JP2012525130A - 新規真菌プロテアーゼおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、配列番号：１５のアミノ酸配列を有する成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列を含む真菌セリンプロテアーゼ酵素に関する。該セリンプロテアーゼは、フザリウム・エクイセチ、より好ましくは寄託された株ＣＢＳ１１９５６８から得ることができる。また、該プロテアーゼをコードする核酸配列、例えば、受入番号ＤＳＭ２２１７１の下に大腸菌ＲＦ７６６４において寄託されている配列番号：９のヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＡＬＫ２５２１および受入番号ＤＳＭ２２１７２の下に大腸菌ＲＦ７８００において寄託されている配列番号：１０の全長遺伝子を含むプラスミドｐＡＬＫ２５２９も記載されている。該プロテアーゼは、界面活性剤組成物において適用できる酵素調製物として、ならびに繊維を処理するために、羊毛を処理するために、髪を処理するために、革を処理するために、食物または飼料を処理するために、またはタンパク質物質の修飾、分解または除去にかかわるあらゆる適用のために有用である。

Description

技術分野
本発明は、種々の適用、特に洗濯用および食器洗い用界面活性剤において有用である真菌セリンプロテアーゼ酵素に関する。本発明は、該酵素をコードする核酸分子、組換えベクター、該酵素を生産するための宿主細胞、該酵素を含む酵素組成物ならびにこのような組成物を調製するための方法に関する。本発明は、また、該酵素の種々の使用または該酵素を含む組成物に関する。

背景
微生物プロテアーゼは、最も重要な加水分解酵素の１つであり、種々の産業分野における適用、例えば、界面活性剤、食物、革、医薬、診断、廃棄物管理および銀回収において見られる。微生物細胞外プロテアーゼは、全世界の産業的酵素売買の３分の１以上の大部分を占める（Cherry and Fidantsef, 2003）。市販のプロテアーゼの約９０％は、界面活性酵素である（Gupta et al., 2002）。多数の市販のプロテアーゼは、主に中性およびアルカリ性であり、バチルス(Bacillus)属に属する生物により生産される。

バチルス種により生産されるサブチリシンファミリーのセリンプロテアーゼまたはサブチリシンは、産業プロテアーゼの最も大きなサブグループを形成する。これらの酵素は、洗浄用界面活性剤のタンパク質分解成分または添加物として商業的に重要である。現在使用されている市販の界面活性調製物は、バチルス種起源の天然アルカリ性セリンプロテアーゼを含むか、または組換えプロテアーゼ調製物である（Maurer, 2004）。温度、酸化剤および洗浄条件の変化に対して改良された触媒効率および／またはより良い安定性を有する天然酵素の変異体は、部位特異的および／またはランダム変異誘発を介して開発されている。市販のプロテアーゼの例は、例えば、サブチリシン Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Novozymes, DK）、サブチリシン ３０９（Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Novozymes, DK）、サブチリシン １４７（Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Novozymes, DK）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）（Novozymes, DK）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）（Genencor Inc., USA）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｏｘ、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）（Genencor Inc., USA）ならびにＢＬＡＰ ＳおよびＸシリーズ（Henkel, DE）である。

いくつかのアルカリ性セリンプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２１）およびこれらの酵素をコードする遺伝子は、また、酵母菌および糸状菌(filamentous fungi)を含む真核生物から単離されている。米国特許第３，６５２，３９９号およびＥＰ５１９２２９（Takeda Chemical Industries, Ltd., JP）は、界面活性剤および他の洗浄剤組成物の製剤化において有用な属フザリウム(Fusarium)（無性状態、テレオモルフ）またはジベレラ(Gibberella)（有性状態、アナモルフ）、特にフザリウム種Ｓ−１９−５（ＡＴＣＣ ２０１９２、ＩＦＯ ８８８４）、フザリウム・オキシスポルム(oxysporum) フザリウム種リニ(lini)（ＩＦＯ ５８８０）またはジベレラ・サンビネッティ(saubinetti)（ＡＴＣＣ ２０１９３、ＩＦＯ６６０８）由来のアルカリプロテアーゼを記載している。ＷＯ８８／０３９４６およびＷＯ８９／０４３６１（Novo Industri A/S, DK）は、プロテアーゼおよびリパーゼを含む酵素的な界面活性剤添加物および界面活性剤組成物を記載しており、ここで、真菌プロテアーゼはフザリウム、特にフザリウム・オキシスポルムまたはフザリウム・ソラニ(solani)に由来する。１または２つの特定のアミノ酸のみに隣接したペプチド結合に対する特異性を有するプロテアーゼを含む界面活性剤添加物は、ＷＯ８９／０６２７０に記載されている。ＷＯ１９９４０２５５８３（NovoNordisk A/S, DK）は、フザリウム種、特にフザリウム・オキシスポルムの株（ＤＳＭ ２６７２）から誘導できる活性なトリプシン様プロテアーゼ酵素、および同じものをコードするＤＮＡ配列を記載している。フザリウム種ＢＬＢ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４９３）由来の新規プロテアーゼのアミノ酸配列は、ＷＯ２００６１０１１４０（SODX Co. Ltd, Nakamura）に記載されている。また、真菌種、例えば、トリチラキウム(Tritirachium)およびコニディオボルス(Conidiobolus)由来のアルカリプロテアーゼが報告されている（Anwar and Saleemuddin, 1998、参照）。

異なる適用における真菌セリンプロテアーゼの使用は、また、いくつかの特許出願から知られている。例えば、界面活性剤添加物または組成物としてセルラーゼおよびプロテアーゼ、特にフザリウム種 ＤＳＭ ２６７２由来のトリプシン様プロテアーゼの組合せが、ＷＯ１９９２０１８５９９（NovoNordisk A/S）に記載されている。このような界面活性剤組成物は、ＷＯ１９９２００３５２９およびＷＯ１９９２００５２３９（NovoNordisk A/S）に記載されている酵素を安定させるために可逆性プロテアーゼ阻害剤をさらに含み得る。触媒的に活性なアミノ酸配列、例えば、セルロース結合ドメインを含むアミノ酸配列に連結したプロテアーゼを含む酵素ハイブリッドでの、セルロース系織物から染みまたは汚点の除去または漂白のための方法は、ＷＯ１９９７０２８２４３（NovoNordisk A/S）に記載されている。ＷＯ１９９７００２７５３（NovoNordisk A/S）は、リパーゼおよびプロテアーゼ、好ましくはフザリウムから得ることができるセリンプロテアーゼを使用する汚れ処理装置の穏やかな清浄のための方法を記載している。廃水中の有機物を減少させるためのフザリウム・エクイセティ(equiseti)および他の真菌の使用は、ＥＰ１４６４６２６特許出願（Biovitis S.A., FR）に記載されている。

社会経済の挑戦および政府規制は、少量で使用でき、残す環境廃棄物跡がより少ないさらに寛大な化学物質の使用だけでなく、エネルギー節約の必要性もまた含む多数の環境局面を考慮して、界面活性剤産業に強要している。界面活性剤酵素、特にプロテアーゼは、界面活性剤組成物における重要な成分である。洗浄温度を低下させることによるエネルギーの節約の必要性があり、高い温度に耐えることができない合成繊維の使用が増加しており、現在のライフスタイルは低い洗浄温度へ顧客の習慣が変化しており、低い温度において有効である新しい酵素に対する要求が作られている。

種々の微生物由来のセリンプロテアーゼ、例えば、放線菌(actinomycete)（ノカルジオプシス・ダソンヴィレィ(Nocardiopsis dassonvillei)）および真菌（ペシロミセス・マルクアンディ(Paecilomyces marquandii)）微生物由来の低温アルカリプロテアーゼが、多数の特許公報、論評および論文、例えば、ＥＰ０２９０５６７およびＥＰ０２９０５６９（Novo Nordisk A/S, DK）に公開されている事実にもかかわらず、特に低い温度または中程度の温度範囲においてタンパク質物質の修飾、分解および除去において適当および有効であり、非常に様々な特性を有する界面活性剤の存在下で安定である代替セリンプロテアーゼのかなりの必要性が未だ存在する。

界面活性剤産業は、新規製品を顧客の習慣および要求、新規織物製品および新規洗浄機の特性に適合において大幅に進歩させる。新規界面活性剤、特に洗濯用および食器洗浄用組成物を開発するとき、非常に様々な要求および迅速に変化する要求を満足させなければならないことは明らかである。界面活性剤産業および政府規制の様々な全ての要求を満たすために、界面活性剤組成物用の新規セリンプロテアーゼ成分は、広範なｐＨおよび温度範囲において役割を成し遂げることができるだけでなく、種々の異なる界面活性剤と組み合わせて機械的および化学的介入を含む種々の条件下で安定性を維持するべきであり、また、セリンプロテアーゼは高収率において生産することができ、発酵培養液および菌糸から容易な分離によりコスト的に有効な下流処理できることが望ましい

発明の概要
本発明の目的は、広範な基質特異性を示し、広範なｐＨ範囲で活性であり、広範な温度最適条件を有する、すなわち低い温度および中程度の温度の両方で機能する真菌起源のセリンプロテアーゼを提供することである。洗濯用および食器用界面活性剤のためのセリンプロテアーゼは、界面活性剤の存在下でも安定であるか、または界面活性剤と適合性であるべきである。特に、本発明の目的は、現在市販の酵素調製物よりも低い温度で洗濯用および食器用の洗浄において汚点を含むタンパク質物質を除去し、それによりエネルギーを節約することができるセリンプロテアーゼを提供することである。真菌セリンプロテアーゼは、真菌宿主において高収率で生産することができ、その下流処理、例えば、発酵培養液および菌糸の分離は実施することが容易である。

本発明は、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列または配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む真菌セリンプロテアーゼ酵素に関する。

本発明の酵素は、フザリウム・エクイセチ(Fusarium equiseti)、より好ましくは寄託された株ＣＢＳ１１９５６８から得ることができる。

該酵素は、２５から３５ｋＤａの分子量を有する。該酵素は、ｐＨ９で３０℃から７０℃の範囲の最適温度を有する。該酵素は、５０℃で少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で最適ｐＨを有する。温度および最適ｐＨは、１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用して決定した。本発明のセリンプロテアーゼは、界面活性剤の存在下で１０℃から６０℃でタンパク質汚点を分解または除去することができる。

本発明の真菌セリンプロテアーゼ酵素は、受入番号ＤＳＭ２２１７１の下に大腸菌ＲＦ７６６４において寄託されている配列番号：９のヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＡＬＫ２５２１に含まれているポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。

該酵素は、配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列または配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。好ましくは、該酵素は、配列番号：１４のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる。

本発明の全長真菌セリンプロテアーゼ酵素は、受入番号ＤＳＭ２２１７２の下に大腸菌ＲＦ７８００において寄託されているｐＡＬＫ２５２９に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

該真菌セリンプロテアーゼ酵素は、適当な宿主におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を駆動することができる調節配列に作動可能に連結した本発明の真菌セリンプロテアーゼをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターから生産される。適当な宿主は、異種宿主、好ましくは属トリコデルマ(Trichoderma)、アスペルギルス(Aspergillus)、フザリウム(Fusarium)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、アカパンカビ(Neurospora)、クモノスカビ(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)およびモルティエラ(Mortiriella)の微生物宿主を含む。

好ましくは、該酵素は、トリコデルマまたはアスペルギルス、さらに好ましくはトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)において生産される。

本発明は、また：
（ａ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５において記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｃ）配列番号：１０において記載されているヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
（ｄ）ＤＳＭ２２１７１またはＤＳＭ２２１７２に含まれるポリヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
（ｅ）遺伝子コードの縮重によって、（ｃ）から（ｄ）のいずれか１つの核酸分子のコード配列と異なるコード配列を含む核酸分子；および
（ｆ）ＤＳＭ２２１７１に含まれる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５において記載されているアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群から選択される真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子に関する。

本発明は、適当な宿主における該セリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を駆動することができる調節配列に作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターにさらに関する。適当な宿主は、異種宿主、好ましくは属トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムおよびモルティエラの微生物宿主を含む。好ましくは、該酵素は、トリコデルマまたはアスペルギルス、さらに好ましくはトリコデルマ・リーゼイにおいて生産される。

本発明は、また、上記組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、該宿主細胞は、微生物宿主、例えば、糸状菌である。好ましい宿主は、属トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムおよびモルティエラである。より好ましくは、該宿主は、トリコデルマまたはアスペルギルス、さらに好ましくは糸状菌トリコデルマ・リーゼイである。

本発明は、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、本発明の宿主細胞を培養する工程、該ポリペプチドを回収する工程を含む方法に関する。また、本発明の核酸配列によってコードされ、上記方法により得ることができるセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドも本発明の範囲内である。

