalla tavalla entsyymi tuotetaan Trichoderma- tai Aspergillus-5 sukuun kuuluvassa säikeisessä sieni-isännässä, kuten lajissa T. reesei tai A. niger, A. oryzae tai A. awamori. Keksinnön kaikkein edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi tuotetaan T. reesei: ssä.
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös eristetty nukleiinihappomolekyyli, jonka 10 sisältämä polynukleotidisekvenssi koodaa seriiniproteaasientsyymiä ja joka nukleiinihappomolekyyli on valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: a) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaamalla polypeptidillä on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja sekvenssinä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi; b) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaamalla polypeptidillä on seriiniproteaasin 15 aktiivisuutta ja joka polypeptidi on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin sekvenssinä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi; e) nukleiinihappomolekyylistä, jossa on sekvenssinä SEQ ID No: 17 esitetyn nukleotidisekvenssin mukainen koodaava sekvenssi; d) nukleiinihappomolekyylistä, jossa on DSM 24410-tallenteeseen sisällytetyn poly-20 nukleotidisekvenssin mukainen koodaava sekvenssi; e) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaava sekvenssi eroaa jommankumman kohdan (c)-(d) mukaisen nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneroitumisesta johtuen; sekä
f) nukleiinihappomolekyylistä, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa DSM
^ 25 24426-tallenteeseen tai sekvenssiin SEQ ID No: 17 sisältyvään nukleiinihappomole- ^ kyyliin, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on 0X1 aminohapposekvenssi, joka on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin sek- cc .
venssissä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi, o cö
LO
^ 30 Keksinnön mukainen nukleiinihappomolekyyli voi olla RNA tai DNA, joka DNA voi o muodostua perimän DNA:sta tai cDNA:sta.
31
Molekyylibiologian standardimenetelmiä voidaan käyttää keksinnön mukaista sieniperäistä seriiniproteaasia koodaavan polynukleotidisekvenssin eristämiseen ja cntsyymikäsittclyihin, mukaan lukien perimä- ja plasmidi-DNA:n eristys, DNA:n sulatus DNA-ffagmenttien tuottamiseksi, E. co/z-transformanttien sekvenssin määritys, 5 jne. Perusmenetelmät on kuvattu molekyylibiologian standardikäsikirjoissa, esimerkkinä Sambrookja Russell, 2001.
Malbranchea ALK04122-polypeptidiä koodaavan Malbranchea-proteaasin geenin eristäminen on kuvattu esimerkissä 1. Lyhyesti esittäen, PCR-fragmentti, joka on saatu 10 käyttäen degeneroituneita oligonukleotidialukkeita (SEQ ID No: 5 ja SEQ ID No: 4) PCR-reaktiossa, käytettiin proteaasigeenin eristämiseen Malbranchea ALK04122:sta. Proteaasigeenin sisältävä perimän fragmentti ligatoitiin pBluescript II KS+ -vektoriin. Täysipituinen Malbranchea-proteaasigeeni sisällytettiin plasmidiin pALK3094, joka on talletettu E. coli\ssa kantakokoelmaan DSMZ talletusnumerolla DSM 24410. 15 Seriiniproteaasin päätelty aminohapposekvenssi analysoitiin DNA-sekvenssin perusteella.
Kuvioissa 1A-B on esitetty Malbranchea ALK04122-proteaasin nukleotidisekvenssi (SEQ ID No: 13), sen osittaiset promoottori- ja päättäjäsekvenssit sekä päätelty amino- 20 happosekvenssi (SEQ ID No: 14). Geenin pituus on 1436 bp (mukaan lukien pysäytyskodoni). Kolme oletettua intronia löydettiin ja niiden pituudet olivat 72, 87 ja 71 emäsparia (bp). Päätelty proteiinisekvenssi koostuu 401 aminohaposta, mukaan lukien ennustettu signaalisekvenssi, jossa on 20 aminohappoa (SignalP V3.0; Nielsen et ^ ai., 1997 sekä Nielsen ja Krogh, 1998) sekä ennustettu propeptidi jäännöksestä Gly21 c\i ^ 25 jäännökseen Aspl20. Ennustettu molekyylimassa oli 28,5 kDa kypsälle polypeptidille ja o ^ ennustettu pl oli 6,15. Nämä ennustukset tehtiin käyttäen Compute pI/MW-työkalua,
CM
joka on ExPASy-palvelimella (Gasteiger et ai., 2003). Ennustettu
CC
aminohapposekvenssi sisälsi kolme mahdollista N-glykosylointikohtaa (Asnl34, o ^ Asnl72 ja Asn277), lähteen CBS Server NetNGlyc VI.0 mukaan todennäköisiä ovat m .
^ 30 vam kaksi kohtaa, Asnl34 ja Asn277. Julkaistujen proteaasisekvenssien homologioita δ ^ etsittiin käyttäen BLASTP-ohjelmaa, versio 2.2.25, NCBI (National Center for
Biotechnology Information) (Altschul et ai., 1990). Kypsän Malbranchea-proteaasin sekvenssin ja homologisimpien sekvenssien vastaavien alueiden väliset 32 samanlaisuusarvot saatiin käyttäen ClustalW2-rinnastusta (Matriiisi: Gonnet, aukko auki: 10, aukon laajennus: 0,20, aukkojen etäisyydet 5; saatavana esimerkiksi osoitteesta www.ebi.ac.uk/rools/msa/clustalw2A. Tulokset on esitetty taulukossa 2.
5 Suurimmat BLASTP-hausta saadut samanlaisuusarvot esillä olevan keksinnön mukaiselle kypsälle Malbranchea ALK04122-proteaasille (SEQ ID NO: 18) olivat seuraavat: 66 % Coccidioides posadasii:n oletetun, subtilisiinin kaltaisen proteaasin (EER24932.1) ja Coccidioides immitis:in hypoteettisen proteiinin CIMG_09197 (XP 001239485.1) tapauksessa, 65 % Uncinocarpus reesii:n hypoteettisen proteiinin 10 UREG05170 (EEP80328.1) tapauksessa, 64 % Coccidioides immitis:in hypoteettisen proteiinin CIMB 01394 (XPOO 1247623.1) tapauksessa, Coccidioides posadasii:n oletetun, subtilisiinin kaltaisen proteaasin (EER23662.1) tapauksessa, Uncinocarpus reesi i:n hypoteettisen proteiinin (EEP81307.1) tapauksessa ja Arthroderma otae:n alkalisen proteinaasin (EEQ28657.1) tapauksessa. Patenttialan sekvenssien suurimmat 15 samanlaisuudet olivat 55 % patenttijulkaisussa US 5962765 esitetyn sekvenssin SEQ ID NO:2 tapauksessa (AAE30270.1; proteaasi eliöstä Metarhizium anisopliae) sekä patenttijulkaisussa WO 8807581 esitetyn SEQ ID:15 tapauksessa (AAA54276.1; proteaasi Tritirachium album:ista). Kypsän Malbranchea ALK04122-proteaasin sekvenssi (SEQ ID NO: 18) rinnastettiin edellä mainittujen homologisten sekvenssien 20 kypsien sekvenssien kanssa käyttäen ClustalW2-rinnastusta. Samanlaisuusarvot (pisteytys-%), jotka saatiin käyttäen ClustalW2-rinnastusta (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/), olivat alueella 63 % - 65 %.
Näin ollen keksinnön piiriin kuuluu eristetty polynukleotidisekvenssi tai eristetty ^ 25 nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä tai polyol peptidiä, jolla on Malbranchea ALK04122-entsyymin kypsän muodon aminohappo- ^ sekvenssi, jonka tunnuspiirteet ilmenevät sekvensseistä SEQ ID No: 18, 15, eli cc sekvenssin SEQ ID No: 14 mukaisen täysipituisen seriiniproteaasin aminohapot Alal21- 2 Arg401.
tn r- 30 o 00 Nukleiinihappomolekyyli on edullisesti molekyyli, jolla on sekvenssissä SEQ ID No: 17 esitetty koodaava sekvenssi, joka koodaa tämän keksinnön mukaisen sieniperäisen seriiniproteaasientsyymin kypsää muotoa.
33
Keksinnön mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli voi olla molekyyli, joka sisältää tallenteeseen DSM 24410, DSM 24426 tai DSM 24427 sisältyvän polynukleotidisek-venssin koodaavan sekvenssin. DSM 24426 sisältää PCR-fragmentin 5 nukleotidisekvenssin (SEQ ID No: 11), jota käytetään täysipituisen Malbranchea ALK04122-proteaasin geenin kloonaukseen. DSM 24427 sisältää PCR-fragmentin nukleotidisekvenssin (SEQ ID No: 12), joka on saatu Malbranchea ALK04178:sta. DSM 24410 sisältää täysipituisen Malbranchea ALK04122-proteaasin geenin nukleotidisekvenssin (SEQ ID No: 13).
10
Keksinnön mukainen nukleiinihappo voi olla myös nukleotidisekvenssin, jonka tunnuspiirteet on esitetty edellä, analogi. "Degeneraatio" tarkoittaa nukleotidisekvenssin analogeja, jotka eroavat yhden tai useamman nukleotidin tai kodonin suhteen, mutta jotka koodaavat keksinnön mukaista yhdistelmä-DNA-teknistä proteaasia.
15
Nukleiinihappomolekyyli voi olla myös nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa plasmidiin pALK3092 tai pALK3093 sisältyvään PCR-koettimeen, joka plasmidi on talletettu E.coli:sa talletusnumerolla DSM 24426 ja DSM 24427, vastaavasti, tai DNA-sekvenssiin SEQ ID NO: 17, joka koodaa kypsää 20 polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja sen aminohapposekvenssi. Hybridisoituva DNA voi olla peräisin Malbranchea-lajin sienestä tai se voi olla peräisin muusta sienilajista.
Näin ollen keksinnön suojapiiriin kuuluu eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka ^ 25 sisältää sekvenssinä SEQ ID NO: 17 esitetyn nukleotidisekvenssin, ja sen analogit, o
CM
Esillä oleva keksintö kohdistuu myös yhdistelmä-DNA-teknisen ilmentämisvektoriin tai
E
yhdistelmä-DNA-tekniseen ilmentämismuodosteeseen, jota voidaan käyttää valittua ? seriiniproteaasia koodaavan nukleiinihapposekvenssin kartuttamiseen tai ilmentämiseen
LO
>- 30 sopivassa prokarioottisessa tai eukarioottisessa isännässä. Yhdistelmä-DNA-tekninen o cm ilmentämisvektori sisältää DNA- tai nukleiinihapposekvenssejä, jotka helpottavat tai ohjaavat seriiniproteaasia koodaavan sekvenssin ilmentymistä ja eritystä sopivassa isännässä ja joita ovat mm. promoottorit, jouduttimet, päättäjät (mukaan lukien 34 kopioinnin ja luennan päättävät signaalit) sekä signaalisekvenssit, jotka on kytketty toimivasti mainittua seriiniproteaasia koodaavaan polynukleotidisekvenssiin. Ilmentämisvektorissa voi lisäksi olla merkkigeenejä transformanttikantojen valikoimiseksi tai valikoinnin merkki voidaan sisällyttää isäntään toisessa 5 vektorimuodosteessa samanaikaisella transformoinnilla. Mainitut säätelevät sekvenssit voivat olla homologisia tai heterologisia tuotantoeliön suhteen tai ne voivat olla peräisin eliöstä, josta seriiniproteaasia koodaava geeni on peräisin.
Promoottoreiden, joita käytetään keksinnön mukaisen seriiniproteaasin ilmentämiseen 10 säikeisissä sieni-isännissä, esimerkkejä ovat A. oryzae TAKA-amylaasin, alkalisen proteaasin ALP ja trioosifosfaatti-isomeraasin promoottorit, Rhizopus mze/zez-lipaasin promoottori, Aspergillus niger- tai A. awamon-glukoamylaasin (glaA) promoottori, Fusarium oxysporunv.in trypsiinin kaltaisen proteaasin promoottori, Chrysosporium lucknowense cellobiohydrolase 1: n promoottori, Trichoderma reeser.n 15 sellobiohydrolaasi I:n (Cel7A) promoottori, jne.
Hiivassa esimerkiksi S. cerevisiae:n enolaasin (ENO-1), galaktokinaasin (GAL1), alkoholi- dehydrogenaasin (ADH2) ja 3-fosfoglyseraattikinaasin promoottoreita voidaan käyttää ilmentämisen aikaansaamiseksi.
20
Promoottorisekvenssien, jotka ohjaavat keksinnön mukaisen seriiniproteaasin kopiointia bakteeri-isännässä, esimerkkejä ovat Escherichia coli:n lac-operoni, Streptomyces coelicolor.m agaraasin dagA promoottori, B. lieheniformis :in alfa-amylaasi geenin ^ (amyL) promoottori, B. stearothermophilus:in maltogeenisen amylaasigeenin (amyM) c\i , 25 promoottori, B. sublitis xylA- ja xy/B-gccnien promoottorit, jne.
o i
CM
Sopivia päättäjiä ovat mm. edellä mainittujen geenien päättäjät tai mitkä tahansa muut cc päättäjäsekvenssit, joiden tunnuspiirteet on selvitetty, o cö
LO
>- 30 Sopivia transformoinnin tai valikoinnin merkkejä ovat mm. ne, jotka täydentävät jotakin o puutosta isännässä, esimerkkeinä dal-geenit bakteereista#, subtilis tai B. lieheniformis tai Aspergillus amdS ja niaD. Valikointi voi myös perustua merkkiin, joka saa aikaan 35 vastustuskykyä antibiootille, kuten vastustuskykyä ampisilliinille, kanamysiinille, kloramfenikolille, tetrasykliinille, fleomysiinille tai hygromysiinille.
Keksinnön mukaisen seriiniproteaasin ilmentyminen solun ulkopuolella on edullista. 5 Näin ollen yhdistemä-DNA-teknisessa vektorissa on sekvenssejä, jotka helpottavat erittymistä valitussa isännässä. Keksinnön mukaisen seriiniproteaasin signaalisekvenssi tai presekvenssi tai prepeptidi voidaan sisällyttää yhdistelmä-DNA-tekniseen ilmentämisvektoriin tai luonnollinen signaalisekvenssi voidaan korvata toisella signaalisekvenssillä, joka kykenee helpottamaan ilmentymistä valitussa isännässä. Näin 10 ollen valittu signaalisekvenssi voi olla homologinen tai heterologinen isännän, jossa ilmentäminen tapahtuu, suhteen.
