CN103890172B - 蛋白酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种真菌丝氨酸蛋白酶，所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性并具有在SEQ？ID？No:18中定义的畸枝霉属ALKO4122成熟蛋白酶的氨基酸序列或与SEQ？ID？No:18的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。一种分离的核酸分子也被公开，其包含编码真菌丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列、编码所述蛋白酶的核酸序列、宿主细胞以及生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法。所述蛋白酶作为酶制剂可在去垢剂组合物中和在处理纤维、毛、发、皮革或丝、对于处理食品或饲料，或者在任何涉及蛋白质材料的修饰、降解或去除中使用。
Description
技术领域
本发明涉及丝氨酸蛋白酶，尤其是可在多种应用、特别是在去垢剂中使用的真菌丝氨酸蛋白酶。本发明涉及编码所述酶的核酸分子、重组载体、生产所述酶的宿主细胞、包含所述酶的酶组合物，以及制备该组合物的方法。本发明还涉及所述酶的多种应用和包含所述酶的组合物。
背景技术
微生物蛋白酶是最重要的水解酶之一，并在例如去垢剂、食品、皮革、制药、诊断、废物管理和银回收等多项工业领域中取得应用。微生物细胞外蛋白酶占据世界范围内工业用酶销量的主要部分（Cherry和Fidantsef，2003）。大约90%的市售的蛋白酶是去垢剂酶（Gupta等人，2002）。目前使用的市售去垢剂制剂包含自然形成的枯草杆菌蛋白酶家族的碱性丝氨酸蛋白酶（EC3.4.21）或者来源自芽孢杆菌种的枯草杆菌蛋白酶（EC3.4.21.62），或者是其重组蛋白酶的制剂（Maurer，2004）。
商业化蛋白酶的例子有SubtilisinCarlsbergSubtilisin309Subtilisin147和冷洗蛋白酶(丹麦NovozymesA/S)、Ox、Prime和(美国Genencor国际公司)，以及BLAPS和Xseries（德国Henkel）。
几种碱性丝氨酸蛋白酶和编码这些酶的基因也已经从包括酵母和丝状真菌的真核生物中被分离出来。美国专利No.3652399和EP519229（日本TakedaChemicalIndustries有限公司）公开了一种碱性蛋白酶，它来源于镰孢菌属（无性生殖状态，有性型）或者赤霉菌属（有性生殖状态，无性型），尤其是来源于可在去垢剂和其他清洁剂组分的配方中使用的镰孢菌属sp.S-19-5（ATCC20192，IFO8884）、尖孢镰刀菌胡麻专化型（IFO5880）或者小麦赤霉菌（ATCC20193，IFO6608)。WO1994025583（丹麦NovoNordiskA/S）公开了源自于镰孢菌属、尤其是一株尖孢镰刀菌菌株（DSM2672）的活性类胰蛋白酶，以及编码它的DNA序列。来源于木贼镰孢菌和锐顶镰刀菌的丝氨酸蛋白酶的氨基酸及核苷酸序列已经分别公布于WO2010125174和WO2010125175（芬兰ABEnzymesOy)。并且，来源于如麦轴梗霉属和耳霉属等真菌种的碱性蛋白酶已经被报道过（摘要见Anwar和Saleemuddin1988）。
在液态去垢剂中使用蛋白酶的主要问题是它们的不稳定性。在液态去垢剂中，酶与水以及如阴离子表面活性剂和络合剂的离散剂直接接触，这会导致不可逆变性。蛋白酶降解包括去垢剂配方中的其他酶和其自身的蛋白质。自身蛋白质水解通过表面活性剂和高温得到加强。因此，包含蛋白酶的液态去垢剂的稳定性代表着产品研发中一个主要的挑战（Maurer，2010）。
为了改进工业用丝氨酸蛋白酶的稳定性，已经使用了多种方法。WO92/03529（丹麦NovoNordiskA/S）、US2009/096916（美国Genencor国际公司）和WO2007/145963（美国Procter&Gamble公司）公开了一种可逆的肽或蛋白型的蛋白酶抑制剂的使用。包含蛋白酶的液态去垢剂组分通常包括蛋白酶抑制剂，如含有或不含多元醇的硼酸，以抑制蛋白酶的活性。此类抑制剂的一个例子是公开于US2010/0120649（丹麦NovozymesA/S）的4-甲酰苯基硼酸（4-FPBA）。蛋白酶的稳定性还通过联合使用卤盐与多元醇得到改进（WO02/08398,美国Genencor国际公司）。EP0352244A2（丹麦NovoNordiskA/S)建议通过使用两性化合物、例如表面活性剂来改进源自于芽孢杆菌的酶的稳定性。
基于由晶体结构和同源蛋白之间的序列相似性比较所得到的信息，可以设计出具有改良的稳定性和/或改良的性能的蛋白质变体。通过定点和/或随机突变，已经研发出具有改良的催化效率和/或针对温度、氧化剂和不同洗涤条件具有更好的稳定性以及具有改进的液态去垢剂储藏稳定性的天然丝氨酸蛋白酶的变体。
作为细胞外碱性内肽酶被分离出来的嗜热霉菌素EC3.4.21.65是由嗜热真菌马拉分支霉产生的。嗜热霉菌素被描述为一段含325个氨基酸残基的单链蛋白质。它有活性位点序列为-亮氨酸-丝氨酸-（甘氨酸）-苏氨酸-丝氨酸*-甲硫氨酸-，其是典型的枯草杆菌蛋白酶家族成员的序列。嗜热霉菌素拥有一个特殊的二硫键。嗜热霉菌素并不像嗜热细菌的细胞外丝氨酸蛋白酶一样热稳定，但是它比大多数真菌的蛋白酶更加稳定（Gaucher和Stevenson，2004）。根据Ong和Gaucher（1975），嗜热霉菌素的热失活发生在73℃且存在于10mMCa2+的条件下。嗜热霉菌素在广泛的pH值范围中水解酪蛋白。水解酪蛋白的最佳pH值大约是8.5。
Abu-Shady等人（2001）公开了来自于马拉分支霉的蛋白酶的性状，它是从取自埃及屠宰场的土壤样本中就地分离，加以培养以取得蛋白酶。这篇公开文献描述了马拉分支霉蛋白酶在特定去垢剂的存在下在低浓度（0.7%）、30-90℃下使用15-60分钟预孵育时间（即在类似于洗涤的条件下）的相对活性。然而，它并没有给出任何关于此蛋白酶在去垢剂本身中的去污性能或者储藏稳定性的说明，而这些对于蛋白酶在去垢剂配方中的使用的适宜性来说是关键的性质。该公开文献还描述了部分纯化过的蛋白酶的温度和pH曲线。蛋白酶的最适温度是50℃，最适pH值是9.0。
尽管已经发表了大量的专利公开文本、综述和文章，它们公开了源自多种微生物的真菌丝氨酸蛋白酶，例如源自于放射菌类（Nocardiopsisdassonvillei）和真菌（Paecilomycesmarquandii）微生物的低温碱性蛋白酶，例如见EP0290567和EP0290569（丹麦NovoNordiskA/S），然而仍然非常需要新型的蛋白酶，其适于尤其是在低温或中等温度的范围内有效地修饰、降解和去除不同污垢的蛋白质材料，并且在具有高度变化性质的去垢剂存在时是稳定的。由于丝氨酸蛋白酶的自催化性质，储藏过程中的稳定性也十分重要。
同样希望的是，通过从发酵液和菌丝体中简单分离而能够大量地生产丝氨酸蛋白酶，并能够经济上合算地向下游加工。
发明内容
本发明的目的是提供源自酵母的、在广泛的pH值范围内具有活性、在低温和中温下作用得尤其好的丝氨酸蛋白酶。应用于去垢剂的丝氨酸蛋白酶还必须在去垢剂存在时稳定，并能和去垢剂兼容。尤其是，本发明的目的是提供能够在比商业用酶制剂更低的温度下去除包括洗衣服和洗盘子的污垢在内的蛋白质材料的丝氨酸蛋白酶，由此例如能清洗更敏感的材料，并能节省能源。本发明的另一目的是提供编码所述酶的核酸分子、重组载体、生产所述酶的宿主细胞、包含所述酶的组合物、用于制备该组合物的方法，以及所述酶和包含所述酶的组合物的使用。
根据本发明的真菌的丝氨酸蛋白酶可以在高产的真菌宿主中生产，并且其下游加工、例如分离发酵液和菌丝体易于执行。
本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，它具有丝氨酸蛋白酶活性，并包含与如SEQIDNo:18所定义的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。一种优选的丝氨酸蛋白酶源自于樟绒枝霉（Libert）OorschotdeHoog。
在本文中，“源自于”不仅意欲用于表示已被或者能被所讨论的一株生物体来生产，还表示通过从这样的菌株中分离得来的DNA序列编码并在转化了所述DNA序列的宿主生物体中生产的丝氨酸蛋白酶。最后，这个术语意欲用于表示被合成的和/或来源于cDNA的DNA序列所编码的并且具有所讨论的丝氨酸蛋白酶的识别特征的丝氨酸蛋白酶。
本发明优选地涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性，并包括与如SEQIDNo:18定义的成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶具有至少66%的一致性的氨基酸序列，或者包括如SEQIDNO:18定义的成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列。
本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可由畸枝霉属得到，优选是由樟绒枝霉（Libert）OorschotdeHoog（马拉分支霉（Miehe）的同义词，Cooney&R.Emers.）得到。根据该特别优选的实施方式，本发明的丝氨酸蛋白酶可以从保存于登记号CBS128533的畸枝霉属ALKO4122菌株或者从保存于登记号CBS128564的畸枝霉属ALKO4178菌株得到。畸枝霉属ALKO4178的蛋白酶本质上与畸枝霉属ALKO4122菌株的蛋白酶相同。
真菌丝氨酸蛋白酶的分子质量介于20到35kDa之间。在pH8.5的条件下，酶的最适温度在30℃到80℃的范围内，最好是70℃左右。在50℃的条件下，酶的最适pH值在从至少pH6到pH10的范围内，最好是pH10。温度和pH特性通过以酪蛋白为底物、30分钟的反应时间确立。
本发明的真菌丝氨酸蛋白酶能够在去垢剂存在时在0℃到90℃的温度下、优选在5℃到60℃的温度下、尤其优选在10℃到40℃的温度下降解和去除蛋白质污垢。
本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由一段分离的多核苷酸序列编码，该序列在严格条件下与包含于拥有核苷酸序列SEQIDNo:11的质粒pALK3092（保存于登记号为DSM24426的大肠杆菌RF8758中）的多核苷酸序列，或者成为编码成熟ALKO4122蛋白酶SEQIDNo:17的序列杂交。或者，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由一段分离的多核苷酸序列编码，该序列在严格条件下能与包含于拥有核苷酸序列SEQIDNo:12的质粒pALK3093（保存于登记号为DSM24427的大肠杆菌RF8759中）的多核苷酸序列杂交。
所述酶由一段分离的多核苷酸序列编码，该序列编码含有如SEQIDNo:18所定义的成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列或与如SEQIDNo:18所定义的成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列的多肽。所述酶优选地由含有核苷酸序列SEQIDNo:17的分离的核酸分子编码。
本发明的全长真菌丝氨酸蛋白酶由含有保存于登记号为DSM24410的大肠杆菌RF8791的质粒pALK3094的多核苷酸序列编码。
真菌丝氨酸蛋白酶由重组表达载体生产，该载体含有编码本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的核酸分子，可操作于连接到能够在适宜宿主中指导丝氨酸蛋白酶表达的常规序列上。适宜宿主包括异源宿主，优选是木霉菌属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、链孢霉属、根霉属菌、青霉菌属、毁丝霉属和被抱霉属的微生物宿主。
所述酶优选由木霉菌属或曲霉属真菌生产，最好是在里氏木霉中生产。
本发明还涉及包含编码丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分离的核酸分子，其选自：
（a）一种编码多肽的核酸分子，该多肽具有丝氨酸蛋白酶活性，并含有如SEQIDNo:18所述的氨基酸序列；
（b）一种编码多肽的核酸分子，该多肽具有丝氨酸蛋白酶活性，并与SEQIDNo:18的氨基酸序列具有至少66%的一致性。
（c）一种核酸分子，其具有如SEQIDNo:17所述的核苷酸序列的编码序列。
（d）一种核酸分子，其具有包含于DSM24410中的多核苷酸序列的编码序列。
（e）一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的简并性而与从（c）到（d）的任一核酸分子的编码序列不同；并且
（f）一种核酸分子，其在严格条件下与包含于DSM24426或者SEQIDNo:17的核酸分子杂交，后者编码具有丝氨酸蛋白酶活性并且与如SEQIDNo:18所示的氨基酸序列有至少66%的一致性的氨基酸序列的多肽。
本发明进一步涉及一种重组表达载体，其含有可操作地连接到能够在适宜宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶基因的表达的常规序列上的本发明的核苷酸序列。适宜宿主包括异源宿主，优选是木霉菌属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、链孢霉属、根霉属菌、青霉菌属、毁丝霉属和被抱霉属的微生物宿主。所述酶优选由木霉菌属或曲霉属真菌生产，最好是在里氏木霉中生产。
本发明还涉及包含如上所述的重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞优选是微生物宿主，例如丝状真菌。优选的宿主有木霉菌属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、链孢霉属、根霉属菌、青霉菌属、毁丝霉属和被抱霉属的微生物。更加优选的宿主是木霉菌属或曲霉属真菌微生物，最优选的是丝状真菌里氏木霉。
