CN102625843B

CN102625843B - 一种新型真菌蛋白酶及其用途

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Publication number: CN102625843B
Application number: CN201080030241.0A
Authority: CN
Inventors: L·瓦尔塔卡里; K·琼图南; S·马基南; J·卡利奥; J·维马安佩拉; P·奥贾帕洛; M·帕洛海莫
Original assignee: AB Enzymes Oy
Current assignee: AB Enzymes Oy
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: US20130065810A2; BRPI1014959B1; BRPI1014959A2; FI121712B; JP5698217B2; US20110003729A1; US8603795B2; CN102625843A; KR101739770B1; WO2010125174A1; DK2424992T3; EP2424992B1; US8937170B2; MY152952A; EP2424992A1; KR20120096872A; RU2566549C2; US20140134706A1; RU2011145540A; MX2011011528A

Abstract

本发明涉及一种真菌丝氨酸蛋白酶，其包含成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列，所述成熟Fe_RF6318酶具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列。所述丝氨酸蛋白酶可自木贼镰孢获得，更优选来自保藏菌株CBS 119568。公开的还有编码所述蛋白酶的核酸序列，例如保藏在检索号为DSM 22171的大肠杆菌RF7664中的包含核苷酸序列SEQ ID NO：9的质粒pALK2521，以及保藏在检索号为DSM 22172的大肠杆菌RF7800中的包含全长基因SEQ ID NO：10的质粒pALK2529。所述蛋白酶可用作酶制剂，其可应用于洗涤剂组合物以及用于处理纤维、用于处理毛织品、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食品或饲料或用于涉及修饰、降解或去除蛋白质材料的任何应用。

Description

一种新型真菌蛋白酶及其用途

发明领域

本发明涉及在多种应用、特别是衣物和餐具洗涤剂中有用的一种真菌丝氨酸蛋白酶。本发明涉及编码所述酶的核酸分子、重组载体、用于产生所述酶的宿主细胞、包含所述酶的酶组合物以及用于制备这类组合物的方法。本发明还涉及所述酶或包含所述酶的组合物的各种用途。

发明背景

微生物蛋白酶为最重要的水解酶之一，并发现其在各个产业部门，例如洗涤剂、食品、皮革、药品、诊断、废物管理和银回收方面具有应用。微生物胞外蛋白酶占全球工业酶总销售的主要部分(1/3以上)(Cherry和Fidantsef，2003)。近90％的商业蛋白酶为洗涤剂用酶(Gupta等，2002)。大多数商业蛋白酶(主要中性和碱性)由属于杆菌属(Bacillus)的生物产生。

枯草蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶或由杆菌种产生的枯草蛋白酶形成工业蛋白酶的最大亚群。这些酶作为洗涤剂的蛋白质降解组分或添加剂，在商业上重要。目前使用中的商业洗涤剂制剂包括源自杆菌种的天然产生的碱性丝氨酸蛋白酶，或为重组蛋白酶制剂(Maurer，2004)。具有改进的催化效率和/或对温度、氧化剂和变化的洗涤条件具有更好稳定性的天然酶变体，已通过定向诱变和/或随机诱变开发。商业蛋白酶的实例为例如枯草蛋白酶Carlsberg(AlcalaseNovozymes，DK)、枯草蛋白酶309(SavinaseNovozymes，DK)、枯草蛋白酶147(EsperaseNovozymes，DK)、Kannase(Novozymes，DK)、Purafect(Genencor Inc.，USA)、PurafectOx、Properase(Genencor Inc.，USA)以及BLAP S和X系列(Henkel，DE)。

数种碱性丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)和编码这些酶的基因也已从真核生物(包括酵母和丝状真菌)中分离。美国专利第3,652,399号和EP519229(Takeda Chemical Industries，Ltd.，JP)公开了一种源自镰孢属(Fusarium)(无性状态，有性型)或赤霉属(Gibberella)(性状态，无性型)的碱性蛋白酶，具体地来自镰孢种(Fusarium sp.)S-19-5(ATCC 20192，IFO 8884)、亚麻尖镰孢(F.oxysporum f.sp.lini)(IFO 5880)或小麦赤霉(G.saubinetti)(ATCC 20193，IFO6608)，所述碱性蛋白酶可用于配制洗涤剂和其它清洁剂组合物。WO 88/03946和WO 89/04361(NovoIndustri A/S，DK)公开了包含蛋白酶和脂肪酶的酶促除垢添加剂和洗涤剂组合物，其中所述真菌蛋白酶来自镰孢，具体地尖镰孢(F.oxysporum)或腐皮镰孢(F.solani)。在WO89/06270中公开了一种除垢添加剂，其包含对邻近仅一或两个特定氨基酸的肽键特异的蛋白酶。WO1994025583(NovoNordisk A/S，DK)公开了可从镰孢种(具体地尖镰孢的菌株(DSM 2672))中得到的一种活性胰蛋白酶样蛋白酶，和编码所述蛋白酶的DNA序列。在WO 2006101140(SODX Co.Ltd，Nakamura)中公开了源自镰孢种BLB(FERM BP-10493)的新型蛋白酶的氨基酸序列。另外，已报道来自真菌种(例如念球属(Tritirachium)和耳霉属(Conidiobolus))的碱性蛋白酶(在Anwar和Saleemuddin，1998中综述)。

在不同应用中使用真菌丝氨酸蛋白酶也已从数个专利申请中得知。例如，在WO 1992018599(NovoNordisk A/S)中公开了作为除垢添加剂或洗涤剂组合物的纤维素酶和蛋白酶(具体地来自镰孢种DSM2672的胰蛋白酶样蛋白酶)的组合。如在WO 1992003529和WO1992005239(NovoNordisk A/S)中所公开，这类洗涤剂组合物可进一步包含可逆的蛋白酶抑制剂用于使酶稳定。在WO 1997028243(NovoNordisk A/S)中公开了使用酶杂合体从纤维素织物中去除或漂白污物或污迹的方法，所述酶杂合体包含这类蛋白酶的催化活性氨基酸序列，其与包含纤维素结合域的氨基酸序列连接。WO 1997002753(NovoNordisk A/S)公开了使用脂肪酶和蛋白酶(优选地为可从镰孢得到的丝氨酸蛋白酶)温和清洗受污工艺设备的方法。在EP 1464626专利申请(Biovitis S.A.，FR)中公开了木贼镰孢(F.equiseti)和其它真菌在减少废水中的有机物中的用途。

社会经济挑战和政府规章已迫使洗涤剂产业考虑许多环境问题，不仅包括使用更温和的化学制品(其可小量使用并因此遗留更少的环境废迹)，还包括节能的需要。洗涤剂用酶(具体地蛋白酶)为洗涤剂组合物中的重要组分。通过降低洗涤温度节约能源的需要和不可耐高温的合成纤维的使用增加以及当前的生活方式，已将消费者习惯向低洗涤温度转变，并已造成对在低温下有效的新酶的需求。

尽管已出版大量专利出版物、综述和论文这一事实，其中已公开(例如在EP 0290567和EP 0290569(Novo Nordisk A/S，DK)中)来自各种微生物的丝氨酸蛋白酶，例如，来自放线菌(达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei))和真菌(马昆得拟青霉(Paecilomycesmarquandii))微生物的低温碱性蛋白酶，但是对备选的丝氨酸蛋白酶仍有巨大需求，所述丝氨酸蛋白酶在修饰、降解和去除蛋白质物质(特别地在低或中温范围)中适用并有效，并且在存在具有高度变化特性的洗涤剂的情况下稳定。

洗涤剂产业在使其新产品适应消费者习惯和需要、新纺织产品的性质和新洗涤机方面正在取得巨大进步。显然，当开发新洗涤剂(具体地衣物和餐具洗涤组合物)时，必须满足大范围变化和迅速改变的需求。为了满足洗涤剂产业和政府规章的所有变化需求，用于洗涤剂组合物的新丝氨酸蛋白酶组分不仅应该能够在宽pH和温度范围内完成其任务并在各种条件下(包括与各种不同洗涤剂联合的机械和化学干预)保持稳定，还需要的是，所述丝氨酸蛋白酶可大量生产，这可通过简化从发酵液和菌丝体中的分离而节约下游处理成本。

发明概述

本发明的目的为提供一种真菌来源的丝氨酸蛋白酶，其显示宽的底物特异性，在宽pH范围下有活性并具有宽的最适温度，即在低温和中温均起作用。用于衣物和餐具洗涤剂的丝氨酸蛋白酶必须在存在洗涤剂的情况下也稳定或与洗涤剂兼容。具体而言，本发明的目标为提供一种丝氨酸蛋白酶，其能够在比目前商业酶制剂更低的温度下去除蛋白质材料(包括在洗涤衣物和餐具中的污迹)，从而节约能源。所述真菌丝氨酸蛋白酶可在高产的真菌宿主中产生，且其下游处理(例如分离发酵液和菌丝体)容易进行。

本发明涉及一种真菌丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性且包含如SEQ ID NO：15定义的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15定义的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。

本发明的酶可自木贼镰孢得到，更优选来自保藏菌株CBS119568。

所述酶具有在25-35kDa之间的分子质量。所述酶在pH 9具有在30℃-70℃范围的最适温度。所述酶在50℃具有在至少pH 6-pH 11的pH范围的最适pH。最适温度和pH使用15min反应时间和酪蛋白作为底物来确定。本发明的丝氨酸蛋白酶能够在10℃-60℃之间、存在洗涤剂的情况下降解或去除蛋白质污迹。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在严格条件下与包含在质粒pALK2521中的多核苷酸序列杂交，所述质粒包含核苷酸序列SEQ ID NO：9，保藏在检索号为DSM22171的大肠杆菌RF7664中。

所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列编码这样的多肽，其包含如SEQ ID NO：15定义的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15定义的成熟Fe_RF6318的氨基酸序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。优选地，所述酶由分离的核酸分子编码，所述核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：14。

本发明的全长真菌丝氨酸蛋白酶由包含在pALK2529中的多核苷酸序列编码，pALK2529保藏在检索号为DSM 22172的大肠杆菌RF7800中。

所述真菌丝氨酸蛋白酶从重组表达载体中产生，所述重组表达载体包含编码本发明真菌丝氨酸蛋白酶的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接到能够在适宜宿主中指导丝氨酸蛋白酶编码基因表达的调控序列。适宜宿主包括异源宿主，优选下列属的微生物宿主：木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、镰孢、腐质霉(Humicola)、金孢子菌(Chrysosporium)、脉孢菌(Neurospora)、根霉(Rhizopus)、青霉(Penicillium)和被孢霉(Mortiriella)。

优选所述酶在木霉或曲霉中产生，最优选在里氏木霉(T.reesei)中产生。

本发明还涉及编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离核酸分子，所述核酸分子选自：

(a)以下核酸分子，其编码具有丝氨酸蛋白酶活性并包含如SEQID NO：15所述的氨基酸序列的多肽；

(b)以下核酸分子，其编码具有丝氨酸蛋白酶活性并与SEQ IDNO：15的氨基酸序列具有至少86％同一性的多肽；

(c)以下核酸分子，其包含如SEQ ID NO：10所述的核苷酸序列的编码序列；

(d)包含以下多核苷酸序列的编码序列的核酸分子，所述多核苷酸序列包含于DSM 22171或DSM 22172中；

(e)以下核酸分子，其编码序列与(c)-(d)的任一核酸分子的编码序列由于遗传密码的简并性而不同；和

(f)以下核酸分子，其在严格条件下与包含在DSM 22171中的核酸分子杂交，并编码以下多肽，该多肽具有丝氨酸蛋白酶活性并且具有显示与如SEQ ID NO：15所述的氨基酸序列有至少86％同一性的氨基酸序列。

本发明进一步涉及包含本发明核苷酸序列的重组表达载体，所述核苷酸序列可操作地连接到能够在适宜宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因表达的调控序列。适宜宿主包括异源宿主，优选下列属的微生物宿主：木霉、曲霉、镰孢、腐质霉、金孢子菌、脉孢菌、根霉、青霉和被孢霉。优选所述酶在木霉或曲霉中产生，最优选在里氏木霉中产生。

本发明还涉及包含如上所述重组表达载体的宿主细胞。优选地，宿主细胞为微生物宿主，例如丝状真菌。优选宿主为下列属的：木霉、曲霉、镰孢、腐质霉、金孢子菌、脉孢菌、根霉、青霉和被孢霉。更优选宿主为木霉或曲霉，最优选为丝状真菌里氏木霉。

本发明涉及产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：培养本发明的宿主细胞和回收多肽。亦在本发明中的是，由本发明核酸序列编码的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，并且所述多肽可通过上述方法得到。

本发明涉及获得酶制剂的方法，所述方法包括以下步骤：培养本发明的宿主细胞，和从细胞中回收多肽或从培养基中分离细胞并获得上清液。亦在本发明中的是，可通过上述方法获得的酶制剂。

本发明涉及一种酶制剂，其包含本发明的丝氨酸蛋白酶。

本发明的酶制剂可进一步包含含或不含介质的其它酶以及合适的添加剂，所述其它酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或氧化酶，所述添加剂选自：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、防蚀剂、增效剂、抗再沉积剂、荧光增白剂、染剂、色素、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂，等等。