Sopivien signaalisekvenssien esimerkkejä ovat sieni- tai hiivaeliöiden signaalisekvenssit, esimerkkinä hyvin ilmentyvien geenien signaalisekvenssit. Tällaiset 15 signaalisekvenssit tunnetaan hyvin kirjallisuudesta.
Yhdistelmä-DNA-vektori voi lisäksi sisältää sekvenssejä, jotka helpottavat vektorin yhdentymistä isännän kromosomiseen DNA:han niin, että saadaan vakaa ilmentyminen ja/tai helpotetaan kohdentumista isännän perimässä olevaan tiettyyn asemaan.
20
Keksinnön mukainen Malbranchea ALK04122-proteaasi omine signaalisekvensseineen ilmennettiin T. r ees ei cbhl (cel7A) -promoottorista esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Ilmentämistä varten tarkoitettu muodoste, jota käytettiin T. ree.se/-i sännän ^ transformointiin, sisälsi myös cM/-päättäjän ja synteettisen amdS-merkin ^ 25 transformanttien valikoimiseksi transformoitumattomista soluista.
co o
CM
Esillä olevan keksinnön kohteena ovat myös isäntäsolut, jotka sisältävät edellä kuvatun
E
kaltaisen yhdistelmä-DNA-teknisen ilmentämisvektorin. Sopivia isäntiä sieniperäisen ? seriiniproteaasientsyymin tuottamiseksi ovat homologiset ja heterologiset isännät kuten
LO
<- 30 mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, hiivat ja sienet. Mahdollisia ovat myös o cm tuotantoj äq estelmät kasvi- tai nisäkässoluissa.
36 Säikeiset sienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium, Myceliophthora ja Mortiriella ovat edullisia tuotantoisäntiä johtuen entsyymituotteen jälkikäsittelyn ja talteenoton helppoudesta. Ilmentämiseen ja tuotantoon sopivia isäntäjärjestelmiä ovat esimerkiksi 5 tuotantojärjestelmä, joka on kehitetty isäntänä käytetylle säikeiselle sienelle
Trichoderma reesei (EP 244234), tai Aspergillus-tuotdxito)ärjcstclmät, kuten A. oryzae tai A. niger (WO 9708325, US 5,843,745, US 5,770,418), A. awamori, A. sojae sekä A. japonicus-tyyppiset kannat, tai tuotantojärjestelmiä, joka on kehitetty Fusarium:ille, kuten homeille F. oxysporum (Malardier et ai., 1989) tai F. venenatum, sekä homeille 10 Neurospora erässä, Rhizopus miehei, Mortiriella alpinis, H. lanuginosa tai H. insolens tai homeelle Chrysosporium lucknowense (US 6,573,086). Sopivia, hiivoja varten kehitettyjä tuotantojärjestelmiä ovat ne, jotka on kehitetty hiivoille Saccharomyces, Schizosaccharomyces yai Pichia pastoris. Sopivia, bakteereille kehitettyjä tuotantoj ärj estelm i ä ovat ne, jotka on kehitetty bakteereille Bacillus, esimerkiksi 15 bakteereille B. subtilis, B. lieheniformis, B. amyloliquefaciens, E. coU.iMq tai aktinomykeetille Streptomyces. Edullisessa tapauksessa keksinnön mukainen seriinipro-teaasi tuotetaan suvun Trichoderma or Aspergillus säikeisessä sieni-isännässä, esimerkkeinä T. reesei tai A. niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonicus-tyyppiset kannat. Keksinnön kaikkein edullisimman suoritusmuodon mukaan 20 sieniperäinen proteaasientsyymi tuotetaan T. reesei:ssa.
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös menetelmä polypeptidin tuottamiseksi, jolla polypeptidilla on seriiniproteaasin aktiivisuutta, johon mainittuun menetelmään kuuluvissa vaiheissa luonnollista tai yhdistelmä-DNA-teknistä isäntäsolua, joka sisältää ^ 25 yhdistelmä-DNA-teknisen ilmentämisvektorin keksinnön mukaista seriiniproteaasia ^ varten, viljellään sopivissa olosuhteissa ja valinnaisesti mainittu entsyymi eristetään.
^ Tuotantoalusta voi olla alusta, joka soveltuu isäntäeliön kasvatukseen ja joka sisältää cc indusoijia tehokasta ilmentämistä varten. Sopivia alustoja tunnetaan hyvin ? kirjallisuudesta.
LO
1- 30 o
Keksintö kohdistuu polypeptidiin, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta, jota mainittua polypeptidiä koodaa keksinnön mukainen nukleiinihappomolekyyli ja joka voidaan saada edellä kuvatulla menetelmällä.
37
Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta, sisältävän entsyymivalmisteen saamiseksi, johon mainittuun menetelmään kuuluvissa vaiheissa keksinnön mukaisen ilmentämisvektorin sisältävää isäntäsolua 5 viljellään ja joko polypeptidi otetaan talteen soluista tai solut erotetaan viljelyalustasta ja saadaan supematantti, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta.
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös entsyymivalmiste, joka sisältää seriini-proteaasientsyymiä, jonka tunnuspiirteet on esitetty edellä. Tällä entsyymivalmisteella 10 tai -koostumuksella on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja se voidaan saada keksinnön mukaisella menetelmällä.
Keksinnön puitteisiin kuuluu entsyymivalmiste sekä keksinnön mukaista seriiniproteaasia sisältävä koostumus.
15
Keksinnön mukaista proteaasientsyymiä sisältävä entsyymivalmiste tai -koostumus (esim. pesuainevalmiste) voi sisältää lisäksi muitakin entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu proteaaseista (muu kuin keksinnön mukainen proteaasi), amylaaseista, lipaaseista, sellulaaseista, kutinaaseista, pektinaaseista, mannaaneista, 20 ksylanaaseista ja oksidaaseista kuten lakkaasista tai peroksidaasista, välittäjän kanssa tai ilman sitä. Näiden entsyymien odotetaan edistävän keksinnön mukaisten seriiniproteaasien suorituskykyä, esimerkiksi poistamalla käsiteltävässä materiaalissa olevia hiilihydraatteja ja öljyjä tai rasvoja. Mainitut entsyymit voivat olla luonnollisia £· tai yhdistelmä-DNA-teknisiä entsyymejä, joita isäntäkanta tuottaa, tai niitä on voitu 25 lisätä vilj elmän supematanttiin tuotantoprosessin j älkeen.
o i C\l CM . .
Mainittu entsyymivalmiste tai -koostumus voi lisäksi sisältää yhtä tai useampaa sopivaa cc lisäainetta, joka on valittu pinta-aktiivisten aineiden, puskureiden, korroosiota toijuvien 2 aineiden, stabilisaattoreiden, valkaisuaineiden, välittäjien, runkoaineiden, emäksisten
LO
>- 30 aineiden, hankausaineiden ja säilöntäaineiden, optisten kiijasteiden, lian uudelleentarttu- o ...
cu mistä torjuvien aineiden, väriaineiden, pigmenttien, hajusteiden, jne. joukosta.
38
Pinta-aktiiviset aineet ovat käyttökelpoisia rasvan emulgoinnissa ja pintojen kastelussa. Pinta-aktiivinen aine voi olla ei-ioninen, mukaan lukien puoliksi poolinen ja/tai anioninen ja/tai kationinen ja/tai kahtaisioninen.
5 Entsyymivalmisteeseen tai -koostumukseen voidaan lisätä puskureita pH:n muokkaamiseksi tai niin, että kyetään vaikuttamaan muiden ainesosien suorituskykyyn tai pysyvyyteen.
Sopivia stabilisaattoreita ovat mm. polyolit kuten propyleeniglykoli tai glyseroli, sokeri 10 tai sokerialkoholi, maitohappo, boorihappo tai boorihapon johdannaiset, peptidit, jne.
Valkaisuainetta käytetään orgaanisten yhdisteiden hapetukseen ja hajotukseen. Sopivien kemiallisten valkaisujärjestelmien esimerkkejä ovat H202-lähteet kuten perboraatti tai perkarbonaatti, mahdollisesti yhdessä perhappoa muodostavien valkaisun 15 aktivaattoreiden kanssa tetra-asetyylietyleenidiamiinin kuten, tai vaihtoehtoisesti peroksihapot, jotka ovat esimerkiksi amidi-, imidi- tai sulfonityyppisiä. Kemialliset hapettimet voidaan korvata osittain tai kokonaan käyttämällä hapettavia entsyymejä kuten lakkaaseja tai peroksidaaseja. Monet lakkaasit eivät toimi tehokkaasti ilman välittäjiä.
20
Runkoaineita tai kompleksien muodostajia ovat mm. sellaiset aineet kuten zeoliitti, difosfaatti, trifosfaatti, karbonaatti, sitraatti, jne. Entsyymivalmiste voi lisäksi sisältää yhtä tai useampaa polymeeriä kuten karboksimetyyliselluloosaa, poly(etyleeniglykolia), £· poly(vinyylialkoholia), poly(vinyylipyrrolidonia), jne. Samoin voidaan lisätä ^ 25 pehmittimiä, emäksisiä aineita, säilöntäaineita muiden ainesosien pilaantumisen ^ estämiseksi, hankausaineita ja aineita, jotka muokkaavat vaahtoamis- ja 0X1 viskositeettiominaisuuksia.
X
cc
CL
2 Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mainittua entsyymiä sisältävä 30 mainittu entsyymivalmiste tai -koostumus on nesteenä, jauheena, rakeina tai tabletteina, o
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan mainittu koostumus on pesuaine-valmiste, joka on nestemäistä, jauhemaista, rakeista tai tabletteina. Lisäksi valmisteessa tai koostumuksessa oleva entsyymi voi olla immobilisoidun cntyymin muodossa.
39
Esillä olevan keksinnön mukaista seriiniproteaasia voidaan käyttää muiden proteaasien, erityisesti aikalisien proteaasien tavoin pesuaine-, proteiini-, panimo-, liha-, valokuvaus-, nahka-, meijeri- ja lääketeollisuudessa (Kalisz, 1988; Rao et ai., 1998). Sitä voidaan 5 käyttää esimerkiksi vaihtoehtona kemikaaleille kuitumaisen proteiinijätteen (esim. sarviaineksen, sulkien, kynsien sekä hiusten tai karvojen) muuntamiseen käyttökelpoiseksi biomassaksi, proteiinitiivisteeksi tai aminohapoiksi (Anwar ja Saleemuddin, 1998). Esillä olevan keksinnön mukaisen seriiniproteaasin, samoin kuin muidenkin entsyymien, käyttö voi osoittautua menestykselliseksi nahan laadun 10 parantamisessa ja ympäristön saasteiden vähentämisessä ja energian säästössä, ja se voi olla alkalisten proteaasien tavoin käyttökelpoinen peptidien synteesissä ja D,L-aminohappojen seoksen erotuksessa. Subtilisiini yhdistelmänä laajakirjöisten antibioottien kanssa palovammojen ja haavojen hoidossa on esimerkki seriiniproteaasien käytöstä lääketeollisuudessa, joten esillä olevan keksinnön mukaista 15 sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan myös käyttää tällä tavalla ja se voi olla alkalisten proteaasien tavoin käyttökelpoinen kirurgisissa välineissä olevien veren poistoon ja ja piilolinssien tai hammasproteesien puhdistukseen. Samoin kuin Conidiobolus coronatus :ista peräisin olevaa alkalista proteaasia, myös esillä olevan keksinnön mukaista sieniperäistä proteaasia voidaan käyttää trypsiinin korvaamiseen eläinsolujen 20 viljelmässä. Keksinnön mukaisia proteaaseja voidaan myös käyttää membraanien puhdistukseen ja biokalvojen tuhoamiseen. Leivonnassa proteaaseja voidaan käyttää esimerkiksi gluteeniverkon hajotukseen ja muissa elintarvikesovelluksissa elintarvikkeen proteiinien, esimerkiksi maidon proteiinien hydrolyysiin. Niitä voidaan ^ käyttää myös hiivan käsittelyyn, saannon parantamiseen (proteiinin lisämäärien ^ 25 erotukseen eläinten luista), uusien flavorien luomiseen, karvauden vähentämiseen,
CO
^ emulgoivien ominaisuuksien muuttamiseen, bioaktiivisten peptidien aikaansaamiseen ja 0X1 proteiinien allergeenisuuden vähentämiseen. Substraatteja ovat eläin-, kasvi- ja ^ mikrobiperäiset proteiinit.
o cö i- 30 Pesuaineteollisuudesta, erityisesti pyykinpesuun tarkoitettuja pesuaineita tuottavasta o <m teollisuudesta on tullut suurten pH-arvojen alueella aktiivisten proteaasien yksittäinen suuri käyttäjä (Anwar ja Saleemuddin, 1998). Pesuaineessa käytettävällä ihanteellisella proteaasilla tulisi olla laajaa substraattispesifisyyttä, joka helpottaa hyvin monenlaisten, 40 elintarvikkeista, ruohosta, verestä ja muista elimistön eritteistä peräisin olevien likojen poistoa. Sen on oltava aktiivinen pesuaineliuoksen pH:ssa ja ionivahvuudessa, pesulämpötilassa ja pH:ssa ja sen on kestettävä mekaanista käsittelyä sekä pesuaineisiin lisättäviä kelatoivia ja hapettavia aineita. Energian säilymiseen liittyvästä tietoisuudesta 5 johtuen tällä hetkellä toivottavaa on käyttää proteaasia alhaisissa lämpötiloissa.
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös seriiniproteaasientsyymin tai -entsyymi-valmisteen käyttö pesuaineissa, tekstiilikuitujen käsittelyyn, proteiinipitoisten materiaalien kuten villan, hiusten/karvojen, silkin, nahan käsittelyyn, elintarvikkeiden ja 10 eläinravinnon käsittelyyn tai mihin tahansa muuhun sellaiseen sovellukseen, joihin liittyy proteiinipitoisen materiaalin muokkausta, hajotusta tai poistoa.
Näin ollen keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on seriiniproteaasin, jonka tunnuspiirteet on esitetty edellä, käyttö pesuaineen lisäaineena, joka on käyttökelpoinen 15 pyykinpesuun tarkoitetussa pesuaineessa ja tiskienpesuun tarkoitetuissa koostumuksissa, automaattiseen tiskinpesuun tarkoitetut koostumukset mukaan lukien.