本发明涉及生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞的步骤和回收多肽的步骤。本发明还包括一种多肽，其具有由本发明的核酸序列编码的丝氨酸蛋白酶活性，并能从上述方法获得。
本发明涉及一种用于获取酶制剂的方法，其包括步骤：培养本发明的宿主细胞，要么从细胞中回收多肽要么从培养基中分离细胞并获取上清液。本发明还包括一种能由上述方法获得的酶制剂。
本发明涉及一种包含本发明的丝氨酸蛋白酶的酶制剂。
本发明进一步涉及一种包含本发明的丝氨酸蛋白酶的组合物。
包含本发明的丝氨酸蛋白酶的酶制剂或组合物（如去垢剂配方）进一步含有选自于由含有或不含介体的蛋白酶（除本发明外的其他蛋白酶）、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶和氧化酶所组成的组中的其他酶，以及选自于由稳定剂、缓冲液、表面活性剂、漂白剂、介体、防蚀剂、增洁剂、抗再沉积剂、光亮剂、染料、色素、香料、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂等所组成的组中的适宜添加剂。
生产宿主的用过的培养基同样可以使用，或者可以除去宿主细胞，和/或可使其集中、过滤或分离。还可以对其进行干燥。包含本发明的丝氨酸蛋白酶的酶制剂和组合物可以是液体、粉末、颗粒或者药片的形式。酶可以在制剂或组合物中呈固定化的形态。
本发明还包括本发明的丝氨酸蛋白酶或酶制剂在去垢剂、处理纤维、处理蛋白质材料（如毛、发、皮革、丝）、处理食物或饲料，或者任何涉及蛋白质材料的修饰、降解或移除方面的应用。酶或酶制剂尤其可作为去垢剂添加剂在去垢液、去垢粉和去垢片中使用。
附图说明
图1（1A和1B）显示了畸枝霉属ALKO4122的蛋白酶基因的核苷酸序列，其编码的蛋白酶的部分启动子（从ATG上游50个核苷酸）和终止子序列（从终止密码子下游60个核苷酸）以及推导的氨基酸序列。经SignalPV3.0程序分析而推断的信号肽用小写字母表示，并加有下划线。前端序列及由前端序列推导的氨基酸用小写字母表示。成熟的核苷酸和肽序列用大写字母表示。三个推断的内含子序列用小写斜体字母表示，并在核苷酸序列下用虚线标记。终止密码子用序列下方的星号表示。用于畸枝霉属ALKO4178蛋白酶基因PCR（聚合酶链式反应）克隆的引物DET27（5’-上游引物，s）和DET28（3’-下游引物，as）的位置用双下划线标注。
图1A显示了畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因及其部分启动子的核苷酸序列。蛋白酶基因序列包括从51到960的核苷酸，即编码从Met1到Val279的氨基酸序列的序列区域，以及蛋白酶的Ala280的第一个密码子。
图1B显示了畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因及其部分启动子的核苷酸序列。蛋白酶基因序列包括从961到1486（包括TAA终止密码子）的核苷酸，即编码蛋白酶的从Ala280（最后两个密码子）到Arg401的氨基酸序列的序列区域。
图2示意性地显示了用作构建pALK3097表达框的骨架的质粒pALK2777的质粒图。畸枝霉属蛋白酶基因连接到cbh1（cel7A）启动子（通过SacII位点精确融合）和终止子序列（通过连接序列中的BamHI位点）之间，使之成为SacII-BamHI剪切过的pALK2777。更多细节请参见例2。质粒pALK2777包含用于转化子筛选的一段合成的amdS标记基因。pcbh1表示cbh1启动子；tcbh1表示cbh1终止子；s_amdS表示合成的amdS标记基因（cDNA）；Linker表示包括如BamHI位点的连接序列。
图3示意性地显示了pALK3097表达框，其从载体骨架上通过NotI酶解得到，用于在里氏木霉中表达畸枝霉属ALKO4122的蛋白酶基因。pcbh1表示cbh1启动子；tcbh1表示cbh1终止子；s_amdS表示合成的amdS标记基因（cDNA）；linker表示连接序列。
图4显示了在12%SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）胶上分析的部分纯化的重组蛋白。条带1:部分纯化的畸枝霉属蛋白酶的样品；条带2:MW（分子量）标记（聚丙烯酰胺凝胶电泳标尺未染色的蛋白质梯（PageRulerUnstainedProteinLadder)，Fermentas）。
图5（5A和5B）显示了在不同温度和pH值条件下酶的相对活性。
图5A描述了重组畸枝霉属蛋白酶和的温度曲线，其是在pH8.5的条件下用30分钟的反应时间以酪蛋白为底物而测定的。数据点是三次独立测量结果的平均值。
图5B描述了pH值对重组畸枝霉属蛋白酶和的活性的影响。所用的缓冲液是40mMBritton-Robinson缓冲液，使用了酪蛋白作为底物，反应时间是30分钟，反应温度是50℃。数据点是三次独立测量结果的平均值。
图6（6A，6B，6C和6D）描述了在10-50℃，pH8左右，在浓度为5g/l的市售液态去垢剂存在下60分钟时，重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶对于血液/奶/墨水污垢的去污性能（Art.117，CO+PES，系列序号11-08，新批次，EMPA）。市售的蛋白酶制剂和Ultra16L被用于比较。
图6A描述了在10℃条件下的去污性能。
图6B描述了在20℃条件下的去污性能。
图6C描述了在30℃条件下的去污性能。
图6D描述了在50℃条件下的去污性能。
图7（7A，7B，7C和7D）描述了在10-50℃，pH8左右，在浓度为5g/l的市售液态去垢剂存在下60分钟时，重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶对于血液/奶/墨水污垢的去污性能（Art.117，CO+PES，系列序号11-07，旧批次，EMPA）。Ultra16L被用于比较。
图7A描述了在10℃条件下的去污性能。
图7B描述了在20℃条件下的去污性能。
图7C描述了在30℃条件下的去污性能。
图7D描述了在50℃条件下的去污性能。
图8（8A，8B，8C和8D）描述了在10-50℃，pH8左右，在浓度为5g/l的市售液态去垢剂存在下60分钟时，重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶对于血液/奶/墨水污垢的去污性能（Art.117，CO+PES，系列序号11-08，新批次，EMPA）。和Ultra16L被用于比较。
图8A描述了在10℃条件下的去污性能（酶用量计为蛋白质）。
图8B描述了在20℃条件下的去污性能（酶用量计为蛋白质）。
图8C描述了在30℃条件下的去污性能（酶用量计为蛋白质）。
图8D描述了在50℃条件下的去污性能（酶用量计为蛋白质）。
图9（9A，9B，9C，9D，9E，9F，9G和9H）显示了在30℃和60℃，pH8左右，在浓度为5g/l的市售液态去垢剂存在下60分钟时，重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在清洗检验法测试(LaunderOmetertest)下对不同污垢的性能。Ultra16L被用于比较。
图9A显示了在30℃条件下对草、棉花的性能，Art.164（系列序号23-03），EMPA。
图9B显示了在60℃条件下对草、棉花的性能，Art.164（系列序号23-03），EMPA。
图9C显示了在30℃条件下对血液/奶/墨水、棉花的性能，Art.116（系列序号18-16），EMPA。
图9D显示了在60℃条件下对血液/奶/墨水、棉花的性能，Art.116（系列序号18-16），EMPA。
图9E显示了在30℃条件下对血液/奶/墨水、CO+PES的性能，Art.117（系列序号11-08，新批次），EMPA。
图9F显示了在60℃条件下对血液/奶/墨水、CO+PES的性能，Art.117（系列序号11-08，新批次），EMPA。
图9G显示了在30℃条件下对血液/奶/墨水、CO+PES的性能，Art.117（系列序号10-07，旧批次），EMPA。
图9H显示了在60℃条件下对血液/奶/墨水、CO+PES的性能，Art.117（系列序号10-07，旧批次），EMPA。
图10（10A和10B）显示了去垢剂粉存在下蛋白酶的性能。
图10A描述了在50℃、60分钟、pH值约为10.5、5g/l市售传统去垢粉（如例8所述）存在的条件下，重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶对血液/奶/墨水、CO+PES、Art.117（系列序号11-08）、EMPA的性能。Ultra16L被用于比较。
图10B描述了在50℃、60分钟、pH值约为10、5g/l去垢粉Art.601,EMPA存在的条件下，重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶对血液/奶/墨水、CO+PES、Art.117（系列序号11-08）、EMPA的性能。Ultra16L被用于比较。
图11（11A和11B）显示了蛋白酶储藏于37℃时的稳定性。
图11A显示了当用ProxelLV或丙二醇（PG）保藏/稳定时，重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶储藏于37℃时的稳定性。
图11B显示了当用ProxelLV或丙二醇（PG）保藏/稳定时，重组蛋白酶Fe_RF6318（见WO2010125174Al）储藏于37℃时的稳定性。
图12（12A和12B）显示了蛋白酶在去垢剂中的稳定性。
图12A显示了在37℃、pH值约为7的条件下重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在生态标签标准洗涤剂（ecolabelreferencedetergent）中的稳定性。市售制剂Ultra16L和重组蛋白酶Fe_RF6318（见WO2010125174Al）被用于比较。去垢剂中使用的酶制剂用量为4%（w/w）。
图12B显示了在37℃、pH值约为8的条件下，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在市售液态去垢剂中的稳定性。市售制剂Ultra16L和重组蛋白酶Fe_RF6318（见WO2010125174Al）被用于比较。去垢剂中使用的酶制剂用量为4%（w/w）。
序列表
SEQIDNO:1用于畸枝霉属蛋白酶探针合成的PCR的DET1上游引物的序列
SEQIDNO:2用于畸枝霉属蛋白酶探针合成的PCR的DET2上游引物的序列
SEQIDNO:3用于畸枝霉属蛋白酶探针合成的PCR的DET3下游引物的序列
SEQIDNO:4用于畸枝霉属蛋白酶探针合成的PCR的DET4下游引物的序列
SEQIDNO:5用于畸枝霉属蛋白酶探针合成的PCR的DET5上游引物的序列
SEQIDNO:6用于设计DET1的PCR上游引物的共有肽序列的核苷酸序列
SEQIDNO:7用于设计DET2的PCR上游引物的共有肽序列的核苷酸序列
SEQIDNO:8用于设计DET3的PCR下游引物的共有肽序列的核苷酸序列
SEQIDNO:9用于设计DET4的PCR下游引物的共有肽序列的核苷酸序列
SEQIDNO:10用于设计DET5的PCR上游引物的肽序列的核苷酸序列
SEQIDNO:11使用DET5和DET4以畸枝霉属ALKO4122的基因组DNA为模板在PCR反应中得到的PCR片段的序列。此片段包含部分畸枝霉属蛋白酶基因，并是质粒pALK3092的插入片段。
SEQIDNO:12用DET5和DET4以畸枝霉属ALKO4178的基因组DNA为模板的PCR反应得到的PCR片段的序列。此片段包含部分畸枝霉属蛋白酶基因，并是质粒pALK3093的插入片段。
SEQIDNO:13编码畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的全长氨基酸序列的核苷酸序列。质粒pALK3094包括全长基因。通过PCR由畸枝霉属ALKO4178克隆的蛋白酶基因序列与此序列相同。
SEQIDNO:14畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的全长氨基酸序列包括全长蛋白酶的从Met1到Arg401的氨基酸。
SEQIDNO:15编码畸枝霉属ALKO4122蛋白酶原酶形式的氨基酸序列的核苷酸序列。
SEQIDNO:16包括全长蛋白酶的从Gly21到Arg401的氨基酸的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶原酶形式的氨基酸序列
SEQIDNO:17编码畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的核苷酸序列
SEQIDNO:18包括全长蛋白酶从Ala121到Arg401的氨基酸的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列
SEQIDNO:19用于克隆畸枝霉属ALKO4178蛋白酶基因的PCR上游引物DET27的序列
SEQIDNO:20用于克隆畸枝霉属ALKO4178蛋白酶基因的PCR下游引物DET28的序列
SEQIDNO:21用于构建pALK3097中表达框的PCR上游引物DET17的序列
SEQIDNO:22用于构建pALK3097中表达框的PCR下游引物DET18的序列
菌种保藏
畸枝霉属ALKO4122于2010年12月20日保存于位于荷兰Uppsalalaan8,3508AD,Utrecht的荷兰微生物菌种保藏中心（CBS），登记号为CBS128533。
畸枝霉属ALKO4178于2011年1月5日保存于位于荷兰Uppsalalaan8,3508AD,Utrecht的荷兰微生物菌种保藏中心（CBS），登记号为CBS128564。