本発明は、酵素調製物を得るための方法であって、本発明の宿主細胞を培養し、該細胞から該ポリペプチドを回収するか、または該培養培地から該細胞を分離して上清を得る工程を含む方法に関する。また、上記方法により得ることができる酵素調製物も本発明の範囲内である。

本発明は、本発明のセリンプロテアーゼ酵素を含む酵素調製物に関する。

本発明の酵素調製物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼまたはオキシダーゼの群から選択される他の酵素をメディエーターと共にまたはメディエーターなしでならびに安定剤、バッファー、界面活性剤、漂白剤、メディエーター、防食剤、増進剤、再付着防止剤、光学的光沢剤、色素、顔料、腐食剤、研磨剤および防腐剤などの群から選択される適当な添加物をさらに含み得る。

生産宿主の消費された培養培地はそれ自体使用することができ、または該宿主細胞を除去され得、および／またはそれは濃縮、濾過または分画され得る。それは、また、乾燥され得る。本発明の酵素調製物は、液体、粉末または粒状の形態であり得る。

また、界面活性剤のための、繊維を処理するための、羊毛を処理するための、髪を処理するための、革を処理するための、食物または飼料を処理するための、またはタンパク質物質の修飾、分解または除去にかかわるあらゆる適用のための本発明のセリンプロテアーゼ酵素または酵素調製物の使用も本発明の範囲内である。特に、該酵素または酵素調製物は、液体の界面活性剤および粉末の界面活性剤における界面活性剤添加物として有用である。

図１は、フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８ Ｆｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。シグナルＰ Ｖ３．０ プログラムにより分析される推定シグナルペプチドは、小文字であり、下線が引かれている。プロ配列およびプロ配列の推定アミノ酸は小文字である。成熟ヌクレオチドおよびペプチド配列は、大文字である（精製された野生型Ｆｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質から決定されたＮ−末端配列）。推定イントロン配列の位置は、小文字のイタリック体であり、ヌクレオチド配列下で点線によりマークされている。終始コドンは、配列下のアステリスクにより示されている。野生型Ｆｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質から得られるＮ−末端配列およびペプチド配列は、グレイ色の背景で強調されている。図１Ａは、Ｆｅ ｐｒｔ８Ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンからＣＣＴコドン（ヌクレオチド８９８から９００）のヌクレオチド配列、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質のＭｅｔ１からＶａｌ２７８のアミノ酸配列をコードする配列領域を示す。図１Ｂは、Ｆｅ ｐｒｔ８Ａ遺伝子のＣＴＣコドン（ヌクレオチド９０１から９０３）からＴＡＡ終始コドンのヌクレオチド配列、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質のＬｅｕ２７９からＡｌａ４１２のアミノ酸配列をコードする配列領域を示す。 図２は、トリコデルマ・リーゼイにおいてＦｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子を発現するために使用されるカセットを概略的に示す。 図３は、１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにおいて分析された部分的に精製された組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質を示す。レーン１．部分的に精製されたＦｅ＿ＲＦ６３１８のサンプル、レーン２．ＭＷマーカー（Bench Mark Protein Ladder, Invitrogen）。 図４Ａは、１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用してｐＨ９でアッセイされた組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の温度プロフィールを示す。データ点は３つの異なる測定の平均である。図４Ｂは、組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の活性におけるｐＨの影響を示す。使用されるバッファーは４０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファーであり、カゼインは基質として使用され、反応時間は１５分であり、反応温度は５０℃であった。データ点は３つの異なる測定の平均である。 図５は、３０℃、ｐＨ９、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１６、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標） １６Ｌ（Novozymes A/S, DK）およびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ（Genencor Inc., USA）を比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。

図６は、５０℃、ｐＨ９、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ． １１６、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。 図７Ａは、粉末界面活性剤（Ａｒｔ． ６０１、ＥＭＰＡ）の存在下で、４０℃、約ｐＨ１０、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。 図７Ｂは、粉末界面活性剤および漂白剤（Ａｒｔ． ６０４および６０６、ＥＭＰＡ）の存在下で、４０℃、約ｐＨ１０、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。 図８Ａは、粉末界面活性剤（Ａｒｔ． ６０１、ＥＭＰＡ）の存在下で、５０℃、約ｐＨ１０、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。 図８Ｂは、粉末界面活性剤および漂白剤（Ａｒｔ． ６０４および６０６、ＥＭＰＡ）の存在下で、５０℃、約ｐＨ１０、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。 図９は、４０℃、約ｐＨ７．９、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）および液体界面活性剤Ａｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅでの組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌを比較のために使用した。ｘ軸 酵素量（活性単位／ｍｌ）、ｙ軸 ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）で示されている。

図１０は、３０℃で色付き織物に対する異なる濃度の液体ベースの界面活性剤で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。図１０Ａは、５ｇ／ｌの界面活性剤濃度およびｐＨ７．５での能力を示す。図１０Ｂは、５ｇ／ｌの界面活性剤濃度（タンパク質として計算された酵素量）での能力を示す。 図１０Ｃは、３．３ｇ／ｌの界面活性剤濃度およびｐＨ７．４での能力を示す。図１０Ｄは、１ｇ／ｌの界面活性剤濃度およびｐＨ７．３での能力を示す。 図１１は、３０℃で織物において異なる濃度のＡｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（酵素無し）で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力を示す。市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。図１１Ａは、５ｇ／ｌの界面活性剤濃度およびｐＨ８での能力を示す。図１１Ｂは、５ｇ／ｌの界面活性剤濃度での能力を示す（タンパク質として計算された酵素量）。 図１１Ｃは、３．３ｇ／ｌの界面活性剤濃度およびｐＨ７．９での能力を示す。図１１Ｄは、１ｇ／ｌの界面活性剤濃度およびｐＨ７．６での能力を示す。 図１２は、３０℃で液体の界面活性剤 Ａｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（酵素無し）でＬａｕｎｄｅｒ Ｏｍｅｔｅｒ試験における異なる汚点に対する組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ １６Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。図１２Ａは、血液／ミルク／インク／ＰＥ−綿（Ａｒｔ． １１７、ＥＭＰＡ）における能力を示す。図１２Ｂは、血液／ミルク／インク／綿（Ａｒｔ． １１６、ＥＭＰＡ）における能力を示す。 図１２Ｃは、草（Ａｒｔ． １６４、ＥＭＰＡ）における能力を示す。 図１３は、３０℃で色付き織物に対する液体ベースの界面活性剤でＬａｕｎｄｅｒ Ｏｍｅｔｅｒ試験における異なる汚点における組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ Ｌを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。図１３Ａは、血液／ミルク／インク／ＰＥ−綿（Ａｒｔ． １１７、ＥＭＰＡ）における能力を示す。図１３Ｂは、血液／ミルク／インク／綿（Ａｒｔ． １１６、ＥＭＰＡ）における能力を示す。 図１３Ｃは、草（Ａｒｔ． １６４、ＥＭＰＡ）における能力を示す。図１３Ｄは、ココア（Ａｒｔ． １１２、ＥＭＰＡ）における能力を示す。 図１４は、フルスケール洗浄試験における８つの異なるプロテアーゼ感知汚点（表５）に対するＦｅ＿ＲＦ６３１８酵素調製物の全汚点除去効率（デルタ％ＳＲ）を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌを比較のために使用した。図１４Ａは、プロテアーゼ調製物が活性にしたがって投薬されたときの全汚点除去効率を示す。図１４Ｂは、プロテアーゼ調製物がタンパク質の量にしたがって投薬されたときの全汚点除去効率を示す。

図１５は、３０℃でフルスケール試験における色付き織物に対する液体ベースの界面活性剤での汚点除去効果を示す。図１５Ａは、血液／ミルク／インク／綿（Ｃ−０５−０１４／ＣＦＴ）における汚点除去を示す。図１５Ｂは、血液／ミルク／インク／ＰＥ−綿（Ｃ−０５−０１４／ＣＦＴ）における汚点除去を示す。 図１５Ｃは、チョコレートミルク／顔料／綿（Ｃ−０３−０３０／ＣＦＴ）における汚点除去を示す。図１５Ｄは、落花生油／ミルク／綿（Ｃ−０５−０１４／ＣＦＴ）における汚点除去を示す。 図１５Ｅは、卵黄／顔料／綿（ＣＳ−３８−０１０／ＣＦＴ）における汚点除去を示す。 図１６は、１０℃から６０℃の温度、ｐＨ９、６０分で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標） １６Ｌ （Novozymes A/S, DK）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ （Genencor Inc., USA）およびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００Ｅ （Genencor Inc., USA）を比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。図１６Ａは、１０℃での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。図１６Ｂは、２０℃での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。 図１６Ｃは、３０℃での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。図１６Ｄは、４０℃での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。 図１６Ｅは、５０℃での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。図１６Ｆは、６０℃での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８および市販のプロテアーゼ調製物の能力を示す。 図１７は、１０℃および２０℃で血液／ミルク／インク汚点（Ａｒｔ １１７、ＥＭＰＡ）および３．３ｇ／ｌの液体ベース濃度での組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質の能力を示す。市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌ、 Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００ Ｅを比較のために使用した。ΔＬ＊（デルタＬ＊）＝酵素処理された織物の明度Ｌ＊−バッファーのみで処理された織物の明度Ｌ＊（酵素ブランク）。図１７Ａは、１０℃での能力を示す。図１７Ｂは、２０℃での能力を示す。

配列表
配列番号：１ フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼ由来のアミノ末端ペプチド＃３７９２の配列。
配列番号：２ フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼ由来のトリプシンペプチド１２４６．６７３の配列。
配列番号：３ フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼ由来のトリプシンペプチド３３４１．６３３の配列。
配列番号：４ フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼ由来のトリプシンペプチド１５０３．７９９の配列。
配列番号：５ 配列番号：１のアミノ末端ペプチド由来のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲＯ８７の配列。

配列番号：６ 配列番号：１のアミノ末端ペプチド由来のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲＯ８８の配列。
配列番号：７ 配列番号：４のペプチド由来のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲＯ８９の配列。
配列番号：８ 配列番号：４のペプチド由来のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲＯ９０の配列。
配列番号：９ プライマーＰＲＯ８８（配列番号：６）およびＰＲＯ８９（配列番号：７）ならびに鋳型としてフザリウム・エクイセチＲＦ６３１８ゲノムＤＮＡを使用して得られるＰＣＲフラグメントの配列
配列番号：１０ 全長フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼ遺伝子（Ｆｅ ｐｒｔＳ８Ａ）のヌクレオチド配列。

配列番号：１１ Ｍｅｔ１からＡｌａ４１２のアミノ酸を含む全長フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼ（Ｆｅ＿ＲＦ６３１８）の推定アミノ酸配列。
配列番号：１２ フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼのプロ酵素形態のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
配列番号：１３ 全長プロテアーゼのＡｌａ２１からＡｌａ４１２のアミノ酸を含むフザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼのプロ酵素形態のアミノ酸配列。
配列番号：１４ フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼの成熟形態のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
配列番号：１５ 全長酵素のＡｌａ１２４からＡｌａ４１２のアミノ酸を含むフザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼの成熟形態のアミノ酸配列。

寄託
フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８は、２００６年４月７日にＵｐｐｓａｌａｌａａｎ ８、３５０８ ＡＤ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓでＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓで寄託され、受入番号ＣＢＳ１１９５６８を割り当てられた。

プラスミドｐＡＬＫ２５２１を含む大腸菌株ＲＦ７６６４は、２００９年１月１４日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７ ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで寄託され、受入番号ＤＳＭ２２１７１を割り当てられた。

プラスミドｐＡＬＫ２５２９を含む大腸菌株ＲＦ７８００は、２００９年１月１４日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７ ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで寄託され、受入番号ＤＳＭ２２１７２を割り当てられた。

詳細な説明
本発明は、広範な基質特異性を示し、高いｐＨ範囲で安定であり、広範な温度最適条件、すなわち低い温度および中程度の温度の両方で良い能力を有する真菌起源のセリンプロテアーゼを提供する。該酵素は、酸化剤およびキレート化剤に耐え、界面活性剤溶液において低い酵素レベルで有効であって、界面活性剤適用に理想的である。特に、該セリンプロテアーゼは１０℃と低い温度で活性であり、好ましい範囲は１０℃から６０℃である。したがって、本発明は、界面活性剤における使用および他の適用のための代替セリンプロテアーゼを提供する。該真菌セリンプロテアーゼは、高収率の真菌宿主およびその下流処理、例えば、容易に行われる発酵培養液および菌糸の分離において生産することができる。