Ilmausta "pesuaine" käytetään tarkoittamaan ainetta tai materiaalia, jonka on tarkoitus olla apuna puhdistuksessa tai jolla on tarkoitus olla puhdistavia ominaisuuksia. Käsite 20 "puhdistuskyky" osoittaa puhdistavan ominaisuuden läsnäolon tai asteen. Puhdistavan ominaisuuden aste voidaan testata kiinteään, veteen liukenemattomaan kantajaan kuten tekstiilikuituihin tai lasiin sitoutuneiden erilaisten proteiinipitoisten tai proteiinia sisältävien substraattimateriaalien tai likojen tai likaseosten avulla. Tyypillisiä proteiinini pitoisia materiaaleja ovat veri, maito, muste, kananmuna, ruoho ja kastikkeet. Testaus- ^ 25 tarkoituksia varten kaupallisesti on saatavilla monia erilaisia proteiinipitoisia likani aineita. Pesuaine-entsyymin tehtävänä on hajottaa ja poistaa proteiinia sisältäviä likoja.
^ Koetulokset riippuvat lian tyypistä, pesuaineen koostumuksesta sekä pesukokeessa
CC
käytettyjen tekstiilien luonteesta ja tilasta (Maurer, 2004). o cö
LO
30 Esillä olevan hakemuksen yhteydessä käsite "alhainen lämpötila" tarkoittaa alueella δ ^ 10-30 °C olevia lämpötiloja, jotka kokeiden mukaan eivät ole optimaalisia monien, tällä hetkellä saatavilla olevien entsyymivalmisteiden, etenkään pesuaine-entsyymejä 41 sisältävien valmisteiden suorituskyvylle. Käsitteellä "kohtalainen lämpötila" tarkoitetaan lämpötila-aluetta 30-60 °C.
Ilmaus "käyttökelpoinen alhaisten tai kohtalaisten lämpötilojen alueilla" pitää 5 sisällään teolliset sovellukset, joissa on toivottavaa, että entsyymi toimii tehokkaasti alhaisten tai kohtalaisten lämpötilojen alueilla (10-60 °C). Tällaisia käyttösovelluksia ovat mm. niiden käyttö elintarvike-, eläinravinto- ja nahkateollisuudessa, farmaseuttisissa aineissa, diagnostisissa aineissa, jätteen käsittelyssä sekä hopean talteenotossa. Ohessa on tarkoitus ymmärtää, että näistä sovelluksista on poissuljettu 10 keksinnön mukaisen scri i n i proteaasientsyym i n käyttö biologisena toijunta-aineena kasveille patogeenisten sienten ja nematodien biologisessa torjunnassa.
Esillä olevassa keksinnössä " pysyvyys pesuaineessa " tarkoittaa sitä, että entsyymi tai entsyymimuunnos säilyttää aktiivisuutensa riittävällä tavalla pesuaineliuoksessa, 15 säilytyksen ja/tai pesun aikana. Tästä syystä se hajottaa tai poistaa tehokkaasti proteiini- pitoisia likoja tai materiaalia pesuaineen kuten viitepesuaineen Ecolabel Reference Detergent, hellävaraisen pesuaineen (wfk Testgewebe GmbH) tai kaupallisen nestemäisen pesuaineen läsnä ollessa, kuten on kuvattu esimerkin 6 taulukossa 3. Pysyvyys voidaan selvittää määrittämällä jäljellä oleva aktiivisuus esimerkiksi sen 20 jälkeen, kun on toteutettu inkubointi useiden vuorokausien ajan pesuaineessa (37 °C:ssa). Proteaasin jäännösaktiivisuus voidaan määrittää käyttäen menetelmää, joka on kuvattu esimerkissä 3, tai millä tahansa muulla kirjallisuudessa esitetyllä menetelmällä (Gupta et ai. 2002).
C\J
δ
CM
οό 25 Ilmaus seriiniproteaasin "tehokas määrä" viittaa proseaasientsyymin siihen määrään, cp cm joka on välttämätön entsyymiaktiivisuuden saavuttamiseen erityisessä x pesuainekoostumuksessa. Keksinnön mukainen pesuainekoostumus sisältää keksinnön Q.
mukaista proteaasimuunnosta edullisesti noin 0,0001-10 paino-%, edullisemmin noin o δ 0,001-1 paino-%, edelleen edullisemmin noin 0,001-0,5 paino-% ^ 30 pesuainekoostumuksen painosta.
CM
Tyypillisessä tapauksessa proteaasin pesevä suorituskyky mitataan "likaa poistavana tehona" tai "likaa poistavana vaikutuksena" tai "puhdistavan ominaisuuden asteena", 42 mikä tarkoittaa likaantuneen materiaalin vaaleuden näkyvää ja mitattavaa suurenemista tai sen näkyvää ja mitattavaa värinmuutosta, esimerkiksi keinotekoisesti liattujen pyykkinäytteiden tai koetekstiilien tapauksessa. Vaaleuden tai värinmuutoksen arvot voidaan mitata, esimerkiksi mittaamalla väri heijastuskyvyn arvoina spektrofotometrin 5 avulla käyttäen väriavaruuden L*a*b*-koordinaatteja, kuten on kuvattu esimerkeissä 6-8. Proteiinia sisältävän lian vaaleneminen tai poisto, mikä osoittaa proteaasin suorituskyvyn (likaa poistavan tehon), lasketaan esimerkiksi arvona AL*, mikä tarkoittaa entsyymillä käsitellyn kankaan vaaleusarvoa L*, josta on vähennetty entsyymiä sisältämättömällä pesuliemellä käsitellyn kankaan (entsyymin suhteen 10 nollakoe tai vertailu) vaaleusarvo L*. Pesuaineen läsnäolo voi parantaa entsyymin suorituskykyä likojen poistoa ajatellen. Esillä olevan keksinnön mukainen seriiniproteaasi hajottaa erilaisia proteiinipitoisia likoja aikalisissä olosuhteissa, koostumuksiltaan erilaisten pesuaineiden läsnä ollessa (esimerkit 6-8).
15 Kuten esimerkissä 6 on esitetty, keksinnön mukainen seriiniproteaasi poisti veri-/maito-/painovärilian alueella 10-50 °C ja erityisesti 30 °C:ssatai sen alapuolella kaupallisessa nestemäisessä pesuaineessa huomattavasti paremmin kuin kaupalliset proteaasivalmisteet Savinase® 16 L ja Savinase® Ultra 16L (kuviot 6 ja 7). Entsyymivalmisteet annosteltiin aktiivisuusyksikköinä. Sama vaikutus havaittiin myös 20 silloin, kun annostus laskettiin lisätyn proteiinin määränä (kuvio 8). Yllättävää on se, että Malbranchea ALK04122-proteaasilla todetaan optimaalista likaa poistavaa suorituskykyä hyvin leveällä lämpötila-alueella ja erityisesti alhaisissa lämpötiloissa, kuten alueella 10-30 °C huolimatta sen korkeasta lämpötilaoptimista analyyttisissa c\i 5 olosuhteissa kaseiinisubstraattia käytettäessä (arviolta 70 °C, kuvio 5A). Tuotteella
CVJ
(V) 25 Savinase®, jolla on samankaltainen lämpötilaprofiili analyyttisissä olosuhteissa (kuvio cp ^ 5A), todetaan selvästi heikompaa suorituskykyä kylmissä pesulämpötiloissa. Näiden
CM
x kokeiden tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisen proteaasin suorituskyky on cc erinomainen yhdessä nestemäisen pesuaineen kanssa laajalla lämpötila-alueella ja jopa o hyvin kylmissä pesulämpötiloissa. m ^ 30 o 0X1 Erilaisten veri-/maito-/painovärilikojen lisäksi Malbranchea ALK04122-proteaasi oli tehokasta likojen kuten ruohon ja kaakaon poistoa ajatellen, testattaessa nestemäisessä pesuaineessa 30 ja 60 °C:ssa. Käsittelyt toteutettiin ATLAS LP-2 Launder-Ometer- 43 laitteessa ja entsyymi annosteltiin aktiivisuutena. Tulokset (kuviot 9A-H) osoittavat, että Malbranchea-proteaasi tehosi useisiin likoihin kummassakin lämpötilassa 30 °C ja 60 °C, ja sillä todettiin likaa paremmin poistava suorituskyky verrattuna tuotteeseen Savinase® Ultra 16L. Malbranchea ALK04122 tehosi myös maapähkinäöljystä, 5 maidosta ja munasta peräisin oleviin likoihin.
Malbranchea ALK04122-proteaasin suorituskyky testattiin myös yhdessä valkaisevia aineita sekä optisia kirkasteita sisältävän perinteisen kaupallisen detergenttijauheen kanssa sekä yhdessä optisia kirkasteita ja valkaisuaineita sisältämättömän 10 viitepesuaineen ECE 77 kanssa, 50 °C:ssa, vastaavasti 10,5 tai 10 olevassa pH:ssa, esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. Entsyymin kyky poistaa verestä/maidosta/painoväristä peräisin olevaa likaa polyesteri-puuvilla-materiaalista määritettiin. Kuten kuvioissa 10A ja B on esitetty, keksinnön mukainen proteaasi soveltuu myös jauhemaisille pesuaineille hyvin aikalisissä olosuhteissa ja vaikutus oli samankaltainen verrattuna tuotteeseen 15 Savinase® Ultra 16L, kun kutakin entsyymivalmistetta annosteltiin aktiivisuusyksikköinä.
Pesun lisäksi esillä olevan keksinnön mukaisen entsyymin aktiivisuus säilyy riittävästi myös säilytyksen aikana, silloinkin kun sitä säilytetään nestemäisissä pesuaineissa, 20 kuten on esitetty esimerkeissä 9 ja 10. Malbranchea ALK04122-proteaasin pysyvyys sitä varastoitaessa on erinomainen 37 °C:ssa, verrattuna esimerkiksi Fusarium-proteaasiin Fe_RF6318 (WO 2010125174 AI) (kuviot 11A ja B). Kuviot 12A ja 12B esittävät, että Malbranchea-proteaasm pysyvyys on erityisen hyvä viitepesuaineessa
CM
o Ecolabel Reference Detergent, hellävaraisessa (wfk Testgewebe GmbH) ja οό 25 kaupallisessa nestemäisessä pesuaineessa (taulukko 3) verrattuna Fusarium-proteaasiin, cp cm sekä samankaltainen pysyvyys Ecolabel-pesuaineessa verrattuna kaupalliseen x bakteeriperäiseen proteaasiin Savinase® 16 L. Keksinnön mukaisen proteaasin hyvä pysyvyys korkeissa lämpötiloissa tekee sen erityisen sopivaksi nestemäsiin cö pesuainevalmisteisiin lämpimän ilmaston maita varten.
^ 30
CM
Keksinnön erään suoritusmuodon mukaan keksinnön mukainen sieniperäinen seriini-proteaasi on käyttökelpoinen pesuainenesteissä ja pesuainejauheissa, kuten on esitetty esimerkeissä 6-10. Keksinnön mukaisen entsyymivalmisteen entsyymistä voidaan 44 valmistaa tuote, jota käytetään käsin tapahtuvassa tai koneellisessa pyykinpesussa, tai siitä voidaan valmistaa tuote, jota käytetään kotitalouksissa kovien pintojen puhdistukseen tai edullisesti käsin tapahtuvassa tai koneellisessa astioidenpesutoimenpiteissä.
5
Johtopäätöksenä voidaan nähdä, että aikaan saadaan termofiilisesta pieneliöstä peräisin oleva uusi, lämpöä kestävä sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, joka toimii erityisen hyvin alhaisissa lämpötiloissa ja joka on yhteensopiva nestemäisten pesuainekoostumusten kanssa ja pysyvä niissä, jolloin tarvitaan vähemmän stabiloivia ja 10 muita lisäaineita.
Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä, jotka kohdistuvat keksinnön eräisiin suoritusmuotoihin, mutta keksintöä ei ole kuitenkaan tarkoitus rajoittaa vain näihin esimerkkeihin.
15 ESIMERKIT ESIMERKKI 1
Koettimien synteesi Malbranchea: sta peräisin olevien proteaasigeenien 20 kloonaamista varten sekä Malbranchea ALK04122- ja ALK04178-kannoista peräisin olevan proteaasigeenin kloonaamista varten (a) DNA:n eristäminen ja käytetyt molekyylibiologiset menetelmät
C\J
O
^ 25 Molekyylibiologian standardimenetelmiä käytettiin DNA:n eristämiseen ja entsyymi- ° käsittelyihin (esim. plasmidi-DNA:n eristäminen, DNA:n sulatus DNA-fragmenttien
CM
tuottamiseksi), E. colr.n transformointeihin, sekvenssimäärityksiin ja muihin vastaaviin. ^ Käytetyt perusmenetelmät olivat joko sellaiset kuin entsyymin, reagenssin tai 2 yhdistelmäpakkauksen valmistaja on kuvannut ne tai kuin on kuvattu ^ 30 molekyylibiologian standardikäsikirjoissa, esimerkkinä Sambrook ja Russell (2001).
S Perimä-DNA:n eristäminen säikeisistä sienistä tapahtui tavalla, jonka Raeder ja Broda (1985) ovat kuvanneet yksityiskohtaisesti.
45 (b) Alukkeet koettimen valmistamiseksi
Koettimet Ma/^ranc/zea-proteaaseja koodaavien geenien kloonaamiseksi syntetisoitiin PCR-reaktiolla. Degeneroituneet sense- ja antisense-oligot toteutettiin sieniperäisten 5 proteaasien (esimerkkeinä Fusarium equiseti RF6318, Fusarium acuminatum RF7182, T. reesei Prbl in W02010125174, W02010125175 ja WO2011003968, AB Enzymes Oy, vastaavasti) yleispätevien aminohapposekvenssien perusteella. Ylimääräinen 5'-aluke (DET5) syntetisoitiin Malbranchea cinnamomea:n termomykoliinin julkaistusta N-päätteen sekvenssistä valitun alueen mukaisesti (yhteensä 34 aminohappoa; Swiss-10 Prot-talletusnumero P13858.1). Edellä olevan sekvenssin aminohappoja 20-28 käytettiin DET5:n toteuttamiseen. Alukkeiden sekvenssit ja alukkeiden toteuttamiseen käytetyt peptidisekvenssit on esitetty seuraavassa taulukossa 1 (SEQ ID NOt: 1-5 sekä SEQ ID NOt: 6-10, vastaavasti). Taulukkoon on sisällytetty oligon nimi, SEQ ID NO, pituus, degeneroituitumisaste ja nukleotidisekvenssi samoin kuin peptidisekvenssit, joita 15 käytettiin alukkeiden toteutukseen, ja niiden sekvenssit SEQ ID NOt: 6-10.