包括质粒pALK3094的大肠杆菌菌株RF8791于2010年12月20日保存于位于德国Inhoffenstrasse7B,D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），登记号为DSM24410。
包括质粒pALK3092的大肠杆菌菌株RF8758于2011年1月3日保存于位于德国Inhoffenstrasse7B,D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM24426。
包括质粒pALK3093的大肠杆菌菌株RF8759于2011年1月3日保存于位于德国Inhoffenstrasse7B,D-38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM24427。
具体实施方式
本发明提供了一种源自真菌的丝氨酸蛋白酶。此蛋白酶在广泛的pH值范围内具有活性，并且在洗涤中有广泛的最佳温度范围，在低温范围内以及中温和高温时性能尤佳。本酶对于去垢剂应用十分理想，能忍受典型的去垢剂组分，并在去垢剂溶液中低酶水平时有效。本蛋白酶尤其在使用温度为0℃到90℃时具有活力，优选温度范围是5℃到60℃，更佳的温度范围是从10℃到40℃。本发明的蛋白酶在液态去垢剂组分中同样高度稳定。因此，本发明提供了一种新型丝氨酸蛋白酶，其可应用于去垢剂和其他应用中，尤其是在液态配方中。本真菌丝氨酸蛋白酶可以在高产量的真菌宿主中生产，并且其下游处理、例如从发酵液和菌丝体中的分离简单易行。
特别是，本发明提供了一种丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性，并含有与如SEQIDNo:18中所的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。本发明优选地提供了一种真菌丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性，并含有如SEQIDNo:18中所限定的氨基酸序列。一种优选的丝氨酸蛋白酶从樟绒枝霉(Lib.)OorschotdeHoog衍生得到。
在本发明中，“丝氨酸蛋白酶”或“丝氨酸内肽酶”或“丝氨酸内蛋白酶”均指经国际生物化学与分子生物学联盟（IUBMB）命名法分类为EC3.4.21的酶。蛋白酶可用类属特异性抑制剂来分类。丝氨酸蛋白酶抑制剂的不同种类包括合成型化学抑制剂和天然蛋白质抑制剂。因此，丝氨酸蛋白酶活性可通过在适宜条件下基于特异性底物分解的试验或使用含有或不含丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的含底物的任何蛋白的试验加以确定。
如本发明中使用的术语“丝氨酸蛋白酶活性”是指对含蛋白质的底物如酪蛋白、血红蛋白、牛血清蛋白（BSA）的水解活性。分析蛋白水解活性的方法在文献中广为人知，可参考文献如Gupta等人（2002）的文章。
丝氨酸蛋白酶以前酶原的形式作为无活性的酶原前体或酶原而合成，后者通过去除信号序列（分泌信号肽或前肽）和前序列（前肽）活化，以得到有活性的成熟形式的酶（Chen和Inouye，2008）。此活化过程涉及蛋白酶的作用，可能由丝氨酸蛋白酶的少量自消化或自催化处理造成，例如在生产的翻译后阶段或者在用过的培养基中或者在培养基或酶制剂的储藏过程中。原酶活化还可以通过在宿主生物培养时或培养后往培养基中添加能使无活性的原酶转化成有活性的成熟酶的蛋白水解酶来实现。酶的缩短还可以通过如在将基因转化入生产宿主前截短编码多肽的基因来实现。本发明中的丝氨酸蛋白酶的“前酶原形式”是指包含前肽和原肽的酶。“原酶形式”是指含有原肽但缺乏前肽（信号序列）的酶。
术语“成熟”是指丝氨酸蛋白酶的在其去除信号序列（前肽）和原肽后含有对于酶活性或催化活性必须的氨基酸的形式。在丝状真菌中，这是分泌入培养基的自然形式。成熟序列的第一个氨基酸可以通过分泌蛋白酶的N端测序来确定。在生化数据缺失的情况下，N端的位置可以通过将氨基酸序列和同源蛋白的成熟氨基酸序列进行比对来估测。可使用如ClustalW2alignment（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)来比对序列。
最大类型的市售的丝氨酸蛋白酶是“碱性丝氨酸蛋白酶”，其是指在pH值为9到11或pH值甚至为10到12.5的条件下具有活性且稳定（Shimogaki等人，1991）且等电点约为pH9的酶。可以在适宜缓冲液中、不同pH值条件下通过跟踪蛋白酶底物的活性来确定催化活性的最佳pH值。典型情况下，去垢剂蛋白酶在其工作所在的去垢剂溶液的pH值大约与酶的pI值大致相同时表现最佳。可以通过在由丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定化pH梯度胶上等点聚焦，或者通过从氨基酸序列预测pI，如通过使用ExPASy服务器上的pI/MW工具（http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger等人，2003）来确定pI。
成熟碱性丝氨酸蛋白酶的分子量在15到35kDa的范围内，通常是从约25到30kDa的范围内（Rao等人，1998）。丝氨酸蛋白酶的分子量可以通过质谱分析或者SDS-PAGE（Laemmli，1970）确定。还可以从酶的氨基酸序列来预测分子量。
大部分天然丝氨酸蛋白酶的最适温度在60℃左右（Rao等人，1998）。可以通过在适宜缓冲液、不同温度条件下，以如例3所述的酪蛋白为底物或者通过文献中描述的其他底物和缓冲液体系（Gupta等人，2002）来测定丝氨酸蛋白酶的最佳温度。
根据本发明，成熟的重组畸枝霉属丝氨酸蛋白酶的分子量约为29kDa，pH8.5、以酪蛋白为底物、反应时间为30分钟时的最佳温度约为70℃，并在50℃时且以酪蛋白为底物、反应时间为30分钟的条件下在碱性pH值范围内、例如pH10的条件下具有活性。重组畸枝霉属丝氨酸蛋白酶在去垢剂存在下具有优良性能，在广泛的如从低温到中温甚至高温范围内有高度可变的性质。基于洗涤条件、辅助成分和去垢剂中的添加剂，重组畸枝霉属丝氨酸蛋白酶在60℃或以下时尤其有用。
为了提高在如去垢剂等多种工业应用中畸枝霉属丝氨酸蛋白酶的性能，希望改进天然酶的性质。这些性质包含如储藏稳定性、去垢剂存在或不存在下的稳定性、pH稳定性、氧化稳定性、对漂白剂的抵抗力和底物特异性。此酶的蛋白质自水解活性对储藏稳定性有影响，其应该尽量降低。不言而喻，例如在洗衣和洗碗组分中，与母酶或蛋白酶前体相比，改进过的酶的洗涤性能不应被减弱。换句话说，与母丝氨酸蛋白酶相比，希望酶变体有相似甚至更好的洗涤性能和去污性质。
所生产的蛋白酶、尤其是丝氨酸蛋白酶可通过使用常规的酶化学方法纯化，例如盐制备法、超过滤法、离子交换层析法、亲和层析法、胶过滤法和疏水作用色谱法。可通过蛋白质鉴定、酶活性试验和SDS-PAGE来检测纯化。可以测定在不同温度和pH值条件下纯化酶的酶活性和稳定性，以及分子量和等电点。
本发明的重组丝氨酸蛋白酶纯化显示于例4。离心、过滤过的培养基上清液通过经20mMMESpH5.3平衡过的HiPrep26/10脱盐柱（来自于GEHealthcare）。胶过滤后的样品通过经20mMMESpH5.3平衡过的1mLSSepharoseHP柱（来自于GEHealthcare)。蛋白质用NaCl递增梯度（0.5M）洗提。含有蛋白酶的部分汇合,并用AmiconUltra-410,000CO离心过滤装置MILLIPORE浓缩。样品用经20mMMES，150mMNaClpH5.3平衡过的Superdex75胶过滤柱进一步纯化。汇合含有蛋白酶的部分。在SDS-PAGE胶上（图4）分析最终样品。自然也可以改为用其他已知的纯化方法来替代这里所描述的方法或作为其附加来分离本发明的酶。重组丝氨酸蛋白酶被纯化（如例4所述），并用于鉴定pH和温度曲线（如例5所述）。
蛋白酶活性大体上基于可溶性底物的降解。在去垢剂应用中，蛋白酶必须作用于至少部分不可溶的底物。因此，对于去垢剂蛋白酶的一个重要参数是吸附和水解这些不可溶碎片的能力。
本发明的丝氨酸蛋白酶可源自于下列任何生物：细菌、古生菌、真菌、酵母，甚至高等真核生物，如植物。所述酶优先来源于真菌，包括丝状真菌和酵母，如源自于选自包含畸枝霉属的类属。由于能够容易地进行下游处理以得到无微生物的酶或酶组合物，真菌碱性蛋白酶比细菌蛋白酶有利。通过纯化蛋白之前的过滤手段，可以轻松除去菌丝体。
本发明的真菌发酵产物的微臭相对于源自于芽孢杆菌的产品是有利的，后者通常散发难闻的臭味。因此，对于最终组合物需要更少的香料来掩盖臭味，这使得该产品也适合于不宜使用香料的应用。
本发明涉及一种真菌丝氨酸蛋白酶，其在去垢剂存在下具有优良性能，在广泛的例如从0℃到90℃的低温到中温具有高度可变的性质，优选在温度范围介于5℃到60℃之间，尤其优选在温度范围介于10℃到40℃之间。
在本发明中，“在去垢剂存在下的优良性能”是指酶（在这里指本发明的重组丝氨酸蛋白酶）能在比许多市售枯草杆菌蛋白酶更低的温度下起作用。换言之，优良性能是指酶能够在低温到中温范围能降解或去除蛋白质污垢或材料，但尤其能在比现在市售的枯草杆菌蛋白酶产品更低的温度范围下，例如市售枯草杆菌蛋白酶产品或Ultra16L（丹麦NovozymesA/S）。
根据洗涤条件、辅助成分和去垢剂中的添加剂，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可在特别是不高于60℃的温度下使用。酶还可以在不高于50℃、不高于40℃、不高于30℃、不高于20℃以及不高于10℃条件下起作用。出乎意料的是，一种最佳温度约为70℃的嗜热酶在低于40℃、甚至低于30℃温度下有效且有用。
在去垢剂存在下，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶在如上定义的温度下起作用，所述丝氨酸蛋白酶尤其在去垢剂存在、不高于40℃的条件下具有优良性能。在不同的测试条件下对于不同的污垢，经deltaL*测试，源自于畸枝霉属的真菌丝氨酸蛋白酶的去污能力远远优于市售产品或Ultra16L（丹麦NovozymesA/S）。结果在例6到例8和图6到图10中显示。
根据本发明的一个优选实施方式，重组真菌丝氨酸蛋白酶是一种多肽，其具有丝氨酸蛋白酶活性，并含有如SEQIDNo:18定义的成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列，或者与如SEQIDNo:18定义的成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。优选的酶显示有至少66%、优选至少70%、更优选至少75%、还更优选至少80%的一致性。甚至还更优选的氨基酸序列与SEQIDNo:18的氨基酸序列显示有至少85%或者至少90%或95%、更加优选为至少98%、最优为99%的一致性。酶的一致性可用对应的成熟序列区域来合适地进行比较。
本发明的丝氨酸蛋白酶可来源于畸枝霉属，最好来源于樟绒枝霉（Libert）OorschotdeHoog（马拉分支霉（Miehe）的同义词，Cooney&R.Emers.），它是EC3.4.21的成员。根据该特别优选的实施方式，本发明的丝氨酸蛋白酶源自于以登记号CBS128533保藏的畸枝霉属ALKO4122菌株，或者源自于以登记号CBS128564保藏的畸枝霉属ALKO4178菌株。畸枝霉属ALKO4178的蛋白酶与畸枝霉属ALKO4122菌株的蛋白酶本质上相同。
术语“一致性”在这里是指两种氨基酸序列间在具有大概一样数量的氨基酸的对应序列区间之间互相比较的一致性。例如，可以比较两段氨基酸序列的全长或成熟序列的一致性。两种要比较的分子的氨基酸序列可以在一个或多个部位有所不同，但这并不改变分子的生物学功能或结构。这种变异可自然形成，因为不同的宿主生物，或者氨基酸序列的突变，或者它们可以通过特异性突变实现。变异可由氨基酸序列中的一个或多个位点的缺失、替换、插入、增加或组合而产生。可通过ClustalW2alignment（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）以默认设置（蛋白质权重矩阵为：连接，开口：10；间隙延伸：0.20；间隙距离：5）来估量一致性。
本发明的一个优选实施方式是一种成熟真菌丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性以及如SEQIDNo:18定义的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列。成熟酶没有信号序列或前肽以及原序列或原肽。本发明的成熟丝氨酸蛋白酶包括在SEQIDNo:14中所示的全长蛋白酶的从Ala121到Arg401的氨基酸。因此，包括信号序列（前肽）和原肽的具有SEQIDNo:14的全长畸枝霉属ALKO4122蛋白酶以及缺乏信号序列（前肽）而具有SEQIDNo:16的原酶也在本发明的范围内。
本发明涉及一种真菌丝氨酸蛋白酶，其成熟形式的分子质量或分子量（MW）在20到35kDa之间，优选25到33kDa之间，更加优选在28到30kDa之间。最优MW是通过使用ExPASy服务器上的工具ComputepI/MWtool（Gasteiger等人，2003）而得到的成熟多肽的预测分子量29kDa。
本发明的酶在广泛的温度范围内对降解蛋白质材料有效。当如例5所述在pH8.5、30分钟反应时间、以酪蛋白为底物时，真菌丝氨酸蛋白酶的最适温度在从30℃到80℃的范围内（至少具有最大活性的10%），优选从40℃到80℃的范围内（至少具有最大活性的20%），更加优选从50℃到80℃的范围内（至少具有最大活性的40%），最好选择从60℃到80℃的范围内（至少具有最大活性的65%），最大活性在70℃。
当如例5所述在50℃、使用30分钟反应时间、以酪蛋白为底物时，本酶的最适pH值在从pH6到至少pH10的范围内。最适pH值尤其在pH6到pH10之间（至少具有60%的最大活性），更加优选pH9到pH10之间（具有至少70%的最大活性），最好是在pH10左右。