因此，可使用生产宿主的耗尽培养基，或者可去除宿主细胞，和/或可将其浓缩、过滤或分级。也可将其干燥。本发明的酶制剂可呈液体、粉末或颗粒形式。

亦在本发明中的是，本发明的丝氨酸蛋白酶或酶制剂在洗涤剂、处理纤维、处理毛织品、处理毛发、处理皮革、处理食品或饲料或涉及修饰、降解或去除蛋白质材料的任何应用中的用途。具体而言，所述酶或酶制剂可用作在洗涤液和洗涤粉中的除垢添加剂。

附图简述

图1显示了木贼镰孢RF6318 Fe prtS8A基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。通过SignalP V3.0程序分析推定的信号肽以小写字母和下划线表示。前序列(pro sequence)和前序列的推导氨基酸以小写字母表示。成熟核苷酸和肽序列以大写字母表示(N末端序列根据纯化的野生型Fe_RF6318蛋白确定)。推定内含子序列的位置以小写、斜体字母表示并在核苷酸序列下以虚线标记。终止密码子通过序列下的星号显示。从野生型Fe_RF6318蛋白获得的N末端序列和肽序列用灰色背景突出。

图1A显示了Fe prt8A基因从ATG起始密码子到CCT密码子(核苷酸898-900)的核苷酸序列，该序列区编码Fe_RF6318蛋白从Met1到Val278的氨基酸序列。

图1B显示了Fe prt8A基因从CTC密码子(核苷酸901-903)到TAA终止密码子的核苷酸序列，该序列区编码Fe_RF6318蛋白从Leu279到Ala412的氨基酸序列。

图2示意性地显示了用于在里氏木霉中表达Fe prt8A基因的盒。

图3显示了在12％SDS PAGE凝胶上分析的部分纯化的重组Fe_RF6318蛋白。泳道1：部分纯化的Fe_RF6318样品，泳道2：MW标记(Bench Mark Protein Ladder，Invitrogen)。

图4A描述在pH 9使用15min反应时间和酪蛋白作为底物测定的重组蛋白Fe_RF6318的温度概况。数据点为三次独立测量的平均值。

图4B描述了pH对重组Fe_RF6318蛋白活性的影响。所用缓冲液为40mM Britton-Robinson缓冲液，使用酪蛋白作为底物，反应时间为15min且反应温度为50℃。数据点为三次独立测量的平均值。

图5描述了重组Fe_RF6318蛋白在30℃、pH 9、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art 116，EMPA)的性能。将商业制剂Savinase Ultra16L(Novozymes A/S，DK)和Purafect4000L(Genencor Inc.，USA)用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图6描述了重组Fe_RF6318蛋白在50℃、pH 9、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art 116，EMPA)的性能。将商业制剂Savinase Ultra16L和Purafect4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图7A描述了在存在洗涤粉(Art.601，EMPA)的情况下，重组Fe_RF6318蛋白在40℃、约pH 10、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art117，EMPA)的性能。将商业制剂Purafect4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图7B描述了在存在洗涤粉和漂白剂(Art.604和606，EMPA)的情况下，重组Fe_RF6318蛋白在40℃、约pH 10、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art 117，EMPA)的性能。将商业制剂Purafect4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图8A描述了在存在洗涤粉(Art.601，EMPA)的情况下，重组Fe_RF6318蛋白在50℃、约pH 10、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art117，EMPA)的性能。将商业制剂Purafect4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图8B描述了在存在洗涤粉和漂白剂(Art.604和606，EMPA)的情况下，重组Fe_RF6318蛋白在50℃、约pH 10、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art 117，EMPA)的性能。将商业制剂Purafect4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图9显示了重组Fe_RF6318蛋白与液体洗涤剂Ariel Sensitive在40℃、约pH 7.9、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art 117，EMPA)的性能。将商业制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L用于比较。x轴显示酶用量(活性单位/ml)，y轴显示ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图10显示了重组Fe_RF6318蛋白与不同浓度的用于有色织物的液体碱性洗涤剂(liquid base detergent)在30℃下对于血/牛奶/墨水污迹(Art 117，EMPA)的性能。将商业制剂Purafect4000L和SavinaseUltra 16L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图10A显示了在5g/l洗涤剂浓度和pH 7.5下的性能。

图10B显示了在5g/l洗涤剂浓度下的性能(酶用量以蛋白质计)。

图10C显示了在3.3g/l洗涤剂浓度和pH 7.4下的性能。

图10D显示了在1g/l洗涤剂浓度和pH 7.3下的性能。

图11显示了重组蛋白Fe_RF6318与不同浓度Ariel Sensitive(无酶)在30℃下，在织物上对于血/牛奶/墨水污迹(Art 117，EMPA)的性能。将商业制剂Purafect4000L和SavinaseUltra 16L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图11A显示了在5g/l洗涤剂浓度和pH 8下的性能。

图11B显示了在5g/l洗涤剂浓度下的性能(酶用量以蛋白质计)。

图11C显示了在3.3g/l洗涤剂浓度和pH 7.9下的性能。

图11D显示了在1g/l洗涤剂浓度和pH 7.6下的性能。

图12显示了重组蛋白Fe_RF6318与液体洗涤剂Ariel Sensitive(无酶)在30℃下，在Launder Ometer试验中对不同污迹的性能。将商业制剂Savinase Ultra 16L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图12A显示了对血/牛奶/墨水/PE-棉(Art.117，EMPA)的性能。

图12B显示了对血/牛奶/墨水/棉(Art.116，EMPA)的性能。

图12C显示了对草(Art.164，EMPA)的性能。

图13显示了重组蛋白Fe_RF6318与用于有色织物的液体碱性洗涤剂在30℃下，在Launder Ometer试验中对不同污迹的性能。将商业制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图13A显示了对血/牛奶/墨水/PE-棉(Art.117，EMPA)的性能。

图13B显示了对血/牛奶/墨水/棉(Art.116，EMPA)的性能。

图13C显示了对草(Art.164，EMPA)的性能。

图13D显示了对可可粉(Art.112，EMPA)的性能。

图14描述了Fe_RF6318酶制剂在全规模洗涤试验中，对八种不同的蛋白酶敏感污迹(表5)的总污迹去除效率(Δ％SR)。将商业制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L用于比较。

图14A描述了当根据活性施用蛋白酶制剂时的总污迹去除效率。

图14B描述了当根据蛋白质量施用蛋白酶制剂时的总污迹去除效率。

图15描述了在30℃下、全规模试验中与用于有色织物的液体碱性洗涤剂(liquid detergent base)的污迹去除效率。

图15A描述了对血/牛奶/墨水/棉(C-05-014/CFT)的污迹去除。

图15B描述了对血/牛奶/墨水/PE-棉(C-05-014/CFT)的污迹去除。

图15C描述了对巧克力奶/色素/棉(C-03-030/CFT)的污迹去除。

图15D描述了对花生油/牛奶/棉(C-05-014/CFT)的污迹去除。

图15E描述了对蛋黄/色素/棉(CS-38-010/CFT)的污迹去除。

图16描述了重组Fe_RF6318蛋白在温度10℃-60℃、pH 9、60min对于血/牛奶/墨水污迹(Art 117，EMPA)的性能。将商业制剂SavinaseUltra16L(Novozymes A/S，DK)、Purafect4000L(Genencor Inc.，USA)和Properase4000E(Genencor Inc.，USA)用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图16A显示了重组蛋白Fe_RF6318和商业蛋白酶制剂在10℃的性能。

图16B显示了重组蛋白Fe_RF6318和商业蛋白酶制剂在20℃的性能。

图16C显示了重组蛋白Fe_RF6318和商业蛋白酶制剂在30℃的性能。

图16D显示了重组蛋白Fe_RF6318和商业蛋白酶制剂在40℃的性能。

图16E显示了重组蛋白Fe_RF6318和商业蛋白酶制剂在50℃的性能。

图16F显示了重组蛋白Fe_RF6318和商业蛋白酶制剂在60℃的性能。

图17显示了在3.3g/l浓度的液体碱(Liquid Base)的情况下，重组Fe_RF6318蛋白在10℃和20℃下对于血/牛奶/墨水污迹(Art 117，EMPA)的性能。将商业制剂SavinaseUltra 16L、Purafect4000L和Properase4000 E用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的亮度值L^*-仅用缓冲液处理的织物的亮度值L^*(酶空白)。

图17A显示了在10℃的性能。

图17B显示了在20℃的性能。

序列表

SEQ ID NO：1来自木贼镰孢RF6318蛋白酶的氨基末端肽#3792的序列。

SEQ ID NO：2来自木贼镰孢RF6318蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1246.673的序列。

SEQ ID NO：3来自木贼镰孢RF6318蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段3341.633的序列。

SEQ ID NO：4来自木贼镰孢RF6318蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1503.799的序列。

SEQ ID NO：5源自氨基末端肽SEQ ID NO：1的寡核苷酸引物PRO87的序列。

SEQ ID NO：6源自氨基末端肽SEQ ID NO：1的寡核苷酸引物PRO88的序列。

SEQ ID NO：7源自肽SEQ ID NO：4的寡核苷酸引物PRO89的序列。

SEQ ID NO：8源自肽SEQ ID NO：4的寡核苷酸引物PRO90的序列。

SEQ ID NO：9使用引物PRO88(SEQ ID NO：6)和PRO89(SEQ ID NO：7)并以木贼镰孢RF6318基因组DNA作为模板得到的PCR片段的序列。

SEQ ID NO：10全长木贼镰孢RF6318蛋白酶基因(Fe prtS8A)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11全长木贼镰孢RF6318蛋白酶(Fe_RF6318)的推导氨基酸序列，包括从Met1到Ala412的氨基酸。

SEQ ID NO：12编码酶原形式木贼镰孢RF6318蛋白酶氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13酶原形式木贼镰孢RF6318蛋白酶的氨基酸序列，包括全长蛋白酶的氨基酸Ala21至Ala 412。

SEQ ID NO：14编码成熟形式木贼镰孢RF6318蛋白酶氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15成熟形式木贼镰孢RF6318蛋白酶的氨基酸序列，包括全长酶的氨基酸Ala124至Ala 412。

保藏物

木贼镰孢RF6318于2006年4月7日保藏在Uppsalalaan 8，3508AD，Utrecht，Netherlands的Centraalbureau Voor Schimmelcultures，并分配检索号CBS 119568。

大肠杆菌菌株RF7664(包含质粒pALK2521)于2009年1月14日保藏在Inhoffenstrasse 7 b Inhoffenstrasse 7 b，D-38124 Braunschweig，Germany的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)，并分配检索号DSM 22171。

大肠杆菌菌株RF7800(包含质粒pALK2529)于2009年1月14日保藏在Inhoffenstrasse 7 b，D-38124 Braunschweig，Germany的DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，并分配检索号DSM 22172。

发明详述

本发明提供一种真菌来源的丝氨酸蛋白酶，该蛋白酶显示宽底物特异性、在高pH范围稳定并具有宽最适温度，即在低温和中温均有良好性能。所述酶对于洗涤剂应用、抗氧化和螯合剂而言理想，且在洗涤剂溶液中在低酶水平下有效。具体而言，所述丝氨酸蛋白酶在低至10℃的温度下有活性，优选范围10℃-60℃。因此，本发明提供用于洗涤剂和其它应用的一种备选丝氨酸蛋白酶。所述真菌丝氨酸蛋白酶可在高产真菌宿主中产生，且其下游处理(例如分离发酵液和菌丝体)容易进行。

与本发明相关的“丝氨酸蛋白酶”或“丝氨酸内肽酶”或“丝氨酸内蛋白酶”意为通过国际生物化学和分子生物学联盟的命名法分类为EC3.4.21的酶。在单细胞和复杂生物二者中均存在丝氨酸蛋白酶。基于它们的结构相似性，已将丝氨酸蛋白酶分为至少六个氏族(clan)(SA、SB、SC、SE、SF和SG；S指丝氨酸蛋白酶)，将所述氏族以相似的氨基酸序列和三维结构进一步亚分为家族(参见，例如http://www.biochem.wustl.edu/～protease/的丝氨酸蛋白酶主页，生物化学和分子生物物理学系，华盛顿医科大学，St.Louis，MO，USA)。这些蛋白质水解酶或降解酶以其活性部位存在亲核的丝氨酸基团为特征，并且氏族SA和氏族SB的蛋白酶还通过具有必需的天冬氨酸和组氨酸残基来区分，所述残基连同丝氨酸一起形成催化三联体。

主要的氏族包括“胰凝乳蛋白酶样”(包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶)(氏族SA)和“枯草蛋白酶样”(氏族SB)丝氨酸蛋白酶。基于围绕切割位点的氨基酸残基的侧链，所述酶靶定多肽链的不同区。本发明的丝氨酸蛋白酶属于氏族SB。

已表征的“枯草蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”或“亚麻酶(subtilase)”通常为细菌来源。这类蛋白酶以各种杆菌为代表，如解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquifaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Rao等，1998)，其对芳族或疏水残基(例如酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸)特异。