Taulukko 1. Oligonukleotidit (SEQ ID NOt: 1-5), joita käytettiin PCR-alukkeine koettimen monistuksessa
Olig S Pitu Deg Sekvenssi^ Peptidi S
o E us ene E
Q (nt) r.as Q
I te I
cm D D
° N N
S o o
C\J
cm : :
Er DET ϊ 17 256 GGNCAYGGNACNCAYGT GHGTH 6
CL
oi (s) V
LO DET 2 2Ö 128 AAYTGGGCNGTNAAYGAY NWAYN 7
o 2 AT (s) DI
DET 3 2Ö 307 NC CRT ARTTN GTRAAN S W ASFTNY 8
3 2 NG (as) G
46 DET p p2Ö Γ69Ϊ NGCCATNSWNGTNCCNSW ISGTSM [9
4 2 DA (as) A
DET 5 26 614 CARGCNGGNATHMGNGA QAGIRD Ϊ0
5 4 YTAYCAYTA (s) YHY
(a N = A, T, C tai G; R = A tai G, Y = T tai C, H = A, C tai T, M = A tai C; “s” ja “as” suluissa nukleotidisekvenssin jälkeen = "sense"-juoste ja "antisense"-juoste, vastaavasti.
(c) PCR-reaktiot ja koettimien valinta täysipituisten proteaasigeenien 5 kloonaamiseksi
Malbranchea ALK04122:sta ja ALK04178:sta eristettyjä DNA-valmisteita käytettiin mallineina PCR-reaktioissa. CBS-tunnistuspalvelu (Utrecht, The Netherlands) on tunnistanut Malbranchea ALK04122:n eliöksi Malbranchea cinnamomea (Lib.) 10 Oorschot de Hoog (jonka synonyymi on Malbranchea pulchella var. sulfurea (Miehe) Cooney & R. Emers.) tammikuussa 2011. Malbranchea ALK04178 on talletettu yhtiön Roal Oy kantakokoelmaan nimellä Malbranchea sulfurea, mutta CBS tai mikään muukaan, säikeisten sienten tunnistamiseen erikoistunut laitos ei ole tunnistanut tämän enempää tätä eristettä.
15
Perimän DNA-molekyylien eristämistä varten Malbranchea ALK04122:n ja ALK04178:n myseeleitä kasvatettiin viljelemällä näitä kantoja 37 °C:sa 4 vuorokautta nopeudella 250 kierr/min 50 mkssa glukoosia ja hiivauutetta sisältävää alustaa (25 g glukoosia, 27,5 g hiivauutetta, pH 6.5). Myseelit otettiin talteen ja perimän DNA:t c\j ^ 20 eristettiin ja niitä käytettiin mallineena koettimen synteesiä varten. PCR-reaktion
^ seokset sisälsivät Phusion® GC-puskuria (Finnzymes/Fisher Scientific, Suomi), 0,2 m M
o ^ dNTP:tä, 50 pmol kutakin aluketta, yhdistettä DMSO (1/10 tilavuudesta) sekä 1 yksikön
Phusion®-polymeraasia (Finnzymes/Fisher Scientific) ja arviolta 0,5-1 pg perimän cc DNA:ta jokaista 50 μ1:η reaktiotilavuutta kohden. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat: 1 ° 25 minuuttia kestävä lähtödenaturointi 98 °C:ssa, sitten 28 sykliä: 10 sekuntia 98 °C:ssa,
LO
^ 30 sekunnin pituinen emäspariutuminen 45, 47, 52 ja 57 °C:ssa, 30 sekunnin pituinen C\| jatkaminen 72 °C:ssa ja lopullinen jatkaminen 72 °C:ssa 5 minuutin ajan. Aluke-yhdistelmät DET5 (SEQ ID NO: 5) ja DET4 (SEQ ID NO: 4) tuottivat kolmessa alimmassa, emäspariutumiseen käytetyssä lämpötilassa (katso edellä), DNA-tuotteen,
AI
jonka koko oli noin 0,8 kb. Tämä koko vastasi sitä kokoa, joka odotettiin saatavan proteaasigeenistä sieniperäisen proteaasin julkaistuihin sekvensseihin perustuvien laskelmien mukaisesti. Tuote, jolla oli samankaltainen koko, saatiin kun mallineena käytettiin joko ALK04122:n tai ALK04178:n perimän DNA:ta. DNA-tuotteet 5 eristettiin ja puhdistettiin PCR-reaktioseoksista ja ligatoitiin pCR®4 Blunt-TOPO-vektoriin valmistajan (Invitrogen, USA) ohjeiden mukaisesti. Tuloksena saadut plasmidit nimettiin seuraavasti: pALK3092 (ALK04122 PCR-tuote istutteena) ja pALK3093 (ALK04178 PCR-tuote istutteena). Istutteiden sekvenssit määritettiin sekä muodosteesta pALK3092 (SEQ ID NO: 11) että muodosteesta pALK3093 (SEQ ID 10 NO: 12). Kummankin istutteen pituudeksi todettiin 791 bp ja niissä todettiin vain yhden nukleotidin ero toisiinsa nähden syntetisoidussa alueessa (alukesekvenssejä huomioon ottamatta). Nukleotidi 323 pALK3092-istutteessa oli C ja se oli pALK3093-istutteessa T. Vastaavasti plasmidit pALK3092 ja pALK3093 sisältävät E. coli RF8758- ja RF8759-kannat talletettiin kantakokoelmaan DSMZ vastaavasti talletusnumeroilla DSM 15 24426 ja DSM 24427.
BLASTP-haku tapahtui ohjelmaversiolla 2.2.23 saatuja sekvenssejä käyttäen NCBEssa (National Center for Biotechnology Information) oletusasetuksilla (Altschul et ai, 1990). Koodatut aminohapposekvenssit osoittivat homologiaa esimerkiksi hypoteettisiin 20 ja säilyneisiin hypoteettisiin proteiineihin nähden, jotka proteiinit olivat peräisin
Uncinocarpus reesibsAa (XP 002584481.1 ja XP 002583205.1, vastaavasti), sekä otaksuttuun, subtilisiinin kaltaiseen, Coccidioides posadasii:sta (EER24932.1) peräisin olevaan proteiiniin nähden sekä Coccidioides immitis:sta (XP 001239485.1) peräisin olevaan hypoteettiseen proteiiniin nähden, samanlaisuuksien ollessa 59-65 %. Näin o ^ 25 ollen nämä tulokset osoittavat, että PCR-reaktioista saadut DNA-fragmentit olivat ^ proteaaseja koodaavien geenien osia ja näin ollen käyttökelpoisia koettimia yhden tai ^ useamman täysipituisen proteaasigeenin seulomiseksi Malbranchecr.sta. DET5-alukkeen ^ koodaamaa sekvenssiä seurannut koodautunut aminohapposekvenssi ei kuitenkaan ollut ? samanlainen kuin julkaistu Malbranchea:n termomykoliinin sekvenssi (aminohapot 29- ί 30 34, talletusnumero P13858).
δ
(M
(d) Täysipituisen Malbranchea ALK04122-proteaasin geenin kloonaus 48
Malbranchea ALK04122:n ja ALK04178:n perimän DNAt sulatettiin monilla erilaisilla restriktioentsyymeillä Southern Blot-analyysia varten. Sulatteet ajettiin geelillä ja Southem-siirto ja hybridisointi toteutettiin. Southern Blot-koetin merkittiin PCR-reaktion avulla käyttäen M13-peruutus- ja M13-eteenpäinalukkeita sekä 5 muodostetta pALK3092 (esimerkki le) mallineena. Koettimen sekvenssi sisältää sekvenssin SEQ ID NO: 11 (esimerkki le). Koettimen merkitseminen käyttäen PCR DIG (digoksigeniini) -merkintäseosta ja hybridisointi toteutettiin toimittajan (Roche, Germany) ohjeiden mukaisesti. Hybridisointi toteutettiin yön yli 68 °C:ssa. Hybridisoinnin jälkeen suodattimet pestiin seuraavasti: 2x5 minuutin pesua huoneen 10 lämpötilassa käyttäen puskuria 2 x SSC - 0,1 % SDS, sitten 2x5 minuutin pesua 68 °C:ssa käyttäen puskuria 0,1 x SSC-0,1 % SDS.
Useita hybridisoituvia fragmentteja todettiin Malbranchea ALK04122:n ja ALK04178:n perimän DNA:n sulatteissa. Useimmilla sulatteilla saatiin samanlaiset 15 tulokset kummastakin perimästä. Arviolta 2,7 kb:n hybridisoituva fragmentti saatiin perimän Ahal-sulatteesta. Tämän Ahal-fragmentin analysoitiin sisältävän täysipituisen proteaasigeenin (koetinsekvenssiin sisältyneen perimän DNA:n kaksinkertaisella sulatuksella käyttäen entsyymejä Xbal ja Pstl ja sieniperäisen proteaasin julkaistuihin sekvensseihin perustuvilla koon laskelmilla). DNA-fragmentit eristettiin ALK04122:n 20 perimän Λ7ν/1-pilkkeestä, hybridisoituvan fragmentin kokoalueelta (arviolta 2,7 kb). Eristys tehtiin agaroosigeelistä. Eristetyt perimän fragmentit kloonattiin pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) -vektoriin, joka oli katkaistu entsyymillä Xbal. Ligaatioseos transformoitiin Escherichia coli XLIO-Gold -soluihin (Stratagene) ja maljattiin LB
CM
>- (Luria-Bertani) -maljoille, jotka sisälsivät 50 pg/ml ampisilliinia. Positiiviset E. coli -
CM
^ 25 pesäkkeet seulottiin käyttäen pesäkkeiden hybridisointia PCR-merkittyyn pALK3092- o ^ istutteeseen, joka toimi koettimena. Hybridisointi toteutettiin tavalla, joka on kuvattu cm perimän DNA-sulatteille. Maljoilta poimittiin yhteensä 20 kloonia ja näistä kahdeksan cc todettiin sisältävän istutteita, joilla on odotettu koko ja jotka hybridisoituvat ^ pALK3092-koettimeen, johon toteamiseen käytettiin sulatusta Xbal-
LO
^ 30 restriktioentsyymi 11 ä ja Southern Blot-hybridisointia (joka toteutettiin perimän o ^ hybridisoinnille kuvatulla tavalla). Ahal-istutteen (2961 bp) sekvenssi määritettiin ja sen varmistettiin sisältävän täysipituisen Malbranchea ALK04122-proteaasigeenin (SEQ ID NO: 13). Edellä olevan ΑδαΙ-perimäfragmentin sisältävälle plasmidille annettiin 49 nimeksi pALK3094. E. co/z-kanta RF8791, joka sisälsi plasmidin pALK3094, talletettiin kantakokoelmaan DSMZ talletusnumerolla DSM 24410.
(e) Malbranchea ALK04122-proteaasia koodaavan geenin tunnuspiirteiden 5 selvitys ja proteaasin päätelty aminohapposekvenssi
Kuviossa 1 on esitetty geenisekvenssi (SEQ ID NO: 13), sen osittaiset promoottori- ja päättäjäsekvenssit sekä koodautuneen proteaasin päätelty aminohapposekvenssi (SEQ ID NO: 14). Geenin pituus on 1436 bp (pysäytyskodoni mukaan lukien). Löydettiin 10 kolme otaksuttua intronia, joiden pituudet olivat 72, 87 ja 71 bp. Introneissa oli yleispätevät 5'- ja 3'-rajasekvenssit sekä sisäisiä yleispäteviä sekvenssejä useista sieniperäisistä introneista tunnistettujen sekvenssien mukaisesti (Gurr et ai., 1987). Päätelty proteiinisekvenssi (SEQ ID NO: 14) koostuu 401 aminohaposta, mukaan lukien ennustettu, 20 aminohapon signaalisekvenssi (SignalP V3.0; Nielsen et ai., 1997 sekä 15 Nielsen ja Krogh, 1998) sekä ennustettu 100 aminohapon prosekvenssi. Kypsän proteaasin N-päätteen, Alal21, sijainti arvioitiin muiden sieniperäisten proteaasisekvenssien kanssa tehtyjen vertailujen mukaisesti. Kypsän proteaasin ennustettu molekyylimassa oli 28 530 Da ja ennustettu pl oli 6,15. Nämä ennustukset laskettiin käyttäen ExPASy-palvelimella olevaa laskentatyökalua Compute pEMW 20 (Gasteiger et ai, 2003). Päätelty kypsä aminohapposekvenssi sisälsi kolme mahdollista N-glykosylointikohtaa kypsän sekvenssin aminohappoasemissa Asnl34, Asnl72 ja Asn277 (aminohappoasemat 254, 292 ja 397 kuviossa 1), mutta CBS-palvelimen NetNGlyc V1.0 mukaan vain asemien Asnl34 and Asn277 kohdat ovat todennäköisiä.
CvJ
δ ^ 25 Malbranchea ALK04122-proteaasin N-päätteen sekvenssi vastasi vain osittain aikai- ^ semmin julkaistua M. cinnamonea.n termomykoliinin N-päätteen sekvenssiä (P13858): ^ vain ensimmäiset 28 aminohappoa olivat samanlaiset näissä kahdessa sekvenssissä.
x cc
CL
? Vain yhden nukleotidin ero esiintyi muodosteessa pALK3092 olevassa, Malbranchea ^ 30 ALK04122-proteaasigeenin koetinsekvenssissä verrattuna perimästä saadun o cvj ALK04122-proteaasin geenisekvenssiin (vastaavassa alueessa). Perimästä saatu ALK04122-proteaasin geenisekvenssi oli kuitenkin samanlainen kuin muodosteessa pALK3093 oleva ALK04178-proteaasigeenin koetinsekvenssi (vastaavassa alueessa).
50 Näin ollen tämä yhden nukleotidin ero pALK3092-istutteessa (esimerkki le) johtui kaikkein todennäköisimmin koettimen PCR-alueessa esiintyvästä mutaatiosta.