本発明との関連において、「セリンプロテアーゼ」または「セリンエンドペプチダーゼ」または「セリンエンドプロテイナーゼ」は、International Union of Biochemistry and Molecular Biologyの命名法によってＥＣ ３．４．２１として分類される酵素である。セリンプロテアーゼは、単細胞および複合生物の両方において見出される。構造的類似性に基づいて、セリンプロテアーゼは、同様のアミノ酸配列および三次元構造でファミリーにさらにサブグループ化される少なくとも６つのクラン(clan)（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦおよびＳＧ；Ｓはセリンプロテアーゼを示す）にグループ化されている（例えば、セリンプロテアーゼホームページ http://www.biochem.wustl.edu/~protease/, Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University of Medicine, St. Louis, MO, USA、参照）。これらのタンパク質加水分解酵素または分解酵素は、活性部位における求核セリン基の存在により特徴付けられ、クランＳＡおよびクランＳＢのプロテアーゼは、また、セリンと共に触媒トライアド(triad)を形成する重要なアスパラギン酸およびヒスチジン残基を有することにより区別される。

主なクランは、「キモトリプシン様」、例えば、キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼ（クランＳＡ）および「サブチリシン様」（クランＳＢ）セリンプロテアーゼを含む。該酵素は、開裂部位を取り囲むアミノ酸残基の側鎖に基づいてポリペプチド鎖の異なる領域を標的とする。本発明のセリンプロテアーゼは、クランＳＢに属する。

記載されている「サブチリシン様セリンプロテアーゼ」または「サブチラーゼ」は、一般的に細菌起源である。バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquifaciens)、バチルス・リケニフォルミス(B.licheniformis)およびバチルス・サブティリス(B.subtilis)のような種々のバチルスにより示される（Rao et al., 1998）このプロテアーゼのクラス、は、芳香族性または疎水性残基、例えば、チロシン、フェニルアラニンおよびロイシンに特異的である。

本発明において使用される「セリンプロテアーゼ活性」なる用語は、基質、例えば、カゼイン、ヘモグロビン、ケラチンおよびＢＳＡを含むタンパク質における加水分解活性を示す。タンパク質分解活性を分析するための方法は、文献においてよく知られており、例えば、Gupta et al. (2002)において言及されている。

プロテアーゼは、特定の阻害剤のグループを使用して分類することができる。種々の「セリンプロテアーゼ阻害剤」のグループは、合成化学阻害剤および天然タンパク質阻害剤を含む。１つのグループの天然阻害剤は、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤から省略された）、例えば、アンチトロンビンおよびアルファ１−アンチトリプシンである。人工合成阻害剤は、３，４−ジクロロイソクマリン（３，４−ＤＣＩ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）およびトシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）を含む。いくつかのセリンプロテアーゼは、活性部位付近のシステイン残基の存在によって、チオール試薬、例えば、ｐ−クロロ水銀安息香酸（ＰＣＭＢ）により阻害される。したがって、セリンプロテアーゼ活性は、適当な条件下でセリンプロテアーゼの特定の阻害剤の存在または非存在下で、特定の基質の開裂に基づくアッセイまたは基質を含む任意のタンパク質を使用するアッセイにおいて測定することができる。

セリンプロテアーゼは、一般的に中性またはアルカリ性ｐＨで、ｐＨ７から１１の最適条件で活性であり、広範な基質特異性を有する。「アルカリ性セリンプロテアーゼ」は、ｐＨ９からｐＨ１１またはさらにｐＨ１０から１２．５で活性および安定であり（Shimogaki et al., 1991）、約ｐＨ９で等電点を有する酵素を意味する。これらは、市販のセリンプロテアーゼの最も大きなサブグループを示す。アルカリ性セリンプロテアーゼの分子量は、１５から３５ｋＤａの範囲である。天然セリンプロテアーゼの温度最適条件は、約６０℃である（Rao et al., 1998）。

プロテアーゼ活性を生産することができる微生物株をスクリーニングすることができ、異なる基質における活性を決定することができる。選択された株は、適当な培地上で培養することができる。十分な量の興味あるセリンプロテアーゼが生産された後、該酵素を単離または精製し、その特性をさらに徹底的に特徴付けることができる。あるいは、種々の生物におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を本実施例において単離され特徴付けられたセリンプロテアーゼのアミノ酸配列と比較することができる。

生産されたプロテアーゼ酵素、特にセリンプロテアーゼは、酵素化学の慣用の方法、例えば、塩調製、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過および疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用することにより精製することができる。精製は、タンパク質定量、酵素活性アッセイおよびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりモニタリングすることができる。種々の温度およびｐＨ値での精製された酵素の酵素活性および安定性ならびに分子量および等電点を、決定することができる。

本発明の好ましいセリンプロテアーゼの精製は、実施例１ｂにおいて証明されている。濾過された培養上清をＱ セファロース ＦＦカラムに適用した。流入画分をフェニルセファロース ＨＰ カラムに適用し、タンパク質を線形減少塩勾配で溶離した。プロテアーゼ活性を示す画分を貯め、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムに適用した。精製は、実施例１ｂに記載されているレゾルフィン標識カゼインでの活性アッセイにしたがった。当然、本明細書に記載されている方法の代わりに、または、該方法に加えて他の既知の精製方法を使用することにより、本発明の酵素を分離することができる。組換えセリンプロテアーゼを実施例５において記載されているとおりに精製し、ｐＨおよび温度プロフィールの特徴付けのために使用した。

精製されたセリンプロテアーゼの分子量は、質量分析により、またはＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）にしたがってＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて決定することができる。分子量は、また、酵素のアミノ酸配列から予測することができる。成熟セリンプロテアーゼまたは成熟セリンプロテアーゼ酵素は、一般的に２０から３５ｋＤａ、一般的に約２５から３０ｋＤａの分子量を有する（Rao et al., 1998）。

該セリンプロテアーゼは、プレプロ酵素の形態における不活性な「酵素前駆体」または「酵素前駆体」として合成され、これはシグナル配列（分泌シグナルペプチドまたはプレペプチド）およびプロ配列（プロペプチド）の除去により活性化され、該酵素の活性な成熟形態を生じる（Chen and Inouye, 2008）。この活性化プロセスはプロテアーゼの作用と関連し、セリンプロテアーゼの限定された自己消化または自己触媒プロセスをもたらし得る。プロ配列は、例えば、生産の翻訳後段階中または消費された培養培地中または培養培地もしくは酵素調製物の保存中に開裂され得る。プロ酵素の活性化は、また、不活性なプロ酵素を活性な成熟酵素に変換することができるタンパク質分解酵素を宿主生物を培養する培養培地に加えることにより、または培養プロセス後に該タンパク質分解酵素を培養上清に加えることにより成し遂げられ得る。該酵素の短縮は、また、例えば、該ポリペプチドをコードする遺伝子で生産宿主を形質転換する前に切断することにより成し遂げることができる。

「成熟」なる用語は、シグナル配列およびプロペプチドの除去後に、酵素または触媒活性のために重要なアミノ酸を含む酵素の形態を意味する。糸状菌において、それは、培養培地に分泌される天然形態である。

セリンプロテアーゼの温度最適条件は、実施例１ｃ、５または１４に記載されている基質としてカゼインを使用することにより、または文献（例えば、Gupta et al., 2002）に記載されている他の基質およびバッファー系を使用することにより、異なる温度で適当なバッファー中で決定することができる。最適ｐＨの決定は、タンパク質基質の活性にしたがって、異なるｐＨ値で適当なバッファーで実施することができる。

プロテアーゼ活性は、一般的に可溶性基質の分解に基づく。界面活性剤適用において、プロテアーゼは、少なくとも部分的に不溶性である物質に影響を与えるべきである。したがって、界面活性剤プロテアーゼのための重要なパラメーターは、これらの不溶性フラグメントを吸収および加水分解する能力である。

界面活性剤プロテアーゼの選択のための別の重要なパラメーターは、その等電点またはｐＩ値である。界面活性剤プロテアーゼは、機能する界面活性剤溶液のｐＨ値が酵素に対するｐＩ値とほぼ同じであるとき、最もよい。ｐＩは、ポリアクリルアミド、デンプンまたはアガロースから成る固定化されたｐＨ勾配ゲルにおける等電点電気泳動、またはアミノ酸配列からｐＩを概算することにより、例えば、ＥｘＰＡＳｙサーバー（http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003）のｐＩ／ＭＷツールを使用することにより決定することができる。

精製されたプロテアーゼのＮ−末端ならびに内部ペプチドは、実施例２に記載されているエドマン分解化学（Edman and Begg, 1967）にしたがって、または文献に記載されている他の方法により配列決定することができる。

本発明のセリンプロテアーゼ酵素は、細菌、古細菌、真菌、酵母菌およびより高等な真核生物、例えば、植物を含むあらゆる生物由来であり得る。好ましくは、該酵素は、糸状菌および酵母菌を含む真菌、例えば、フザリウムを含む群から選択される属から生じる。真菌アルカリプロテアーゼは、微生物非含有酵素または酵素組成物を生産するための下流処理の容易さのため細菌プロテアーゼに有利である。菌糸体は、酵素の精製の前に濾過技術を介して容易に除去することができる。

本発明は、広範、すなわち低い温度から中程度の温度範囲、例えば、１０℃から６０℃で非常に様々な特性を有する界面活性剤の存在下で良い能力を有する真菌セリンプロテアーゼに関する。

本発明において、界面活性剤の存在下で良い能力は、本発明の真菌セリンプロテアーゼの場合において、酵素が現在販売されている多数の市販のサブチリシンよりも低い温度で機能することを意味する。言い換えれば、良い能力は、酵素が低い温度から中程度の温度範囲、とりわけ現在市販の製品、例えば、市販の酵素生成物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ （Genencor Inc., USA）よりも低い温度範囲でタンパク質汚点または物質を分解または除去することができることを意味する。

本発明の真菌セリンプロテアーゼは、低い温度範囲で機能する。例えば、ｐＨを修飾すること、適当な特性を有する界面活性剤を選択すること、酵素保護剤を含むこと、および洗浄条件をコントロールすることにより、本発明のセリンプロテアーゼの活性は１０℃と低い温度で維持され得る。したがって、本発明のセリンプロテアーゼは、洗浄条件ならびに界面活性剤中の補助成分および添加物に依存して、特に５０℃以下の温度で有用である。該酵素は、また、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下または３０℃以下の温度でも機能する。

界面活性剤の存在下、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、上記定義されているとおり１０℃から６０℃で機能する。実施例６から１３において比較実験を記載しており、図７から１７から、デルタＬ＊またはデルタ％ＳＲとして測定される、異なる織物材料における異なる汚点の強度に対して様々な処理に暴露された、様々な条件下での真菌セリンプロテアーゼＦｅ＿ＲＦ６３１８の能力は、市販の製品、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌ（Novozymes A/S, DK）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ（Genencor Inc, USA）およびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００Ｅ（Genencor Inc., USA）の能力よりもはるかに良いことが明らかである。特に、低い温度から中程度の温度範囲、例えば、１０℃から６０℃における該真菌セリンプロテアーゼＦｅ＿ＲＦ６３１８の汚点除去効果は、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌよりも顕著に高い。それは、また、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００Ｅと比較したとき、３０℃から６０℃の範囲で高い汚点除去能力を有する。

該実験結果から、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、界面活性剤の顧客および界面活性剤産業および洗浄機を提供する産業の非常に様々な要求を満足させることができ、将来の規制および顧客の習慣の要求に非常に適合していると結論づけることができる。

本発明の好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５のアミノ酸配列または配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列または配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＦｅ＿ＲＦ６３１８の成熟酵素を含むポリペプチドである。好ましい酵素は、少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の同一性を示す。さらにより好ましくは、該アミノ酸配列は、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも９２％または少なくとも９４％または９６％、より好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは９９％の同一性を示す。２つの酵素の同一性は、対応する配列領域内、例えば、該セリンプロテアーゼの成熟または全長領域内を比較する。

本発明のセリンプロテアーゼは、特にフザリウム・エクイセチ起源である単離されたセリンプロテアーゼであるＦｅ＿ＲＦ６３１８であり、セリンエンドプロテイナーゼのファミリー８であるクランＳＢのメンバーである。

「同一性」なる用語は、本明細書において、ほぼ同じ量のアミノ酸を有する対応する配列領域内で互いに比較される２つのアミノ酸配列間の同一性を意味する。例えば、２つのアミノ酸配列の全長または成熟配列の同一性が比較され得る。比較されるべき２つの分子のアミノ酸配列は、１つ以上の位置で異なっていてもよいが、しかしながら、分子の生物学的機能または構造は変化していない。このような変化は、アミノ酸配列における異なる宿主生物または変異のために自然に起こり得るか、特異的変異誘発により達成され得る。本発明は、アミノ酸配列における１つ以上の位置の欠失、置換、挿入、付加または組合せから生じ得る。配列の同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷ アラインメント（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw）を使用することにより測定される。使用されるマトリックスは、以下のとおりである：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５。