本发明所用术语“丝氨酸蛋白酶活性”意为对含蛋白质的底物(例如酪蛋白、血红蛋白、角蛋白和BSA)的水解活性。用于分析蛋白水解活性的方法在文献中众所周知，且在例如Gupta等(2002)中提及。

可使用组别特异性抑制剂将蛋白酶分类。不同组的“丝氨酸蛋白酶抑制剂”包括合成化学抑制剂和天然蛋白质抑制剂。其中一组天然抑制剂为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin，缩写自serine protease inhibitor)，例如抗凝血酶和α1-抗胰蛋白酶。人工合成抑制剂包括3，4-二氯异香豆素(3，4-DCI)、氟磷酸二异丙酯(DFP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)。由于靠近活性部位存在半胱氨酸残基，某些丝氨酸蛋白酶被巯基试剂(例如对氯汞苯甲酸(PCMB))抑制。因此，可在适宜条件下在含或不含丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的情况下，在基于切割特异性底物的测定法或利用任何包含蛋白质的底物的测定法中确定丝氨酸蛋白酶活性。

丝氨酸蛋白酶通常在中性或碱性pH(其中最适值在pH 7-11之间)下有活性，并具有宽底物特异性。“碱性丝氨酸蛋白酶”意为以下酶，其在pH 9-pH 11或甚至在pH 10-12.5有活性且稳定(Shimogaki等，1991)，并具有pH 9附近的等电点。它们代表商业丝氨酸蛋白酶的最大亚群。碱性丝氨酸蛋白酶的分子质量范围在15-35kDa之间。天然丝氨酸蛋白酶的最适温度在60℃附近(Rao等，1998)。

可筛选能够产生蛋白酶活性的微生物菌株，并且可确定对不同底物的活性。选出的菌株可在适宜培养基上培养。在产生足量令人关注的丝氨酸蛋白酶之后，可将该酶分离或纯化，并且可更彻底地表征其特性。或者，可分离在各种生物中编码丝氨酸蛋白酶的基因，并且可将所述基因编码的氨基酸序列与本文实施例中分离和表征的丝氨酸蛋白酶氨基酸序列比较。

产生的蛋白酶(具体地丝氨酸蛋白酶)可使用酶化学的常规方法纯化，例如盐制备(salt preparation)、超滤、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤和疏水作用层析。可通过蛋白质测定、酶活性测定和通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳监测纯化。可确定在各种温度和pH值下纯化酶的酶活性和稳定性，以及分子质量和等电点。

本发明优选丝氨酸蛋白酶的纯化已在实施例1b中显示。将已过滤的培养物上清液上样于Q Sepharose FF柱。将流出流分上样于苯基Sepharose HP柱并用线性递减的盐梯度洗脱蛋白质。将显示蛋白酶活性的流分合并、浓缩并上样于Superdex 75 10/300GL柱。如实施例1b所述，纯化后接着是在试卤灵标记的酪蛋白上的活性测定。自然地，可能通过使用代替本文所述方法的其它已知的纯化方法，或除本文所述方法之外的方法来分离本发明的酶。如实施例5所述纯化重组丝氨酸蛋白酶并将其用于表征pH和温度曲线。

依照Laemmli(1970)，可通过质谱法或SDS-PAGE确定纯化丝氨酸蛋白酶的分子质量。还可从酶的氨基酸序列预计分子质量。成熟丝氨酸蛋白酶典型地具有在20-35kDa之间的分子质量，典型地在25-30kDa附近的分子质量(Rao等，1998)。

将丝氨酸蛋白酶以前酶原的形式合成为无活性的“酶原前体”或“酶原”，其通过去除信号序列(分泌信号肽或前导肽)和前序列(前肽)来激活以产生酶的活性成熟形式(Chen和Inouye，2008)。此激活过程涉及蛋白酶的作用且可起因于丝氨酸蛋白酶的有限自我消化或自身催化过程。前序列可例如在生成的翻译后阶段期间、或在耗尽的培养基中、或在培养基或酶制剂储存期间被切割。酶原的激活也可通过向宿主生物在其中培养的培养基中加入能够将无活性酶原转化成活性成熟酶的蛋白水解酶或者在培养过程后向培养上清液加入蛋白水解酶来完成。酶的缩短还可通过例如在将其转化进生产宿主之前截短编码多肽的基因来完成。

术语“成熟的”意为在去除信号序列和前肽之后包含对于酶活性或催化活性必需的氨基酸的酶形式。在丝状真菌中，其为分泌到培养基中的天然形式。

丝氨酸蛋白酶的最适温度，可在适宜缓冲液中于不同温度下，通过如实施例1c、5或14所述使用酪蛋白作为底物或如文献(例如Gupta等，2002)所述使用其它底物和缓冲系统确定。最适pH的确定可在适宜缓冲液中于不同pH值下，通过追踪对蛋白质底物的活性来进行。

蛋白酶活性通常基于可溶性底物的降解。在洗涤剂应用中，蛋白酶必须对至少部分不溶的物种起作用。因此，对于洗涤剂用蛋白酶而言的一个重要参数为吸附和水解这些不溶片段的能力。

选择洗涤剂用蛋白酶的另一个重要参数为其等电点或pI值。当洗涤剂用蛋白酶工作的洗涤剂溶液pH值接近与酶的pI值相同时，其性能最佳。可通过在固定化pH梯度凝胶(由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成)上的等点聚焦或通过根据氨基酸序列估计pI(例如通过使用在ExPASy服务器的pI/MW工具(http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger等，2003))来确定pI。

纯化蛋白酶的N末端以及内部肽可依照如实施例2所述的Edman降解化学(Edman和Begg，1967)或通过文献所述的其它方法测序。

本发明的丝氨酸蛋白酶可源自任何生物，包括细菌、古细菌、真菌、酵母乃至高等真核生物(例如植物)。优选所述酶来源于真菌，包括丝状真菌和酵母，例如来自选自镰孢的属。真菌碱性蛋白酶比细菌蛋白酶有利，这归因于简化产生无微生物的酶或酶组合物的下游处理。在纯化酶之前，可通过过滤技术轻易地去除菌丝体。

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其在存在具有高度变化特性的洗涤剂的情况下，在宽温度范围(即从低温到中温，例如10℃-60℃)具有良好性能。

在本发明中，在存在洗涤剂的情况下的良好性能意为所述酶(这种情况下为本发明的真菌丝氨酸蛋白酶)在比许多目前出售的商业枯草蛋白酶更低的温度范围起作用。换言之，良好性能意为所述酶能够在低温到中温范围、但尤其是在比目前商业产品(例如商业酶产品Purafect4000L(Genencor Inc.，USA))更低的温度范围降解或去除蛋白质污迹或材料。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶在低温范围起作用。例如，通过更改pH、选择具有适宜特性的洗涤剂、包含酶保护剂和通过控制洗涤条件，可在低至10℃的温度下维持本发明丝氨酸蛋白酶的活性。因此，取决于洗涤条件以及洗涤剂中的辅助成分和添加剂，本发明丝氨酸蛋白酶尤其可用于50℃或更低的温度。所述酶也在45℃或更低、在40℃或更低、在35℃或更低或者在30℃或更低的温度下起作用。

在存在洗涤剂的情况下，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶在10℃-60℃之间与上文定义的一样起作用。在实施例6-13中，描述了比较试验，并且从图7到17显而易见的是，真菌丝氨酸蛋白酶Fe_RF6318在不同条件中和受到不同处理时，对不同织物材料上众多不同污迹的性能(测定为deltaL^*或Δ％SR)远好于商业产品SavinaseUltra 16L(Novozymes A/S，DK)、Purafect4000L(Genencor Inc，USA)和Properase4000E(Genencor Inc.，USA)的性能。具体而言，所述真菌丝氨酸蛋白酶Fe_RF6318在低温到中温范围内(例如10℃-60℃)的污迹去除效果显著高于SavinaseUltra 16L和Purafect4000L。与Properase4000E相比，其在30℃-60℃的范围亦具有更高的污迹去除能力。

从所述实验结果可推断，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶能够满足洗涤剂消费者和洗涤剂产业以及工业供应洗涤机大大变化的需求，并很好地适合于未来规章和消费者习惯的需求。

根据本发明的一个优选实施方案，所述真菌丝氨酸蛋白酶为这样的多肽，其具有丝氨酸蛋白酶活性并包含Fe_RF6318的成熟酶，所述成熟酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：15或者与氨基酸序列SEQ ID NO：15有至少86％同一性或与氨基酸序列SEQ ID NO：11有至少86％同一性的氨基酸序列。优选酶显示至少86％、优选至少87％、更优选至少88％、甚至更优选至少90％同一性。还更优选所述氨基酸序列显示与SEQ ID NO：15的氨基酸序列有至少92％或至少94％或96％、更优选至少98％、最优选99％同一性。两个酶的同一性在相应序列区内(例如在丝氨酸蛋白酶的成熟或全长区内)比较。

将本发明的丝氨酸蛋白酶记为Fe_RF6318(来源于木贼镰孢的分离丝氨酸蛋白酶)，并为丝氨酸内蛋白酶家族8氏族SB的成员。

术语“同一性”在本文意为在相应序列区内相互比较的两个氨基酸序列之间的同一性，所述相应序列区具有接近相同数量的氨基酸。例如，可比较两个氨基酸序列的全长或成熟序列的同一性。待比较的两个分子的氨基酸序列可在一个或多个位置不同，然而这不改变分子的生物学功能或结构。这类变化可因为不同宿主生物或氨基酸序列中的突变而自然发生，或者它们可通过特异性诱变来完成。变化可起因于氨基酸序列中一个或多个位置的缺失、取代、插入、添加或组合。序列同一性通过使用ClustalW比对(例如在www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw)来测定。使用的矩阵如下：BLOSUM，缺口开放(Gap open)：10，缺口延伸(Gap extension)：0.5。

优选地，所述真菌丝氨酸蛋白酶可从镰孢获得，更优选来自木贼镰孢。根据最优选的实施方案，本发明的丝氨酸蛋白酶可从以检索号CBS 119568保藏在Centraalbureau voor Schimmelculture的菌株获得。

本发明的一个优选实施方案为一种真菌丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性和如SEQ ID NO：15所定义的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列。所述成熟酶缺少信号序列或前导肽(prepeptide)以及前序列(prosequence)或前肽(propeptide)。本发明的成熟丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO：11中表征的全长蛋白酶的氨基酸Ala124至Ala412。因此，具有包含信号序列(前导肽)和前肽的SEQ ID NO：11的全长Fe_RF6318酶，和成熟酶以及缺少信号序列(前导肽)因而具有SEQ IDNO：13的酶原形式，也在本发明的范围内。

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其成熟形式具有在20-35kDa之间、优选在25-33kDa之间、更优选在28-30kDa之间的分子质量或分子量。最优选MW为预计的Fe_RF6318分子质量，其对于成熟多肽而言为29kDa，通过在ExPASy服务器使用pI/MW工具获得(Gasteiger等，2003)。

本发明的酶在宽温度范围下对降解蛋白质材料有效。如实施例5所述，当在pH 9使用15min反应时间和酪蛋白作为底物测定时，所述酶的最适温度为30℃-70℃(约最大活性的20％)，优选40℃-60℃(至少约最大活性的40％)，以及更优选50℃-60℃(至少约最大活性的70％)，最优选60℃(最大活性，Fe_RF6318)。

根据本发明的一个优选实施方案，如实施例5所述在50℃使用15min反应时间和酪蛋白作为底物，所述真菌丝氨酸蛋白酶具有pH范围为至少pH 6-pH 11的最适pH，在pH 10显示超过40％最大活性。具体而言，在50℃，最适pH在pH 6-pH 10之间(约最大活性的60％)，和更优选pH 9-pH 10之间(约最大活性的80％)，以及最优选在pH 10。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶“在存在洗涤剂的情况下具有良好性能”，即在低温度范围，特别是在比目前商业产品(例如商业酶产品Purafect4000L(Genencor Inc.，USA))更低的温度范围，在存在洗涤剂的情况下能够降解或去除蛋白质污迹或材料。在存在洗涤剂的情况下，本发明的酶在10℃-60℃之间、优选在50℃或更低起作用。Fe_RF6318酶也在温度为45℃或更低、40℃或更低、35℃或更低或30℃或更低起作用。

本发明的丝氨酸蛋白酶具有pI，其如从推导氨基酸序列预计的在pI 9-pI 9.5之间，优选在pI 9.1-pI 9.4之间。本发明Fe_RF6318酶的预计pI为pI 9.3。

可将依据N末端氨基酸序列或纯化酶的胰蛋白酶消化肽段合成的寡核苷酸或通过使用上述寡核苷酸得到的PCR产物，在分离编码本发明丝氨酸蛋白酶的cDNA或基因组基因中用作探针。也可基于同源丝氨酸蛋白酶的已知核苷酸或氨基酸序列设计探针。还可基于在平板(含有对酶特异的底物)上的活性或通过使用对丝氨酸蛋白酶特异的抗体筛选丝氨酸蛋白酶克隆。