(f) Malbranchea ALK04178-proteaasigeenin kloonaus 5
Alukkeet DET27 (SEQ ID NO: 19) ja DET28 (SEQ ID NO: 20) toteutettiin täysipituisen proteaasigeenin syntetisoimiseksi Malbranchea ALK04178:sta PCR:n avulla. DET 27 on Malbranchea ALK04122-proteaasigeenin (kuvio 1) promoottorista peräisin oleva sense-aluke (nukleotidista -44 nukleotidiin -24 ATG:sta) ja DET28 on 10 sen päättäjästä peräisin oleva antisense-aluke (nukleotidista 55 nukleotidiin 36 pysäytyskodonista). PCR-reaktioseokset sisälsivät lXPhusion® HF -puskuria (Finnzymes/Fisher Scientific, Suomi), 0,2 mM dNTP:tä, 75 pmol kutakin aluketta ja 2 yksikköä Phusion® -polymeraasia (Finnzymes/ Fisher Scientific) sekä arviolta 1,5 pg perimän DNA:ta reaktiotilavuuden jokaista 200 pl:aa kohden. PCR-reaktioiden 15 olosuhteet olivat: 30 sekunnin alustava denaturointi 98 °C:ssa, mitä seurasi 24 syklinä 10 sekuntia 98 °C:ssa, 30 sekunnin emäspariutuminen 60 ja 65 °C:ssa, 60 sekunnin jatkaminen 72 °C:ssa ja lopullinen jatkaminen 72 °C:ssa 7 minuuttia. Näistä reaktioista saatiin fragmentteja, joilla oli odotettu pituus (~ 1,5 kb). Kahdesta erillisestä PCR-reaktiosta peräisin olevat fragmentit eristettiin ja ligatoitiin pCR4®Blunt-TOPO®-20 vektoreihin. Istutteiden sekvenssit määritettiin erillisistä klooneista. Kummassakin kloonissa olevien istutteiden sekvenssit olivat samanlaiset keskenään ja Malbranchea ALK04122-proteaasigeenin, sen osittaisen promoottorin ja päättäjän kanssa (kuvio 1). Malbranchea AFK04178-proteaasin geenin sisältävälle plasmidille (saatu PCR-
CVJ
q fragmentti) annettiin nimeksi pAFK3147. Plasmidin sisältävä E. co/Z-klooni
CVJ
(V) 25 tallennettiin yhtiön Real Oy viljelmäkokoelmassa talletusnumerolla RF9332.
o
Ovi
Ovi x (g) Homologia-, samanlaisuus- ja rinnastustutkimukset tr
CL
o ^ Kypsän Malbranchea ALK04122-proteaasin aminohapposekvenssiä (SEQ ID NO: 18) m 30 käytettiin homologisten proteaasisekvenssien etsintään julkisista lähteistä. Haku tehtiin o ^ sekä redundanteista proteiinisekvensseistä että GenBank:in patenttijaoston proteiinisekvensseistä. Hakuun käytettiin BLASTP-ohjelman versiota 2.2.25 tutkimuslaitoksessa NCBI (National Center for Biotechnology Information) sekä oletusasetuksia 51 (Altschul et ai, 1990). Kaikista redundanteista sekvensseistä saadut suurimman samanlaisuudet olivat 66 % Coccidioides posadasii:n oletetulle, subtilisiinin kaltaiselle proteaasille (EER24932.1) sekä Coccidioides immitis:in hypoteettiselle proteiinille CIMG_09197 (XP_001239485.1), 65 % Uncinocarpus reesiv.n hypoteettiselle 5 proteiinille UREG_05170 (EEP80328.1), 64 % Coccidioides immitis:in hypoteettiselle proteiinille CIMB 01394 (XP_001247623.1), Coccidioides posadasii:n oletetulle, subtilisiinin kaltaiselle proteaasille (EER23662.1), Uncinocarpus reesii:n hypotettiselle proteiinille (EEP81307.1) ja Ärthroderma otae:n alkaliselle proteinaasille (EEQ28657.1). EER24932.1 ja XP 001239485.1 eroavat toisistaan vain kolmen 10 aminohapon verran ja XP_001247623.1 EER23662.1 eroavat toisistaan vain yhden aminohapon verran. Malbranchea ALK04122-proteaasin sekvenssi rinnastettiin edellä mainittujen homologisten sekvenssien kanssa käyttäen ClustalW2-rinnastusta. Kustakin proteaasista peräisin olevia oletettuja kypsiä sekvenssejä käytettiin rinnastukseen. Kustakin proteaasista peräisin olevia kypsiä sekvenssejä verrattiin toisiinsa. Taulukossa 15 2 on esitetty ClustalW2-rinnastusta (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) käyttäen saadut samanlaisuusarvot (pisteytys-%). Kypsät aminohapposekvenssit, poissulkien signaalipeptidit ja propeptidit, rinnastettiin käyttäen oletusasetuksia (proteiinipainomatriisi: Gonnet, aukko auki: 10, aukon pidennys: 0,20, aukon etäisyydet 5). SEQ ID NO: 18 on ALK04122-proteaasin kypsä aminohapposekvenssi. Saadut 20 samanlaisuusarvot (pisteytys-%) olivat 63-65 %.
Suurimmat samanlaisuudet patenttijaoston sekvensseille olivat 55 % patenttijulkaisun US 5962765 sekvenssille SEQ ID NO: 2 (AAE30270.1; Metarhizium anisopliae.n proteaasille ja patenttijulkaisun WO 8807581 sekvenssille SEQ ID:15 (AAA54276.1; ^ 25 proteaas i Tritirachium album: i sta).
o
CM
C\]
Taulukko 2. Pääteltyjen aminohapposekvenssien tapauksessa sekvenssien monin- cn kertaisesta ClustalW 2.1 -rinnastuksesta saadut samanlaisuusarvot (pisteytys-%) o cö ^ Sekvenssi 12345678 ° 1 Ξ SEQ ID 1ÖÖ NO:18 2 = EER24932.1 ~65 1ÖÖ 52 1 = [65 [99 [TÖÖ XP_001239485.1 4 = EEP80328.1 64 "73 "72 lÖÖ 1 Ξ 63 "59 "59 6Ö 1ÖÖ XP_001247623.1 6 = EER23662.1 "63 "59 "59 "61 "99 1ÖÖ 7 = EEP81307.1 "63 "59 "59 "63 "62 ~61 1ÖÖ 8 = EEQ28657.1 "64 "58 "58 "58 "57 "57 "62 1ÖÖ ESIMERKKI 2.
Yhdistelmä-DNA-teknisen Malbranchea ALK04122-proteaasin tuottaminen
Trichoderma reesei:ssä 5 (a) Tuotanto vektoreiden ja tuotanto kantojen valmistus
Ilmentämisplasmidi pALK3097 muodostettiin yhdistelmä-DNA-teknisen Malbranchea ALK04122-proteaasin tuottamiseksi Trichoderma reesei:ssa. Geeni ja sen oma 10 signaalisekvenssi fuusioitiin täsmällisesti T. reesei cbhl (cel7A) -promoottoriin PCR-reaktion avulla. PCR-reaktiossa käytetyille alukkeille annettiin nimiksi DET 17 (5'-aluke; SEQ ID NO:21) ja DET18 (3'-aluke; SEQ ID NO:22). DET17-aluke sisältää osittaisen cbh 1-promoottorin SacII-kohdasta (asema -16 ATG:sta) asemaan -1 sekä Malbranchea-proteaasigeenin alun (26 nukleotidiä, ATG-aloituskodoni mukaan lukien) 15 sekä 3 ylimääräistä nukleotidiä 5’-päässä. DET 18 sisältää 26 nukleotidiä Malbranchea-
OJ
q proteaasigeenin päästä (mukaan lukien STOP-kodoni) sekä kytkijän, joka sisältää
(M
^ HI-kohdan geenin fuusioimiseksi sen 3’-päästä pALK2777-kytkijään (cbhl- cp ¢(, päättäjä; katso alla). Proteaasigeenin luonnonmukainen päättäjä ei sisälly
(M
x muodostukseen.
cc 20
O
Proteaasigeeni leikattiin PCR-fragmentista Sac\\ - 5amHI-sulatuksella ja fuusioitiin
LO
^ pALK2777-ilmentämisvektorin runkoon, joka oli leikattu näillä samoilla entsyymeillä o ^ (kuvio 2). pALK2777-plasmidi sisältää cbh 1 -promoottorin (&cII-kohtaan), kytkijän, joka sisältää mm. RamHI-kohdan, cbhl -päättäjän ja synteettisen amdS- geenin 25 transformanttien seulomiseksi. Synteettinen amdS-geeni muodosteessa pALK2777 53 sisältää lyhentyneen päättäjän (Abal-kohtaan) luonnonmukaiseen amdS- geeniin verrattuna (Kelly ja Hynes, 1985). Samoin luonnonmukaisen amdS-geenin intronit on poistettu ja valittuja restriktiokohtia amc/S-promoottorista ja geenistä on muokattu ilmentämiskasettien muodostuksen ja eritämisen helpottamiseksi. Kuitenkin synteettisen 5 amdS-geenin koodaama aminohapposekvenssi on samanlainen kuin villityyppisen amdS-geenin koodaama aminohapposekvenssi.
7,2 kb:n lineaarinen ilmentämiskasetti (esitetty kuviossa 3) eristettiin vektorin rungosta iVotl-sulatuksen jälkeen ja sen avulla transformoitiin Trichoderma reeser.n 10 protoplasteja. Isäntänä käytetty T. reese/-kanta ei tuota mitään neljästä pääasiallisesta T. reesei:n sellulaasista (CBHI, CBHII, EGI, EGII). Transformointi tapahtui tavalla, jonka ovat esittäneet Penttilä et ai. (1987), käyttäen muokkauksia, jotka Karhunen et ai. (1993) ovat esittäneet. Transformantit puhdistettiin valintamaljoilla yksittäisten konidioiden avulla ennen niiden itiöintiä PD:llä.
15 (b) Proteaasin tuotanto ravistelupulloissa ja laboratoriomitan bioreaktorissa
Transformantteja siirrostettiin PD-vinoviljelmistä ravistelupulloihin, joka sisälsi 50 ml monimutkaista laktoosipohjaista, sellulaasilla indusoitavaa alustaa (Joutsjoki et ai., 20 1993), joka oli puskuroitu 5 % yhdistettä KH2PO4, pH 6,0. Transformanttien kyky tuottaa proteaasia analysoitiin viljelmien supematanteista sen jälkeen, kun transformantteja oli kasvatettu 5 vrk 30 °C:ssa, 250 kierr/min. Käytetyistä viljelmän supematanteista peräisin oleva, yhdistelmä-DNA-teknisen proteaasin odotettua massaa
CM
^ vastaava, noin 30 kDa:n suurin proteiinivyöhyke ilmaistiin SDS-PAGE-geeleillä.
cvj .....
^ 25 Proteaasin aktiivisuus näytteissä määritettiin käyttäen kaseiinia substraattina, o ^ esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Viljelmän supematanteista mitattiin selvästi kohonneita cm aktiivisuuksia isäntään verrattuna. Ilmentämiskasetin yhdentyminen sienen perimiin cc varmistettiin valituista transformanteista käyttäen Southern Blot-analyysia, jossa o ^ käytettiin useita perimän sulatteita j a koettimena ilmentämiskasettia pALK3097.
LO
^ 30 δ ^ T. reesei--transformantit, jotka tuottivat parhaita proteaasin aktiivisuuksia ravistelupulloissa toteutetuissa viljelmissä, valittiin viljeltäviksi laboratoriomitan bioreaktoreissa. Selluloosilla indusoitavaa monimutkaista alustaa käytettiin viljelmissä.
54
Viljelmistä saatua käytettyä viljelyalustaa tai väkevöityjä näytteitä käytettiin lähtöaineina yhdistelmä-DNA-teknisen Malbranchea ALK04122-proteaasin puhdistuksessa ja edelleen sen biokemiallisten tunnuspiirteiden selvityksessä sekä esimerkeissä 6-10 esitetyissä sovelluskokeissa.
5 ESIMERKKI 3.
Proteaasin aktiivisuuden määritys
Proteaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen kaseiinia substraattina. Nopeus, jolla proteiini 10 hajotti kaseiinia, mitattiin seuraamalla happoliukoisten peptidifragmnttien vapautumista ajan funktiona. Happoliukoiset peptidit kvantitoitiin spektrofotometrisesti. Tulos esitettiin muodossa 1 pg tyrosiinia minuutissa millilitraa (ml) tai grammaa (g) kohden.
Ensin kaikki määrityksessä tarvittavat reagenssiliuokset valmistettiin ionittomaksi 15 tehtyyn veteen, Milli-Q tai vastaava, seuraavalla tavalla.
(STW) Synteettinen vesijohtovesi:
Seuraavat varastoliuokset valmistettiin: 5.8 g CaCl2 x 2 H20 / 200 ml H20 20 2,8 g MgCl2 x 6 H20 / 200 ml H20 4,2 g NaHCOs / 200 ml H20 10 ml näitä liuoksia lisättiin esitetyssä järjestyksessä 300 mkaan H20:ta samalla sekoittaen, sitten täytettiin 1 litraksi H20:lla. Tuloksena saatua liuosta kutsuttiin ^ 25 synteettiseksi vesijohtovedeksi, o i
CM
CM
Tris-liuos, 0.3 M synteettisessä vesijohtovedessä: cc 36,3 g Trizma-emästä (SIGMA T-1503) liuotettiin synteettiseen vesijohtoveteen ja ? täytettiin 1 litraksi.
LO
^ 30 δ ^ Kaseiiniliuos: 6 g kaseiinia (Hammarsten Usb. 12840) lisättiin 350 mkaan synteettistä vesijohtovettä ja liuotettiin magneettisekoittamalla 10 min. 50 ml Tris-liuosta lisättiin ja liuosta 55 sekoitettiin vielä 10 min. Sitten liuos kuumennettiin 70 °C:seen. Tämän jälkeen lämpötilan annettiin laskea arvoon 50 °C ja pH asetettiin arvoon 8,5 käyttäen 0,1M NaOH-liuosta. Sekoitusta jatkettiin, kunnes huoneen lämpötila oli saavutettu. Liuoksen tilavuus asetettiin 500 mkksi synteettisellä vesijohtovedellä. Substraattiliuosta 5 säilytettiin korkeintaan 3 vrk jääkaapissa (tai sitä säilytettiin pakastettuna).
110 mM trikloorietikkahapporeagenssi (reaktion pysäyttävä liuos): 18 g yhdistettä TCA (Merck 807) liuotettiin veteen H2O ja tilavuus asetettiin 1 litraksi.
10 0,5 M Na2CO: 53 g yhdistettä Na2C03 liuotettiin veteen H20 ja tilavuus asetettiin 1 litraksi. Foliiniliuos: 25 ml 2N Folin-Ciocalteu:n fenolireagenssia (SIGMA, F 9252) laimennettiin 100 mkksi 15 vedellä H20.
Näytteen laimennuspuskuri: Näyte laimennettiin 50 mM Tris-HCl-puskurilla, pH 8,5.
Sopivin laimennus tuottaa reaktiossa alueella 0,4-0,8 olevan absorbanssin.