好ましくは、真菌セリンプロテアーゼは、フザリウム、より好ましくはフザリウム・エクイセチから得ることができる。最も好ましい態様において、本発明のセリンプロテアーゼは、受入番号ＣＢＳ１１９５６８の下にCentraalbureau voor Schimmelculturesで寄託されている株から得ることができる。

本発明の１つの好ましい態様は、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列を含む真菌セリンプロテアーゼ酵素である。成熟酵素は、シグナル配列またはプレペプチドおよびプロ配列またはプロペプチドを欠く。本発明の成熟セリンプロテアーゼは、配列番号：１１に特徴付けられる全長プロテアーゼのアミノ酸Ａｌａ１２４からＡｌａ４１２を含む。したがって、また、シグナル配列（プレペプチド）およびプロペプチドおよび成熟酵素を含む配列番号：１１を有する全長Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素ならびにシグナル配列（プレペプチド）を欠いており、したがって配列番号：１３を有するプロ酵素も本発明の範囲内である。

本発明は、成熟形態が２０から３５ｋＤａ、好ましくは２５から３３ｋＤａ、より好ましくは２８から３０ｋＤａの分子量または分子重量を有する真菌セリンプロテアーゼ酵素に関する。最も好ましいＭＷは、ＥｘＰＡＳｙ ｓｅｒｖｅｒでのＣｏｍｐｕｔｅ ｐＩ／ＭＷツールを使用することにより得られる成熟ポリペプチドに対して２９ｋＤａであるＦｅ＿ＲＦ６３１８の予測される分子量である（Gasteiger et al., 2003）。

本発明の酵素は、広範な温度範囲でタンパク質物質の分解において有効である。該酵素の最適温度は、実施例５において記載されている１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用するｐＨ９で測定されるとき、３０℃から７０℃（最大活性の約２０％）、好ましくは４０℃から６０℃（最大活性の少なくとも約４０％）、より好ましくは５０℃から６０℃（最大活性の少なくとも７０％）、さらに好ましくは６０℃（Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の最大活性）である。

本発明の１つの好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、実施例５において記載されている１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用する５０℃でｐＨ１０で最大活性の４０％を越えるものを示す少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で最適ｐＨを有する。特に、最適ｐＨは、５０℃で、ｐＨ６からｐＨ１０（最大活性の約６０％）、より好ましくはｐＨ９からｐＨ１０（最大活性の約８０％）、さらに好ましくはｐＨ１０である。

本発明の真菌セリンプロテアーゼは「界面活性剤の存在下で良い能力」を有する、すなわち低い温度範囲、具体的には、現在市販の製品、例えば、市販の酵素生成物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ（Genencor Inc., USA）よりも低い温度範囲で、界面活性剤の存在下でタンパク質汚点または物質を分解または除去することができる。界面活性剤の存在下で、本発明の酵素は、１０℃から６０℃、好ましくは５０℃以下で機能する。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素は、また、４５℃以下、４０℃以下、および３５℃以下、または３０℃以下の温度において機能する。

本発明のセリンプロテアーゼ酵素は、推定アミノ酸配列から推定されるとおり、ｐＩ９からｐＩ９．５、好ましくはｐＩ９．１からｐＩ９．４であるｐＩを有する。本発明のＦｅ＿ＲＦ６３１８酵素の推定ｐＩはｐＩ９．３である。

精製された酵素のＮ−末端またはトリプシンペプチドのアミノ酸配列で合成されたオリゴヌクレオチドまたは上記オリゴヌクレオチドを使用することにより得られるＰＣＲ産物は、本発明のセリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子の単離においてプローブとして使用することができる。プローブは、また、同種セリンプロテアーゼの既知のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に基づいて設計され得る。セリンプロテアーゼクローンは、また、酵素に対して特異的な基質を含むプレートにおける活性に基づいて、またはセリンプロテアーゼに特異的な抗体を使用することによりスクリーニングされ得る。

本発明の好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、受入番号ＤＳＭ２２１７１の下にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）で寄託されている大腸菌ＲＦ７６６４における配列番号：９のヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＡＬＫ２５２１に含まれるポリヌクレオチドまたはプローブ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。

本発明において、Ｆｅ ｐｒｔ８Ａ遺伝子は、実施例３ｄにおいて記載されているストリンジェントハイブリダイゼーションを使用するＰＣＲにより調製されるプローブで単離される。標準分子生物学方法、例えば、分子生物学ハンドブック、例えば、Sambrook and Russell, 2001において記載されている方法を、宿主生物のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの単離において使用することができる。

１００−２００以上のヌクレオチドからなるＤＮＡプローブ、例えば、配列番号：９とのハイブリダイゼーションは、通常、「高ストリンジェンシー」条件で、すなわち完全ハイブリッドの計算される融解温度（Ｔｍ）未満の２０−２５℃である温度でのハイブリダイゼーションを行う（Ｔｍは、Bolton and McCarthy (1962)にしたがって計算される）。通常、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、少なくとも６５℃で６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性された、断片化されたサケ精子ＤＮＡ中で行われる。５０％のホルムアミドの添加は、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション温度を４２℃まで下げる。洗浄は、低い塩濃度、例えば、２×ＳＳＣ−０．５％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）で１５分間、室温（ＲＴ）で、次に２×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）でＲＴで、最後に０．１×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）で少なくとも６５℃で行われる。

１つの好ましい態様において、本発明の真菌セリンプロテアーゼ酵素は、配列番号：１５に特徴付けられるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも８６％または配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８６％を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子によってコードされる。好ましい酵素は、少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を示す。より好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも９２％または少なくとも９４％または９６％、より好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは９９％の同一性を示す。２つの酵素の同一性は、対応する配列領域内、例えば、セリンプロテアーゼの成熟または全長領域内で比較される。

したがって、酵素の成熟形態に加えてプレペプチド（シグナル配列）およびプロペプチドを含む本発明の全長セリンプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする核酸分子によってコードされ、配列番号：１１に特徴付けられるポリペプチド配列は、本発明の範囲内である。

また、酵素の成熟形態に加えてプロペプチドを含む本発明のセリンプロテアーゼ酵素のプロペプチドをコードする核酸分子によってコードされ、配列番号：１３に特徴付けられるポリペプチド配列も、本発明の範囲内である。

本発明の１つの好ましい態様は、配列番号：１５を有するＦｅ＿ＲＦ６３１８セリンプロテアーゼの成熟形態をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる真菌セリンプロテアーゼ酵素である。

１つの好ましい態様において、本発明の真菌セリンプロテアーゼ酵素は、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素の成熟形態（配列番号：１５）をコードする配列番号：１４のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる。

したがって、酵素に対する「コード配列」を含む配列番号：１０のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるポリペプチドは、本発明の範囲内である。「コード配列」なる表現は、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から始まり、翻訳終始コドン（ＴＡＡ、タグまたはＴＧＡ）で停止するヌクレオチド配列を意味する。翻訳された全長ポリペプチドは通常メチオニンで開始し、イントロン領域を含む。

また、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロ酵素形態をコードする配列番号：１２のヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる真菌セリンプロテアーゼ酵素は、本発明の範囲内である。

本発明の別の好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼは、受入番号ＤＳＭ２２１７２の下に大腸菌ＲＦ７８００において寄託されているｐＡＬＫ２５２９に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

本発明の１つの態様は、適当な宿主における該セリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を駆動することができる調節配列に作動可能に連結した上記特徴付けられた真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする、核酸分子を含む組換え発現ベクターから生産されるセリンプロテアーゼ酵素である。該組換え発現ベクターの構築および該ベクターの使用は、実施例４に詳細に記載されている。

真菌セリンプロテアーゼ酵素の生産のために適当な宿主は、同種または異種宿主、例えば、細菌、酵母菌および真菌を含む微生物宿主である。糸状菌、例えば、トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムおよびモルティエラは、酵素生成物の下流処理および回収の容易さにより好ましい生産宿主である。適当な宿主は、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ソーエ、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギルス・ジャポニクス、フザリウム・ベネナツムまたはフザリウム・オキシスポルム、フミコーラ・インソレンスまたはフミコーラ・ラヌギノサ、ニューロスポラ・クラッサおよびクリソスポリウム・ルクノウェンセのような種を含み、これらのいくつかは例えば、市販の酵素のＡＭＦＥＰ ２００７リスト（http://www.amfep.org/list.html）において酵素生産宿主生物として挙げられている。より好ましくは、該酵素は、属トリコデルマまたはアスペルギルス、例えば、トリコデルマ・リーゼイまたはアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエまたはアスペルギルス・アワモリの糸状菌宿主において生産される。本発明の最も好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、トリコデルマ・リーゼイにおいて生産される。

本発明は、また：
（ａ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５において記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
（ｃ）配列番号：１０において記載されているヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
（ｄ）ＤＳＭ２２１７１またはＤＳＭ２２１７２に含まれるポリヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
（ｅ）遺伝子コードの縮重によって、（ｃ）から（ｄ）のいずれか１つの核酸分子のコード配列と異なるコード配列を含む核酸分子；および
（ｆ）ＤＳＭ２２１７１に含まれる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５において記載されているアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群から選択される真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子に関する。

本発明の核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、ＤＮＡはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを構成し得る。

標準分子生物学方法は、本発明の真菌セリンプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列の単離および酵素処理、例えば、ゲノムおよびプラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡフラグメントを生産するためのＤＮＡの消化、配列決定、大腸菌形質転換などにおいて使用することができる。基本的な方法は、標準分子生物学ハンドブック、例えば、Sambrook and Russell, 2001に記載されている。

Ｆｅ＿ＲＦ６３１８ポリペプチドをコードするＦｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子の単離は、実施例３に記載されている。簡潔には、縮重オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：６および配列番号：７）の配列を使用することにより得られる８６６ｂｐのＰＣＲフラグメントを使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターにおけるフザリウム・エクイセチＲＦ６３１８からＦｅ ｐｒｔ８Ａを単離した。全長フザリウム・エクイセチ Ｆｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子は、受入番号ＤＳＭ２２１７２の下にＤＳＭＺカルチャー・コレクションに大腸菌において寄託されているプラスミドｐＡＬＫ２５２９に含まれていた。セリンプロテアーゼの推定アミノ酸配列をＤＮＡ配列から分析した。

フザリウム・エクイセチ セリンプロテアーゼＦｅ ｐｒｔＳ８Ａのヌクレオチド配列（配列番号：１０）および推定配列（配列番号：１１）を図１Ａ−Ｂに記載する。該遺伝子の長さは１３０３ｂｐ（終始コドンを含む）である。１つの推定イントロンは、６４ｂｐの長さを有することを見出した。推定タンパク質配列は、２０個のアミノ酸の予測されるシグナル配列（シグナルＰ Ｖ３．０；Nielsen et al., 1997およびNielsen and Krogh, 1998）およびＡｌａ２１からＡｒｇ１２３のプロペプチドを含む４１２個のアミノ酸からなる。野生型Ｆｅ＿ＲＦ６３１８から精製されたペプチドは、遺伝子が受入番号ＣＢＳ１１９５６８の下にＣＢＳカルチャー・コレクションに寄託されているフザリウム・エクイセチ宿主ＲＦ６３１８から精製されるプロテアーゼをコードすることを示す推定アミノ酸配列とマッチした。予測される分子量は成熟ポリペプチドに対して２９ｋＤａであり、予測されるｐＩは９．３０であった。これらの予測は、ＥｘＰＡＳｙサーバーでのＣｏｍｐｕｔｅ ｐＩ／ＭＷツール（Gasteiger et al., 2003）を使用して作成された。推定アミノ酸配列は、２つの起こりうるＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ７７およびＡｓｎ２５５）を含んだが、ＣＢＳ Ｓｅｒｖｅｒ ＮｅｔＮＧｌｙｃ Ｖ１．０によると、Ａｓｎ７７（プロ配列において）の１つの部位のみが有望である。公開されているプロテアーゼ配列に対する相同性を、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）でのＢＬＡＳＴ プログラム、バージョン２．２．９を使用して検索した（Altschul et al., 1990）。同種配列の対応する領域に対する成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８配列の同一性値を、ＣｌｕｓｔａｌＷ アラインメント（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw）を使用することにより得た（表３に示されている）。