根据本发明的一个优选实施方案，所述真菌丝氨酸蛋白酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在严格条件下与包含在的质粒pALK2521中的多核苷酸或探针序列杂交，所述质粒在大肠杆菌RF7664中包含核苷酸序列SEQ ID NO：9，所述大肠杆菌RF7664以检索号DSM 22171保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)。

如实施例3d所述，在本发明中利用严格杂交，用通过PCR制备的探针分离Fe prt8A基因。标准分子生物学方法可用于分离宿主生物的cDNA或基因组DNA，例如在分子生物学手册(例如Sambrook和Russell，2001)中描述的方法。

与DNA探针(例如由多于100-200个核苷酸组成的SEQ ID NO：9)的杂交通常在“高严格”条件下进行，即在以下温度下杂交，所述温度低于完全杂合体的计算解链温度(Tm)20-25℃，Tm根据Bolton和McCarthy(1962)计算。通常预杂交和杂交至少在65℃下于6xSSC(或6xSSPE)、5xDenhardt氏试剂、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中进行。添加50％甲酰胺将预杂交和杂交温度降至42℃。在低盐浓度中进行洗涤，例如在2xSSC-0.5％SDS(w/v)中在室温(RT)下达15分钟，接着在RT下2xSSC-0.1％SDS(w/v)中，以及最后至少在65℃下0.1xSSC-0.1％SDS(w/v)中洗涤。

根据一个优选的实施方案，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由分离的核酸分子编码，所述核酸分子编码包含在SEQ ID NO：15中表征的氨基酸序列的多肽，或者与氨基酸序列SEQ ID NO：15具有至少86％同一性或与氨基酸序列SEQ ID NO：11具有至少86％同一性的多肽。优选酶显示至少86％、优选至少87％、更优选至少88％、甚至更优选至少90％同一性。还更优选所述氨基酸序列显示与SEQ ID NO：15的氨基酸序列有至少92％或至少94％或96％、更优选至少98％、最优选99％同一性。两个酶的同一性在相应序列区内(例如在丝氨酸蛋白酶的成熟或全长区内)比较。

因此，由编码本发明全长丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的核酸分子编码的多肽序列在本发明的范围内，所述多肽序列包括前导肽(信号序列)和前肽以及酶的成熟形式，并且其氨基酸序列在SEQ ID NO：11中表征。

同样，由编码本发明丝氨酸蛋白酶前肽的核酸分子编码的多肽序列在本发明的范围内，所述多肽序列包括前肽以及酶的成熟形式，并且其氨基酸序列在SEQ ID NO：13中表征。

本发明的一个优选实施方案为由分离核酸分子编码的真菌丝氨酸蛋白酶，所述核酸分子包含编码具有SEQ ID NO：15的Fe_RF6318丝氨酸蛋白酶成熟形式的核苷酸序列。

根据一个优选的实施方案，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO：14的分离核酸分子编码，所述核苷酸序列编码Fe_RF6318酶的成熟形式(SEQ ID NO：15)。

因此，由具有核苷酸序列SEQ ID NO：10的核酸分子编码的多肽在本发明的范围内，所述核苷酸序列包含酶的“编码序列”。措辞“编码序列”意为始于翻译起始密码子(ATG)并止于翻译终止密码子(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。翻译的全长多肽通常以甲硫氨酸开始并包含内含子区。

同样，由包含核苷酸序列SEQ ID NO：12的核酸分子编码的真菌丝氨酸蛋白酶在本发明的范围内，所述核苷酸序列编码Fe_RF6318酶原形式。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述真菌丝氨酸蛋白酶由包含在pALK2529中的多核苷酸序列编码，pALK2529保藏于检索号为DSM 22172的大肠杆菌RF7800中。

本发明的一个实施方案为由包含核酸分子的重组表达载体产生的丝氨酸蛋白酶，所述核酸分子编码如上文表征的真菌丝氨酸蛋白酶，并可操作地连接到能够在适宜宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因表达的调控序列。在实施例4中更详细地描述了所述重组表达载体的构建和所述载体的使用。

用于产生真菌丝氨酸蛋白酶的适宜宿主为同源或异源宿主，例如包括细菌、酵母和真菌的微生物宿主。丝状真菌(例如木霉、曲霉、镰孢、腐质霉、金孢子菌、脉孢菌、根霉、青霉和被孢霉)为优选的生产宿主，这是由于简化酶产物的下游处理和回收。适宜宿主包括下列种，例如里氏木霉、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A oryzae)、酱油曲霉(A.sojae)、泡盛曲霉(A.awamori)或日本曲霉(A.japonicus)型菌株、F.venenatum或尖镰孢、特异腐质霉(H.insolens)或绵毛腐质霉(H.lanuginosa)、粗糙脉孢菌(N.crassa)和C.lucknowense，其中的一些在例如商业酶AMFEP 2007列表(http://www.amfep.org/list.html)中被列为酶生产宿主生物。更优选地，所述酶在木霉属或曲霉属的丝状真菌宿主中产生，例如里氏木霉或黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉。根据本发明的最优选实施方案，所述真菌丝氨酸蛋白酶在里氏木霉中产生。

(b)以下核酸分子，其编码具有丝氨酸蛋白酶活性并与SEQ IDNO：15具有至少86％同一性的多肽；

(d)包含多核苷酸序列的编码序列的核酸分子，所述多核苷酸序列包含于DSM 22171或DSM 22172中；

(e)以下核酸分子，其编码序列与(c)-(d)的任一核酸分子的编码序列因遗传密码的简并性而不同；和

(f)以下核酸分子，其在严格条件下与包含在DSM 22171中的核酸分子杂交，并编码以下多肽，所述多肽具有丝氨酸蛋白酶活性并具有显示与如SEQ ID NO：15所述的氨基酸序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。

本发明的核酸分子可为RNA或DNA，其中DNA可由基因组DNA或cDNA构成。

标准分子生物学方法可用于分离和酶处理编码本发明真菌丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列，包括分离基因组和质粒DNA、消化DNA以产生DNA片段、测序、大肠杆菌转化等。在标准分子生物学手册(例如Sambrook和Russell，2001)中描述了基本方法。

编码Fe_RF6318多肽的Fe prtS8A基因的分离在实施例3中描述。简言之，将通过使用简并寡核苷酸引物序列(SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7)获得的866bp PCR片段用于从木贼镰孢RF6318分离pBluescript II KS+载体中的Fe prt8a。全长木贼镰孢Fe prtS8A基因包含在质粒pALK2529中，所述质粒在检索号为DSM 22172的大肠杆菌中保藏至DSMZ培养物保藏所。从DNA序列分析所述丝氨酸蛋白酶的推导氨基酸序列。

木贼镰孢丝氨酸蛋白酶Fe prtS8A的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)和推导序列(SEQ ID NO：11)在图1A-B中显示。基因长度为1303bp(包括终止密码子)。发现一个推定的内含子具有64bp长度。推导的蛋白序列由412个氨基酸组成，包括20个氨基酸的预计信号序列(SignalPV3.0；Nielsen等，1997以及Nielsen和Krogh，1998)和从Ala21至Arg123的前肽。从野生型Fe_RF6318纯化的肽与推导的氨基酸序列匹配，表明克隆的基因编码从木贼镰孢宿主RF6318中纯化的蛋白酶，所述宿主以检索号CBS 119568保藏在CBS培养物保藏所。对于成熟多肽而言预计的分子质量为29kDa，且预计pI为9.30。这些预测使用ExPASy服务器的Compute pI/MW工具进行(Gasteiger等，2003)。推导的氨基酸序列包含两个可能的N-糖基化位点(Asn77和Asn255)，但是根据CBS Server NetNGlyc V1.0很可能只有一个位点Asn77(位于前序列)。使用NCBI(国家生物技术信息中心)的BLAST程序2.2.9版搜寻与已公布蛋白酶序列的同源性(Altschul等，1990)。通过使用ClustalW比对(矩阵：BLOSUM，缺口开放：10，缺口延伸：0.5)(例如在www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw)获得的成熟Fe_RF6318序列与同源序列相应区的同一性值在表3中显示。

本发明的丝氨酸蛋白酶Fe_RF6318显示与玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae)假定蛋白PH-1(基因座标签FG03315.1)(EMBL检索号XP_383491，未公布)、与哈茨木霉(T.harzianum)CECT 2413丝氨酸内肽酶(EMBL检索号CAL25508，Suarez等，2007)以及与深绿木霉(T.atroviride)碱性蛋白酶前体S08.066 ALP(EMBL检索号M87516，Geremia等，1993)最高的同源性，后者在US 60/818,910(CatalystBioscience Inc.)中公开为氨基酸序列SEQ ID NO：313。与玉蜀黍赤霉假定蛋白的同一性在全长酶内为85％。当比对缺少信号序列和前肽的成熟多肽时，同一性为85％。与哈茨木霉CECT 2413丝氨酸内肽酶的同一性为70％(全长酶)和75％(成熟酶)。与深绿木霉ALP的同一性为69％(全长酶)和74％(成熟酶)。

因此，分离的多核苷酸序列或分离的核酸分子在本发明的范围内，其编码包含Fe_RF6318酶成熟形式的氨基酸序列的真菌丝氨酸蛋白酶或多肽，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：15中表征，即SEQ ID NO：11的全长丝氨酸蛋白酶的氨基酸Ala124至Ala412。

此外，编码真菌丝氨酸蛋白酶多肽片段的核酸分子在本发明的范围内，其中所述片段具有丝氨酸蛋白酶活性并与氨基酸序列SEQ IDNO：15具有至少86％同一性或与氨基酸序列SEQ ID NO：11具有至少86％同一性。优选酶显示至少86％、优选至少87％、更优选至少88％、甚至更优选至少90％同一性。还更优选所述氨基酸序列显示与SEQ IDNO：15的氨基酸序列有至少92％或至少94％或96％、更优选至少98％、最优选99％同一性。两个酶的同一性在相应序列区内(例如在丝氨酸蛋白酶的全长或成熟区内)比较。

优选核酸分子为包含如SEQ ID NO：10所述编码序列的分子，所述编码序列编码本发明真菌丝氨酸蛋白酶的全长形式。

本发明的分离核酸分子可为包含多核苷酸序列的编码序列的分子，所述多核苷酸序列包含在DSM 22171或DSM 22172中。DSM22171携带用于克隆全长Fe prtS8A基因的PCR片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。DSM 22172携带全长Fe prtS8A基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。

本发明的核酸分子也可为上文表征的核苷酸序列的类似物。“简并”意为核苷酸序列的类似物，其在一个或多个核苷酸或密码子上不同，但其编码本发明的重组蛋白酶。

所述核酸分子还可为这样的核酸分子，其在严格条件下与包含在质粒pALK2521(保藏在检索号为DSM 22171的大肠杆菌中)中的PCR探针杂交，并编码具有丝氨酸蛋白酶活性和以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列在相应序列区内显示与如SEQ ID NO：15所述氨基酸序列有至少86％同一性。杂交DNA可来源于属于镰孢种的真菌或其可来源于其它真菌种。

因此，以下分离的核酸分子在本发明的范围内，所述分子包含如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所述的核苷酸序列及其类似物。

本发明还涉及重组表达载体或重组表达构建体，其可用于在适宜原核或真核宿主中增殖或表达编码所选丝氨酸蛋白酶的核酸序列或基因。重组表达载体包含在适宜宿主中促进或指导丝氨酸蛋白酶编码序列表达和分泌的DNA或核酸序列，例如可操作地连接编码所述丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的启动子、增强子、终止子(包括转录和翻译终止信号)和信号序列。表达载体可进一步包含用于选择转化菌株的标记基因，或可用另一个载体构建体通过共转化将选择标记引入宿主。所述调节序列可与生产生物同源或异源，或者它们可来源于从其中分离编码所述丝氨酸蛋白酶的基因的生物。

用于在丝状真菌宿主中表达本发明丝氨酸蛋白酶的启动子的实例为米曲霉TAKA淀粉酶、碱性蛋白酶ALP和磷酸丙糖异构酶的启动子、米黑根霉(Rhizopus miehei)脂肪酶启动子、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)的启动子、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶启动子、Chrysosporium lucknowense纤维二糖水解酶I启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I(Cel7A)启动子等。

在酵母中，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、半乳糖激酶(GAL1)、醇脱氢酶(ADH2)和3-磷酸甘油酸激酶的启动子可用来提供表达。

用于在细菌宿主中指导本发明丝氨酸蛋白酶转录的启动子序列的实例为大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子，等等。

适宜终止子包括上文提及基因的终止子或任何其它已表征的终止子序列。

适宜的转化或选择标记包括在宿主中弥补缺陷的那些，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或曲霉amdS和niaD。选择也可基于赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素、四环素、腐草霉素或潮霉素抗性。

优选胞外分泌本发明的丝氨酸蛋白酶。因此，重组载体包含在所选宿主中促进分泌的序列。本发明丝氨酸蛋白酶的信号序列或者前导序列(presequence)或前导肽可包含在重组表达载体中，或者可用另一个能够在所选宿主中促进分泌的信号序列替代天然信号序列。因此，所选信号序列可与表达宿主同源或异源。