丝氨酸蛋白酶、合适地说本发明的真菌丝氨酸蛋白酶“在去垢剂存在下具有优良性能”，也就是说能够在去垢剂存在下在低温范围内降解或去除蛋白质污垢或材料，尤其是比现在市售的枯草杆菌蛋白酶产品、例如市售酶产品或Ultra16L（丹麦NovozymesA/S）更低的温度范围下。在去垢剂存在下，本发明的酶在5℃到60℃的范围内，优选不高于50℃时作用良好。本酶在温度不高于40℃或不高于30℃时也能起作用。
根据本发明的一个优选实施方式，真菌丝氨酸蛋白酶由分离的多核苷酸序列编码，该序列在严格条件下与包含于拥有大肠杆菌RF8758中核苷酸序列SEQIDNo:11的质粒pALK3092的多核苷酸序列或探针序列杂交，该大肠杆菌RF8758保存于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），登记号为DSM24426。
通过类似方式，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶（由畸枝霉属ALKO4178得到）通过一段分离的多核苷酸序列编码，其在严格条件下与包含于大肠杆菌RF8759中的拥有核苷酸序列SEQIDNo:12的质粒pALK3093的多核苷酸序列杂交，该大肠杆菌RF8759保存于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），登记号为DSM24427。
此外，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶通过一段分离的多核苷酸序列编码，其在严格条件下与包含于大肠杆菌RF8791中的拥有核苷酸序列SEQIDNo:17的质粒pALK3094的多核苷酸序列杂交，该大肠杆菌RF8791保存于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），登记号为DSM24410。
本发明中，畸枝霉属蛋白酶基因通过用如例4所述的严格杂交PCR制备的探针分离得到。可用标准分子生物学方法来分离宿主生物的cDNA或基因组DNA，例如在分子生物学手册（如Sambrook和Russell，2001）中描述的方法。
通常在“高度严格”的条件下实施与DNA探针（如包含多于100-200个核苷酸的SEQIDNo:11、SEQIDNo:12或SEQIDNo:17）的杂交，即在比完美杂交物的计算出的解链温度（Tm）低20-25℃的温度下的杂交，其中Tm根据Bolton和McCarthy（1962）算出。通常，预杂交和杂交在至少65℃下、在6×SSC（或6×SSPE）、5×Denhardt氏试剂、0.5%（w/v）SDS、100μg/ml变性、片段化的鲑鱼精子DNA中实施。加入50%甲酰胺会使预杂交和杂交温度降低到42℃。洗涤在低盐浓度中进行，如室温条件下（RT），在2×SSC-0.5%SDS（w/v）中15分钟，然后室温条件下在2×SSC-0.1%SDS（w/v）中，最后在至少65℃下，0.1×SSC-0.1%SDS（w/v）中，或者在例1d中描述的条件下。
根据一个优选实施方式，本发明的优选真菌丝氨酸蛋白酶由一种分离的核酸分子编码，其编码包含在SEQIDNo:18中表征的氨基酸序列的多肽，或与SEQIDNo:18的氨基酸序列具有至少66%的一致性的多肽。优选酶显示有至少66%、优选至少70%、更加优选至少75%、甚至更优选至少80%的一致性。更加优选的氨基酸序列显示与SEQIDNo:18的氨基酸序列有至少85%或者至少90%或95%、更加优选至少98%、最好99%的一致性。通过使用相对应的成熟序列区域来比较酶的一致性。
因此，在本发明的范围内包括一种多肽序列，其由编码本发明的除酶的成熟形式外包括前肽（信号序列）和原肽的全长丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的核酸分子编码，其氨基酸序列在SEQIDNo:14中表征。
在本发明的范围内还包括一种多肽序列，其由编码本发明的除酶的成熟形式外包括原肽的丝氨酸蛋白酶的原肽形式的核酸分子编码，其氨基酸序列在SEQIDNo:16中表征。
本发明的一个优选实施方式是通过分离的核酸分子编码的真菌丝氨酸蛋白酶，其包含编码成熟形式的含有SEQIDNo:18的畸枝霉属ALKO4122丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列。
根据一个优选实施方式，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由分离的核酸分子编码，其包含编码成熟形式畸枝霉属ALKO4122酶（SEQIDNo:18）的核苷酸序列SEQIDNo:17。
因此，由含有包含本酶“编码序列”的核苷酸序列SEQIDNo:13的核酸分子编码的多肽在本发明的范围内。表达“编码序列”是指从翻译起始密码子（ATG）开始、在翻译终止密码子（TAA、TAG或TGA）终止的核苷酸序列。翻译的全长多肽通常以甲硫氨酸开始，可能含有内含子区域。
一种真菌丝氨酸蛋白酶也在本发明的范围内，其由包含编码畸枝霉属ALKO4122原酶形式的SEQIDNo:15核苷酸序列的核酸分子编码。
根据本发明的另一个优选实施方式，真菌丝氨酸蛋白酶由多核苷酸序列编码，其含在包含大肠杆菌RF8791（以登记号DSM24410保藏）中的核苷酸序列SEQIDNo:13的质粒pALK3094中。
本发明的一个实施方式是由重组表达载体生产的丝氨酸蛋白酶，其包含编码如上描述的、可操作于连接到能够在适宜宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶表达的常规序列上的真菌丝氨酸蛋白酶的核酸分子。所述重组表达载体的构建和所述载体的应用在例2中有更多细节的描述。
用于生产真菌丝氨酸蛋白酶的适宜宿主是同源性宿主或异源性宿主，例如包括细菌、酵母和真菌的微生物宿主。如木霉菌属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、链孢霉属、根霉属菌、青霉菌属、毁丝霉属和被抱霉属的丝状真菌由于下游处理和酶产物回收的简便性是优选的生产宿主。适宜宿主包括如里氏木霉、黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉典型菌株、镰孢霉或尖孢镰刀菌、特异腐质霉或柔毛腐质霉、粗糙脉孢菌和粗糙脉孢菌孢子的物种，其中一些在如AMFEP2009市售酶列表（http://www.amfep.org/list.html)中被列为酶生产宿主生物。本酶更加优选地是从木霉菌属或曲霉属的丝状真菌宿主生产，例如里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉。根据本发明的最优选实施方式，真菌丝氨酸蛋白酶从里氏木霉中生产。
本发明还涉及包含编码丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分离的核酸分子，其选自：
（g)一种核酸分子，其编码具有丝氨酸蛋白酶活性且含有如SEQIDNo:18所述的氨基酸序列的多肽。
（h）一种核酸分子，其编码具有丝氨酸蛋白酶活性且与SEQIDNo:18的氨基酸序列有至少66%的一致性的多肽。
（i）一种核酸分子，其含有如SEQIDNo:17所述的核苷酸序列的编码序列。
（j）一种核酸分子，其含有含在DSM24410中的多核苷酸序列的编码序列。
（k）一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的简并性而与从（c）到（d）的任一核酸分子的编码序列不同；并且
（l）一种核酸分子，其在严格条件下与包含于编码具有丝氨酸蛋白酶活性且与如SEQIDNo:18所述的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列的多肽的DSM24426或SEQIDNo:17中的核酸分子杂交。
本发明的核酸分子可以是RNA或DNA，其中DNA可由基因组DNA或cDNA构成。
可以在编码本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分离和酶处理方面使用标准分子生物学方法，包括基因组DNA和质粒DNA的分离、用来生产DNA片段的DNA消化、测序、大肠杆菌转化等。基本方法在标准分子生物学手册（如Sambrook和Russell，2001）描述。
编码畸枝霉属ALKO4122多肽的畸枝霉属蛋白酶基因的分离在例1中描述。简单地说，在PCR反应中使用简并寡核苷酸引物（SEQIDNo:5和SEQIDNo:4）得到的PCR片段被用来分离源自畸枝霉属ALKO4122的蛋白酶基因。包括蛋白酶基因的基因组片段与pBluescriptIIKS+载体连接。保藏于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）中登记号为DSM24410的大肠杆菌中的质粒pALK3094包括全长畸枝霉属蛋白酶基因。丝氨酸蛋白酶的推论的氨基酸序列由DNA序列分析得来。
畸枝霉属ALKO4122蛋白酶（SEQIDNo:13）的核苷酸序列、其部分启动子和终止子序列以及推论的氨基酸序列（SEQIDNo:14）在图1A-B中呈现。基因长度为1436bp（包括终止密码子）。找到三个长度为72bp、87bp和71bp的推定的内含子。推论的蛋白质序列由包括20个氨基酸组成的预测的信号序列（SignalPV3.0；Nielsen等人，1997和Nielsen和Krogh，1998）和从Gly21到Asp120的预测的前肽在内的401个氨基酸组成。成熟多肽的预测的分子量是28.5kDa，预测的pI是6.15。通过使用ExPASy服务器上的工具ComputepI/MWtool（Gasteiger等人，2003）做了这些预测。推论的氨基酸序列包含三个可能的N-糖基化位点（Asn134、Asn172和Asn277），但根据CBS服务器NetNGlycV1.0只有两个位点，Asn134与Asn277是类似的。通过使用美国国立生物技术信息中心（NCBI）的版本为2.2.25的BLASTP程序搜索了与已发表的编码序列的同源性（Altschul等人，1990）。成熟畸枝霉属蛋白酶序列与大多数同原序列的对应区域的一致性值通过使用ClustalW2alignment（可在如http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/上得到；矩阵为：连接，开口：10；间隙延伸：0.20；间隙距离：5）得到。结果显示于表2中。
下面是对本发明成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶（SEQIDNo:18）从BLASTP搜索得到的最高一致性值：对于Coccidioidesposadasii（一种二态真菌）的推定的类枯草杆菌蛋白酶（EER24932.1）和粗球孢子菌的假定的蛋白质CIMG_09197（XP_001239485.1）是66%，对于Uncinocarpusreesii（一种腐生型真菌）的假定的蛋白质UREG_05170（EEP80328.1）是65%，对于粗球孢子菌的假定的蛋白质CIMB_01394（XP_001247623.1）、Coccidioidesposadasii的推定的类枯草杆菌蛋白酶（EER23662.1）、Uncinocarpusreesii的假定的蛋白质（EEP81307.1）和太田节皮菌的碱性蛋白酶（EEQ28657.1）是64%。对于专利文献中的序列的最高一致性是对美国US5962765（AAE30270.1；来自于金龟子绿僵菌的蛋白酶）中的SEQIDNo:2和WO8807581（AAA54276.1；来自于白色念球菌的蛋白酶）中的SEQIDNo:15的55%。成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶序列（SEQIDNo:18）与上述用ClustalW2alignment比对得到的同原序列的成熟序列进行比对。用ClustalW2alignment（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)比对得到的一致性值（得分%）是从63%到65%。
因此，在本发明的范围内包括一种分离的多核苷酸序列或分离的核酸分子，其编码包含如SEQIDNo:18和15表征（即SEQIDNo:14的全长丝氨酸蛋白酶从Ala121到Arg401的氨基酸）的畸枝霉属ALKO4122酶的成熟形式的氨基酸序列的真菌丝氨酸蛋白酶或多肽。
核酸分子优选是包含如SEQIDNo:17描述的编码序列的分子，其编码本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的成熟形式。
本发明的分离的核酸分子可以是一种包括包含于DSM24410、DSM24426或DSM24427中的多核苷酸序列的编码序列的分子。DSM24426具有用于克隆全长畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因的PCR片段（SEQIDNo:11）的核苷酸序列。DSM24427具有来自于畸枝霉属ALKO4178的PCR片段（SEQIDNo:12）的核苷酸序列。DSM24410具有全长畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因（SEQIDNo:13）的核苷酸序列。
本发明的核酸分子也可是如上描述的核苷酸序列的类似物。“简并性”是指核苷酸序列的类似物，其在一个或多个核苷酸或密码子上不同，但编码本发明的重组蛋白酶。
核酸分子也可是一种能在严格条件下与包含于质粒pALK3092或pALK3093的PCR探针的核酸分子杂交，质粒分别保存于登记号为DSM24426和DSM24427的大肠杆菌中，或者是一种能在严格条件下与编码具有丝氨酸蛋白酶活性和氨基酸序列的成熟多肽的DNA序列SEQIDNo:17的核酸分子杂交。杂交DNA可源自于属于畸枝霉属种类的真菌，或者它能源自于其他真菌种类。
因此，包含如SEQIDNo:17所述的核苷酸序列及其类似物的分离的核酸分子属于本发明的范围内。