本発明のセリンプロテアーゼＦｅ＿ＲＦ６３１８は、ジベレラ・ゼアエ 仮想的タンパク質ＰＨ−１、ローカスタグ(locus tag) ＦＧ０３３１５．１（ＥＭＢＬ受入番号 ＸＰ＿３８３４９１、未公開）、トリコデルマ・ハルジアナム ＣＥＣＴ ２４１３ セリンエンドペプチダーゼ（ＥＭＢＬ受入番号 ＣＡＬ２５５０８、Suarez et al., 2007）およびトリコデルマ・アトロビリデ アルカリ性プロテイナーゼ前駆体 Ｓ０８．０６６、ＡＬＰ（ＥＭＢＬ受入番号 Ｍ８７５１６、Geremia et al. 1993）と非常に高い相同性を示した（後者はＵＳ６０／８１８，９１０（Catalyst Bioscience Inc.）において配列番号：３１３のアミノ酸配列として記載されている）。ジベレラ・ゼアエ 仮想的タンパク質との同一性は、全長酵素内で８５％であった。シグナル配列およびプロペプチドを欠いている成熟ポリペプチドとアラインされたとき、同一性は８５％であった。トリコデルマ・ハルジアナム ＣＥＣＴ ２４１３ セリンエンドペプチダーゼとの同一性は、７０％（全長酵素）および７５％（成熟酵素）であった。トリコデルマ・アトロビリデ ＡＬＰとの同一性は、６９％（全長酵素）および７４％（成熟酵素）であった。

したがって、配列番号：１５に特徴付けられるＦｅ＿ＲＦ６３１８酵素の成熟形態のアミノ酸配列、すなわち配列番号：１１の全長セリンプロテアーゼのＡｌａ１２４からＡｌａ４１２のアミノ酸を含む真菌セリンプロテアーゼ酵素またはポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列または単離された核酸分子は、本発明の範囲内である。

さらに、セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性または配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有する真菌セリンプロテアーゼポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子は、本発明の範囲内である。好ましい酵素は、少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の同一性を示す。さらにより好ましくは、該アミノ酸配列は、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも９２％または少なくとも９４％または９６％、より好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは９９％の同一性を示す。２つの酵素の同一性は、対応する配列領域内で、例えば、セリンプロテアーゼの全長または成熟領域内で比較される。

核酸分子は、好ましくは、本発明の真菌セリンプロテアーゼ酵素の全長形態をコードする、配列番号：１０において記載されているコード配列を含む分子である。

本発明の単離された核酸分子は、ＤＳＭ２２１７１またはＤＳＭ２２１７２に含まれるポリヌクレオチド配列のコード配列を含む分子であり得る。ＤＳＭ２２１７１は、全長Ｆｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子のクローニングにおいて使用されるＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号：９）を有する。ＤＳＭ２２１７２は、全長Ｆｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１０）を有する。

本発明の核酸分子は、また、上記に特徴付けられるヌクレオチド配列の類似体であり得る。「縮重」は、１つ以上のヌクレオチドまたはコドンが異なっているが、本発明の組換えプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の類似体を意味する。

核酸分子は、また、受入番号ＤＳＭ２２１７１の下に大腸菌において寄託されているプラスミドｐＡＬＫ２５２１に含まれているＰＣＲプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよび対応する配列領域内で配列番号：１５において記載されているアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸分子であり得る。ハイブリダイズするＤＮＡは、種フザリウムに属する真菌に由来し得るか、または、それは、他の真菌種に由来し得る。

したがって、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４において記載されているヌクレオチド配列およびそれらの類似体を含む単離された核酸分子は、本発明の範囲内である。

本発明は、また、適当な原核生物または真核生物宿主において選択されたセリンプロテアーゼをコードする核酸配列または遺伝子を増殖または発現させるために使用することができる組換え発現ベクターまたは組換え発現構築物に関する。組換え発現ベクターは、適当な宿主においてセリンプロテアーゼのコード配列の発現および分泌を促進または駆動するＤＮＡまたは核酸配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター（転写および翻訳終結シグナルを含む）、および該セリンプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したシグナル配列を含む。発現ベクターは、形質転換体株の選択のためのマーカー遺伝子をさらに含み得るか、または選択マーカーは、共形質転換により別のベクター構築物において宿主に導入され得る。該調節配列は生産生物と同種または異種であってよく、または、それらはセリンプロテアーゼをコードする遺伝子が単離される生物由来であり得る。

糸状菌宿主において本発明のセリンプロテアーゼを発現するためのプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ ＴＡＫＡアミラーゼ、アルカリプロテアーゼ ＡＬＰおよびトリオースリン酸イソメラーゼ、リゾプス・ミエハイ リパーゼ、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・アワモリ グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、フザリウム・オキシスポルム トリプシン様プロテアーゼ、クリソスポリウム・ルクノウェンセ セロビオヒドロラーゼ１プロモーター、トリコデルマ・リーゼイ セロビオヒドロラーゼＩ（Ｃｅｌ７Ａ）などのプロモーターである。

酵母菌において、例えば、サッカロミセス・セレビシエ エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）および３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーターを、発現を提供するために使用することができる。

細菌宿主において本発明のセリンプロテアーゼの転写を駆動するためのプロモーター配列の例は、大腸菌のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・セリカラー アガラーゼｄａｇＡのプロモーター、バチルス・リケニフォルミス アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・サブティリス ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどである。

適当なターミネーターは、上記遺伝子のもの、または他の特徴付けられたあらゆるターミネーター配列を含む。

適当な形質転換または選択マーカーは、宿主の欠損を補うもの、例えば、バチルス・サブティリスまたはバチルス・リケニフォルミス由来のｄａｌ遺伝子またはアスペルギルス ａｍｄＳおよびｎｉａＤを含む。選択は、また、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、フレオマイシンまたはハイグロマイシン耐性を与えるマーカーに基づき得る。

本発明のセリンプロテアーゼの細胞外分泌が好ましい。したがって、組換えベクターは、選択された宿主において分泌を促進する配列を含む。本発明のセリンプロテアーゼのシグナル配列またはプレ配列またはプレペプチドは、組換え発現ベクターに含まれていてもよく、または、天然シグナル配列は、選択された宿主において分泌を促進することができる別のシグナル配列で置換され得る。したがって、選択されたシグナル配列は、発現宿主に対して同種または異種であり得る。

適当なシグナル配列の例は、真菌または酵母菌生物のもの、例えば、よく発現される遺伝子由来のシグナル配列である。このようなシグナル配列は、文献からよく知られている。

組換えベクターは、安定な発現をもたらすために宿主染色体ＤＮＡへのベクターの統合を促進する配列をさらに含み得る。

本発明のＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼは、実施例４に記載されているトリコデルマ・リーゼイ ｃｂｈ１（ｃｅｌ７Ａ）プロモーター由来の自らのシグナル配列で発現した。トリコデルマ・リーゼイ宿主を形質転換するために使用された発現構築物は、また、形質転換されていない細胞から形質転換体を選択するためにｃｂｈ１ターミネーターおよびａｍｄＳマーカーを含んだ。

本発明は、また、上記組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。真菌セリンプロテアーゼ酵素の生産のための適当な宿主は、同種または異種宿主、例えば、細菌、酵母菌および真菌を含む微生物宿主である。植物または哺乳動物細胞における生産系も可能である。

糸状菌、例えば、トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムおよびモルティエラは、酵素生成物の下流処理および回収の容易さによって好ましい生産宿主である。適当な発現および生産宿主系は、例えば、糸状菌宿主トリコデルマ・リーゼイ（ＥＰ２４４２３４）、またはアスペルギルス生産系、例えば、アスペルギルス・オリザエまたはアスペルギルス・ニガー（ＷＯ９７０８３２５、ＵＳ５，８４３，７４５、ＵＳ５，７７０，４１８）、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ソーエおよびアスペルギルス・ジャポニクス型株のために開発された生産系、またはフザリウム、例えば、フザリウム・オキシスポルム（Malardier et al., 1989）またはフザリウム・ベネナツム、およびアカパンカビ、リゾプス・ミエハイ、モルティエラ・アルピナ、フミコーラ・ラヌギノサまたはフミコーラ・インソレンスまたはクリソスポリウム・ルクノウェンセ（ＵＳ６，５７３，０８６）のために開発された生産系である。酵母菌のために開発された適当な生産系は、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはメタノール資化酵母のために開発された系である。細菌のために開発された適当な生産系は、バチルス、例えば、バチルス・サブティリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリクエファシエンス、大腸菌、または放線菌のストレプトマイのために開発された生産系である。好ましくは、本発明のセリンプロテアーゼは、属トリコデルマまたはアスペルギルス、例えば、トリコデルマ・リーゼイ、またはアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ソーエ、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギルス・ジャポニクス型株の糸状菌宿主において生産される。本発明の最も好ましい態様において、真菌セリンプロテアーゼ酵素は、トリコデルマ・リーゼイにおいて生産される。

生産宿主細胞は、本発明のセリンプロテアーゼと同種または異種であってよい。宿主は、１つ以上の宿主プロテアーゼの不活性化または除去のいずれかによる、例えば、このような同質または同種プロテアーゼをコードする遺伝子の欠失によるプロテアーゼの除去により同質プロテアーゼを含まなくてもよい。

本発明は、また、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを生産するための方法であって、適当な条件下で本発明のセリンプロテアーゼに対する組換え発現ベクターを有する天然または組換え宿主細胞を培養する工程、所望により該酵素を単離する工程を含む方法に関する。生産培地は、宿主生物を増殖するために適当であり、効率的な発現のための誘導物質を含む培地であり得る。適当な培地は、文献からよく知られている。

本発明は、本発明の核酸分子によってコードされ、上記方法により得ることができるセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。好ましくは、該ポリペプチドは、本発明のセリンプロテアーゼに対する組換え発現ベクターを有する宿主細胞を培養することにより得られる組換えプロテアーゼ酵素である。

本発明は、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素調製物を得るための方法であって、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを該細胞から回収するか、または該培養培地から該細胞を分離してセリンプロテアーゼ活性を有する上清を得るのいずれかの工程を含む方法にさらに関する。

本発明は、また、上記特徴付けられたセリンプロテアーゼ酵素を含む酵素調製物に関する。該酵素調製物または組成物は、セリンプロテアーゼ活性を有し、本発明の方法により得ることができる。

本発明の真菌セリンプロテアーゼ、好ましくは本発明の組換え発現ベクターを有する宿主細胞を培養することにより得られる組換えセリンプロテアーゼを含む酵素調製物は、本発明の範囲内である。

該酵素調製物は、本発明のセリンプロテアーゼに加えて、異なる型の酵素、例えば、別のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼおよび／またはオキシダーゼ、例えば、ラッカーゼまたはペルオキシダーゼをメディエーターと共にまたはメディエーターなしでさらに含み得る。これらの酵素は、処理されるべき材料に存在する炭水化物および油または脂肪を除去することにより、本発明のセリンプロテアーゼの能力を増強することが予期される。該酵素は、宿主株により生産される天然または組換え酵素であり得、または生産プロセス後に培養上清に加えられ得る。

該酵素調製物は、界面活性剤または表面活性剤、バッファー、防食剤、安定剤、漂白剤、メディエーター、増進剤、腐食剤、研磨剤および防腐剤、光学的光沢剤、再付着防止剤、色素、顔料などの群から選択される適当な添加物をさらに含み得る。

界面活性剤は、油脂を乳状化すること、および表面を湿らせることにおいて有用である。界面活性剤は、非イオン、例えば、半極性および／または陰イオンおよび／または陽イオンおよび／または双性イオンであり得る。

バッファーは、ｐＨを調節するか、または他の成分の能力または安定性に影響するように酵素調製物に加えられ得る。

適当な安定剤は、ポリオール、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体、ペプチドなどを含む。

漂白剤は、有機化合物を酸化および分解するために使用される。適当な化学漂白系の例は、過酸発生漂白剤アクチベーター、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン、またはあるいはペルオキシ酸塩、例えば、アミド、イミドまたはスルホン型と共に、またはこれらなしで、Ｈ_２Ｏ_２供給源、例えば、過ホウ酸塩または過炭酸塩である。化学酸化剤は、酸化酵素、例えば、ラッカーゼまたはペルオキシダーゼを使用することにより部分的または完全に置き換えられ得る。多数のラッカーゼは、メディエーターの非存在下で有効に機能しない。

増進剤または錯化剤は、物質、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などを含む。酵素調製物は、１つ以上のポリマー、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）などをさらに含み得る。また、軟化剤、腐食剤、他の成分の損傷を防止するための防腐剤、研磨剤および起泡性および粘性を修飾する物質を加えることができる。