适宜信号序列的实例为真菌或酵母生物的那些，例如来自良好表达基因的信号序列。这类信号序列从文献中众所周知。

重组载体可进一步包含促进载体整合进入宿主染色体DNA的序列以获得稳定表达。

如实施例4所述，将本发明的Fe_RF6318蛋白酶用其自身信号序列(来自里氏木霉cbh1(cel7A)启动子)表达。用来转化里氏木霉宿主的表达构建体还包含cbh1终止子和用于自未转化细胞选择转化体的amdS标记。

本发明也涉及包含如上所述重组表达载体的宿主细胞。用于产生所述真菌丝氨酸蛋白酶的适宜宿主为同源或异源宿主，例如包括细菌、酵母和真菌的微生物宿主。还可能为植物或哺乳动物细胞中的生产系统。

丝状真菌(如木霉、曲霉、镰孢、腐质霉、金孢子菌、脉孢菌、根霉、青霉和被孢霉)为优选的生产宿主，归因于其简化酶产物的下游处理和回收。适宜表达和生产宿主系统为例如开发用于丝状真菌宿主里氏木霉的生产系统(EP 244234)，或曲霉生产系统，例如米曲霉或黑曲霉(WO 9708325、US 5,843,745、US 5,770,418)、泡盛曲霉、酱油曲霉和日本曲霉型菌株，或开发用于镰孢例如尖镰孢(Malardier等，1989)或F.venenatum的生产系统，以及开发用于粗糙脉孢菌、米黑根霉、高山被孢霉(Mortiriella alpinis)、绵毛腐质霉或特异腐质霉或者用于Chrysosporium lucknowense(US 6,573,086)的生产系统。开发用于酵母的适宜生产系统为开发用于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的系统。开发用于细菌的适宜生产系统为开发用于杆菌(例如用于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌)、用于大肠杆菌、或用于放线菌链霉菌属(Streptomyces)的生产系统。优选本发明的丝氨酸蛋白酶在木霉属或曲霉属的丝状真菌宿主中产生，例如里氏木霉、或黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉型菌株。根据本发明的最优选实施方案，所述真菌丝氨酸蛋白酶在里氏木霉中产生。

生产宿主细胞可与本发明的丝氨酸蛋白酶同源或异源。由于通过灭活去除蛋白酶或例如通过缺失编码这类同种(homogenous)或同源蛋白酶的基因去除一种或多种宿主蛋白酶，宿主可不含同种蛋白酶。

本发明也涉及用于产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括下列步骤：在适宜条件下培养天然或重组宿主细胞(携带用于本发明丝氨酸蛋白酶的重组表达载体)和任选分离所述酶。生产培养基可为适于生长宿主生物并含有用于有效表达的诱导物的培养基。适宜培养基从文献中众所周知。

本发明涉及具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由本发明的核酸分子编码并可通过上述方法获得。优选地，所述多肽为通过培养宿主细胞获得的重组蛋白酶，所述宿主细胞携带用于本发明丝氨酸蛋白酶的重组表达载体。

本发明进一步涉及用于获得酶制剂的方法，所述酶制剂包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述方法包括下列步骤：培养携带本发明表达载体的宿主细胞，和从细胞中回收多肽或从培养基中分离细胞以及获得具有丝氨酸蛋白酶活性的上清液。

本发明也涉及酶制剂，其包含上文表征的丝氨酸蛋白酶。所述酶制剂或组合物具有丝氨酸蛋白酶活性并可通过根据本发明的方法获得。

以下酶制剂在本发明内，所述酶制剂包含本发明的真菌丝氨酸蛋白酶，优选地通过培养宿主细胞获得的重组丝氨酸蛋白酶，所述宿主细胞携带本发明的重组表达载体。

除了本发明的丝氨酸蛋白酶外，所述酶制剂可进一步包含不同类型的酶，例如含或不含的另一种蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和/或氧化酶(例如漆酶或过氧化物酶)。通过去除存在于待处理的材料中的碳水化合物和油或脂肪，期望这些酶增强本发明丝氨酸蛋白酶的性能。所述酶可为由宿主菌株产生的天然或重组酶，或可在产生过程之后将其加入培养上清液。

所述酶制剂可进一步包含选自下列的适宜添加剂：表面活性剂或表面活化剂、缓冲剂、防蚀剂、稳定剂、漂白剂、介质、增效剂、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂、荧光增白剂、抗再沉积剂、染剂、色素，等等。

表面活性剂可用于乳化油脂和润湿表面。表面活性剂可为非离子的(包括半极性的)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的。

可向酶制剂中添加缓冲剂以改变pH或影响其它组分的性能或稳定性。

适宜稳定剂包括多元醇(例如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、肽，等等。

漂白剂用于氧化和降解有机化合物。适宜化学漂白系统的实例为H₂O₂来源，例如含或不含过酸形成漂白激活剂(例如四乙酰基乙二胺)的过硼酸盐或过碳酸盐，或备选地过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜型)。化学氧化剂可通过使用氧化酶(例如漆酶或过氧化物酶)部分或完全替代。许多漆酶在没有介质的情况下不会有效地起作用。

增效剂或络合剂包括下列物质，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐，等等。所述酶制剂可进一步包含一种或多种聚合物，例如羧甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，等等。另外，可加入软化剂、腐蚀剂、用于防止其它组分腐坏的防腐剂、研磨剂以及改变起泡和粘度特性的物质。

根据本发明的一个优选实施方案，所述酶制剂呈液体、粉末或颗粒形式。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可与其它蛋白酶相似，具体地用于洗涤剂、蛋白质、酿造、肉类、摄影、皮革、乳品和制药工业的碱性蛋白酶(Kalisz，1988；Rao等，1998)。例如，其可用作化学制品的替代物将纤维状蛋白质废物(例如角、羽毛、指甲和毛发)转化成有用的生物质、浓缩蛋白或氨基酸(Anwar和Saleemuddin，1998)。本发明真菌丝氨酸蛋白酶的应用可与在改善皮革质量和减轻环境污染以及节能中证实成功的其它酶相似，并且其可与用于肽合成和D，L-氨基酸混合物拆分中的碱性蛋白酶相似。在治疗烧伤和创伤中枯草蛋白酶与广谱抗菌素组合为丝氨酸蛋白酶在制药工业中的应用的实例，因此本发明的真菌丝氨酸蛋白酶也可具有这类应用，并且也可与可应用于去除外科设备上的血以及清洁隐形眼镜或假牙的碱性蛋白酶相似。如同来自冠状耳霉(Conidiobolus coronatus)的碱性蛋白酶，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可用于替代动物细胞培养中的胰蛋白酶。本发明的蛋白酶也可用于清洁膜和破坏生物膜。在焙烤中所述蛋白酶可用于例如破坏面筋网络，并且在其它食品应用中可用于水解食物蛋白(例如牛奶中的蛋白质)。它们还可用于例如处理酵母、炼制(从动物骨中提取更多蛋白质)、创造新味道、减少苦味、改变乳化特性、产生生物活性肽和降低蛋白质的变应原性。底物包括动物、植物和微生物蛋白。

洗涤剂工业，特别是衣物洗涤剂工业，已显示为在高pH范围有活性的蛋白酶的单个主要消费者(Anwar和Saleemuddin，1998)。理想的洗涤剂用蛋白酶应具有宽底物特异性以促进去除由食物、草、血和其它身体分泌物造成的多种污迹。其必须在洗涤剂溶液的pH和离子强度、洗涤温度和pH中有活性，并耐受机械处理以及添加到洗涤剂中的螯合物和氧化剂。蛋白酶的pI必须接近洗涤剂溶液的pH。归因于目前的能源危机和能源节约的意识，当前希望在较低温度下使用蛋白酶。

本发明也涉及丝氨酸蛋白酶或酶制剂在以下中的应用：洗涤剂、处理织物纤维、处理毛织品、处理毛发、处理皮革、处理饲料或食物或者涉及修饰、降解或去除蛋白质材料的任何应用。

因此本发明的一个优选实施方案为将如上表征的丝氨酸蛋白酶用作可用于衣物洗涤剂和餐具洗涤组合物(包括自动餐具洗涤组合物)的除垢添加剂。

措辞“洗涤剂”用于意指意图协助清洗或具有清洗特性的物质或材料。术语“去污力”表示清洗特性的存在情况或程度。清洗特性的程度可对与固体、水不溶性载体(例如织物纤维或玻璃)结合的不同蛋白质材料或含蛋白的底物材料或者污迹或污迹混合物进行测试。典型的蛋白质材料包括血、牛奶、墨水、蛋、草和调味汁。对于测试目的，蛋白质污迹混合物可市购。洗涤剂用酶的功能为降解和去除含蛋白污迹。测试结果取决于用于洗涤测试的污迹类型、洗涤剂组成以及织物的性质和状态(Maurer，2004)。

典型地，将蛋白酶或洗涤性能测定为“污迹去除效率”或“污迹去除效果”或“清洗特性的程度”，意为污迹材料(例如人为污染的样品或试布)可见和可测定的亮度增加或颜色变化。可测定亮度或色值变化，例如如实施例6-10所述，使用L^*a^*b^*颜色空间坐标用分光光度计将颜色测定为反射率值。将指示蛋白酶性能(污迹去除效率)的蛋白质污迹褪色或去除计算为例如ΔL^*，其意为酶处理织物的亮度值L^*减去用缓冲液或无酶洗涤液处理的织物的亮度值L^*(酶空白或对照)。洗涤剂的存在可改善酶去除污迹的性能。

本发明的丝氨酸蛋白酶在中性和碱性pH条件下乃至在存在具有不同组成的洗涤剂的情况下降解不同种类的蛋白质污迹(如实施例6-13所示)。

如实施例6所示，与商业蛋白酶制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L相比，本发明的丝氨酸蛋白酶在50℃和尤其是30℃pH 9缓冲液中，更好地去除血/牛奶/墨水污迹(图5和图6)。酶制剂按活性单位施用。如实施例12所述，也在10℃-60℃的全温度范围测试了对血/牛奶/墨水污迹的污迹去除效果。与商业蛋白酶制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L相比，Fe_RF6318蛋白酶制剂显示更高的污迹去除能力。与Properase4000E相比，其在30℃-60℃的范围亦显示更高的污迹去除能力(图16)。

如实施例7所述，也在40℃/50℃ pH 10于洗涤粉中测试了Fe_RF6318蛋白酶的性能。测定了所述酶去除聚酯棉材料上血/牛奶/墨水污迹的能力。每种酶制剂按活性单位(μmol酪氨酸/分钟)施用。如图7和8所示，本发明的蛋白酶在极碱性条件下也适于粉状洗涤剂，并且其对漂白剂的抵抗力略高于商业蛋白酶Purafect4000L。

在存在液体碱性洗涤剂和30℃下，Fe_RF6318蛋白酶也在液体碱性洗涤剂中和在Ariel Sensitive(Procter & Gamble，UK)中去除血/牛奶/墨水标准污迹(实施例9)。对血/牛奶/墨水污迹的效率远高于商业制剂SavinaseUltra 14L和Purafect4000L(图10和11)。酶制剂按活性单位施用。当用量计算为添加蛋白量时，也观察到同样的效果(图10B和11B)。在3.3.g/l液体洗涤剂浓度以及10℃和20℃下进行的洗涤，再一次显示了超过商业制剂SavinaseUltra 14L、Purafect4000L和Properase4000E的优越性能(实施例13；图17)。

当在30℃、液体洗涤剂中测试时，除了血/牛奶/墨水污迹外，Fe_RF6318蛋白酶还对去除诸如草和可可粉等污迹有效。在ATLASLP-2Launder-Ometer中进行处理。结果(图12和13)显示，Fe_RF6318蛋白酶在低温(如30℃)下对数种污迹有效。

在30℃于洗涤机中，全规模测试了在里氏木霉中产生的重组Fe_RF6318酶制剂在存在液体碱性洗涤剂时的性能(实施例11)。用于测试副作用的8种不同蛋白酶敏感示踪物在表5中显示，工艺条件在表6中显示。用于测试试验的酶用量计算为酶活性和酶蛋白量二者。图14A-B所示结果显示，当按活性量或蛋白质量施用酶时，用Fe_RF6318对不同污迹获得结果的总和，高于商业蛋白酶制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L。Fe_RF6318对血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黄污迹最有效(图15A-E)。

根据本发明的一个优选实施方案，如实施例6-13所示，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可用于洗涤液和洗涤粉。可将本发明酶制剂的酶配制成用于手动或机械洗衣，或者可配制成用于家居硬表面清洗或优选地用于手动或机械洗餐具操作。