本发明还涉及一种重组表达载体或重组表达载体构建物，其可用于在适宜原核宿主或真核宿主中扩增或表达编码所选丝氨酸蛋白酶的核酸序列。重组表达载体包含DNA或核酸序列，其促进或指导在适宜宿主中丝氨酸蛋白酶编码序列的表达和分泌，例如启动子、增强子、终止子（包括转化和翻译终止信号）和可操作于连接到编码所述丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的信号序列。表达载体可进一步包含用于选择转化子菌株的标记基因，或者选择标记可以在另一个载体构建物中通过共转化引入宿主。所述调控序列可与生产生物同源或者异源，或者它们可以源自于分离编码丝氨酸蛋白酶的基因的生物。
在丝状真菌中用来表达本发明的丝氨酸蛋白酶的启动子的例子是米曲霉TAKA淀粉酶、碱性蛋白酶ALP以及丙糖磷酸异构酶、黑根毛霉脂肪酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA）、尖孢镰刀菌类胰蛋白酶、孢子菌纤维二糖水解酶I启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I（Cel7A）等的启动子。
在酵母中，如酿酒酵母烯醇化酶（ENO-1）、半乳糖激酶（GAL1）、乙醇脱氢酶（ADH2）和3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子可用来提供表达。
在细菌宿主中用以指导本发明丝氨酸蛋白酶的转录的启动子序列的例子是大肠杆菌的lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyL）的启动子、嗜热脂肪芽胞杆菌麦芽糖淀粉酶基因（amyM）的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等的启动子
适宜的终止子包括上述提到的基因或其他任何鉴定过的终止子序列的终止子。
适宜的转化或选择标记包括补足宿主中的缺陷的标记，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或曲霉菌amdS和niaD的dal基因。选择还可基于给予抗生素抗性的标记，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、腐草霉素或匀霉素抗性。
优选本发明的丝氨酸蛋白酶的细胞外表达。因此，重组载体包括在所选宿主中促进分泌的序列。本发明的丝氨酸蛋白酶的信号序列或前序列或前肽可包括在重组表达载体中，或者可用另一个能在所选宿主中促进表达的信号序列来替代天然信号序列。因此，所选信号序列可以与表达宿主同源或者异源。天然原肽还可用另一原肽替代。原肽可以与表达宿主同源或者异源。
适宜的信号序列的例子是真菌或酵母生物的信号序列，例如源自于表达良好的基因的信号序列。这些信号序列从文献中已被详知。
重组载体可进一步包括能促进载体整合入宿主染色体DNA中以得到稳定的表达和/或促进瞄准宿主基因组中的某些位点的序列。
本发明的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶及其自身的信号序列从里氏木霉cbh1（cel7A）启动子表达，如例2所述。用于转化里氏木霉宿主的表达载体的构建还包括cbh1终止子和用于从未转化细胞里选择转化子的合成的amdS标记。
本发明还涉及含有如上所述的重组表达载体的宿主细胞。用于生产真菌丝氨酸蛋白酶的适宜宿主是同源或异源宿主，例如包括细菌、酵母、真菌在内的微生物宿主。也可以使用植物细胞或哺乳动物细胞的生产体系。
如木霉菌属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、链孢霉属、根霉属菌、青霉菌属、毁丝霉属和被抱霉属的丝状真菌由于下游处理和酶产物回收的简便性是优选的宿主。适宜的表达和生产宿主体系是如从丝状真菌宿主里氏木霉（EP244234）中研发出的生产体系，或者如米曲霉或黑曲霉（WO9708325，US5843745，US5770418）、泡盛曲霉、酱油曲霉和日本曲霉类型的菌株的曲霉菌生产体系，或者为如尖孢镰刀菌（Malardier等人，1989）或镰孢霉的镰刀菌以及为粗糙脉孢菌、黑根毛霉、高山被孢霉、棉毛嗜热丝孢霉或腐质霉或为真菌孢子（US6573086）而研发的生产体系。为酵母研发的适宜生产体系是为酿酒酵母、粟酒裂酵母或毕赤酵母研发的体系。为细菌研发的适宜生产系统是为芽胞杆菌属（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌），为大肠杆菌，或者为放射菌类链霉菌属研发的生产系统。优选地，本发明的丝氨酸蛋白酶是从木霉菌属或曲霉属的丝状真菌宿主生产的，例如里氏木霉或黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉典型菌株。根据本发明的最优选实施方式，真菌丝氨酸蛋白酶在里氏木霉中生产。
本发明还涉及一种生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培养天然或重组宿主细胞的步骤，该细胞在适宜条件下具有本发明丝氨酸蛋白酶的重组表达载体，并可选择性地分离所述酶。生产培养基可以是适合培养宿主生物且含有有效表达的诱导物的培养基。适宜培养基从文献中已被详知。
本发明涉及一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由本发明的核酸分子编码，并且可以由如上所述的方法得到。
本发明进一步涉及一种获取包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的酶制剂的方法，所述方法包含如下步骤：培养具有本发明表达载体的宿主细胞，以及要么从细胞中回收多肽，要么从培养基中分离细胞并取得具有丝氨酸蛋白酶活性的上清液。
本发明还涉及一种具有如上所述的丝氨酸蛋白酶的酶制剂。该酶制剂或酶组合物具有丝氨酸蛋白酶活性，并且可以通过依据本发明的方法获得。
包含本发明的丝氨酸蛋白酶的酶制剂以及酶组合物在本发明的范围内。
包含本发明丝氨酸蛋白酶的酶制剂或酶组合物（如去垢剂配方）可进一步包含选自于蛋白酶（除本发明外的其他蛋白酶）、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶的其他酶，例如含有或不含介体的漆酶或过氧化物酶。这些酶被预计能够增强本发明的丝氨酸蛋白酶的性能，例如通过去除在要被处理的材料中存在的碳水化合物和油或脂。所述酶可以是通过宿主品种生产的天然或重组酶，或者可以在培养过程后加入到培养基上清液中。
所述酶制剂或酶组合物可进一步包含选自于表面活性剂或表面活化剂、缓冲液、防蚀剂、稳定剂、漂白剂、介体、增洁剂、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂、光亮剂、抗再沉积剂、染料、色素、香料等的一种或多种适宜添加剂。
表面活性剂在乳化油脂和湿化表面时有用。表面活性剂可以是包括半极性的和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的非离子表面活性剂。
可在酶制剂或酶组合物中加入缓冲液以调节pH值，或影响其他成分的性能或稳定性。
适宜的稳定剂包括如丙二醇或甘油的多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、肽等。
漂白剂被用来氧化和降解有机化合物。适宜的化学漂白剂系统的例子有H2O2来源，例如含有或不含有形成过酸的漂白激活剂（如四乙酰乙二胺）的过硼酸盐或过碳酸钾，或者如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。化学氧化剂可通过使用氧化酶、例如漆酶或过氧化物酶来部分或完全取代。许多漆酶在介体缺失的情况下不能有效运作。
增洁剂或络合剂包括如沸石、二磷酸、三磷酸、碳酸盐、柠檬酸等的物质。酶制剂可进一步包含一种或多种聚合体，例如羟甲基化纤维素、聚（乙烯乙二醇）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡咯烷酮）等。也可加入柔顺剂、腐蚀剂、用于防止其它成分腐坏的防腐剂、研磨剂和以及修饰起泡和粘性性质的物质。
根据本发明的一个优选实施方式，包含所述酶的所述酶制剂或酶组合物以液体、粉末、颗粒或者片剂的形式存在。根据本发明的一个优选实施方式，所述组合物是液体、粉末、颗粒或者片剂形式的去垢剂制剂。另外，制剂或组合物中的酶可以固定酶的形式存在。
本发明的丝氨酸蛋白酶可以和其他蛋白酶、尤其是碱性蛋白酶类似地用于去垢剂、蛋白质、酿酒、肉、照相业、皮革业、乳业和制药工业（Kalisz，1988；Rao等人，1988）。举例来说，它可被用作将纤维蛋白废物（如角、皮革、指甲和毛发）转化为有用的生物质、蛋白质精料或氨基酸的化学药品的替代物（Anwar和Saleemuddin，1988）。本发明的丝氨酸蛋白酶的使用可以与其他酶类似地在改进皮革质量、减少环境污染和节省能源方面被证明是成功的，它也可与碱性丝氨酸蛋白酶一样在肽的合成与D,L-氨基酸混合物的解析上使用。枯草杆菌蛋白酶与广谱抗生素结合治疗烧伤和创伤是丝氨酸蛋白酶在医药工业中应用的一个例子，因此本发明的真菌丝氨酸蛋白酶还可有这类应用，并可与碱性蛋白酶类似地应用于去除外科手术器械上的血渍和清洁隐形眼镜或假牙。与源自于冠状耳霉的碱性蛋白酶类似，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可用于在动物细胞培养基中替代胰蛋白酶。本发明的蛋白酶还可用于膜的清洁和生物膜的破坏。在烘焙中，本蛋白酶可用于水解食物蛋白质（如牛奶中的蛋白质）的如谷胶网络的破坏及其他食物应用。它们还可用于如处理酵母、精炼（从动物骨头中分离更多蛋白质）、创造新味、减少苦味、改变乳化性质、产生具有生物活性的肽和减少蛋白质的变应原性。底物包括动物、植物和微生物蛋白质。
去垢剂工业、尤其是衣服去垢剂工业是在高pH值范围内具有活性的蛋白酶的单一的主要消费者（Anwar和Saleemuddin，1998）。理想的去垢剂蛋白酶应具有广泛的底物特异性，以促进由食物、草、血液和其他身体分泌物产生的多种污垢的去除。它还应在去垢剂溶液的pH值和离子强度下、洗涤温度和pH值条件下具有活性，能忍受机械处理及加入去垢剂的螯合剂和氧化剂。出于保护能源的意识，现在希望的是在较低温度下使用蛋白酶。
本发明还涉及丝氨酸蛋白酶或酶制剂在去垢剂、处理纺织品纤维、处理蛋白质材料（如毛、发、丝、皮革）、处理饲料或食物、或任何涉及蛋白质材料的修饰、降解或去除的应用方面的使用。
因此，本发明的一个优选实施方式是如上描述的丝氨酸蛋白酶作为在洗衣去垢剂和包括自动洗碗组合物的洗碗组合物中有用的去垢剂添加剂的应用。
用语“去垢剂”用以表示用来协助清洁或具有清洁性质的物质或材料。术语“去垢力”表示清洁性质的存在或程度。清洁性质的程度可以测试于不同的蛋白质或含蛋白质的底物材料或污垢或污垢混合物，其粘在如纺织品纤维或玻璃上的固态的、不溶于水的载体上。典型的蛋白质材料包括血液、奶、墨水、蛋、草和酱汁。以测试为目的的多种蛋白质污垢已能在市场上买到。去垢剂酶的功能是降解和去除含蛋白质的污垢。测试结果依用于洗涤测试的污垢的种类、去垢剂的成分和纺织品的本性和状态而定（Maurer，2004）。
在本发明中，术语“低温”是指从10℃到30℃的温度范围，根据实验其对许多现有的酶制剂，尤其是去垢剂酶制剂的性能并不是最佳的。术语“中温”是指从30℃到60℃的温度范围。
术语“可用于低温或中温范围内”包括希望酶能在低温或中温范围（10℃到60℃）内有效运作的工业应用。这类应用包括其在食物、饲料和皮革工业、制药、诊断、废物管理和银回收中的应用。如在此所指，这些应用不包括本发明的丝氨酸蛋白酶作为生物防控剂对植物致病性真菌和线虫起生物防控作用的应用。
在本发明中，术语“去垢剂稳定性”是指酶或酶变体在去垢剂溶液、在储藏和/或洗涤过程中充分保留其活性。因此，在如轻型生态标签标准去垢剂（EcolabelReferenceDetergent，wfkTestgewebeGmbH）或如例6表3中描述的市售液态去垢剂的去垢剂存在下它能有效地降解或去除蛋白质污垢或材料。可通过测定如在去垢剂中37℃下孵育几天之后的残余活性来分析稳定性。残留蛋白酶活性可以用如例3所描述的方法或其他任何文献中公开的方法（Gupta等人，2002）来测定。
术语丝氨酸蛋白酶的“有效用量”是指在特定去垢剂成分中为实现酶活性的必要的蛋白酶的量。本发明的去垢剂组合物优选包含按重量计从约0.0001%到约10%的本发明蛋白酶变体的去垢剂组合物，更优选从0.001%到约1%，还更加优选从0.001%到约0.5%。
典型地，蛋白酶的洗涤性能以“去垢效率”或“去垢效果”或“清洁性质的程度”来测量，其是指例如在人为弄脏的样品或测试布的沾污材料中的亮度或颜色变化的可见且可测量的增加。亮度或变色值可以测量，例如通过用如从例6到例8中描述的L*a*b*颜色空间坐标系的分光光度计以反射系数值来测量颜色。显示蛋白酶性能（去污效率）的蛋白质污垢的退色或去除例如以ΔL*来计算，其是指酶处理过的织物的亮度值L*减去用无酶洗液（酶空白或对照）处理过的织物的亮度值L*。去垢剂的存在可提高酶在去污中的性能。本发明的丝氨酸蛋白酶可在具不同成分的去垢剂存在时在碱性条件下降解多种蛋白质污垢（例6到例8）。
如例6所示，本发明的丝氨酸蛋白酶在市售液体去垢剂中在10-50℃、尤其是在不高于30℃时对于去除血液/奶/墨水污垢来说明显优于市售蛋白酶制剂和Ultra16L（图6和图7）。酶制剂以酶活力单位给量。当使用加入的蛋白质用量来计量给药时也观察到了同样的效果（图8）。出乎意料的是，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在十分广泛的温度范围内、尤其在如10-30℃的低温下显示有极佳的去污性能，尽管它在分析条件下、以酪蛋白为底物（大约70℃，图5A）时具有高温最适宜性。在分析条件下具有类似温度曲线的（图5A）清晰地显示了在冷洗温度下较低的性能。这些测试结果表明，根据本发明的蛋白酶在广泛的温度范围内、甚至在非常低的冷洗温度下也具有与液态去垢剂一起使用的优异的性能。