本発明の１つの好ましい態様において、該酵素調製物は、液体、粉末または粒状の形態である。

本発明の真菌セリンプロテアーゼは、界面活性剤、タンパク質、醸造、食肉、写真、革、乳業および医薬産業において使用される他のプロテアーゼ、特にアルカリプロテアーゼに好まれ得る（Kalisz, 1988; Rao et al., 1998）。例えば、それは、繊維性タンパク質廃棄物（例えば、角、羽、爪および髪）を有用なバイオマス、タンパク質濃縮物またはアミノ酸に変換する化学物質の代替物として使用され得る（Anwar and Saleemuddin, 1998）。本発明の真菌セリンプロテアーゼの使用は、革の質および還元環境汚染を改善すること、ならびにエネルギーを節約することにおける成功が証明されている他の酵素に好まれ得、それは、ペプチドの合成およびＤ，Ｌ−アミノ酸の混合物の分離において有用であるアルカリプロテアーゼに好まれ得る。火傷および創傷の処置における広範な薬効範囲の抗生物質と組み合わせられたサブチリシンは、医薬産業におけるセリンプロテアーゼの使用の一例であり、したがって、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、また、このような使用を見出し得、また、外科的器具の血液の除去およびコンタクトレンズまたは義歯の清浄において適用できるアルカリプロテアーゼに好まれ得る。コニディオボルス・コロナトゥス由来のアルカリプロテアーゼのように、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、動物細胞培養においてトリプシンの代わりに使用され得る。本発明のプロテアーゼは、また、膜の清浄および生物膜の破壊において使用することができる。ベーキングにおいて、該プロテアーゼは、例えば、グルテンネットワークの破壊および食物タンパク質、例えば、ミルク中のタンパク質の加水分解における他の食物適用において使用することができる。それらは、また、例えば、酵母菌を処理すること、溶かすこと（動物の骨からさらなるタンパク質を抽出すること）、新規風味を創造すること、苦味を減少させること、乳化性を変化させること、生物活性ペプチドを産生すること、およびタンパク質のアレルギー誘発性を減少させるにおいて使用することができる。基質は、動物、植物および微生物タンパク質を含む。

界面活性剤産業、特に洗濯洗剤産業は、高いｐＨ範囲で活性なプロテアーゼの１つの重要な消費者として現れている（Anwar and Saleemuddin, 1998）。理想的な界面活性剤プロテアーゼは、食物、草、血液および他の体の分泌物による多種多様の汚点の除去を容易にするように広範な基質特異性を有するべきである。それは、界面活性剤溶液のｐＨおよびイオン強度、洗浄温度およびｐＨにおいて活性であり、機械処理ならびに界面活性剤に加えられたキレート化剤および酸化剤に耐えるべきである。プロテアーゼのｐＩは、界面活性剤溶液のｐＨ付近であるべきである。現在のエネルギー危機および省エネルギーの意識によって、現在、より低い温度でプロテアーゼを使用するのが望ましい。

本発明は、また、界面活性剤のための、織物繊維を処理するための、羊毛を処理するための、髪を処理するための、革を処理するための、飼料または食物を処理するための、または、タンパク質物質の修飾、分解または除去にかかわるあらゆる適用のための、セリンプロテアーゼ酵素または酵素調製物の使用に関する。

したがって、本発明の１つの好ましい態様は、洗濯洗剤および自動食器洗浄組成物を含む食器洗浄組成物のために有用な界面活性剤添加物として上記特徴付けられたセリンプロテアーゼ酵素の使用である。

「界面活性剤」なる表現は、清浄を助けるか、または清浄特性を有することが意図される物質または材料を意味するために使用される。「洗浄力」なる用語は、清浄特性の存在または程度を示す。清浄特性の程度は、異なるタンパク質物質もしくはタンパク質を含む基質物質または固体、不水溶性担体、例えば、織物繊維またはガラスに結合した汚点もしくは汚点混合物において試験することができる。典型的なタンパク質物質は、血液、ミルク、インク、卵、草およびソースを含む。試験目的のためのタンパク質汚点の混合物は、市販されている。界面活性剤酵素の機能は、タンパク質含有汚点を分化および除去することである。試験結果は、洗浄試験において使用される汚点の型、界面活性剤の組成物ならびに織物の性質および状態に依存する（Maurer, 2004）。

一般的に、プロテアーゼまたは洗浄能力は、汚点物質、例えば、人工的な汚れの見本または試験布における明るさの可視および測定可能な増加または色の変化を意味する「汚点除去効率」または「汚点除去効果」または「清浄特性の程度」として測定される。明るさおよび明度の変化は、例えば、実施例６から１０に記載されているＬ＊ａ＊ｂ＊色空間座標を使用して分光光度計で反射率として色を測定することにより測定することができる。プロテアーゼ能力を示すタンパク質汚点の退色または除去（汚点除去効率）は、例えば、酵素処理された織物の明度Ｌ＊ マイナス 酵素を含まないバッファーまたは洗浄溶液（酵素ブランクまたはコントロール）で処理された織物の明度Ｌ＊を意味するΔＬ＊として計算される。界面活性剤の存在は、汚点の除去における酵素の能力を改善し得る。

本発明のセリンプロテアーゼは、中性およびアルカリ性ｐＨの条件下で、さらに異なる組成物を有する界面活性剤の存在下で、種々の種類のタンパク質汚点を分解する（実施例６から１３に示されているとおり）。

実施例６に示されるとおり、本発明のセリンプロテアーゼは、５０℃、とりわけ３０℃でｐＨ９のバッファー中で、市販のプロテアーゼ調製物 Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌよりも良く、血液／ミルク／インク汚点を除去した（図５および６）。酵素調製物は、活性単位として投与した。血液／ミルク／インク汚点に対する汚点除去効果を、また、実施例１２に記載されているとおり１０℃から６０℃の全温度範囲で試験した。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼ調製物は、市販のプロテアーゼ調製物 Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌと比較して高い汚点除去能力を示した。それは、また、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００Ｅと比較して、３０℃から６０℃の範囲で高い汚点除去能力を示した（図１６）。

Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼの能力を、また、実施例７に記載されているとおり、４０℃／５０℃でｐＨ１０で界面活性剤粉末において試験した。ポリエステル−綿材料における血液／ミルク／インク汚点の除去における酵素の能力をアッセイした。それぞれの酵素調製物を活性単位（μｍｏｌチロシン／分）として投与した。図７および８に示されているとおり、本発明のプロテアーゼは、また、非常にアルカリ性の条件で粉末界面活性剤に対して適当であり、漂白剤に対する耐性は、市販のプロテアーゼＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌよりもわずかに高かった。

Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼは、また、液体ベースの界面活性剤および液体ベースの界面活性剤の存在下でＡｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（Procter & Gamble, UK）中で３０℃で血液／ミルク／インク標準汚点を除去した（実施例９）。血液／ミルク／インク汚点に対する効率は、市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １４ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌよりもかなり高かった（図１０および１１）。酵素調製物は、活性単位として投与した。投与量が加えられたタンパク質の量として計算されるとき、同じ効果が、また、観察された（図１０Ｂおよび１１Ｂ）。再び、１０℃および２０℃で３．３ｇ／ｌの液体の界面活性剤濃度で実施された洗浄は、市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １４Ｌ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００Ｅを越える優れた能力を示した（実施例１３；図１７）。

血液／ミルク／インク汚点に加えて、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼは、３０℃で液体の界面活性剤において試験されたとき、汚点、例えば、草およびココアの除去において有効であった。処理は、ＡＴＬＡＳ ＬＰ−２ Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏｍｅｔｅｒにおいて実施した。結果（図１２および１３）は、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８が３０℃のような低い温度でいくつかの汚点に対して有効であることを示す。

トリコデルマ・リーゼイにおいて生産される組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８酵素調製物の能力を、３０℃で洗浄機でフルスケールにおける液体ベースの界面活性剤の存在下で試験した（実施例１１）。副作用を試験するための８つの異なるプロテアーゼ感受性トレーサーは、表５に記載されており、方法条件は、表６に記載されている。試験において使用された酵素用量を、酵素活性および酵素タンパク質の量の両方として計算した。図１４Ａ−Ｂに記載されている結果は、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８における異なる汚点で得られた結果の合計が、酵素が活性量またはタンパク質として投与されたとき、市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌよりも高いことを示す。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８は、血液／ミルク／インク、チョコレート／ミルク、落花生油／ミルクおよび卵黄汚点（図１５Ａ−Ｅ）に対して非常に効率的であった。

本発明の好ましい態様において、本発明の真菌セリンプロテアーゼは、実施例６から１３に示されている界面活性剤液体および界面活性剤粉末に有用である。本発明の酵素調製物の酵素は、手動または電動洗濯における使用のために製剤化され得るか、または家庭の硬表面清浄または好ましくは、手動または電動食器洗における使用のために製剤化され得る。

実施例１．フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８プロテアーゼの生産および精製
（ａ）フザリウム・エクイセチＲＦ６３１８の培養
真菌株ＲＦ６３１８を、セルラーゼを生産する糸状菌として以前に単離した。それをフザリウム・エクイセティとして同定した（Ｌｉｂｅｒｔ） Ｄｅｓｍａｚｉｅｒｅｓ（Arthur de Cock, Identification Services, Centralbureau Voor Schimmelcultures, P.O. Box 85167, 3508 AD Utrecht, The Nehterlandsによる）。フザリウム・エクイセティＲＦ６３１８は、基質としてヘモグロビンを含む寒天プレートアッセイにおいてプロテアーゼ活性を生産することを示した。プレート培養が約１０℃で行われたとき、この結果は、ＲＦ６３１８が低温で作用するプロテアーゼを生産することを示唆した。フザリウム・エクイセティＲＦ６３１８を、ポテトデキストロース（ＰＤ）寒天（Difco）上で＋４℃で、増殖させ、維持し、胞子形成させた。酵素生産のための、ＲＦ６３１８スラント由来の胞子を、３０ｇ／ｌのコーンミール（細挽き）、５ｇ／ｌのコーンスティープ粉末、４ｇ／ｌの大豆ミール（脱脂）、２ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ｌのＮａＣｌおよび１ｇ／ｌのパラフィン油を含む培養培地に植菌した。培地のｐＨを滅菌前にＮａＯＨで８．５に調節し、培地を３０分１２１℃でオートクレーブした。微生物を震盪器（２００ｒｐｍ）上で５０ｍｌ容量で２８℃で７日間培養した。活性測定を異なるｐＨ値（ｐＨ７−１０）で（実施例１ｃ、５または１４にしたがって）行ったとき、消費された培養上清は、アルカリプロテアーゼ活性を含むことが示された。このアルカリ活性のため、ＲＦ６３１８株を推定プロテアーゼ遺伝子ドナー株として選択した。

（ｂ）フザリウム・エクイセティＲＦ６３１８培養培地由来のプロテアーゼの精製
細胞および固体を、３０分、５００００ｇ、＋４℃で遠心分離（Sorvall RC6 plus）により消費された培養培地から除去した。５０ｍｌの上清をプロテアーゼの精製のために使用した。遠心分離後、上清のｐＨをＨＣｌの添加で８．０に調節した。次に、上清を０．４４μｍのフィルター（MILLEX HV Millipore）を介して濾過し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８で平衡にした５ｍＬのＱ セファロース ＦＦ カラム（GE Healthcare）に付した。流入画分を回収し、ｐＨを、ＨＣｌを加えることにより７．５に下げた。固体硫酸アンモニウムを流入画分に加え、１Ｍの最終塩濃度にした。次に、流入画分を０．４４μｍのフィルターを介して濾過し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍの硫酸アンモニウム ｐＨ７．５で平衡にしたフェニル セファロース ＨＰ（１ｍＬ）カラム（GE Healthcare）に付した。タンパク質を硫酸アンモニウムの線形減少勾配（１から０Ｍ）で溶離した。１ｍｌの画分を回収し、製造業者により指示されているとおり、ｐＨ８．０でレゾルフィン標識カゼイン（Boehringer Mannheim Biochemica）でプロテアーゼ活性ついて分析した。プロテアーゼ活性を有する画分を貯め、１０ｋ膜（Amicon）で限外ろ過した。濃縮した濾液を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ カラム（GE Healthcare）に付した。タンパク質を同じバッファーで溶離し、０．５ｍｌの画分を回収した。これらの画分由来のプロテアーゼ活性を分析した。プロテアーゼ活性を有する画分をドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。画分は、約２９ｋＤａの分子量を有する１つの主要なタンパク質バンドを含むことを示した。選択された画分を貯めた。貯められた画分をペプチドの調製のために使用した（実施例２）。活性アッセイ測定によると、精製されたタンパク質はｐＨ１０で最適ｐＨを有した。この精製されたフザリウム・エクイセティ ＲＦ６３１８プロテアーゼをＦｅ＿ＲＦ６３１８と命名する。