20 Määritys: Määritys aloitettiin temperoimalla 2,5 ml substraattiliuosta koeputkissa 5 minuutin ajan 50 °C:ssa. Tämän jälkeen lisättiin 0,5 ml laimennettua entsyymiliuosta, sekoitettiin c\j o pyörresekoittimessa ja reaktion annettiin edetä 50 °C:ssa tasan 30 min. Entsyymin
(M
ob 25 nollanäyte valmistettiin samoin kuin näyte, mutta reaktion pysäyttävää liuosta (110 mM
O
cm TCA) lisättiin koeputkeen ennen näytettä. Reaktion jälkeen 2,5 ml pysäytysliuosta c\i x lisättiin putkiin (ei nollanäytteen tapauksessa), sisältöjä sekoitettiin ja niiden annettiin
CL
seisoa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Putkia sentrifugoitiin nopeudella 4000 o cö kierr/min 10 minuutin ajan (Hettich Rotanta 460). Yhteen ml:aan kirkasta supematanttia ^ 30 sekoitettiin 2,5 ml 0,5 M Na2C03 ja 0,5 ml laimennettua foliinireagenssia. 10 minuutin W pituisen odotuksen jälkeen (värin kehitys) seoksen absorbanssi (väri) mitattiin aallonpituudella 600 nm entsyymin nollanäytettä vastaan.
56
Kussakin mittauksessa käytettiin vähintään kahta rinnakkaista näytettä.
ESIMERKKI 4.
Yhdistelmä-DNA-teknisen proteaasin puhdistus 5
Solut ja kiintoaines poistettiin fermentoinnista saadusta käytetystä viljelyalustasta (esimerkki 2) sentrifugoimalla 30 min nopeudella 50 000 g +4 °C:ssa (Sorvali RC6 plus). 8 ml supematanttia käytettiin proteaasin puhdistukseen. Kaikki puhdistusvaiheet toteutettiin kylmässä tilasa. Sentrifugoinnin jälkeen näyte suodatettiin 0,44 pm:n 10 suodattimen läpi (MILLEX HV Millipore) ennen laittamista suolaa poistavaan HiPrep 26/10-pylvääseen (yhtiöstä GE Healthcare), jota oli tasapainotettu puskurilla 20 mM MES pH 5,3. Geelisuodatettu näyte laitettiin 1 ml S Sepharose HP-pylvääseen (yhtiöstä GE Healthcare), jota oli tasapainotettu puskurilla 20 mM MES pH 5,3. Proteiinit eluoitiin käyttäen kasvavaa NaCl-gradienttia (0,5 M). Proteaasia sisältävät jakeet 15 yhdistettiin ja väkevöitiin käyttäen yhtiön MILLIPORE Amicon Ultra-4 10,000 CO-sentrifugi-suodatus-laitteita. Näytettä puhdistettiin edelleen käyttäen Superdex 75-geelisuodatuspylvästä, jota oli tasapainotettu puskurilla 20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5,3. Proteaasia sisältävät jakeet yhdistettiin ja niitä käytettiin pH- ja lämpötilaprofiileihin liittyvien tunnuspiirteiden selvittämiseksi. Lopullinen näyte 20 analysoitiin SDS PAGE-geelillä, kuvio 4.
ESIMERKKI 5.
Yhdistelmä-DNA-teknisen proteaasin tunnuspiirteiden selvitys c\j δ c\i ^ 25 Lämpötilaprofiili
O
' Lämpötilaprofiili saatiin yhdistelmä-DNA-tekniselle Malbranchea-protcaasiiic ja
CM
tuotteelle Savinase® 16L käyttäen esimerkissä 3 kuvattua määritystä. Tulos on esitetty cc “ kuviossa 5A. Proteaasin lämpötilaoptimi on noin 70 °C.
o δ
LO
^ 30 pH-profiili δ ^ Malbranchea-proteaasin ja tuotteen Savinase® 16L pH-profiili määritettiin 50 °C:ssa käyttäen kaseiinia substraattina, esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, paitsi että entsyyminäytteet laimennettiin ja kaseiini liuotettiin 40 mM Britton-Robinson- 57 puskuriin, reaktion pH asetettiin pH-alueelle 6-10, reaktioaika oli 30 min ja entsyymireaktiot pysäytettiin käyttäen 0,11 M TCA-liuosta, joka sisälsi 0,22 M natriumasetaattia ja 0,33 M etikkahappoa. Tulokset on esitetty kuviossa 5B. Yli 50 % oleva yhdistelmä-DNA-teknisen proteaasin suhteellinen aktiivisuus saavutetaan pH-5 alueella 6-10, ja paras aktiivisuus saavutetaan noin pH-arvossa 10.
ESIMERKKI 6.
Malbranchea ALK04122-proteaasilla oleva, likaa poistava suorituskyky yhdessä nestemäisen pesuaineen kanssa erilaisissa lämpötiloissa 10
Esimerkissä 2 (b) kuvatulla tavalla Trichoderma: ssa tuotetun Malbranchea ALK04122-proteaasin kyky poistaa veri/maito/painomuste-standarditahroja 10, 20, 30 ja 50 °C:ssa kaupallisen nestemäisen pesuaineen läsnä ollessa testattiin (taulukko 3), 5 g/1 olevana pitoisuutena. Koemateriaalina käytettiin standardilialla keinotekoisesti liattua 15 koekangasta, tuotenro 117 (veri/maito/painomuste, polyesteri + puuvilla, sarjanro 11-08 tai 10-07, EMPA Testmaterialen AG, Switzerland). Vertailuun käytettiin kaupallisia proteaasivalmisteita Savinase® 16L ja Savinase® Ultra 16L (sisältää proteaasin inhibiittoria, 4-FBPA) sekä käsittelyä ilman entsyymiä (vertailu). Kutakin entsyymivalmistetti annosteltiin 0-8 tai 0-16 aktiivisuusyksikköä (pg tyrosiinia/min) 20 jokaiseen millilitraan pesulientä. Aktiivisuus mitattiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
C\J
δ cv i co o
(M
(M
X
en
CL
O
δ m δ cv 58
Taulukko 3. Kaupallisen nestemäisen pesuaineen koostumus.
Ainesosa % 15-
Anioniset pinta-aktiiviset aineet 30 5^
Ei-ioniset pinta-aktiiviset aineet, saippua 15
Fosfonaatti, polykarboksylaatti 5
Optiset kirkasteet ja hajusteet pH 8,2-8,6 5 g kaupallista nestemäistä pesuainetta liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä (dH < 4), sekoitettiin hyvin magneettisekoittimella ja temperoitiin pesulämpötilaan. Pesuliemen 5 pH oli noin 8. Tahrittu kangas leikattiin ensin näytepaloiksi, joiden koko oli 1,5 cm x 1,5 cm, ja nämä palat pyöristettiin leikkaamalla kulmat. Palat laitettiin mikrotiitterilevyn (Nunc 150200) kuoppiin. Jokaiseen kuoppaan, jonka halkaisija oli 2 cm, kankaan päälle, laitettiin 1,5 ml pesulientä, joka sisälsi pesuainetta ja veteen laimennettua entsyymiä (noin 50 μΐ). Maljoja näytteineen inkuboitiin ravistelevassa Infors Ecotron-10 inkubaattorissa 10, 20, 30 ja 50 °C:ssa 60 min, nopeudella 130 kierr/min. Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdottiin huolella juoksevan veden alla (suurin piirtein pesun lämpötilassa) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa ristikon päällä, päivänvalolta suojattuna.
15 Tahroja poistava vaikutus arvioitiin mittaamalla väri heijastuskyvyn arvoina Minolta
OJ
5 CM 2500-spektrofotometrillä, käyttäen väriavaruuden L*a*b*-koordinaatteja (valon c\i ^ lähde D65/2°). Väri mitattiin kangasnäytteiden kummaltakin puolelta käsittelyn jälkeen, o ^ Kukin arvo oli vähintään 2 rinnakkaisella kangasnäytteellä saadun arvon keskiarvo,
CM
x kankaan kummaltakin puolelta mitaten. Veri/maito/painoväri-tahran haalistuminen, joka cc 20 osoittaa proteaasin suorituskyvyn (tahroja poistavan tehon), laskettiin arvona AL* (delta o ^ L*), joka tarkoittaa entsyymillä käsitellyn kankaan vaaleusarvoa L*, josta on vähennetty
LO
^ entsyymiä sisältämättömällä pesuliemellä käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte,
O
^ vertailu) vaaleusarvo.
59
Kuvioissa 6A-6D esitetyt tulokset osoittavat, että Malbranchea ALK04122-proteaasilla on huomattavasti parempi vaikutus veri/maito/painomuste-tahroihin (tuote 117, sarjanro 11-08) kaikissa testatuissa lämpötiloissa verrattuna kaupallisiin Savinase®-valmisteisiin. Todettiin, että veri/maito/painomuste-tahran vanhemman erän (sarjanro 5 10-07) poistaminen ilman entsyymiä (pelkän pesuaineen avulla) oli vaikeampaa ja näin ollen entsyymin myötävaikutus (AL*) oli merkittävästi suurempi verrattuna kokeisiin, jotka toteutettiin uudemmalla erällä 11-08. Malbranchea-valmiste oli tätäkin tehokkaampi tämän vaikea vanhan tahramateriaalin tapauksessa tuotteeseen Savinase® verrattuna (kuviot 7A-7D). Samoin mikäli annostus lasketaan lisätyn proteiinin määränä 10 (kuviot 8A-8D), niin tahroja poistava teho oli suurin Malbranchea sulfurea ALK04122-proteaasin tapauksessa. Entsyymi valmisteista peräisin olevan proteiinin määrä määritettiin yhtiön Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) käyttäen standardina naudan gammaglobuliinia (Bio-Rad).
15 Yllättävää on se, että Malbranchea ALK04122-proteaasilla todetaan optimaalista tahroja poistavaa suorituskykyä hyvin laajalla lämpötila-alueella ja erityisesti matalissa lämpötiloissa kuten alueella 10-30 °C huolimatta sen korkeasta lämpötilaoptimista analyyttisissa olosuhteissa kaseiinisubstraattia käytettäessä (arviolta 70 °C, kuvio 5A). Tuotteella Savinase®, jolla on samankaltainen lämpötilaprofiili analyyttisissa 20 olosuhteissa (kuvio 5A), todetaan selvästi heikompi suorituskyky kylmissä pesulämpötiloissa. Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että Malbranchea ALK04122-proteaasilla on erinomainen suorituskyky yhdessä nestemäisen pesuaineen kanssa laajalla lämpötila-alueella ja jopa hyvin kylmissä pesulämpötiloissa.
c\j δ
(M
^ 25 ESIMERKKI 7.
o ^ Pyykinpesukokeet Malbranchea ALKO 4122-proteaasilla käyttäen nestemäistä
CM
x pesuainetta ja erilaisia tahroja cc
CL
O
2^ Esimerkissä 2(b) kuvatulla tavalla Trichoderma:ssa tuotetun Malbranchea ALK04122-
LO
^ 30 proteaasin kyky poistaa erilaisia tahroja yhdessä kaupallisen nestemäisen pesuaineen o ^ kanssa 30- ja 60 °C:ssa testattiin, verrattuna kaupalliseen proteaasivalmisteeseen
Savinase® Ultra 16 L. Seuraavia, keinotekoisesti liattuja EMPA:sta saatuja koekankaita käytettiin: veri/maito/painomuste (tuote 117, saijanro 11-08 ja 10-07, 60 polyesteri+puuvilla), veri/maito/painomuste (tuote 116, sarjanro 18-16, puuvilla), ruoho (tuote 164, sarjanumero 23-03, puuvilla) ja kaakao (tuote 112, sarjanumero 31-06, puuvilla). Kankaasta leikattiin näytepaloja, joiden koko oli 6 cm x 6 cm, ja reunat siistittiin sik-sak-pistoilla.
5
Tahranpoistokäsittelyt toteutettiin LP-2 Launder Ometer-laitteessa seuraavasti. Launder Ometer esikuumennettiin ensin 30 tai 60 °C:seen. Sitten 0, 2, 5, 10 ja 20 (40) aktiivisuusyksikköä entsyymiä pesuliemen jokaista ml:aa kohden lisättiin 1,2 litran säiliöihin, jotka sisälsivät 250 ml temperoitua pesulientä ja tahritut kangasnäytteet. 10 Aktiivisuus (pg tyrosiinia/ml) mitattiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Pesuliemi sisälsi 5 g kaupallista nestemäistä pesuainetta (taulukko 3) litrassa vesijohtovettä (dH < 4) ja sen pH oli arviolta 8. Launder Ometer-laitetta käytettiin 30 °C:ssa 60 minuuttia, pyörimisnopeudella 42 kierr/min. Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdottiin huolella juoksevan veden alla (noin 20 °C) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa, ristikon päällä, 15 päivänvalolta suojattuna.
Kan gasnäytteiden väri mitattiin käsittelyn jälkeen Minolta CM 2500-spektrofotometrillä, käyttäen väriavaruuden L*a*b*-koordinaatteja, ja tahroja poistava vaikutus laskettiin arvona AL* esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Käsittelyn jälkeen väri 20 mitattiin kangasnäytteiden kummaltakin puolelta. Kukin arvo oli vähintään 12 mittauksen keskiarvo kangasnäytettä kohden. Kokeessa vältettiin mittauksia alueissa, joissa oli käsittelyn aikana muodostuneita, kankaan taittamisesta johtuvia taitosjälkiä (puuvillatahrat, tuote 116 ja tuote 112).
(M
o
Cvl ^ 25 Kuvioissa 9A-9H esitetyt tulokset osoittavat, että Malbranchea sulfurea ALK04122- o ,-jj proteaasi vaikuttaa paremmin ruohotahroihin (tuote 164, sarjanumero 23-03) ja erilaisiin
CM
x veri/maito/painomuste-tahroihin (tuote 117, sarjanro 11-08 ja 10-07, tuote 116, sarjanro cc 18-16) sekä 30 että 60 °C:ssa verrattuna kaupalliseen proteaasivalmisteeseen Savinase® o
Ultral6L. Tuotteen Savinase® Ultra 16L annostus 10-20 yksikköä pesulientä kohden
LO
^ 30 oli yhtä suuri kuin 0,4-0,7 % oleva entsyymivalmisteen annostus pesuaineen painoa o ^ kohden, mikä on pesuainessa käytettyjen entsyymien tyypillinen käyttötason vaihtelualue.