当在液态去垢剂中在30℃和60℃条件下测试时，除了不同的血液/奶/墨水污垢之外，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶也能有效地去除如草和可可的污垢。处理在ATLASLP-2清洗检验仪中进行，酶以酶活力单位给量。结果（图9A-H）显示，畸枝霉属蛋白酶对几种污垢既在30℃又在60℃中有效，与Ultra16L相比显示了更好的去垢性能。畸枝霉属ALKO4122还对花生油/奶和蛋黄污垢有效。
畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的性能还通过含有漂白剂和光亮剂的市售传统去垢剂粉末以及通过不含光亮剂和漂白剂的ECE参考去垢剂77在如例8所述的50℃、pH分别为10.5或10的条件下测试。测试了酶对于去除聚酯纤维-棉材料上的血液/奶/墨水污垢的能力。如图10A和B所示，本发明的蛋白酶还在极碱条件下适合于粉末状去垢剂，当每种酶制剂剂量以酶活力单位计量时，其效果与Ultra16L相类似。
除了洗涤以外，本发明的酶还可在储藏过程中充分地保持其活性，即使当储藏在液态去垢剂中的时候，如例9和10所示。畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在37℃下与如镰孢菌属蛋白酶Fe_RF6318(WO2010125174A1)相比具有极佳的储藏稳定性（图11A和B）。图12A和12B显示了畸枝霉属蛋白酶与镰孢菌属蛋白酶相比在轻型生态标签标准洗涤剂（wfkTestgewebeGmbH）和市售液态去垢剂（表3）中具有尤其优良的稳定性，并在生态标签中具有与市售细菌蛋白酶16L相比类似的稳定性。根据本发明的蛋白酶在高温下的良好稳定性使其尤其适合在气候暖和的国家作为液态去垢剂配方。
根据本发明的一个优选实施方式，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可在去垢剂液和去垢剂粉末中使用，如从例6到例10所示。本发明酶制剂的酶可配制用于手洗或机洗衣物，或可配制用于家庭顽固表面清洁或优选手洗或机洗碗盘的操作。
总之可以看到，提供了一种新型的热稳定的真菌丝氨酸蛋白酶，其源自于嗜热微生物，在低温下表现尤其优良，且在液态去垢剂组分中兼容和稳定，由此只需要更少的稳定剂和其他添加剂。
本发明以下列涉及本发明的部分实施方式的实施例加以说明，但并不意味着本发明仅限于这些实施例。
实施例
实施例1.为克隆来源于畸枝霉属的蛋白酶基因和克隆来源于畸枝霉属ALKO4122和ALKO4178菌株的蛋白酶基因的探针的合成
(a)DNA的分离和所用的分子生物学方法
使用标准分子生物学方法来进行DNA的分离和酶处理（如质粒DNA的分离，用以产生DNA片段的DNA酶切消化）、大肠杆菌转化、测序等。所用的基本方法如酶、试剂或试剂盒的生产厂家所描述，或者如标准分子生物学手册（如Sambrook和Russell，2001）中所描述。以被Raeder和Broda（1985）具体描述的方法从丝状真菌中分离基因组DNA。
（b）用于制备探针的引物
用于克隆编码畸枝霉属蛋白酶的基因的探针通过PCR来合成。基于真菌蛋白酶（如分别在ABEnzymesOy的WO2010125174、WO2010125175和WO2011003968中的水贼镰刀菌RF6318、锐顶镰刀菌RF7182和里氏木霉Prb1）的氨基酸序列共有序列设计简并的上游和下游寡核苷酸。根据选自于发表的樟绒枝霉嗜热霉菌素（总共34个氨基酸；Swiss-Prot登记号为P13858.1）的N-端序列的区域合成了一种额外的5’端引物（DET5）。采用上述序列的氨基酸20-28来设计DET5。用于其设计的引物序列和肽序列在下面表1中表示（分别是SEQIDNOs：1-5及SEQIDNOs：6-10)。在该表中包括了寡聚核苷酸的名称、SEQIDNO、长度、简并性和核苷酸序列，以及用于引物及其SEQIDNOs:6-10的准备的肽序列。
表1.在探针扩增中用作PCR引物的寡核苷酸（SEQIDNOs：1-5）
(aN=A、T、C或G；R=A或G；Y=T或C；H=A、C或T；M=A或C；核苷酸序列后面括号中的“s”和“as”分别为有义链和反义链。
（c）用于克隆全长蛋白酶的PCR反应和探针的选择
在PCR反应中，使用由畸枝霉属ALKO4122和ALKO4178分离的基因组DNA制剂为模板。CBS鉴定服务（荷兰Utrecht）于2011年1月将畸枝霉属ALKO4122鉴定为樟绒枝霉（Libert）OorschotdeHoog（马拉分支霉(Miehe)的同义词，Cooney&R.Emers.）。畸枝霉属ALKO4178作为马拉分支霉保藏于RoalOy培养物保藏中心，但是CBS或其他专业鉴定真菌的机构没有对此分离菌作进一步鉴定。
为了基因组DNA的分离，畸枝霉属ALKO4122和ALKO4178菌丝体在37℃、250rpm、50ml葡萄糖-酵母提取物培养基（25g葡萄糖、27.5g酵母提取物，pH6.5）中培养菌株4天。收集菌丝体，分离基因组DNA并以之为模板来合成探针。PCR反应混合物包含缓冲液（芬兰Finnzymes/FisherScientific）、0.2mM三磷酸脱氧核糖核苷（dNTPs）、50pmol每种引物、DMSO（体积的十分之一）和1单位的聚合酶（Finnzymes/FisherScientific）和每50μl反应体积大约0.5-1μg的基因组DNA。PCR反应的条件为：1分钟98℃下初始变性，接着28个循环的98℃下10秒钟，在45、47、52和57℃下30秒钟退火、72℃下30秒钟延伸，以及72℃下5分钟的最后延伸。在三种最低退火温度（见上文）时，引物组合DET5（SEQIDNo:5）和DET4（SEQIDNo:4）产生大小约为0.8kb的DNA产物。根据基于已发表的真菌丝氨酸蛋白酶的计算，此大小符合预期从蛋白酶基因得到的大小。当使用ALKO4122或ALKO4178的基因组DNA作为模板时，得到了相似大小的产物。根据供应商的用法说明（美国Invitrogen），分离DNA产物，从PCR反应混合物中纯化出来，并且连接到Blunt-TOPO载体上。所产生的质粒被命名为pALK3092（ALKO4122的PCR产物作为插入物）和pALK3093（ALKO4178的PCR产物作为插入物）。从pALK3092（SEQIDNo:11）和pALK3093（SEQIDNo:12）都测序插入物。发现两种插入物都是长791bp，它们只在合成的区域（忽视引物序列）互相之间只有一个核苷酸的区别。pALK3092插入物中的核苷酸323是C，pALK3093插入物中其为T。分别包括质粒pALK3092和pALK3093的大肠杆菌菌株RF8758和RF8759保藏于德国微生物菌种保藏中心，登记号分别为DSM24426和DSM24427。
用由使用美国国立生物技术信息中心（NCBI）的默认设置的程序版本2.2.23（Altschul等人，1990）得到的序列做了BLASTP搜索。编码的氨基酸序列显示了与例如源自于Uncinocarpusreesii（分别是XP_002584481.1和XP_002583205.1）的假定的和保守的假定的蛋白质以及与源自于Coccidioidesposadasii（EER24932.1）推定的类枯草杆菌蛋白和源自于Coccidioidesimmitis（XP_001239485.1）假定的蛋白质具有59-65%的一致性的同源性。因此，结果表明，从PCR反应得到的DNA片段是编码蛋白酶的基因的一部分，因此能作为探针在筛选源自于畸枝霉属的全长蛋白酶基因中使用。然而，跟在由引物DET5编码的序列后面的编码的氨基酸序列与所发表的畸枝霉属嗜热霉菌素序列（氨基酸29-34，登记号为P13858）并不相同。
（d）全长畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因的克隆
为了Southern印记分析，畸枝霉属ALKO4122和ALKO4178基因组DNA用了几种限制性酶来酶切消化。酶切消化跑胶，并实行了Southern转移和杂交。Southern印记的探针通过用M13反向引物和M13正向引物以及pALK3092（例1c）作为模板的PCR来标记。探针序列包括SEQIDNo:11（例1c）。根据供应商的用法说明（德国Roche）来实行用PCRDIG（地高辛配基）标记混合和杂交对探针的标记。杂交在68℃条件下过夜实行。杂交之后，过滤器用如下方式清洗：使用2×SSC-0.1%SDS在室温下洗5分钟，重复洗一次，接着使用0.1×SSC-0.1%SDS在68℃条件下洗15分钟，重复洗一次。
畸枝霉属ALKO4122和ALKO4178基因组DNA消化中检测出了几种杂交片段。大部分消化从两种基因组中都给出了相同的结果。大约2.7kb的杂交片段由基因组XbaI酶切消化获得。分析XbaI片段以包含全长蛋白酶基因（通过用包括在探针序列中的XbaI和PstI对基因组DNA进行双酶切，以及通过基于已发表的真菌丝氨酸蛋白酶序列的大小计算）。由ALKO4122基因组的由杂交片段（约2.7kb）的大小范围的XbaI消化分离DNA片段。通过琼脂糖胶实行分离。分离的基因组片段克隆到经XbaI切割的pBluescriptIIKS+（美国Stratagene）载体。连接混合物转化入大肠杆菌XL10-Gold细胞（Stratagene），并在含有50μg/ml氨苄青霉素LB（Luria-Bertani）平板上划平板。使用以PCR标记的pALK3092插入物作为探针的菌落杂交来对阳性大肠杆菌菌落进行筛选。为了基因组DNA的酶切消化，如上所述地进行杂交。从平板中挑选总共20个克隆，通过XbaI限制性酶切消化和Southern印记杂交（如针对基因组杂交所描述地实行）显示了其中的八个，以包含具有预计的大小并与pALK3092探针杂交的插入物。XbaI插入物（2961bp）被测序，并确认包含全长畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因（SEQIDNo:13）。包含上述XbaI基因组片段的质粒被命名为pALK3094。包括质粒pALK3094的大肠杆菌菌株RF8791保藏于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），登记号为DSM24410。
（e）编码畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的基因以及蛋白酶的推论的氨基酸序列的鉴定
图1显示了基因序列（SEQIDNo:13）及其部分启动子及终止子序列和编码的蛋白酶（SEQIDNo:14）的推论的氨基酸序列。基因的长度是1436bp（包括终止密码子）。发现三个推定的内含子具有72bp、87bp和71bp的长度。根据从几种真菌内含子中鉴定的序列，内含子具有一致的5’端和3’端边界序列以及内部共有序列（Gurr等人，1987）。推论的蛋白质序列（SEQIDNo:14）由401个氨基酸组成，包括20个氨基酸的预测的信号序列（SignalPV3.0；Nielsen等人，1997以及Nielsen和Krogh，1998）和预测的100个氨基酸的前序列。根据与其他真菌蛋白酶序列的比较估计了成熟蛋白酶的N端位置Ala121。成熟蛋白酶的预测分子量是28530Da，预测的pI是6.15。使用ExPASy服务器上的ComputepI/MW工具（Gasteiger等人，2003）计算出了这些预测。推论的成熟氨基酸序列包含三种可能的N-糖基化位点，其位于成熟序列的氨基酸位置Asn134、Asn172和Asn277（图1中的氨基酸位置254、292和397），但根据CBSServerNetNGlycV1.0，只有在位置Asn134和Asn277的位点是可能的。
畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的N端序列仅部分相当于之前发表的樟绒枝霉嗜热霉菌素N端序列（P13858）：在这两种序列中只有前28个氨基酸是相同的。
在pALK3092中的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因探针序列与基因组ALKO4122蛋白酶基因序列（在相对应的区域）有一个核苷酸的差别。然而，基因组ALKO4122蛋白酶基因序列与pALK3093中的ALKO4178蛋白酶探针序列的基因序列（在相对应的区域）相同。因此，pALK3092插入物（例1c）中的一个核苷酸的差别最有可能是因为PCR反应中探针中的突变。
（f）畸枝霉属ALKO4178蛋白酶基因的克隆
设计了引物DET27（SEQIDNo:19）和引物DET28（SEQIDNo:20）以通过PCR从畸枝霉属ALKO4178中合成全长蛋白酶基因。DET27是从畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因的启动子的上游引物（自ATG起从核苷酸-44到-24），DET28是从畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因的终止子的下游引物（自终止密码子起从核苷酸55到36）（图1）。PCR反应混合物包含缓冲液（芬兰Finnzymes/FisherScientific）、0.2mMdNTPs、75pmol每种引物和2单位的聚合酶（Finnzymes/FisherScientific）以及每200μl反应体积中约1.5μg的基因组DNA。PCR反应的条件为：30秒钟98℃下初始变性，接着24个循环的98℃下10秒钟、在60和65℃下30秒钟退火、72℃下60秒钟延伸，以及72℃下7分钟的最后延伸。从反应中得到具有预期长度（～1.5kb）的片段。分离得自两次单独的PCR反应的片段，连接到载体上。从单独的克隆来的插入物被测序。在克隆中的插入物的序列彼此相同，并与畸枝霉属ALKO4122蛋白酶基因、其部分启动子和终止子相同（图1）。包含畸枝霉属ALKO4178蛋白酶基因的质粒（其PCR片段已得到）被命名为pALK3147。包括其质粒的大肠杆菌克隆以RF9332保藏于RoalOy培养物保藏中心。
（g）同源性、一致性和比对研究