（ｃ）プロテアーゼ活性アッセイ
プロテアーゼ活性を、基質としてカゼインを使用するカゼイン Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ方法によりアッセイした。プロテアーゼによるカゼイン分解速度を、時間の関数として酸−可溶性フラグメントの放出の分光光度のモニタリングにより測定した。アッセイにおいて使用されるカゼイン基質は、以下のとおりに調製した：６ｇのＣａｓｅｉｎ Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ Ｇｒａｄｅ ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＬＬＣ（１０１２８９）を５００ｍｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ、２０μＭのＣａＣｌ_２、７μＭのＭｇＣｌ_２、２５μＭのＮａＨＣＯ_３に溶解した。基質溶液のｐＨをＨＣｌで９．０に調節した。酵素反応を、１０００ｍｌの蒸留水中に０．１１ＭのＴＣＡ、０．２２Ｍの酢酸ナトリウム、０．３３Ｍの酢酸、０．５ＭのＮａ_２ＣＯ_３を含むＴＣＡ溶液を使用して停止した。アッセイにおいて使用されるＦｏｌｉｎ試薬を、２５ｍｌの２ＮのＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕのフェノール試薬（ＳＩＧＭＡ、Ｆ ９２５２）を１００ｍｌに蒸留水により希釈することにより調製した。最初に所定の温度で５分間２．５ｍｌの基質溶液をインキュベートすることにより反応を開始し、その後、０．５ｍｌの酵素溶液を加え、反応を１５分または３０分間行った。１５分または３０分反応後に、２．５ｍｌの反応停止溶液を加え、内容物を混合し、３０分室温で放置した。チューブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心した（Hettich Rotanta 460）。１ｍｌの上清をピペットに取り、２．５ｍｌの０．５ＭのＮａ_２ＣＯ_３および０．５ｍｌの希釈されたＦｏｌｉｎ試薬と混合した。５分（色発生）待った後、混合物の吸光度（色）を酵素ブランクに対して６６０ｎｍで測定した。酵素ブランクを次のとおりに調製した：０．５ｍｌの酵素溶液を２．５ｍｌの停止溶液および２．５ｍｌの基質と混合し、混合物を所定の温度で１５分または３０分間インキュベートした。酵素活性の１単位を、１μｇチロシン／ｍｌ反応混合物／分に対応する酸可溶性タンパク質加水分解産物を遊離させる酵素量として定義した。

実施例２．精製されたフザリウム・エクイセティ プロテアーゼＦｅ＿ＲＦ６３１８のＮ−末端および内部アミノ酸配列決定
内部配列の決定のために、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色バンドをポリアクリルアミドゲルから切り取り、「イン−ゲル」を本質的にShevchenko et al. (1996)に記載されているとおりに消化した。タンパク質をジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで消化した（Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111, Promega）。

デノボ配列決定のためにエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型タンデム質量分析を、ペプチド前濃縮のために１５０μｍ×１．０ｍｍの捕獲カラム（３μｍ、１２０Å、＃２２２４０３、ＳＧＥ Ｌｔｄ ＵＫ）を使用するが、本質的に以前に記載されている（Poutanen et al., 2001）Ｕｌｔｉｍａｔｅナノ液体クロマトグラフ（LC-Packings, The Netherlands）に接続されたＱ−ＴＯＦ装置（Micromass, Manchester, UK）を使用して行った。

Ｎ−末端配列分析のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフルオリド(polyvinylidine difluororide)膜（ProBlott; Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, Calif.）に電気ブロッティングすることにより移した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅで染色した後、興味あるタンパク質バンドを取り出し、Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４Ａ タンパク質シーケンサー（Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, Calif.）でＥｄｍａｎ分解によりＮ−末端配列分析に付した。

精製されたＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼから決定されたＮ−末端および内部ペプチド配列を表１に示す。ペプチド配列は、ＥＭＢＬ 受入番号 Ｑ５Ｒ２Ｎ９およびＯ７４２３６でフザリウム・オキシスポルム セリンプロテアーゼ由来の公開されているプロテアーゼ配列との相同性を示した。
表１．Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼから決定されたＮ−末端および内部ペプチド配列

実施例３．Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼをコードするフザリウム・エクイセティ ＲＦ６３１８遺伝子のクローニング
（ａ）ＤＮＡの単離および使用される分子生物学方法
標準分子生物学方法を、ＤＮＡの単離および酵素処理（例えば、プラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡフラグメントを生産するためのＤＮＡの消化）、大腸菌形質転換、配列決定などにおいて使用した。使用される基本的な方法は、酵素、試薬もしくはキット製造業者により記載されているか、または標準分子生物学ハンドブック、例えば、Sambrook and Russell (2001)に記載されているとおりであった。フザリウム・エクイセティ ＲＦ６３１８からのゲノムＤＮＡの単離は、Raeder and Broda (1985)に詳細に記載されているとおりに行った。

（ｂ）プローブ調製のためのプライマー
Ｆｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質をコードする遺伝子のクローニングのためのプローブをＰＣＲにより合成した。縮重オリゴを精製されたＦｅ＿ＲＦ６３１８から得られたペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計した（表１）。プライマーの配列を表２に示す（配列番号：５−８）。
表２．プローブ増幅においてＰＣＲプライマーとして使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号：５−８）。オリゴヌクレオチド配列の設計において使用されたオリゴ、配列番号、オリゴ長および縮重、ペプチドのオリゴヌクレオチドおよびアミノ酸

^（ａＮ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＴまたはＣ；丸括弧内の「ｓ」＝センス鎖、丸括弧内の「ａｓ」＝アンチセンス鎖。
^（ｂペプチド配列は表１に含まれている。

（ｃ）ＰＣＲ反応およびクローニングのためのプローブの選択
フザリウム・エクイセティ ＲＦ６３１８ゲノムＤＮＡをプローブ合成のための鋳型として使用した。ＰＣＲ反応混合物は、１００μｌ反応容量あたり１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１μＭのそれぞれのプライマーおよび４単位のＤｙｎａｚｙｍｅ ＩＩ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Finnzymes, Finland）および約３μｇのゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応の条件は以下のとおりである：５分９６℃最初の変性、次に１分９６℃、３０秒５５．５℃アニーリング、１分７２℃伸長を３２サイクルならびに７２℃５分最終伸長。プライマー組合せＰＲＯ８８（配列番号：６）およびＰＲＯ８９（配列番号：７）は、（公開されている真菌プロテアーゼ配列に基づく計算にしたがって）予期されたサイズを有する特定のＤＮＡ産物を生産した。ＤＮＡ産物をＰＣＲ反応混合物から単離し、精製し、製造業者（Invitrogen, USA）の指示にしたがってｐＣＲ^{（登録商標）}２．１−ＴＯＰＯ^{（登録商標）}ベクターにクローニングした。８６６ｂｐのＤＮＡフラグメントをこのプラスミドから配列決定した（配列番号：９）。このＰＣＲで増幅されたＤＮＡフラグメントを含むｐＣＲ^{（登録商標）}２．１−ＴＯＰＯ^{（登録商標）}プラスミドをｐＡＬＫ２５２１と命名した。プラスミドｐＡＬＫ２５２１を含む大腸菌株ＲＦ７６６４を、受入番号ＤＳＭ２２１７１の下にＤＳＭコレクションに寄託した。

ＰＣＲフラグメントの推定アミノ酸配列は、内部Ｆｅ＿ＲＦ６３１８ペプチド１２４６．６７３（配列番号：２）および３３４１．６３３（配列番号：３）の配列（表１）を含んだ。また、プライマーに含まれていないＮ−末端ペプチド＃３７９２（配列番号：１）のＣ−末端部分は、推定アミノ酸配列から見出された（表１）。これは、ＰＣＲ反応から得られたＤＮＡフラグメントがＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質をコードする遺伝子の一部であり、したがってフザリウム・エクイセティ ゲノムＤＮＡ由来の全長遺伝子のスクリーニングのためにプローブとして使用されたことを確認する。

（ｄ）Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼをコードするフザリウム・エクイセティ ＲＦ６３１８遺伝子のクローニング
フザリウム・エクイセティ ゲノムＤＮＡを、サザンブロット分析のためにいくつかの制限酵素で消化した。ハイブリダイゼーションを、プローブとしてプラスミドｐＡＬＫ２５２１から切り出された配列番号：９を含む８８４ｋｂのＥｃｏＲＩ フラグメントで行った（実施例３ｃ）。上記プローブを、供給者の指示（Roche, Germany）にしたがってジゴキシゲニンを使用することにより標識した。ハイブリダイゼーションを６５℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、２×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳを使用して室温で２×５分間、次に０．１×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳを使用して６５℃で２×１５分、洗浄した。

フザリウム・エクイセティ ゲノムＤＮＡ消化物におけるいくつかのハイブリダイズするフラグメントを検出することができた。ゲノム ＭｕｎＩおよびＢｇｌＩＩ消化物は、それぞれ約４．２ｋｂおよび３．２ｋｂのサイズを有するハイブリダイズするフラグメントを含んだ。単一のハイブリダイズするフラグメントのサイズは、公開された真菌プロテアーゼ配列に基づく計算にしたがってＦｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質をコードする全長遺伝子を含むことが十分な大きさであった。ゲノムＤＮＡフラグメントを、ハイブリダイズするフラグメントのサイズ範囲（ＭｕｎＩ消化に対して約４ｋｂ、およびＢｇｌＩＩ消化に対して約３ｋｂ）から、ＲＦ６３１８ ゲノム ＭｕｎＩおよびＢｇｌＩＩ消化物から単離した。ゲノムフラグメントをアガロースゲルから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで開裂されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋（Stratagene, USA）ベクターにクローニングした。ライゲーション混合物を大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（Stratagene）に形質転換し、５０−１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（Luria-Bertani）プレート上に置いた。大腸菌コロニーを、プローブとしてｐＡＬＫ２５２１挿入物でコロニーハイブリダイゼーションを使用して、陽性クローンのためにスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、ＲＦ６３１８ゲノムＤＮＡ消化物について記載されているとおりに行った。４つの陽性ＢｇｌＩＩおよび８つの陽性ＭｕｎＩクローンをプレートから回収した。それらは、制限消化により予期されたサイズの挿入物を含むことが示された。ＢａｍＨＩベクターにライゲートされたＭｕｎＩフラグメントからの挿入物を、ＰｓｔＩ−ＳａｌＩの二重消化で切った。ＥｃｏＲＩベクターにライゲートされたＢｇｌＩＩフラグメントからの挿入物を、ＰｓｔＩ−ＮｏｔＩの二重消化で切った。サザンブロットを、回収されたクローンの挿入物において行った（６８℃でサザンブロットハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳを使用して室温で２×５分、次に０．１×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳを使用して６８℃で２×１５分洗浄）。３つの回収されたＢｇｌＩＩクローンおよび６つの回収されたＭｕｎＩクローンは、サザンブロットにおいてハイブリダイズするフラグメントを含んだ。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼをコードする全長遺伝子（配列番号：１０）を、３．２ｋｂのＢｇｌＩＩ挿入物から配列決定し、この挿入物を含むプラスミドをｐＡＬＫ２５２９と命名した。プラスミドｐＡＬＫ２５２９を含む大腸菌株ＲＦ７８００を、受入番号ＤＳＭ２２１７２の下にＤＳＭコレクションに寄託した。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８タンパク質をコードする遺伝子をＦｅ ｐｒｔＳ８Ａと命名した。

（ｅ）Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼをコードする遺伝子および推定アミノ酸配列の特性化
Ｆｅ ｐｒｔＳ８Ａ配列（配列番号：１０）および推定アミノ酸配列（配列番号：１１）は、図１Ａ−Ｂに示されている。遺伝子の長さは１３０３ｂｐである（終始コドンを含む）。１つの推定イントロンは、６４ｂｐの長さを有することが見出されていた（Gurr et al. (1987)にしたがって真菌イントロンによる５’および３’境界配列）。推定タンパク質配列（配列番号：１１）は、２０個のアミノ酸の予測されるシグナル配列を含む４１２個のアミノ酸からなる（シグナルＰ Ｖ３．０；Nielsen et al., 1997およびNielsen and Krogh, 1998）。全Ｎ−末端ペプチド＃３７９２（プローブ配列に含まれていないＮ−末端部分も）は、推定アミノ酸配列に含まれていた。予測される分子量は、成熟ポリペプチドに対して２９１４１．０９Ｄａであり、予測されるｐＩは９．３０であった。これらの予測は、ＥｘＰＡＳｙサーバーでのＣｏｍｐｕｔｅ ｐＩ／ＭＷツールを使用して行った（Gasteiger et al., 2003）。推定アミノ酸配列は、アミノ酸位置Ａｓｎ７７およびＡｓｎ２５５での２つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位を含むが（図１）、ＣＢＳ Ｓｅｒｖｅｒ ＮｅｔＮＧｌｙｃ Ｖ１．０によると、位置Ａｓｎ７７（プロ配列に位置する）での部位のみが起こりうる。