实施例1.木贼镰孢RF6318蛋白酶的产生和纯化

(a)木贼镰孢RF6318的培养

先前已将真菌菌株RF6318作为产生纤维素酶的丝状真菌分离。将其鉴定为木贼镰孢(Fusarium cf.equiseti(Libert)Desmazières)(由Arthur de Cock，Identification Services，Centralbureau VoorSchimmelcultures，P.O.Box 85167，3508 AD Utrecht，The Netherlands)。已显示木贼镰孢RF6318在含有血红蛋白作为底物的琼脂平板测定中产生蛋白酶活性。随着平板培养在约10℃进行，此结果显示RF6318产生在低温下起作用的一种或多种蛋白酶。木贼镰孢RF6318在+4℃马铃薯葡萄糖(PD)琼脂(Difco)上生长、维持和形成孢子。对于酶产生，将来自RF6318斜面的孢子接种到培养基中，所述培养基包含：30g/l玉米粉(精细研磨)、5g/l玉米浆粉、4g/l大豆粉(脱脂)、2g/l KH₂PO₄、1g/l NaCl和1g/l石蜡油。灭菌前用NaOH将培养基pH调至8.5，再将培养基在121℃高压灭菌30分钟。将微生物以50ml体积在28℃于振荡器(200rpm)上培养7天。当在不同pH值(pH 7-10)进行活性测定(根据实施例1c、5或14)时，耗尽的培养上清液显示含有碱性蛋白酶活性。因为此碱性活性，将RF6318菌株选为推定的蛋白酶基因供体菌株。

(b)从木贼镰孢RF6318培养基中纯化蛋白酶

通过在+4℃以50000g离心30min(Sorvall RC6 plus)从耗尽的培养基中去除细胞和固体。将50ml上清液用于纯化蛋白酶。离心之后，加入HCl将上清液pH调至8.0。然后将上清液通过0.44μm过滤器(MILLEX HV Millipore)过滤并上样至以pH 8的20mM Tris-HCl平衡过的5mL Q Sepharose FF柱(GE Healthcare)。收集流出流分并通过加入HCl将其pH降至7.5。向流出流分加入固体硫酸铵以获得1M的最终盐浓度。然后，将流出流分通过0.44μm过滤器过滤，然后上样至以pH 7.5的20mM Tris-HCl-1M硫酸铵平衡过的苯基SepharoseHP(1mL)柱(GE Healthcare)。用线性递减的硫酸铵梯度(1-0M)洗脱蛋白质。收集1ml流分并按照制造商指导在pH 8.0下试卤灵标记的酪蛋白(Boehringer Mannheim Biochemica)上分析蛋白酶活性。合并具有蛋白酶活性的流分并用10k膜(Amicon)超滤。将浓缩的滤液上样至用pH 7.5的20mM Tris-HCl-200mM NaCl平衡过的Superdex 75 10/300GL柱(GE Healthcare)。用相同缓冲液洗脱蛋白质并收集0.5ml流分。分析来自这些流分的蛋白酶活性。将具有蛋白酶活性的流分在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分析。显示所述流分包含一个具有约29kDa分子质量的主要蛋白带。合并所选流分。将合并部分用于制备肽(实施例2)。根据活性测定的测定结果，纯化的蛋白质在pH 10具有其最适pH。将此纯化的木贼镰孢RF6318蛋白酶命名为Fe_RF6318。

(c)蛋白酶活性测定

蛋白酶活性通过使用酪蛋白作为底物的酪蛋白Folin-Ciocalteau法分析。蛋白酶降解酪蛋白的速率通过分光光度监测作为时间的函数的酸溶性片段的释放来测定。用于测定的酪蛋白底物如下制备：将6g酪蛋白Hammerstein级MP Biomedicals，LLC(101289)溶于500ml的100mM Tris、20μM CaCl₂、7μM MgCl₂、25μM NaHCO₃。用HCl将底物溶液pH调至9.0。使用TCA溶液终止酶反应，所述溶液包含：含0.11M TCA、0.22M乙酸钠、0.33M醋酸、0.5M Na₂CO₃的1000ml蒸馏水。通过用蒸馏水将25ml 2N Folin-Ciocalteu酚试剂(SIGMA，F9252)稀释到100ml来制备用于测定的Folin试剂。首先通过在给定温度孵育2.5ml底物溶液5min开始反应，之后加入0.5ml酶溶液并进行反应15min或30min。15min或30min反应之后，加入2.5ml反应终止液，混合内容物并使其在室温下静置30分钟。将管以4000rpm离心10分钟(Hettich Rotanta 460)。吸取1ml澄清的上清液并与2.5ml0.5M Na₂CO₃和0.5ml稀释的Folin试剂混合。等待5min(显色)之后，对照酶空白在660nm处测定混合物的吸光度(颜色)。酶空白如下制备：将0.5ml酶溶液与2.5ml终止液和2.5ml底物混合，并在给定温度下孵育混合物15min或30min。将一个酶活单位定义为每min每ml反应混合物释放对应于1μg酪氨酸的酸溶蛋白水解产物的酶量。

实施例2.纯化木贼镰孢蛋白酶Fe_RF6318的N末端和内部氨基酸的测序

对于确定内部序列，基本如Shevchenko等(1996)所述，将考马斯亮蓝染色的条带从聚丙烯酰胺凝胶切下并进行“凝胶内”消化。在用胰蛋白酶(测序级修饰胰蛋白酶，V5111，Promega)消化之前，将蛋白质用二硫苏糖醇还原并用碘乙酰胺烷基化。

基本如先前所述(Poutanen等，2001)但使用150μm×1.0mm捕获柱(3μm，#222403，SGE Ltd UK)用于肽预浓缩，使用连接到Ultimate纳级液相色谱仪(LC-Packings，The Netherlands)的Q-TOF仪(Micromass，Manchester，UK)产生用于从头测序的电喷雾离子化四极飞行时间串联质谱。

对于N末端序列分析，将SDS-PAGE/分离的蛋白质通过电印迹转移到聚偏二氟乙烯膜(ProBlott；Perkin Elmer Applied BiosystemsDivision，Foster City，Calif.)中。用考马斯亮蓝染色后，移出目的蛋白带并在Procise 494A蛋白测序仪(Perkin Elmer Applied BiosystemsDivision，Foster City，Calif.)上通过Edman降解对其进行N末端序列分析。

从纯化Fe_RF6318蛋白酶确定的N末端和内部肽序列在表1中显示。肽序列显示与已发表的来自尖镰孢丝氨酸蛋白酶的蛋白酶序列同源，所述蛋白酶的EMBL检索号为Q5R2N9和O74236。

表1.从Fe_RF6318蛋白酶确定的N末端和内部肽序列

实施例3.编码Fe_RF6318蛋白酶的木贼镰孢RF6318基因的克隆

(a)DNA的分离及使用的分子生物学方法

在分离和酶处理DNA(例如分离质粒DNA、消化DNA以产生DNA片段)、大肠杆菌转化、测序等中，使用了标准分子生物学方法。使用的基本方法按照酶、试剂或试剂盒制造商所述，或者按照标准分子生物学手册例如Sambrook和Russell(2001)中所述。从木贼镰孢RF6318中分离基因组DNA如Raeder和Broda(1985)详述的完成。

(b)用于探针制备的引物

用于克隆编码Fe_RF6318蛋白的基因的探针通过PCR合成。简并寡核苷酸基于从纯化Fe_RF6318中所获肽的氨基酸序列设计(表1)。引物序列在表2中显示(SEQ ID NO：5-8)。

表2.在探针扩增中用作PCR引物的寡核苷酸(SEQ ID NO：5-8)。寡核苷酸、SEQ ID NO、寡核苷酸长度和简并性、用于设计寡核苷酸序列的肽的寡核苷酸和氨基酸。

^(aN＝A、T、C或G；R＝A或G，Y＝T或C；圆括号中的“s”＝有义链，圆括号中的“as”＝反义链。

^(b肽序列包含在表1中。

(c)PCR反应和用于克隆的探针的选择

将木贼镰孢RF6318基因组DNA用作探针合成的模板。每100μl反应体积的PCR反应混合物包含pH 8.8的10mM Tris-HCl、50mMKCl、0.1％Triton X-100、1.5mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、1μM每种引物和4单位Dynazyme II DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)以及约3μg基因组DNA。用于PCR反应的条件如下：96℃初始变性5min，接着96℃下1min、55.5℃退火30秒、72℃延伸1min的32个循环以及72℃最终延伸5min。引物组合PRO88(SEQ ID NO：6)和PRO89(SEQ ID NO：7)产生了具有预计大小(根据基于已发表真菌蛋白酶序列的计算)的特异DNA产物。从PCR反应混合物中分离和纯化DNA产物，并根据制造商说明将其克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，USA)。从此质粒对866bp DNA片段测序(SEQ ID NO：9)。将包含此PCR扩增DNA片段的pCR2.1-TOPO质粒命名为pALK2521。将包含质粒pALK2521的大肠杆菌菌株RF7664以检索号DSM 22171保藏于DSM保藏所。

PCR片段的推导氨基酸序列包含内部Fe_RF6318肽1246.673(SEQ ID NO：2)和3341.633(SEQ ID NO：3)的序列(表1)。从推导氨基酸序列中还发现了未包含在引物中的N末端肽#3792(SEQ ID NO：1)的C末端部分(表1)。这证实，从PCR反应获得的DNA片段为编码Fe_RF6318蛋白的基因的部分，并因此用作从木贼镰孢基因组DNA中筛选全长基因的探针。

(d)编码Fe_RF6318蛋白酶的木贼镰孢RF6318基因的克隆

使用数种限制性内切酶消化木贼镰孢基因组DNA用于DNA印迹分析。用包含SEQ ID NO：9的884kb EcoRI片段进行杂交，所述片段从质粒pALK2521切下作为探针(实施例3c)。根据供应商说明(Roche，Germany)使用地高辛标记以上探针。在65℃过夜进行杂交。杂交之后，将过滤器在RT使用2×SSC-0.1％SDS洗涤2x 5min，接着在65℃使用0.1×SSC-0.1％SDS洗涤2x 15min。

可检测到木贼镰孢基因组DNA消化产物中的数种杂交片段。基因组MunI和BglII消化产物分别包含具有大约4.2kb和3.2kb大小的杂交片段。根据基于已发表真菌蛋白酶序列的计算，单个杂交片段的大小大到足以包含编码Fe_RF6318蛋白的全长基因。根据杂交片段的大小范围(MunI消化物大约4kb而BglII消化物大约3kb)，从RF6318基因组MunI和BglII消化产物中分离基因组DNA片段。从琼脂糖凝胶分离基因组片段并克隆到用EcoRI和BamHI切割的pBluescript IIKS+(Stratagene，USA)载体。将连接混合物转化到大肠杆菌XL10-Gold细胞(Stratagene)并涂布到含有50-100μg/ml氨苄西林的LB(Luria-Bertani)平板。使用以pALK2521插入片段作为探针的菌落杂交筛选大肠杆菌菌落的阳性克隆。如对RF6318基因组DNA消化产物所述进行杂交。从平板收集到四个阳性BglII克隆和八个阳性MunI克隆。通过限制性消化显示它们包含预计大小的插入片段。用PstI-SalI双重消化切割来自连接到BamHI载体的MunI片段的插入片段。用PstI-NotI双重消化切割来自连接到EcoRI载体的BglII片段的插入片段。对收集克隆的插入片段进行DNA印迹(在68℃进行DNA印迹杂交并在RT使用2×SSC-0.1％SDS洗涤2×5min，接着在68℃使用0.1×SSC-0.1％SDS洗涤2×15min)。所收集BglII克隆中的三个和所收集MunI克隆中的六个包含DNA印迹中的杂交片段。从3.2kb BglII插入片段对编码Fe_RF6318蛋白酶的全长基因(SEQ ID NO：10)测序，并将包含此插入片段的质粒命名为pALK2529。将包含质粒pALK2529的大肠杆菌菌株RF7800以检索号DSM 22172保藏于DSM保藏所。将编码Fe_RF6318蛋白的基因命名为Fe prtS8A。

(e)编码Fe_RF6318蛋白酶的基因和推导氨基酸序列的表征

Fe prtS8A序列(SEQ ID NO：10)和推导氨基酸序列(SEQ ID NO：11)在图1A-B中显示。基因长度为1303bp(包括终止密码子)。发现一个推定内含子具有64bp的长度(根据Gurr等(1987)的真菌内含子的5′和3′边界序列)。推导蛋白质序列(SEQ ID NO：11)由412个氨基酸组成，包含20个氨基酸的预计信号序列(SignalP V3.0；Nielsen等，1997以及Nielsen和Krogh，1998)。全N末端肽#3792(还有未包含在探针序列中的N末端部分)包含在推导氨基酸序列中。对于成熟多肽而言，预计的分子质量为29141.09Da，且预计pI为9.30。在ExPASy服务器使用Compute pI/MW工具完成这些预测(Gasteiger等，2003)。推导氨基酸序列在氨基酸位置Asn77和Asn255包含两个可能的N糖基化位点(图1)，但是根据CBS Server NetNGlyc V1.0，只有在位置Asn77的位点(位于前序列)是可信的。

(f)同源性、同一性和比对研究

以默认设置，使用NCBI(国家生物技术信息中心)的BLASTX程序2.2.9版搜索与已发表蛋白酶序列的同源性(Altschul等，1990)。与来自玉蜀黍赤霉(禾本科镰孢(Fusarium graminearum))的假定蛋白(EMBL检索号XP_383491)和哈茨木霉(Hypocrea lixii)丝氨酸内肽酶(EMBL检索号CAL25508)有最高同源性。还发现与作为SEQ ID NO：313包含在专利申请US 60/818,910(Catalyst Bioscience Inc.)中的序列有同源性。将Fe_RF6318序列与以上同源序列比对。通过使用ClustalW比对(www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw；矩阵：BLOSUM，缺口开放：10，缺口延伸：0.5)获得的同一性值在表3中显示。