用成熟畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的氨基酸序列（SEQIDNo:18）来从公共来源中搜索同源蛋白酶序列。对冗余的蛋白质序列和GenBank专利部门的蛋白质序列都进行了搜索。在搜索中使用了在美国国立生物技术信息中心（NCBI）的BLASTP程序（版本2.2.25，默认设置）（Altschul等人，1990）。从所有冗余序列得到的最高一致性如下：对于Coccidioidesposadasii的推定的类枯草杆菌蛋白酶（EER24932.1）和粗球孢子菌的假定的蛋白质CIMG_09197（XP_001239485.1）是66%，对于Uncinocarpusreesii（一种腐生型真菌）的假定的蛋白质UREG_05170（EEP80328.1）是65%，对于粗球孢子菌的假定的蛋白质CIMB_01394（XP_001247623.1）、Coccidioidesposadasii的推定的类枯草杆菌蛋白酶（EER23662.1）、Uncinocarpusreesii的假定的蛋白质（EEP81307.1）和太田节皮菌的碱性蛋白酶（EEQ28657.1）是64%。EER24932.1和XP_001239485.1仅仅通过三个氨基酸彼此间区别开，XP_001247623.1和EER23662.1仅仅通过一个氨基酸彼此间区别开。畸枝霉属ALKO4122蛋白酶序列与上述同源序列通过ClustalW2alignment进行比对。在该比对中使用了从每种蛋白酶中推定的成熟序列。对从每种蛋白酶的成熟序列进行彼此间比较。表2中显示了通过使用ClustalW2alignment（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)得到的一致性值（分数%)。使用默认设置（蛋白质权重矩阵为：连接，开口：10；间隙延伸：0.20；间隙距离：5）比对了不包括信号肽和原肽的成熟氨基酸序列。SEQIDNo:18是ALKO4122蛋白酶的成熟氨基酸序列。得到的一致性值（分数%)是从63%到65%。
对于专利部门中的序列的最高一致性是对于US5962765（AAE30270.1;源自金龟子绿僵菌的蛋白酶）中的SEQIDNo:2和WO8807581（AAA54276.1；源自白色念球菌的蛋白酶）中的SEQIDNo:15的55%。
表2.从推论的蛋白酶氨基酸序列的ClustalW2.1多序列比对中得到的一致性值（分数%）
| 序列 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 1＝SEQ ID NO：18 | 100 | |||||||
| 2＝EER24932.1 | 65 | 100 | ||||||
| 3＝XP_001239485.1 | 65 | 99 | 100 | |||||
| 4＝EEP80328.1 | 64 | 73 | 72 | 100 | ||||
| 5＝XP_001247623.1 | 63 | 59 | 59 | 60 | 100 | |||
| 6＝EER23662.1 | 63 | 59 | 59 | 61 | 99 | 100 | ||
| 7＝EEP81307.1 | 63 | 59 | 59 | 63 | 62 | 61 | 100 | |
| 8＝EEQ28657.1 | 64 | 58 | 58 | 58 | 57 | 57 | 62 | 100 |
实施例2.在里氏木霉中的重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的生产
（a）制备生产载体和生产菌株
构建表达质粒pALK3097以在里氏木霉中生产重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶。通过PCR将基因及其自身的信号序列精确地熔合到里氏木霉cbh1（cel7A）启动子上。用在PCR反应中的引物命名为DET17（5’-引物；SEQIDNo:21）及DET18（3’-引物；SEQIDNo:22）。DET17引物包含从SacII位点（自ATG起位置-16）到位置-1的部分cbh1启动子和畸枝霉属蛋白酶基因的起始（包括ATG起始密码子的26个核苷酸）和5’端的三个额外的核苷酸。DET18包含从畸枝霉属蛋白酶基因（包括终止密码子）的末端起的26个核苷酸，以及包括为将基因从其3’端熔合到pALK2777连接序列（cbh1终止子；见下文）的BamHI位点的连接序列。在本构建物中不包括蛋白酶基因的自然终止子。
蛋白酶基因通过SacII-BamHI酶切消化从PCR片段中切除，熔合到用同一酶剪切的pALK2777表达载体骨架上（图2）。pALK2777质粒包含cbh1启动子（SacII位点）、包括如BamHI位点的连接序列、cbh1终止子和为筛选转化子的合成的amdS基因。pALK2777中合成的amdS基因包含与天然amdS基因（Kelly和Hynes，1985）相比缩短的终止子（XbaI位点）。另外，天然amdS基因的内含子被去除，从amdS启动子和基因中所选择的限制性位点被修饰以使构建和表达框的分离简便。然而，由合成的amdS基因编码的氨基酸序列与由野生型的amdS基因编码的氨基酸序列相同。
在NotI酶切消化之后从载体骨架中分离7.2kb的线性表达框（例3中呈现），其被用于转化里氏木霉原生质体。所用的里氏木霉宿主菌株不生产四种主要里氏木霉纤维素酶（CBHI、CBHII、EGI、EGII）中的任何一种。转化如等人（1987）所述地进行，实行了Karhunen等人（1993）所述的修改。转化子在选择平板上通过分生孢子在使其在PD上形成孢子前进行纯化。
（b）在摇瓶和实验室尺度的生物反应器中的蛋白酶生产
转化子从PD斜面接种到含有50ml基于乳糖的复合木质纤维素酶诱导培养基（Joutsjoki等人，1993）（以5%KH2PO4为缓冲液，pH6.0）的摇瓶。在30℃、250rpm的条件下培养转化子5天之后，从培养基上清液分析转化子的蛋白酶生产。在SDS-PAGE胶中，从用尽的培养基上清液中发现了一条约30kDa的主要蛋白质条带，其与重组蛋白酶的预期的质量相符合。从样本中以酪蛋白为底物来分析蛋白酶活性，如例3中所述。从培养基上清液中测量到了与宿主相比明显提高的活性。通过使用Southern印记分析从所选转化子证明了表达框整合入了真菌基因组，其中使用了几种基因组消化，使用了表达框pALK3097作为探针。
选取了在摇瓶培养中生产最佳蛋白酶活性的里氏木霉转化子来在实验室尺度的生物反应器中培养。在培养中使用了纤维素酶诱导复合培养基。由培养或浓缩样品得到的用尽的培养基用作用于重组畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的纯化和进一步生化鉴定（例3-例5）以及例6-例10中所呈现的应用测试的起始材料。
实施例3.蛋白酶活性分析
用酪蛋白为底物测量了蛋白酶活性。通过监测酸溶性肽片段随时间的释放测量了通过蛋白酶使酪蛋白降解的速率。酸溶性肽使用分光光度计定量。结果以1μg酪氨酸每分钟每ml（或g）表示。
首先，试验需要的所有试剂溶液在去离子水、Milli-Q或如下对等物中制备。
（STW）合成自来水：
制备下列原液：
（A）5.8gCaCl2×2H2O/200mlH2O
（B）2.8gMgCl2×6H2O/200mlH2O
（C）4.2gNaHCO3/200mlH2O
以所给顺序边搅拌边加入10ml这些溶液直到300ml水，然后用水补足1升。产生的溶液被称为合成自来水。
合成自来水中0.3M的Tris溶液：
在合成自来水中溶解36.3gTrizma碱（SIGMAT-1503），补足到1升。
酪蛋白溶液：
在350ml合成自来水中加入6g酪蛋白（HammarstenUsb.12840），通过磁搅拌溶解10分钟。加入50ml的Tris溶液，将溶液再搅拌10分钟。然后，将溶液加热到70℃。此后，让温度降低到50℃，用0.1MNaOH将pH值调节到8.5。继续搅拌直到室温。用合成自来水将溶液补足到500ml。底物溶液在冷藏室中最多储存3天（或者以冷冻形式储存）。
110mM三氯乙酸试剂（反应终止溶液）：
在水中溶解18gTCA（Merck807），补足到1升。
0.5MNa2CO3：
在水中溶解53gNa2CO3，补足到1升。
Folin溶液：
用水将25ml的2NFolin-Ciocalteu苯酚试剂（SIGMA，F9252）稀释到100ml。
样品稀释缓冲液：
在50mMTris-HCl缓冲液pH8.5中稀释样品。
反应中最适稀释将产生0.4-0.8的吸光度。
试验：
以在试管中在50℃下5分钟调节2.5ml底物溶液温度开始试验。然后加入0.5ml稀释酶溶液，使用漩涡混合器混合，在50℃下进行反应30分钟整。酶空白对照像样品一样制备，但是在样品之前加反应终止溶液（110mMTCA）到试管中。反应后，将2.5ml终止溶液加入试管（非空白对照），将其混合，室温静置30分钟。试管以4000rpm离心10分钟（HettichRotanta460）。将一毫升清澈上清液与2.5ml0.5MNa2CO3和0.5ml稀释Folin试剂混合。等待10分钟（显色）后，在660nm处对比酶空白对照来测量混合物（颜色）的吸光度。
每种测量至少使用两组平行样本。
实施例4.重组蛋白酶的纯化
从由发酵得到的用过的培养基中通过+4℃、50000g、离心30分钟（SorvallRC6plus）去除细胞和固体（例2）。使用8ml上清液来纯化蛋白酶。在冷室中操作所有纯化步骤。离心后，在用于在20mMMESpH5.3中平衡过的HiPrep26/10去盐柱（来自GEHealthcare公司）之前，样品通过0.44微米滤膜过滤（MILLEXHVMillipore）。胶过滤过的样品用于在20mMMESpH5.3中平衡过的1mlSSepharoseHP柱（来自GEHealthcare公司）。蛋白质使用NaCl递增梯度(0.5M)洗提。集合包含有蛋白酶的部分，并使用AmiconUltra-410,000CO离心过滤装置MILLIPORE浓缩。样品进一步使用在20mMMES，150mMNaClpH5.3中平衡过的Superdex75胶过滤柱纯化。合并包含有蛋白酶的部分，并将其用于pH和温度曲线的鉴定。终样品在SDS-PAGE胶上分析（图4）。
实施例5.重组蛋白酶的特征
温度曲线
通过使用如例3所述的试验得到了重组畸枝霉属蛋白酶和的温度曲线。结果在图5A中显示。蛋白酶的最适温度在70℃左右。
pH曲线
如例3所述地以酪蛋白为底物在50℃下测定了畸枝霉属蛋白酶和 的pH曲线，不同之处在于：稀释酶样品，在40mMBritton-Robinson缓冲液中溶解酪蛋白，将反应pH调节到pH6-10，反应时间是30分钟，使用含有0.22M乙酸钠和0.33M乙酸的0.11MTCA溶液终止酶反应。结果在图5B中显示。从pH6到pH10，重组蛋白酶显示了超过50%的相对活性，其最佳活性在pH10左右。
实施例6.不同温度下液态去垢剂中的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的去垢性能
测试了在10、20、30和50℃下，市售液态去垢剂（表3）存在、浓度为5g/l的条件下，如例2中所述的产自木霉菌属的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶去除血液/奶/墨水标准污垢的能力。使用标准污垢、即人为弄脏的测试布Art.117（血液/奶/墨水，聚脂纤维+棉，序列号11-08或10-07，瑞士EMPATestmaterialenAG公司）作为测试材料。使用市售蛋白酶制剂和Ultra16L（包含蛋白酶抑制剂，4-FBPA）以及无酶（对照）处理作为对比。每种酶制剂的剂量为0-8或0-16酶活力单位（μg酪氨酸/分钟）每毫升洗液。如例3所述测量了酶活力。
表3.市售液态去垢剂的组分
| 成分 | % |
| 阴离子表面活性剂 | 15-30 |
| 非离子表面活性剂、肥皂 | 5-15 |
| 膦酸酯、聚羧酸 | 5 |
| 光亮剂和香料 | |
| pH8.2-8.6 |
在一升自来水（dH≤4）中溶解5g市售液态去垢剂，用磁搅拌器充分混合，温度调到洗涤温度。洗液中pH值大约是8。污染织物先剪成1.5cm×1.5cm的样品，并通过剪角落使各片织物变圆。将小片放到微量滴定板（Nunc150200）的凹槽中。在每个直径为2cm的凹槽中，在织物上面加入1.5ml含有去垢剂和酶的水稀释液（约50μl）的洗液。含有样品的滴定板在10、20、30和50℃、130rpm条件下在InforsEcotron恒温振荡培养箱中孵育60分钟。此后用流水（大约在洗涤温度下）仔细漂洗样品，在栅格上用室内空气过夜干燥，防止日光。
通过使用了L*a*b*颜色空间坐标系（光源D65/2°）的MinoltaCM2500分光光度计以反射系数值来测量颜色，从而评估去垢效应。处理后测量了样品两侧的颜色。每个值是至少2次平行织物样品的从织物两侧测量的平均值。表示蛋白酶性能（去垢效率）的血液/奶/墨水的退色以ΔL*来计算，其表示酶处理织物的亮度值L*减去无酶洗液（酶空白对照）处理织物的亮度值L*。
图6A到6D中显示的结果表明，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶与市售制剂相比在所有温度下对血液/奶/墨水污垢（Art.117，序列号11-08）具有明显更好的效果。发现在无酶情况下（只有去垢剂）更难去除旧批次（序列号11-07）的血液/奶/墨水污垢，因此酶的贡献（ΔL*）与新批次11-08测试的相比明显更高。与相比，畸枝霉属制剂对此更顽固的旧批次污垢材料甚至更加高效（图7A到7D）。同时，如果使用剂量以所加入的蛋白质的量来计算（图8A到8D），则马拉分支霉ALKO4122蛋白酶的去垢效率是最高的。通过Bio-Rad蛋白质试验（加拿大Bio-RadLaboratories，Hercules）测定酶制剂中的蛋白质的量，其使用牛丙种球蛋白（Bio-Rad）作为标准。