61
Samoin kaakaotahroilla saadut tulokset olivat paremmat Malbranchecr.n tapauksessa verrattuna tuotteeseen Savinase® Ultra 16L (tietoja ei ole esitetty). Ylimääräisissä Launder-kokeissa (tietoja ei ole esitetty) Malbranchea-proteaasi todettiin tehokkaaksi 30 °C:ssa myös seuraavien CFT-tahrojen tapauksessa (Center for Testmaterials BY, 5 Alankomaat: maapähkinäöljy, pigmentit, runsaasti maitoa (C-10), munankeltuainen, pigmentti vanhennettu (CS-38), ruohouute (CS-08)). Samaa kaupallista nestemäistä pesuainetta käytettiin kaikissa kokeissa. Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että Malbranchea-protcaasi tehoaa lukuisiin tahroihin 30-60 °C olevalla laajalla lämpötila-alueella.
10 ESIMERKKI 8.
Malbranchea ALK04122-proteaasilla oleva tahroja poistava suorituskyky yhdessä jauhemaisten pesuaineiden kanssa 15 Trichodermcr.ssa tuotetun Malbranchea ALK04122-proteaasin kyky poistaa veri/mai-to/painomuste-standarditahroja pesuaineen läsnä ollessa (5 g/1) testattiin 50 °C:ssa käyttäen samankaltaista koejärjestelmää kuin joka on kuvattu esimerkissä 7, paitsi että nyt käytettiin kaupallista perinteistä jauhemaista pesuainetta, joka sisälsi valkaisevia aineita, optisia kirkasteita ja fosfaatteja/fosfonaatteja sekä ECE-viitepesuainetta 77, joka 20 ei sisällä optista kirkastetta eikä valkaisevia aineita (tuote 601, EMPA). Samoin kangasnäytteiden väri mitattiin käsittelyn jälkeen Minolta CM 2500-spektrofotometrillä, käyttäen väriavaruuden L*a*b*-koordinaatteja, ja tahroja poistava vaikutus laskettiin arvona AL* esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.
C\J
δ
CM
^ 25 Tulokset (kuviot 10A and 10B) osoittavat, että Malbranchea ALK04122-proteaasia cp ^ voidaan käyttää myös yhdessä jauhemaisten pesuaineiden kanssa hyvin aikalisissä
(M
x olosuhteissa (pH noin 10-10,5).
tr
CL
§ ESIMERKKI 9.
LO
^ 30 Malbranchea ALK04122-proteaasin pysyvyys varastoitaessa o
CM
Trichoderma:ssa, 37 °C:ssa, tuotetun Malbranchea ALK04122-proteaasin säilytystä testattiin käyttäen valmisteen seuraavia koostumuksia: 1) 0,2 % (p/p) tuotetta Proxel LV
62 (säilöntäaine, Arch Biosides, U.K), pH asetettu arvoon 6, 2) 20 % propyleeniglykolia, pH asetettu arvoon 6, 3) 50 % propyleeniglykolia, pH asetettu arvoon 5,5. Näytteet pakattiin Sarstedtin koeputkiin (13 ml) ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa. Aktiivisuus mitattiin (esimerkissä 3 kuvatulla tavalla) tietyin aikavälein ja verrattiin aikaisempiin 5 tuloksiin, jotka oli saatu Aw.s'<zm//»-protcaasi 1 la Fe_RF6318 (W02010125174A1) samankaltaisissa olosuhteissa.
Kuviosta 11 nähdään, että Malbranchea ALK04122-proteaasin pysyvyys varastoitaessa on erinomainen korotetuissa lämpötiloissa (37 °C) verrattuna villityypin Fusarium-10 proteaasiin Fe_RF6318. Kun propyleeniglykolia käytettiin stabilointiin, Fusarium-proteaasin jäännösaktiivisuus oli noin 20 % 7 vuorokautta kestäneen inkuboinnin jälkeen, kun taas Malbranchea-protcaasi ei ollut menettänyt aktiivisuuttaan tässä ajassa.
ESIMERKKI 10.
15 Malbranchea ALK04122-proteaasin pysyvyys nestemäisissä pesuaineissa
Trichoderma:ssa, 37 °C:ssa, tuotetun Malbranchea ALK04122-proteaasin pysyvyys testattiin kaupallisessa nestemäisessä pesuaineessa (taulukko 3) ja viitepesuaineessa Ecolabel Reference Detergent, hellävarainen (Ch. Nr. 196-391, wfk Testgewebe 20 GmbH). Tuotetta Savinase® 16L ja Fusarium-proteaasia Fe_RF6318 (W02010125174A1) käytettiin viitteinä
Seuraavia testausjärjestelmiä käytettiin: 0,4 g entsyymivalmistetta ja 9,6 g
OJ
q pesuaineliuosta sekoitettiin hyvin Sarstedtin koeputkissa (13 ml). 0,2 % tuotetta Proxel
(M
^ 25 LV lisättiin säilöntäaineeksi pesuaineeseen ennen sen sekoitusta muihin cp komponentteihin. Kaupalliseen nestemäiseen detergnttiin valmistettujen näytteiden pH-
OJ
x arvo oli noin 8. Viitepesuaineeseen Ecolabel Reference Detergent valmistettujen cc näytteiden pH-arvo oli noin 7,2. Koeputkia inkuboitiin 37 °C:ssa ja proteaasin o oö aktiivisuus mitattiin tietyin aikavälein esimerkissä 3 kuvatulla menetelmällä, m ^ 30 o
Kuviosta 12 nähdään, että Malbranchea ALK04122:n pysyvyys on erittäin hyvä varastoitaessa sitä korotetuissa lämpötiloissa (37 °C), nestemäisissä pesuaineissa, verrattuna villityypin Fusarium-proteaasiin Fe_RF6318 (W02010125174A1).
63
Malbranchea-protcaasin pysyvyys oli samankaltainen kuin tuotteella Savinase® 16L viitepesuaineessa Ecolabel Reference Detergent.
Huoneen lämpötilassa todettiin erinomainen pysyvyys (tietoja ei ole esitetty).
5 c\j δ
(M
co o
(M
(M
X
en
CL
O
δ m δ
(M
64
VIITEJULKAISUT
Abu-Shady MR, El-Gindy AA, Saad RR, Ibrahim ZM. 2001. Production, Partial Purification and Some Properties of Thermostabile Alkaline Proteaasi from 5 Malbranchea sulfurea and its Compatibility with Commercial Detergents. Aff. J. Mycol. And Biotech. 9 (3) (17-26).
Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers and DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
AMFEP, 2009. Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme products, 10 List of enzymes at http://www.amfep.org/list.html (updated October 2009).
Anwar, A and M Saleemuddin. 1998. Alkaline proteaasis: A review. Bioresource Technology 64:175-183.
Bolton, ET and BJ McCarthy. 1962. A geeniral method for the isolation of RNA complementary to DNA. Proc. Nat. Acad. Sci.USA 48:1390-1397.
15 Chen, Y-J, and M Inouye, 2008. The intramolecular chaperone-mediated protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 18: 765-770.
Cherry, J. R., and Fidantsef, A. L. 2003. Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 438-443.
Gasteiger, E, A Gattiker, C Hoogland, I Ivanyi, RD Appel and A Bairoch. 2003.
20 Gaucher G M, Stevenson K J 2004. Thermomycolin. Handbook of Proteolytic Enzymes 2nd Ed. : 1834-1835
ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31:3784-3788.
Gupta, R, QK Beg, S Khan and B Chauhan. 2002. An overview on fermentation, o ^ 25 downstream processing and properties of microbial alkaline proteaasi. Appi. Microbiol.
° Biotechnol. 60: 381-395.
(M
Gurr, SJ, Uncles, SE, and Kinghom JR. 1987. The structure and organization of nuclear ^ geenit in filamentous fungi, pp 93-139. In (JR Kinghom, ed.) Geeni Structure in 2 Eukaryotic Microbes. IRL Press, Oxford.
^ 30 Joutsjoki, W, TK Torkkeli, and KMH Nevalainen. 1993. Transformation of o cm Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) geeni: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Geenit. 24:223-228.
65
Kalisz, HM. 1988. Microbial proteinases. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 36:1-65. Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen, and PL Suominen. 1993. High frequency one-step geeni replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Geenit. 241:515-522.
5 Kelly and Hynes 1985. Transformation of Aspergillus niger by the amdS geeni of Aspergillus nidulans. The EMBO Journal 4(2):475-479.
Laemmli, UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.
Malardier L, MJ Daboussi, J Julien, F Roussel, C Scazzocchio and Y Brygoo. 1989. 10 Cloning of the nitrate reductase geeni (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Geeni 78:147-156.
Maurer, K-H. 2004. Detergent proteaasis. Curr. Opin. Biotechnol. 15: 330-334.
Maurer, K-H, 2010.Enzymes, Detergent, pp. 1-17. In (MC Flickinger ed.) Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology, John 15 Wiley & Sons, Inc.
Nielsen H, J Engelbrecht, S Brunak and G von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10:1-6.
Nielsen H and A Krogh. 1998. Prediction of signal peptides and signal anchors by a 20 hidden Markov model. In: Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130.
Ong PH and Gaucher GM, 1975. Production, purification and characterization of thermomycolase, the extracellular serine proteaasi of the thermophilic fungus o ^ 25 Malbranchea pulchella var. sulfurea. Can. J. Microbiol. 22: 165-175.
^ Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen, and J Knowles. 1987. A versatile
CM
transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. ^ Geeni 61:155-164.
? Raeder U and P Broda. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett.
^ 30 Appi. Microbiol. 1:17-20.
° Rao, MB, AM Tanksale, MS Ghatge and VV Deshpande. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteaasis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:597-635.
66
Sambrook J and DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
Shimogaki, H, K Takenchi, T. Nishino, M. Ohdera, T. Kudo, K. Ohba, MV Iwama and M Irie. 1991. Purification and properties of a novel surface active agent and alkaline-5 resistant proteaasi from Bcillus sp. Y. Agric. Biol. Chem. 55:2251-2258.
c\j o
CM
00 o
CM
CM
X
X
CL
o
CO
in o
CM

Claims (29)

1. Seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja sillä on aminohapposekvenssi, jonka samanlaisuus 5 sekvenssin SEQ ID NO: 18 mukaisen aminohapposekvenssin kanssa on vähintään 66 %.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on aminohapposekvenssi, jonka samanlaisuus sekvenssin SEQ ID NO: 18 mukaisen aminohapposekvenssin kanssa on vähintään 85 %. 10
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on sekvenssinä SEQ ID NO: 18 esitetty aminohapposekvenssi.
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu 15 siitä, että mainittu entsyymi koostuu sekvenssinä SEQ ID NO: 18 esitetystä amino- happosekvensistä.
5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi saadaan talletetusta Malbranchea ALK04122-kannasta
20 CBS 128533 tai talletetusta Malbranchea ALK04178-kannasta CBS 128564.
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin kypsän muodon molekyylimassa on alueella 20-35 kDa, ^ edullisesti alueella 25-33 kDa ja erityisen edullisesti alueella 28-30 kDa. (M , 25 00 ^ 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu C\] siitä, että mainitun entsyymin lämpötilaoptimi 8,5 olevassa pH:ssa, käyttäen 30 te minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina, on alueella 30-80 °C, edullisesti o 2^ alueella 40-70 °C ja edullisemmin alueella 50-80 °C, kaikkein edullisimmin 70 °C. LO 30 o ^ 8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin pH-optimi 50 °C:n lämpötilassa, käyttäen 30 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina, on vähintään pH-alueella 6-10, edullisesti pH-alueella 9-10, kaikkein edullisimmin pH 10.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu 5 siitä, että mainittu entsyymi kykenee hajottamaan ja poistamaan proteiinia sisältäviä likoja pesuaineen läsnä ollessa alueella 0-90 °C, edullisesti alueella 5-60 °C, erityisen edullisesti alueella 10-40 °C olevassa lämpötilassa.
10. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, jossa on seriiniproteaasientsyymiä koodaava 10 polynukleotidisekvenssi, ja joka on valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: a) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaamalla polypeptidillä on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja sekvenssinä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi; b) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaamalla polypeptidillä on seriiniproteaasin aktiivisuutta ja joka polypeptidi on vähintään 66-prosenttisesti samanlainen kuin 15 sekvenssinä SEQ ID No: 18 esitetty aminohapposekvenssi; c) nukleiinihappomolekyylistä, jossa on sekvenssinä SEQ ID No: 17 esitetyn nukleotidisekvenssin mukainen koodaava sekvenssi; d) nukleiinihappomolekyylistä, jossa on DSM 24410-tallenteeseen sisällytetyn poly-nukleotidisekvenssin koodaava sekvenssi; 20 e) nukleiinihappomolekyylistä, jonka koodaava sekvenssi eroaa jommankumman kohdan (c)-(d) mukaisen nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneroitumisesta johtuen; sekä f) nukleiinihappomolekyylistä, jossa oleva polynukleotidisekvenssi hybridisoituu c\i 5 tarkoin rajatuissa olosuhteissa DSM 24426-tallenteeseen sisältyvään nukleiinihappo- <M ^ 25 molekyyliin tai sekvenssiin SEQ ID No: 17, ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on cp ^ seriiniproteaasin aktiivisuutta ja jolla on aminohapposekvenssi, joka on vähintään c\i χ 66-prosenttisesti samanlainen kuin sekvenssinä SEQ ID No: 18 esitetty aminohappo- CC sekvenssi. o n m ^ 30 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, o ^ että mainittu, polynukleotidisekvenssin sisältävä nukleiinihappomolekyyli hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK3092 ja jolla on nukleotidisekvenssi SEQ ID No:l 1 E. coli RF8758:ssa, joka on talletettu talletusnumerolla DSM 24426, tai se hybridisoituu tarkoin rajatuissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK3093 ja jolla on nukleotidisekvenssi SEQ ID No: 12, talletettuna E. coli RF8759:ssa talletusnumerolla DSM 24427. 5
12. Yhdistelmä-DNA-tekninen ilmentämisvektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukaisen nukleotidisekvenssin kytkettynä toiminnallisesti sääteleviin sekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan mainitun seriiniproteaasientsyymin ilmentymistä sopivassa isännässä. 10
13. Isäntäsolu, joka sisältää patenttivaatimuksen 12 mukaisen yhdistelmä-DNA-teknisen ilmentämisvektorin.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on 15 mikrobi-isäntä.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on rihmasieni.
16. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-15 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä kuuluu sukuun Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium, Myceliophthora ja Mortiriella.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on o
25 Trichoderma tai Aspergillus. o i C\l
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on x 1. reesei. o cö LO >- 30 19. Menetelmä polypeptidin, jolla on seriiniproteaasin aktiivisuutta, tuottamiseksi, o johon mainittuun menetelmään kuuluvissa vaiheissa viljellään minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-18 mukaista isäntäsolua ja polypeptidi otetaan talteen.
20. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä että seriiniproteaasientsyymillä on seriiniproteaasin aktiivisuutta, sitä koodaa patenttivaatimuksen 10 mukainen nukleiinihapposekvenssi ja se voidaan saada patenttivaatimuksen 19 mukaisella menetelmällä. 5
21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että polypeptidi otetaan talteen soluista tai supematantista.
22. Entsyymivalmiste, joka voidaan saada patenttivaatimuksen 21 mukaisella 10 menetelmällä.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu valmiste sisältää patenttivaatimuksen 10 mukaisen eristetyn nukleiinihappomolekyylin koodaaman seriiniproteaasientsyymin lisäksi muita entsyymejä, jotka on valittu 15 ryhmästä, joka koostuu proteaaseista, amylaaseista, sellulaaseista, lipaaseista, ksylanaaseista, mannaaseista, kutinaaseista, pektinaaseista ja oksidaaseista yhdessä välittäjän kanssa tai ilman sitä.
24. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 22-23 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu 20 siitä, että mainittu valmiste sisältää yhtä tai useampaa lisäainetta, jo(t)ka on valittu ryhmästä, joka koostuu stabilisaattoreista, puskureista, pinta-aktiivisista aineista, runko-aineista, valkaisuaineista, välittäjistä, korroosiota estävistä aineista, lian uudelleenkiinnittymistä toruvista aineista, emäksisistä aineista, hankausaineista, ^ optisista kirkasteista, väriaineista, hajusteista, pigmenteistä ja säilöntäaineista. CVJ 25 oo o ^ 25. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 22-24 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu oj siitä, että mainittu entsyymivalmiste on nesteenä, jauheena, rakeina tai tabletteina, cc CL o ^ 26. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-9 mukaisen seriiniproteaasientsyymin tai LO ^ 30 minkä tahansa patenttivaatimuksen 22-25 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö δ ^ pesuaineissa, kuitujen käsittelyyn, edullisesti villan, hiusten/karvojen, nahan ja silkin joukosta valittujen proteiinipitoisten materiaalien käsittelyyn, elintarvikkeiden ja eläinravinnon käsittelyyn tai mihin tahansa muihin sellaisiin sovelluksiin, joihin liittyy proteiinipitoisen materiaalin muokkausta, hajotusta tai poistoa.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen käyttö, tunnettu siitä että käyttö on pesuaineen 5 lisäaineena edullisesti nestemäisissä pesuaineissa, jauhemaisissa pesuaineissa tai pesuainetableteissa.
28. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että mainittu koostumus sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-9 mukaista scri iniprotcaasientsyym in tai minkä tahansa patentti- 10 vaatimuksen 22-25 mukaista entsyymi valmistetta sekä lisäaineita, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu stabilisaattoreista, puskureista, pinta-aktiivisista aineista, runko-aineista, valkaisuaineista, välittäjistä, korroosiota estävistä aineista, lian uudelleenkiin-nittymistä torjuvista aineista, emäksisistä aineista, hankausaineista, optisista kirkasteista, väriaineista, hajusteista, pigmenteistä ja säilöntäaineista. 15
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että mainittu koostumus sisältää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu proteaaseista, amylaaseista, sellulaaseista, lipaaseista, ksylanaaseista, mannaaseista, kutinaaseista, pektinaaseista ja oksidaaseista yhdessä välittäjän kanssa tai ilman sitä. C\J δ CM cb o CM CM X cc CL o cö LO δ CM
FI20115310A 2011-03-31 2011-03-31 Proteaasientsyymi ja sen käytöt FI123425B (fi)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20115310A FI123425B (fi) 2011-03-31 2011-03-31 Proteaasientsyymi ja sen käytöt
US13/433,984 US9404164B2 (en) 2011-03-31 2012-03-29 Protease enzyme and uses thereof
JP2014501649A JP2014511681A (ja) 2011-03-31 2012-03-30 プロテアーゼ酵素およびその使用
EP12722084.6A EP2691520B1 (en) 2011-03-31 2012-03-30 Protease enzyme and uses thereof
DK12722084.6T DK2691520T3 (en) 2011-03-31 2012-03-30 Protease enzyme and uses thereof
PCT/EP2012/055762 WO2012131023A2 (en) 2011-03-31 2012-03-30 Protease enzyme and uses thereof
ES12722084.6T ES2585652T3 (es) 2011-03-31 2012-03-30 Enzima proteasa y usos de la misma
KR1020137029011A KR102010747B1 (ko) 2011-03-31 2012-03-30 프로테아제 효소 및 이의 용도
CN201280026496.9A CN103890172B (zh) 2011-03-31 2012-03-30 蛋白酶及其应用
RU2013146665A RU2611043C2 (ru) 2011-03-31 2012-03-30 Фермент протеаза и его применения
BR112013025238A BR112013025238A2 (pt) 2011-03-31 2012-03-30 enzima serina protease, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, processos para produzir um polipeptídeo com atividade serina protease, e para obter uma preparação enzimática, polipeptídeo com atividade serina protease, preparação enzimática, uso de enzima serina protease, e, composição de detergente
US15/196,716 US10221377B2 (en) 2011-03-31 2016-06-29 Protease enzyme and uses thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20115310A FI123425B (fi) 2011-03-31 2011-03-31 Proteaasientsyymi ja sen käytöt
FI20115310 2011-03-31

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI20115310A0 FI20115310A0 (fi) 2011-03-31
FI20115310L FI20115310L (fi) 2012-10-01
FI20115310A FI20115310A (fi) 2012-10-01
FI123425B true FI123425B (fi) 2013-04-30

Family

ID=43806518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20115310A FI123425B (fi) 2011-03-31 2011-03-31 Proteaasientsyymi ja sen käytöt

Country Status (11)

Country Link
US (2) US9404164B2 (fi)
EP (1) EP2691520B1 (fi)
JP (1) JP2014511681A (fi)
KR (1) KR102010747B1 (fi)
CN (1) CN103890172B (fi)
BR (1) BR112013025238A2 (fi)
DK (1) DK2691520T3 (fi)
ES (1) ES2585652T3 (fi)
FI (1) FI123425B (fi)
RU (1) RU2611043C2 (fi)
WO (1) WO2012131023A2 (fi)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2712915A1 (en) * 2012-10-01 2014-04-02 The Procter and Gamble Company Methods of treating a surface and compositions for use therein
WO2015158719A1 (en) * 2014-04-15 2015-10-22 Aalborg Universitet Composition and method for degradation of keratinaceous materials
CN110997117B (zh) 2017-06-30 2023-08-01 戴弗西公司 膜清洁溶液和使用其加速膜清洁的方法
GB2569611B (en) * 2017-12-21 2020-02-19 Cordina Ltd Improvements in hair-curling devices
WO2020043458A1 (de) * 2018-08-27 2020-03-05 Basf Se Die primärwaschkraft verbessernde polymere wirkstoffe
EP3636735B1 (en) * 2018-10-12 2024-03-27 AB Enzymes Oy Protease enzyme variants and uses thereof

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3652399A (en) 1969-04-30 1972-03-28 Takeda Chemical Industries Ltd Alkali protease
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
DK563986A (da) 1986-11-25 1988-06-17 Novo Industri As Fremstilling af en lav-temperatur-aktiv protease
DK564086A (da) 1986-11-25 1988-06-17 Novo Industri As Enzymatisk detergent-additiv
AU617996B2 (en) 1987-04-03 1991-12-12 Amgen, Inc. Novel proteolytic enzymes
DK571587D0 (da) 1987-11-02 1987-11-02 Novo Industri As Enzymatisk detergentsammensaetning
US5288627A (en) 1988-01-07 1994-02-22 Novo Nordisk A/S Endoprotease from Fusarium oxysporumDSM 2672 for use in detergents
JP2624859B2 (ja) 1988-01-07 1997-06-25 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素洗剤
JPH0241398A (ja) 1988-07-20 1990-02-09 Novo Ind As 安定化酵素液体洗剤組成物
US5089163A (en) * 1989-01-30 1992-02-18 Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. Enzymatic liquid detergent composition
DK316989D0 (da) 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
DK204290D0 (da) 1990-08-24 1990-08-24 Novo Nordisk As Enzymatisk detergentkomposition og fremgangsmaade til enzymstabilisering
DK223790D0 (da) 1990-09-18 1990-09-18 Novo Nordisk As Proteaseholdig detergentkomposition
DK73791D0 (da) 1991-04-22 1991-04-22 Novo Nordisk As Detergentadditiv
CA2069147A1 (en) 1991-05-22 1992-11-23 Kazuaki Kitano Dna and its use
US5962765A (en) 1991-08-08 1999-10-05 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Molecular cloning of a complimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi
DK52393D0 (fi) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
EP0699227A4 (en) * 1994-03-21 1999-04-14 Johnson & Son Inc S C STABLE ENZYMETIC AQUEOUS LAUNDRY TREATMENT AGENT
EP0763115B1 (en) 1994-06-03 2000-09-06 Novo Nordisk Biotech, Inc. Purified scytalidium laccases and nucleic acids encoding same
US5770418A (en) 1994-06-24 1998-06-23 Novo Nordisk A/S Purified polyporus laccases and nucleic acids encoding same
IL116275A0 (en) 1994-12-08 1996-03-31 Invest Y De Estudios Avanzados Methods for obtaining strains of trichoderma spp. and strains obtained thereby
US6682924B1 (en) 1995-05-05 2004-01-27 Novozymes A/S Protease variants and compositions
AU695776B2 (en) 1995-07-12 1998-08-20 Novozymes A/S Cleaning-in-place with a solution containing a protease and a lipase
US6008029A (en) 1995-08-25 1999-12-28 Novo Nordisk Biotech Inc. Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same
CA2239576A1 (en) 1996-01-29 1997-08-07 Novo Nordisk A/S Process for removal or bleaching of soiling or stains from cellulosic fabric
CA2270180C (en) 1996-11-04 2011-01-11 Novo Nordisk A/S Subtilase variants and compositions
CA2301851C (en) 1997-08-29 2012-08-07 Novo Nordisk A/S Protease variants and compositions
RU2252958C2 (ru) * 1997-10-23 2005-05-27 Джененкор Интернэшнл, Инк. Вариант субтилизина (варианты), кодирующая его днк, экспрессирующий вектор, очищающая композиция, корм для животных, композиция для обработки ткани
WO1999064555A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-16 The Procter & Gamble Company Granular, powder, and tablet detergent compositions containing gasified particulate matter
ES2237159T3 (es) 1998-10-06 2005-07-16 Mark Aaron Emalfarb Sistema de transformacion en el campo de los hongos micoticos filamentosos en chrysosporium.
ES2329874T3 (es) 2000-07-22 2009-12-02 Genencor International, Inc. Estabilizacion de enzimas.
ES2171136B1 (es) 2000-12-01 2003-10-16 Newbiotechnic Sa Enzima con actividad proteolitica construccion de adn que comprende una secuencia de adn que codifica dicha enzima y sus aplicaciones.
FR2852949B1 (fr) 2003-03-28 2008-08-29 Biovitis Procede de reduction de la matiere organique contenue dans des effluents agroalimentaires et industriels comportant une phase de biodigestion par des champignons filamenteux
CN1187443C (zh) * 2003-05-21 2005-02-02 云南大学 真菌碱性丝氨酸蛋白酶及其制备方法和应用
US7985569B2 (en) * 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
CA2593080C (en) 2004-12-30 2014-03-18 Genencor International, Inc. Acid fungal proteases
US20090155239A1 (en) 2005-03-22 2009-06-18 Sodx Co., Ltd. Novel Protease, Microorganism Producing the Same, and Application Thereof
ATE514770T1 (de) * 2005-10-17 2011-07-15 Novozymes As Verwendung von pilzmutanten zur expression von antikörpern
MX2008015590A (es) 2006-06-05 2008-12-18 Procter & Gamble Estabilizacion de enzima.
ES2372709T3 (es) 2006-07-05 2012-01-25 Catalyst Biosciences, Inc. Procedimientos de cribado de proteasas y proteasas identificadas por los mismos.
CN101646760B (zh) 2007-03-27 2014-11-26 诺维信公司 稳定的酶溶液和制造方法
KR101271731B1 (ko) 2007-10-15 2013-06-04 삼성테크윈 주식회사 감시카메라 및 그의 촬영방법
MX2010007811A (es) 2008-01-29 2011-06-16 Danisco Inc Expresion de proteinas inhibidoras de subtilisina de streptomyces (ssi) en bacillus y streptomyces sp.
WO2010039840A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Novozymes, Inc. Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of fusarium venenatum
CN101487002A (zh) * 2009-03-02 2009-07-22 华南理工大学 碱性蛋白酶
FI121711B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö
FI121712B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121851B (fi) 2009-07-08 2011-05-13 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI123942B (fi) 2010-10-29 2013-12-31 Ab Enzymes Oy Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja

Also Published As

Publication number Publication date
US10221377B2 (en) 2019-03-05
FI20115310L (fi) 2012-10-01
CN103890172A (zh) 2014-06-25
US20160376530A1 (en) 2016-12-29
WO2012131023A3 (en) 2012-11-22
KR20140032396A (ko) 2014-03-14
RU2013146665A (ru) 2015-05-20
WO2012131023A2 (en) 2012-10-04
DK2691520T3 (en) 2016-08-22
EP2691520B1 (en) 2016-05-18
FI20115310A0 (fi) 2011-03-31
FI20115310A (fi) 2012-10-01
US20120252064A1 (en) 2012-10-04
JP2014511681A (ja) 2014-05-19
KR102010747B1 (ko) 2019-08-14
ES2585652T3 (es) 2016-10-07
US9404164B2 (en) 2016-08-02
EP2691520A2 (en) 2014-02-05
RU2611043C2 (ru) 2017-02-20
CN103890172B (zh) 2015-11-25
BR112013025238A2 (pt) 2018-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2451829B1 (en) A fungal protease and use thereof
EP2424993B1 (en) A fungal serine protease and use thereof
US8937170B2 (en) Nucleic acids encoding fungal protease
US10221377B2 (en) Protease enzyme and uses thereof
EP2633041B1 (en) Variants of fungal serine protease

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 123425

Country of ref document: FI

Kind code of ref document: B