表3.从推导蛋白酶氨基酸序列的ClustalW比对获得的同一性值(％)。比对了不包含信号肽和前肽的成熟氨基酸序列。矩阵：BLOSUM，缺口开放：10，缺口延伸：0.5，EMBL_EBI。玉蜀黍赤霉，XP_383491；哈茨木霉CAL25508；US 60/818,910；申请中的SEQ ID NO：313。

实施例4.在里氏木霉中产生重组Fe_RF6318蛋白酶

(a)制备生产(宿主)载体

构建表达质粒pALK2533用于在里氏木霉中产生重组Fe_RF6318蛋白酶。将具有其自身信号序列的Fe prtS8A基因通过PCR准确融合到里氏木霉cbh1(cel7A)启动子。通过BamHI(PCR中在终止密码子之后建立的位点)从其3′末端切离Fe prtS8A基因片段。这使构建体的cbh1终止子序列之前没有原始的fe prtS8A终止子。向包含cbh1启动子和cbh1终止子的构建体加入amdS标记基因。所述构建体与Paloheimo等(2003)中描述的类似，8.7kb线性表达盒在图2中显示。在EcoRI消化之后从载体骨架分离表达盒并用于转化里氏木霉原生质体。所用宿主菌株不产生四种主要里氏木霉纤维素酶(CBHI，CBHII，EGI，EGII)中的任一种。按照Karhunen等(1993)所述的修改，如等(1987)进行转化。在使转化体在PD上形成孢子之前，通过单个分生孢子将其在选择平板上纯化。

(b)在摇瓶和实验室规模生物反应器中的蛋白酶产生

将转化体从PD斜面接种到包含50ml复合乳糖基纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等，1993)的摇瓶，所述培养基用5％KH₂PO₄缓冲在pH 6.0。在30℃、250rpm生长7天后，从培养物上清液分析转化体的蛋白酶产生。在SDS-PAGE凝胶上，从耗尽的培养上清液中检测到对应于重组Fe_RF6318蛋白酶的约29kDa的主要蛋白带。如实施例1c或14所述，使用酪蛋白作为底物测定蛋白酶活性。从培养上清液测得与宿主相比明显增大的活性。通过使用DNA印迹分析法，从所选转化体证实表达盒整合进入真菌基因组，所述分析法中包含了数种基因组消化产物，并将表达盒用作探针。

选择在摇瓶培养中产生最佳蛋白酶活性的里氏木霉转化体，在实验室规模生物反应器中培养。在培养中使用纤维素酶诱导复合培养基。将从培养中获得的耗尽培养基用于应用试验(实施例6-11)，并作为用于纯化和进一步表征重组Fe_RF6318蛋白酶的原材料。

实施例5.重组Fe_RF6318蛋白酶的纯化和表征

通过在+4℃以50000g离心30min(Sorvall RC6 plus)，从获自发酵(实施例4)的耗尽培养基中去除细胞和固体。将15ml上清液用于纯化蛋白酶。所有纯化步骤在冷室进行。离心之后，通过0.44μm过滤器(MILLEX HV Millipore)过滤样品，再上样于以pH 8.8的20mM Tris平衡过的HiPrep 26/10脱盐柱(来自GE Healthcare)。将凝胶过滤的样品上样于以pH 8.8的20mM Tris平衡过的20mL Q Sepharose FF柱(来自GE Healthcare)。收集流出流分并在12％SDS PAGE凝胶上分析(图3)。将此酶样品用于表征pH和温度曲线。

温度曲线

通过使用实施例1c或14所述测定法，使用15min反应时间在pH 9获得Fe_RF6318蛋白酶的温度曲线。结果在图4A中显示。所述蛋白酶具有在60℃附近的最适温度。

pH曲线

如实施例1c或14所述，使用酪蛋白作为底物在50℃确定蛋白酶的pH曲线。使用40mM Britton-Robinson缓冲液将反应pH调至pH6-12，反应时间为15min。使用0.11M TCA溶液(含0.22M乙酸钠和0.33M乙酸)终止酶反应。结果在图4B中显示。重组Fe_RF6318蛋白酶在pH 6-pH 10显示超过60％的相对活性，在pH 10附近显示最佳活性。纯化重组Fe_RF6318蛋白酶的pH曲线与如实施例1a所述纯化的野生型Fe_RF6318蛋白酶的pH曲线相符。

实施例6.重组Fe_RF6318蛋白酶在不同温度下于pH 9缓冲液中的性能

测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318制剂(如实施例4所述)在温度30℃和50℃去除血/牛奶/墨水标准污迹(Art.116，100％棉，EMPA Testmaterialen AG，Switzerland)的能力。将商业蛋白酶制剂SavinaseUltra 16 L(Novozymes)和Purafect4000L(GenencorInternational)以及无酶的处理(对照)用于比较。首先将污染的织物剪成1.5cm×1.5cm样品并通过剪角使织物片更圆。将织物片放入微量滴定板(Nunc 150200)的孔中。每孔具有2cm的直径，在织物上加入1.5ml用pH 9的甘氨酸-NaOH缓冲液稀释的酶。每种酶施用0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8个活性单位(umol酪氨酸/min)/1.5ml缓冲液。如下测定活性：如实施例1(c)或14所述使用30min反应时间，在加入稀释的Folin试剂后用10min时间显色。将含有样品的微量滴定板在水平振荡器中在30℃和50℃以125rpm孵育60min。之后，在流动水(约45℃)下小心地冲洗样品，在格栅上以室内空气干燥过夜，避光保护。

通过使用L^*a^*b^*颜色空间坐标以Minolta CM 2500分光光度计将颜色测定为反射率值来评价污迹去除效果(D65/2°光源)。处理之后，测量样品两面的颜色。每个值为从织物两面测定的至少2个平行织物样品的平均值。将指示蛋白酶性能(污迹去除效率)的血/牛奶/墨水污迹的褪色计算为ΔL^*，其意为酶处理织物的亮度值L^*减去用无酶洗涤液(缓冲液)处理的织物的亮度值L^*(酶空白、对照)。

结果在图5和6中显示。与商业蛋白酶制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L相比，Fe_RF6318蛋白酶制剂在50℃尤其在30℃下pH 9缓冲液中显示了高得多的污迹去除效率。

实施例7.重组蛋白Fe_RF6318与洗涤粉在40℃/50℃和pH 10的性能

在存在含或不含漂白剂的包含磷酸盐的参考洗涤剂的情况下，测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318制剂(如实施例4所述)在40℃和50℃(pH约10)去除血/牛奶/墨水标准污迹的能力。将标准污迹Art.117(血/牛奶/墨水，聚酯+棉，EMPA)用作测试材料。将商业蛋白酶Purafect4000L和无酶的处理(对照)用于比较。每种酶施用0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8个活性单位(μmol酪氨酸/min)/ml洗涤液。如实施例6所述测定活性。

将3.3g量的包含磷酸盐的ECE参考洗涤剂77(不含荧光增白剂)(Art.601，EMPA)溶于1升自来水(水，dH≤4)，用磁力搅拌器充分混合并调温至40℃/50℃。如实施例6所述将污染的织物剪成片。将样品放入微量滴定板(Nunc 150200)的孔中，并在织物上加入1.5ml含有用水稀释的洗涤剂和酶(低于60μl)的洗涤液。将含有样品的板在水平振荡器中在40℃/50℃以125rpm孵育60min。之后，在流动水(约45℃)下小心/彻底地冲洗样品，在格栅上以室内空气干燥过夜，避光保护。除了在加入洗涤剂之外，再加入0.81g四水合高硼酸钠(Art.604，EMPA)和0.16g漂白激活剂TAED四乙酰基乙二胺(Art.606，EMPA)，以相同的方式进行另一个测试系列。

如实施例6所述，使用L^*a^*b^*颜色空间坐标以Minolta CM 2500分光光度计测定处理后的样品颜色，并将污迹去除效果计算为ΔL^*。

图7A、7B、8A和8B所示结果，显示蛋白酶Fe_RF6318在强碱性条件下也适用于粉状洗涤剂，并且其对漂白剂的抵抗力略高于商业蛋白酶Purafect4000L。

实施例8.重组蛋白Fe_RF6318与液体洗涤剂在40℃的性能

在存在不含酶的液体洗涤剂Ariel Sensitive(Procter & Gamble，England)的情况下，测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318制剂(如实施例4所述)在40℃和pH约7.9去除血/牛奶/墨水标准污迹的能力。将标准污迹——人为污染的试布Art.117(血/牛奶/墨水，聚酯+棉，EMPA)用作测试材料。将商业蛋白酶制剂Purafect4000L、SavinaseUltra 16L和无酶的处理(对照)用于比较。每种酶施用0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8个活性单位(μmol酪氨酸/min)/ml洗涤液。如实施例6所述测定活性。

将3.3g量的Ariel Sensitive溶于1升自来水(dH≤4)，用磁力搅拌器充分混合并调温至40℃。如实施例6所述将污染的织物剪成片。将样品放入微量滴定板(Nunc 150200)的孔中，并在织物上加入1.5ml含有用水稀释的洗涤剂和酶(低于60μl)的洗涤液。将含有样品的板在水平振荡器中在40℃以125rpm孵育60min。之后，在流动水(约45℃)下小心地冲洗样品，在格栅上以室内空气干燥过夜，避光保护。

基于图9所示结果，Fe_RF6318蛋白酶与液体洗涤剂在40℃具有优秀的性能。当施用相同量蛋白酶活性时，与商业制剂Purafect4000L和SavinaseUltra 14L相比，Fe_RF6318对血/牛奶/墨水污迹(聚酯+棉)的效率高得多。4-8个单位商业酶/ml洗涤液的用量等于约0.2-0.5％酶制剂/洗涤剂重量的用量，其为用于洗涤剂用酶的典型使用水平。

实施例9.重组蛋白Fe_RF6318在30℃于不同液体洗涤剂浓度下的性能

在30℃下于浓度为1-5g/l的液体洗涤剂情况下，测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318制剂(如实施例4所述)去除血/牛奶/墨水标准污迹的能力。将不含酶的Ariel Sensitive(Procter & Gamble，England)和用于有色织物的液体碱性洗涤剂用作洗涤剂，所述液体碱性洗涤剂含有25％洗涤活性物质、多元醇和聚合物(表4)，并将标准污迹Art.117(血/牛奶/墨水，聚酯+棉，EMPA)用作测试材料。将商业蛋白酶制剂Purafect4000L、SavinaseUltra 16 L和无酶的处理(对照)用于比较。每种酶施用0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8个活性单位(μmol酪氨酸/min)/ml洗涤液。如实施例6所述测定活性。

表4.用于有色织物的液体碱性洗涤剂的组成

组分	％
		NaLES(月桂基乙醚硫酸钠)	4.9
非离子型C12-157EO(环氧乙烷)	15
		钠皂(Palm Kernel FA)	4.4
椰子葡糖苷(Coco Glucoside)	1
		<总表面活性剂>	<25，30>
多元醇(甘油)	5
		膦酸盐(32％)(ThermPhos)	2
PVP-Sokalan HP 53(BASF)	1
		Sokalan PA 15(BASF)	1.56
Sorez-100(ISP)	0.4
		加水至100％

将1、3.3和5g量的液体洗涤剂溶于1升自来水(dH≤4)，用磁力搅拌器充分混合并调温至30℃。含碱性洗涤剂的洗涤液中pH为约7.3-7.5或含Ariel的为约7.6-8.0，这取决于洗涤剂浓度。如实施例6所述将污染的织物剪成片。将样品放入微量滴定板(Nunc 150200)的孔中，并在织物上加入1.5ml含有用水稀释的洗涤剂和酶(低于60μl)的洗涤液。将含有样品的板在水平振荡器中在30℃以125rpm孵育60min。之后，在流动水下小心/彻底地冲洗样品，在格栅上以室内空气干燥过夜，避光保护。

用用于有色织物的碱性洗涤剂获得的结果如图10A-D所示，而用Ariel Sensitive获得的结果如图11A-D所示。当施用相同量活性时，与商业制剂Purafect4000L和SavinaseUltra 14L相比，在两种洗涤剂和所有洗涤剂浓度下Fe_RF6318对血/牛奶/墨水污迹的效率高得多。另外当用量计算为加入蛋白的量时(图10B和11B)，Fe_RF6318的污迹去除效率最高。用牛γ球蛋白(Bio-Rad)作为标准品，通过Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)测定来自酶制剂的蛋白量。这些测试的结果指出，在液体洗涤剂中，Fe_RF6318蛋白酶在低温(如30℃)具有优秀的性能。

实施例10.重组蛋白Fe_RF6318与液体洗涤剂在30℃对不同污迹的效率(Launder Ometer)