出人意料的是，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在非常广泛的温度范围、尤其是如10-30℃的低温下显示了最佳去垢性能，尽管以酪蛋白为底物的分析条件下其具有很高的最适温度（约70℃，图5A）。在分析条件下具有相似温度曲线的（图5A）清晰地显示了在冷洗温度下较低的性能。这些测试结果表明，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在去垢剂存在下在广泛的温度范围、甚至在很低的洗涤温度下也具有优良性能。
实施例7.畸枝霉属ALKO4122蛋白酶和液态去垢剂对不同污垢的清洗检验
测试了相比于市售酶制剂Ultra16L，如例2所述的产生于木霉菌属的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶和市售液态去垢剂在30和60℃下去除不同污垢的能力。使用了下列来自于EMPA的人为弄脏的测试布：血液/奶/墨水（Art.117，序列号11-08或10-07，聚脂纤维+棉）、血液/奶/墨水（Art.116，序列号18-16，棉）、草（Art.164，序列号23-03，棉）和可可（Art.112，序列号31-06，棉）。织物剪成6cm×6cm的样品，角落用曲线缝制弄整齐。
如下所述地在LP-2清洗检验仪中实行去垢处理。清洗检验仪先预热到30或60℃。然后往含有250ml调节洗液和脏污样品的1.2升容器中加入每毫升洗液0、2、5、10和20（40）酶活力单位的酶。如例3所述地测量活性（μg酪氨酸/分钟）。洗液包含5g市售液态去垢剂（表3）每升自来水（dH≤4），其pH值约为8。清洗检验仪在30℃运作60分钟，转速为42rpm。其后用流水（约20℃）仔细漂洗样品，在栅格上用室内空气过夜干燥，防止日光。
通过使用了L*a*b*颜色空间坐标系的MinoltaCM2500分光光度计测量了处理后样品的颜色，如例6所述地以ΔL*来计算去垢效果。在处理后测量了样品两侧的颜色。每个值是每个样品至少12次测量的平均值。测量没有在因折叠织物（棉中污垢Art.116和Art.112）而在处理过程中形成的折痕区域中进行。
图9A到9H中显示的结果表明，相比于市售蛋白酶制剂Ultra16L，在30和60℃下，马拉分支霉ALKO4122蛋白酶对草污垢（Art.164，序列号23-03）和不同的血液/奶/墨水污垢（Art.117，序列号11-08和11-07，Art.116，序列号18-16）都有更好的效果。10-20单位的Ultra16L每重量洗液的剂量相当于每重量去垢剂中含约0.4-0.7%的酶制剂的剂量，其对去垢剂酶而言是在典型的使用水平范围内。
同时，从可可污垢中取得的结果显示，畸枝霉属相比于Ultra16L（数据未显示）更好。在额外的清洗检验（数据未显示）中，发现畸枝霉属还对于下列CFT（荷兰CenterforTestmaterialsBV）污垢在30℃下有效：花生油、色素、高奶（C-10）、蛋黄、颜料、陈年污垢（CS-38）、草提取物（CS-08）。在所有测试中使用了同样的市售液态去垢剂。这些测试的结果表明，畸枝霉属蛋白酶在广泛的温度范围30-60℃下对几种污垢有效。
实施例8.畸枝霉属ALKO4122蛋白酶和去垢剂粉的去垢性能
在50℃下测试了生产自木霉菌属的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在去垢剂（5g/l）存在下去除血液/奶/墨水标准污垢的能力，其使用了与如例7所述相似的测试体系，不同之处在于使用了包含漂白剂、光亮剂和磷酸盐/磷酸酯的市售传统去垢剂粉以及不含光亮剂和漂白剂的ECE参考去垢剂77（Art.601，EMPA）。也通过使用了L*a*b*颜色空间坐标系的MinoltaCM2500分光光度计测量处理后样品的颜色，并且如例6所述地以ΔL*来计算去垢效果。
结果（图10A和10B）显示，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶也可以与去垢剂粉末一起在高度碱性条件下（pH值约为10-10.5）使用。
实施例9.畸枝霉属ALKO4122蛋白酶的储藏稳定性
测试了生产自木霉菌属的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在37℃下的储藏情况，所用配方如下：1）0.2%（w/w）ProxelLV（防腐剂，英国ArchBiosides），pH值调节到6；2）20%丙二醇，pH值调节到6；3）50%丙二醇，pH值调节到5.5。样品装入Sarstedt试管（13ml），在37℃孵育。在特定间隙测量活性（如例3所述），并与在相似条件下、从镰孢菌属蛋白酶Fe_RF6318(WO2010125174A1)中得到的早期结果相比较。
图11显示了畸枝霉属ALKO4122蛋白酶与野生型镰孢菌属蛋白酶Fe_RF6318相比在高温(37℃)下具有优良稳定性。当使用丙二醇以提高稳定性时，经7天孵育后的镰孢菌属蛋白酶的残留活性约为20%，但畸枝霉属蛋白酶在那段时间内没有损失活性。
实施例10.畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在液态去垢剂中的稳定性
在市售液态去垢剂（表3）和轻型生态标签标准洗涤剂（Ch.Nr.196-391，wfkTestgewebeGmbH公司）中测试了生产自木霉菌属的畸枝霉属ALKO4122蛋白酶在37℃下的稳定性。使用了和镰孢菌属蛋白酶Fe_RF6318(WO2010125174A1)作为参考。
使用了如下测试系统：0.4g酶制剂和9.6g去垢剂溶液在Sarstedt试管(13ml)中充分混合。在与其他组分混合前，在去垢剂中加入0.2%ProxelLV作为防腐剂。在市售液态去垢剂中制备的样品的pH值大约为8。在生态标签标准洗涤剂中制备的样品的pH值大约为7.2。在37℃下孵育试管，根据例3中描述的方法在特定时间间隔处测量蛋白酶活性。
图12显示了在液态去垢剂中在高温(37℃)的条件下，畸枝霉属ALKO4122蛋白酶与野生型镰孢菌属蛋白酶Fe_RF6318(WO2010125174A1)相比具有很好的稳定性。在生态标签标准洗涤剂中与相比，畸枝霉属蛋白酶具有类似的稳定性。
在室温下观察到了优异的稳定性（数据未显示）。
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Claims (32)
1.一种由编码丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列构成的分离的核酸分子，其选自于：
(a)一种核酸分子，其编码具有丝氨酸蛋白酶活性且由如SEQIDNO:18所述的氨基酸序列构成的多肽；
(b)一种核酸分子，其由如SEQIDNO:17所述的核苷酸序列的编码序列构成；
(c)一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的简并性而与(b)的核酸分子的编码序列不同，而与(b)的核酸分子编码的氨基酸序列相同；以及
(d)一种核酸分子，其由与核酸分子SEQIDNO:17互补的多核苷酸序列构成。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子由多核苷酸序列构成，其与包括在以登记号DSM24426保藏的大肠杆菌RF8758中的由核苷酸序列SEQIDNO:11构成的质粒pALK3092中的多核苷酸序列互补，或者与包括在以登记号DSM24427保藏的大肠杆菌RF8759中的由核苷酸序列SEQIDNO:12构成的质粒pALK3093中的多核苷酸序列互补。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸分子，其特征在于，分离的核酸分子由与核酸分子SEQIDNO:17互补的多核苷酸序列构成。
4.一种重组表达载体，其包括可操作地连接到能在适宜宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶的表达的调控序列上的根据权利要求1所述的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其包括根据权利要求4所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主是微生物宿主。
7.根据权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主是丝状真菌。
8.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主是木霉菌属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、金孢子菌属、链孢霉属、根霉属菌、青霉菌属、毁丝霉属和被孢霉属中的属的。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主是木霉菌属或曲霉属的。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主是里氏木霉。
11.一种生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括步骤：培养根据权利要求5所述的宿主细胞；以及回收多肽。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述分离的核酸分子并入宿主细胞的基因组，并且在纤维素酶诱导复合培养基中进行培养。
13.一种重组的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并由根据权利要求1所述的分离的核酸分子编码的氨基酸序列构成。
14.根据权利要求13所述的重组的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由如SEQIDNO:18所示的氨基酸序列构成。
15.根据权利要求13或14所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由畸枝霉属ALKO4122的保藏菌株CBS128533或由畸枝霉属ALKO4178的保藏菌株CBS128564得到。
16.根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶的成熟形式具有在20到35kDa之间的分子量。
17.根据权利要求16所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶的成熟形式具有在25到33kDa之间的分子量。
18.根据权利要求17所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶的成熟形式具有在28到30kDa之间的分子量。
19.根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于，在pH8.5下使用30分钟反应时间且以酪蛋白为底物，所述酶的最适温度是从50℃到80℃。
20.根据权利要求19所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于，在pH8.5下使用30分钟反应时间且以酪蛋白为底物，所述酶的最适温度为70℃。
21.根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于，在50℃温度下使用30分钟反应时间且以酪蛋白为底物，所述酶的最适pH值是pH10。
22.一种酶制剂，其包括根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶。
23.根据权利要求22所述的酶制剂，其特征在于，所述制剂包括选自于含有或不含介体的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶和氧化酶的其他酶。
24.根据权利要求22到23中任一项所述的酶制剂，其特征在于，所述制剂包括选自于稳定剂、缓冲液、表面活性剂、增洁剂、漂白剂、介体、防蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光亮剂、染料、色素、香料和防腐剂中的一种或多种添加剂。
25.根据权利要求22所述的酶制剂，其特征在于所述酶制剂以液体、粉末、颗粒或片剂的形式存在。
26.根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶或根据权利要求22所述的酶制剂在去垢剂方面，在处理纤维方面，在处理蛋白质材料方面，或者在处理食物或饲料方面的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述处理蛋白质材料方面选自于涉及修饰、降解或去除蛋白质材料的应用方面。
28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述蛋白质材料选自毛、发、皮革和丝。
29.根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶或根据权利要求22所述的酶制剂作为去垢剂添加剂的应用。
30.根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶或根据权利要求22所述的酶制剂作为去垢剂添加剂在制备液态去垢剂、去垢剂粉末和去垢剂片剂中的应用。
31.一种去垢剂组分，其特征在于，所述组分包括表面活性剂、根据权利要求13所述的重组丝氨酸蛋白酶或根据权利要求22所述的酶制剂，以及选自于稳定剂、缓冲液、增洁剂、漂白剂、介体、防蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光亮剂、染料、色素、香料和防腐剂中的添加剂。
32.根据权利要求31所述的去垢剂组分，其特征在于，所述组分中包括选自于含有或不含介体的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶和氧化酶的其他酶。
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