在30℃下于液体洗涤剂中，测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318制剂(如实施例4所述)去除不同污迹的能力，并与商业蛋白酶制剂Purafect4000L和/或Savinase Ultra16L比较。使用下列来自EMPA的人为污染试布：血/牛奶/墨水(Art.117，聚酯+棉)、血/牛奶/墨水(Art.116，棉)、草(Art.164，棉)和可可粉(Art.112，棉)。将织物剪成9cm×12cm样品并通过Z形缝线使边缘整齐。进行两个测试系列：首先用不含酶的Ariel Sensitive，其次在稍后使用用于有色织物的液体碱性洗涤液(实施例8)。将不同批次的污迹用于以上两个实验。

在LP-2 Launder Ometer中如下进行污迹去除处理。首先将Launder Ometer预热至30℃。向含有污迹Art.116和Art.117或污迹Art.164和Art.112的容器中加入450ml含有5g洗涤剂/升自来水(dH≤4)和酶稀释剂的调温洗涤液。每种酶施用0、2、5、10以及在某些测试中20或30个活性单位(μmol酪氨酸/min)/ml洗涤液。如实施例6所述测定活性。使Launder Ometer在30℃和pH约7.5(碱性洗涤剂)或8(Ariel)运行60min。之后，在流动水(约20℃)下小心地冲洗样品，在格栅上以室内空气干燥过夜，避光保护。

如实施例6所述，使用L^*a^*b^*颜色空间坐标以Minolta CM 2500分光光度计测定处理后的样品颜色，并将污迹去除效果计算为ΔL^*。处理之后，测量样品两面的颜色。每个值为每个样品至少20个测量结果的平均值。使测量避开有折痕的区域，所述折痕在处理期间因折叠织物(在棉污迹Art.116和Art.112中)而形成。

用ArielSensitive获得的结果(图12A-C)显示，当施用相同量蛋白酶活性时在30℃下，与商业制剂SavinaseUltra 16L相比，使用Fe_RF6318对血/牛奶/墨水和草污迹的效率高得多。同样，Fe_RF6318对可可粉污迹获得的结果更好(数据未显示)。

另外，用用于有色织物的碱性洗涤剂(5g/l)获得的结果(图13A-D)显示，当施用相同量蛋白酶活性时在30℃下，与商业制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L相比，使用Fe_RF6318对血/牛奶/墨水、草和可可粉污迹的效率高得多。10单位商业酶/ml液体的用量等于近似0.4％酶制剂/洗涤剂重量的用量，其为用于洗涤剂用酶的典型使用水平。这些测试的结果指出，Fe_RF6318蛋白酶在低温(如30℃)对数种污迹有效。

实施例11.在30℃全规模洗涤试验中，重组蛋白Fe_RF6318在液体衣物洗涤剂中性能的评价

在30℃于洗涤机中，以全规模洗涤试验测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318制剂(如实施例4所述)在液体洗涤剂中的性能，并与商业蛋白酶制剂Purafect4000L和Savinase Ultra16L以及使用不含酶洗涤剂的处理相比较。使用用于有色织物的液体碱性洗涤剂(如实施例9所述)和8种不同的蛋白酶敏感示踪物(表5)。除了两块压载污物(ballast soil)(CFT-SBL)外，将每次洗涤置于洗涤网中以避免与其它样品接触的污染。示踪物来自CFT(Center For Testmaterials BV，TheNetherlands)。将10cm×10cm污迹样品缝成揩巾。处理参数和条件如表6所述。将试验所用的酶用量计算为酶活性(约0-14个活性单位/ml洗涤液)和蛋白量(约0-2.2mg/升洗涤液)二者。如实施例6和9所述测定制剂的蛋白酶活性和蛋白质含量。

表5.测试所用的蛋白酶敏感示踪物

表6.处理参数和条件

污迹去除效果的评价基于用具有UV-滤光器的Datacolor-分光光度计的反射率(R 457nm)测量，并计算为污迹去除效果百分率(％SR)。

将结果计算为Δ％SR(delta％SR)，其意为酶处理织物的％SR减去未用酶(仅洗涤剂)处理的％SR。

用酶的各种用量进行包含每种污迹两个样品的两次洗涤，并测定每种污迹样品的三个测量结果，因此值基于每种产品每种污迹的12个测量结果。

总污物去除效率(Δ％SR)的结果如图14A-B和图15A-E所示。总污迹去除效果基于用八种不同的蛋白酶敏感污迹(污迹1-8，表5)所获结果的总和，当蛋白酶以每洗涤剂体积的活性量和蛋白量施用时，与商业蛋白酶制剂Purafect4000L和SavinaseUltra 16L相比，用Fe_RF6318的总污迹去除效果更高(图14A-B)。Fe_RF6318尤其对血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黄有效(图15A-E)。

将常规的去污力示踪物(色素/油)在不同机器的重复中用作对照。在各种测试间未观察到差异。

实施例12.重组蛋白Fe_RF6318在温度10℃-60℃、pH 9缓冲液中的性能

测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318(如实施例4所述)在温度10-60℃去除血/牛奶/墨水标准污迹(Art.117，聚酯+棉，EMPATestmaterialen AG，Swizerland)的能力。将商业蛋白酶制剂SavinaseUltra16L、Purafect4000L和Properase4000 E以及无酶的处理(对照)用于比较。除了孵育温度范围更宽、污迹材料不同以及样品冲洗水温与洗涤温度相似之外，如实施例6所述在pH 9缓冲液下进行测试。如实施例6所述，使用L^*a^*b^*颜色空间坐标以Minolta CM 2500分光光度计测定处理后的样品颜色，并将污迹去除效果计算为ΔL^*。

结果如图16A-F所示。与商业蛋白酶制剂SavinaseUltra 16L和Purafect4000L相比，Fe_RF6318蛋白酶制剂在pH 9缓冲液中于10℃-60℃的全温度范围下，显示更高的污迹去除能力。与Properase4000E相比，其在30℃-60℃范围亦显示更高的污迹去除能力。

实施例13.重组蛋白Fe_RF6318与液体洗涤剂在低洗涤温度10℃和20℃的性能

在低温和液体碱性洗涤剂的情况下，测试了在木霉中产生的重组蛋白Fe_RF6318(如实施例2所述)去除血/牛奶/墨水标准污迹(Art.117，棉+聚酯，EMPA)的能力。除了仅使用3.3g/l洗涤剂浓度和使用更低的孵育温度(10℃和20℃)，测试方法与实施例9相似。样品的冲洗水温与洗涤温度相似。

如实施例6所述，使用L^*a^*b^*颜色空间坐标以Minolta CM 2500分光光度计测定处理后的样品颜色，并将污迹去除效果计算为ΔL^*。对于无酶的处理(酶空白)，将洗涤剂溶液用作洗涤液。

在3.3g/l液体碱性洗涤剂浓度情况下，在10℃和20℃获得的结果如图17A和B所示。当施用相同活性量时，与商业制剂SavinaseUltra 16L、Purafect4000L和Properase4000E相比，Fe_RF6318在10℃和20℃对血/牛奶/墨水污迹的效率均高得多。这些测试结果指出，在液体洗涤剂的情况下，Fe_RF6318蛋白酶在非常低的洗涤温度下具有优秀的性能。

实施例14.蛋白酶活性测定法II

通过使用酪蛋白作为底物的酪蛋白Folin-Ciocalteau法测定蛋白酶活性。蛋白酶降解酪蛋白的速率通过分光光度监测作为时间的函数的酸溶片断的释放来测定。用于测定的酪蛋白底物如下制备：将6g酪蛋白Hammerstein级MP Biomedicals，LLC(101289)溶于500ml的30mM Tris、2.0mM CaCl₂、0.7mM MgCl₂、2.5mM NaHCO₃。用HCl将底物溶液pH调至8.5。使用0.11M TCA溶液终止酶反应。通过用蒸馏水将25ml 2N Folin-Ciocalteu酚试剂(SIGMA，F 9252)稀释到100ml制备用于测定的Folin试剂。通过首先在50℃孵育2.5ml底物溶液5min开始反应，之后加入0.5ml酶溶液并进行反应30min。30min反应之后，加入2.5ml反应终止液，混合内容物并使其在室温下静置30分钟。将管以4000rpm离心10分钟(Hettich Rotanta 460)。将1ml澄清的上清液与2.5ml 0.5M Na₂CO₃和0.5ml稀释的Folin试剂混合。等待至少5min(显色)之后，对照酶空白在660nm处测定混合物的吸光度(颜色)。酶空白如下制备：将0.5ml酶溶液与2.5ml终止液和2.5ml底物混合，并在50℃孵育混合物30min。将一个酶活单位定义为每min每ml(或g)反应混合物释放对应于1μg酪氨酸的酸溶蛋白水解产物的酶量。

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Claims

1.一种真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并由如SEQ ID NO: 15定义的成熟Fe_RF6318酶的氨基酸序列组成。

2. 根据权利要求1的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶可自木贼镰孢(Fusariumequiseti)获得。

3. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶的成熟形式具有在20-35 kDa之间的分子质量。

4. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，在pH 9使用15 min反应时间以及酪蛋白作为底物，所述酶的最适温度为50℃-60℃。

5. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，在50℃使用15 min反应时间以及酪蛋白作为底物，所述酶的最适pH在pH 9-pH 10的pH范围。

6. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，在存在洗涤剂的情况下于10℃-60℃之间，所述酶能够降解和去除蛋白质污迹。

7. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在严格条件下与包含在质粒pALK2521中的多核苷酸序列杂交，所述质粒包含核苷酸序列SEQ ID NO: 9，保藏在检索号为DSM 22171的大肠杆菌RF7664中。

8. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由分离的核酸分子编码，所述核酸分子编码由在SEQ ID NO: 15中表征的氨基酸序列组成的多肽。

9. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由由核苷酸序列SEQ ID NO: 14组成的分离核酸分子编码。

10. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由包含在pALK2529中的多核苷酸序列编码，pALK2529保藏在检索号为DSM 22172的大肠杆菌RF7800中。

11. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由重组表达载体产生，所述重组表达载体包含编码根据权利要求1-10中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接到能够在适宜宿主中指导丝氨酸蛋白酶编码基因表达的调控序列。

12. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在异源宿主中产生。

13. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在微生物宿主中产生。

14. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在下列属的宿主中产生：木霉、曲霉、镰孢、腐质霉、金孢子菌、脉孢菌、根霉、青霉和被孢霉。

15. 根据权利要求14的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在木霉或曲霉中产生。

16. 根据权利要求15的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶在里氏木霉(T. reesei)中产生。

17. 一种编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离核酸分子，所述核酸分子选自：

(a) 以下核酸分子，其编码具有丝氨酸蛋白酶活性并由如SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列组成的多肽；

(b) 以下核酸分子，其由如SEQ ID NO: 10所述的核苷酸序列的编码序列组成；

(c) 由多核苷酸序列的编码序列组成的核酸分子，所述多核苷酸序列包含于DSM 22172中；和

(d) 以下核酸分子，其编码序列由于遗传密码的简并性而与(b)-(c)的任一核酸分子的编码序列不同。

18. 一种包含根据权利要求17的核酸分子的重组表达载体，所述核酸分子可操作地连接到能够在适宜宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因表达的调控序列。

19. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求18的重组表达载体。

20. 根据权利要求19的宿主细胞，其特征在于，所述宿主为微生物宿主。

21. 根据权利要求19或20的宿主细胞，其特征在于，所述宿主为丝状真菌。

22. 根据权利要求19或20的宿主细胞，其特征在于，所述宿主为下列属的宿主：木霉、曲霉、镰孢、腐质霉、金孢子菌、脉孢菌、根霉、青霉和被孢霉。

23. 根据权利要求22的宿主细胞，其特征在于，所述宿主为木霉或曲霉。

24. 根据权利要求23的宿主细胞，其特征在于，所述宿主为里氏木霉。

25. 一种产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：培养根据权利要求19-24中任一项的宿主细胞和回收所述多肽。

26. 一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由根据权利要求17的核酸分子编码，并且可通过根据权利要求25的方法获得。

27. 一种用于获得酶制剂的方法，所述酶制剂包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述方法包括以下步骤：培养根据权利要求19-24中任一项的宿主细胞，和自所述宿主细胞回收多肽或从培养基中分离所述宿主细胞以及获得上清液。

28. 一种酶制剂，所述酶制剂通过根据权利要求27的方法获得。

29. 一种酶制剂，所述酶制剂包含根据权利要求1-16中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶。

30. 根据权利要求28或29的酶制剂，其特征在于，所述制剂包含选自下列含或不含介质的其它酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或氧化酶。

31. 根据权利要求28或29的酶制剂，其特征在于，所述制剂包含选自下列的适宜添加剂：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、增效剂、漂白剂、介质、防蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、荧光增白剂、染剂、色素和防腐剂。

32. 根据权利要求28或29的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂呈液体、粉末或颗粒形式。

33. 根据权利要求1-16中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶或根据权利要求28-32中任一项的酶制剂在洗涤剂、处理纤维、处理毛织品、处理毛发、处理皮革、处理食物或饲料或涉及修饰、降解或去除蛋白质材料的应用中的用途。

34. 根据权利要求1-16中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶或根据权利要求28-32中任一项的酶制剂作为除垢添加剂的用途。

35. 在洗涤液中的根据权利要求34的用途。

36. 在洗涤粉中的根据权利要求34的用途。