（ｆ）相同性、同一性およびアラインメント試験
公開されているプロテアーゼ配列との相同性を、ＮＣＢＩの（全米バイオテクノロジー情報センター）ＢＬＡＳＴＸ プログラム バージョン２．２．９をデフォルトセッティング（Altschul et al., 1990）で使用して検索した。非常に高い相同性は、ジベレラ・ゼアエ（フザリウム グラミネアラム(graminearum)）（ＥＭＢＬ 受入番号 ＸＰ＿３８３４９１）由来の仮想的タンパク質およびトリコデルマ・ハルジアナム(harzianum)（ヒポクレア・リクシイ(Hypocrea lixii)）セリンエンドペプチダーゼ（ＥＭＢＬ 受入番号 ＣＡＬ２５５０８）であった。また、相同性は、配列番号：３１３として特許出願ＵＳ６０／８１８，９１０（Catalyst Bioscience Inc.）に含まれている配列に見出された。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８配列を上記同種配列とアラインした。ＣｌｕｓｔａｌＷ アラインメント（www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw；Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５）を使用することにより得られる同一性値は、表３に示されている。
表３．推定プロテアーゼアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷ アラインメントから得られる同一性値（％）。シグナルペプチドおよびプロペプチドを除く成熟アミノ酸配列をアラインした。Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープン：１０、ギャップ伸長：０．５、ＥＭＢＬ＿ＥＢＩ。ジベレラ・ゼアエ、ＸＰ＿３８３４９１；トリコデルマ・ハルジアナム ＣＡＬ２５５０８；ＵＳ６０／８１８，９１０、出願における配列番号：３１３。

実施例４．トリコデルマ・リーゼイにおける組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼの生産
（ａ）生産（宿主）ベクターの調製
発現プラスミドｐＡＬＫ２５３３を、トリコデルマ・リーゼイにおける組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼの生産のために構築した。自らのシグナル配列を有するＦｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子をＰＣＲによりトリコデルマ・リーゼイ ｃｂｈ１（ｃｅｌ７Ａ）プロモーターに正確に融合した。Ｆｅ ｐｒｔＳ８Ａ遺伝子フラグメントをＢａｍＨＩにより３’末端から取り出した（ＰＣＲにおいて終始コドン後に創造された部位）。これは、ｃｂｈ１ターミネーター配列前に、構築物中の元のＦｅ ｐｒｔＳ８Ａターミネーターに置かれていない。ａｍｄＳマーカー遺伝子をｃｂｈ１プロモーターおよびｃｂｈ１ターミネーターを含む構築物に加えた。構築物は、Paloheimo et al. (2003)に記載されているものと類似であり、８．７ｋｂの直線的発現カセットは、図２に示されている。ＥｃｏＲＩ消化後に、発現カセットをベクター骨格から単離し、トリコデルマ・リーゼイ プロトプラストを形質転換するために使用した。使用された宿主株は、４つの主要なトリコデルマ・リーゼイ セルラーゼ（ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ）のいずれも生産しない。形質転換を、Karhunen et al. (1993)に記載されている修飾でPenttila et al. (1987)のとおりに行った。形質転換体を単一の分生子を介して選択プレート上で精製し、ＰＤ上でそれらを胞子形成した。

（ｂ）振とうフラスコおよび実験室規模バイオリアクターにおけるプロテアーゼ生産
形質転換体を、ＰＤスラントから５％のＫＨ_２ＰＯ_４でｐＨ６．０で緩衝された５０ｍｌの複合ラクトースをベースとしたセルラーゼ誘導培地（Joutsjoki et al., 1993）を含む振とうフラスコに植菌した。形質転換体のプロテアーゼ生産を、７日間３０℃で２５０ｒｐｍで培養後に培養上清から分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼに対応する約２９ｋＤａの主要なタンパク質バンドを、消費された培養上清から検出した。プロテアーゼ活性を、実施例１ｃまたは１４に記載されている基質としてカゼインを使用してアッセイした。宿主と比較して明らかに増加した活性を培養上清から測定した。発現カセットの真菌ゲノムへの統合を、いくつかのゲノム消化物を含み、発現カセットをプローブとして使用したサザンブロット分析を使用することにより、選択された形質転換体から確認した。

振とうフラスコ培養において非常に良いプロテアーゼ活性を生産するトリコデルマ・リーゼイ形質転換体を、実験室規模バイオリアクターにおける培養のために選択した。セルラーゼ誘導複合培地を培養において使用した。培養から得られた消費された培養培地を適用試験（実施例６−１１）において、および精製および組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼのさらなる特徴付けのための出発物質として使用した。

実施例５．組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼの精製および特徴付け
細胞および固体を、３０分、５００００ｇで＋４℃で遠心分離（Sorvall RC6 plus）により、発酵から得られた消費された培養培地（実施例４）から除去した。１５ｍｌの上清をプロテアーゼの精製のために使用した。全ての精製工程は寒い部屋で行った。遠心分離後、サンプルを０．４４μｍのフィルター（MILLEX HV Millipore）を介して濾過し、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．８で平衡にしたＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ カラム（GE Healthcare）に付した。ゲル濾過されたサンプルを、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．８で平衡にした２０ｍＬのＱセファロース ＦＦ カラム（GE Healthcare）に付した。流入画分を回収し、１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分析した（図３）。この酵素サンプルをｐＨおよび温度プロフィールの特徴付けのために使用した。

温度プロフィール
温度プロフィールを、１５分の反応時間を使用して実施例１ｃまたは１４に記載されているアッセイを使用することにより、ｐＨ９で、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼについて得た。結果は図４Ａに示されている。該プロテアーゼは、約６０の最適温度を有する。

ｐＨプロフィール
プロテアーゼのｐＨプロフィールを、実施例１ｃまたは１４に記載されているとおり基質としてカゼインを使用して５０℃で決定した。反応のｐＨを４０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファーを使用してｐＨ６−１２に調節し、反応時間は１５分であった。酵素反応を、０．２２Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．３３Ｍの酢酸を含む０．１１ＭのＴＣＡ溶液を使用して停止した。結果は図４Ｂに示されている。組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼは、約ｐＨ１０の最適条件活性を有するｐＨ６からｐＨ１０で６０％を越える相対活性を示す。精製された組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼのｐＨプロフィールは、実施例１ａに記載されているとおりに精製された野生型Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼのｐＨプロフィールに対応した。

実施例６．異なる温度でｐＨ９バッファーでの組換えＦｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼの能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８調製物（実施例４に記載されている）を、３０℃および５０℃の温度で血液／ミルク／インク標準汚点（Ａｒｔ．１１６、１００％の綿、EMPA Testmaterialen AG, Switzerland）を除去する能力について試験した。市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ Ｌ（Novozymes）およびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ（Genencor International）および酵素なしの処理（コントロール）を、比較のために使用した。汚点織物を、最初に、１．５ｃｍ×１．５ｃｍの生地見本(swatch)に切り、一片を角を切ることにより丸くした。一片をマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ １５０２００）のウェルに置いた。２ｃｍの直径を有するそれぞれのウェルに、グリシン−ＮａＯＨバッファー ｐＨ９中の１．５ｍｌの酵素希釈物を、織物の上に加えた。それぞれの酵素を、１．５ｍｌのバッファーあたり０、０．２、０．４、０．８、１．６、４および８活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、希釈されたＦｏｌｉｎ試薬の添加後に色発生のための１０分を使用して、実施例１（ｃ）または１４に記載されている反応時間の３０分を使用して測定した。サンプルを有するマイクロタイタープレートを、３０℃および５０℃で６０分１２５ｒｐｍで水平震盪器においてインキュベートした。その後、生地見本を流水（約４５℃）下で注意深く濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。

汚点除去効果を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊ 色空間座標（ｉｌｌｕｍｉｎａｎｔ Ｄ６５／２°）を使用してＭｉｎｏｌｔａ ＣＭ ２５００ 分光光度計で反射率として色を測定することにより評価した。生地見本の両サイドの色を、処理後に測定した。それぞれの値は、織物の両サイドから測定された少なくとも２つの平行織物サンプルの平均であった。プロテアーゼ能力を示す血液／ミルク／インク汚点の退色（汚点除去効率）を、酵素処理された織物の明度Ｌ＊ マイナス 酵素なし（酵素ブランク、コントロール）の洗浄溶液（バッファー）で処理された織物の明度Ｌ＊を意味するΔＬ＊として計算した。

結果は、図５および６に示されている。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼ調製物は、市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌと比較して、ｐＨ９バッファー中で５０℃、とりわけ３０℃でかなり高い汚点除去能力を示した。

実施例７．４０℃／５０℃およびｐＨ１０での界面活性剤粉末との組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８調製物（実施例４に記載されている）を、４０℃および５０℃（ｐＨ約１０）で漂白剤有りまたは無しで参照界面活性剤を含むリン酸塩の存在下で血液／ミルク／インク標準汚点を除去する能力について試験した。標準汚点Ａｒｔ．１１７（血液／ミルク／インク、ポリエステル＋綿、ＥＭＰＡ）を試験物質として使用した。市販のプロテアーゼ Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌおよび酵素なしの処理（コントロール）を、比較のために使用した。それぞれの酵素を、１ｍｌの洗浄溶液あたり０、０．２、０．４、０．８、１．６、４および８活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、実施例６に記載されているとおりに測定した。

光学的光沢剤（Ａｒｔ． ６０１、ＥＭＰＡ）なしでＥＣＥ 参照界面活性剤 ７７を含む３．３ｇの量のリン酸塩を、１リットルの水道水（水、ｄＨ≦４）に溶解し、磁気撹拌棒でよく混合し、４０℃／５０℃に加減した。汚点織物を実施例６に記載されているように一片に切った。生地見本をマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ １５０２００）のウェルに置き、水中（６０μｌ未満）に界面活性剤および酵素希釈物を含む１．５ｍｌの洗浄溶液を、織物の上に加えた。サンプルを有するプレートを、４０℃／５０℃で６０分１２５ｒｐｍで水平震盪器においてインキュベートした。その後、生地見本を流水（約４５℃）下で注意深く／完全に濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。別の試験シリーズを、０．８１ｇの過ホウ酸ナトリウム塩テトラ水和物（Ａｒｔ． ６０４、ＥＭＰＡ）および０．１６ｇの漂白アクチベーター ＴＡＥＤ テトラアセチルエチレンジアミン（Ａｒｔ． ６０６、ＥＭＰＡ）を界面活性剤に加えることを除いて、同じ方法で作った。

処理後の生地見本の色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊ 色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ ＣＭ ２５００ 分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例６に記載されているΔＬ＊として計算した。

図７Ａ、７Ｂ、８Ａおよび８Ｂに示される結果は、プロテアーゼＦｅ＿ＲＦ６３１８が、また、非常にアルカリ性条件で粉末界面活性剤に対して適当であり、漂白剤に対する耐性が市販のプロテアーゼＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌよりもわずかに高いことを示した。

実施例８．４０℃での液体の界面活性剤との組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８調製物（実施例４に記載されている）を、４０℃およびｐＨ約７．９で酵素を含まない液体の界面活性剤Ａｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（Procter & Gamble, England）の存在下で血液／ミルク／インク標準汚点を除去する能力について試験した。標準汚点として人工的に汚された試験布Ａｒｔ．１１７（血液／ミルク／インク、ポリエステル＋綿、ＥＭＰＡ）を試験物質として使用した。市販のプロテアーゼ調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ Ｌおよび酵素なしの処理（コントロール）を、比較のために使用した。それぞれの酵素を、１ｍｌの洗浄溶液あたり０、０．２、０．４、０．８、１．６、４および８活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、実施例６に記載されているとおりに測定した。

３．３ｇの量のＡｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅを、１リットルの水道水（ｄＨ≦４）に溶解し、磁気撹拌棒でよく混合し、４０℃に加減した。汚点織物を実施例６に記載されているように一片に切った。生地見本をマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ １５０２００）のウェルに置き、水中（６０μｌ未満）に界面活性剤および酵素希釈物を含む１．５ｍｌの洗浄溶液を、織物の上に加えた。サンプルを有するプレートを、４０℃で６０分１２５ｒｐｍで水平震盪器においてインキュベートした。その後、生地見本を流水（約４５℃）下で注意深く濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。

処理後の生地見本の色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊ 色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ ＣＭ ２５００ 分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例６に記載されているΔＬ＊として計算した。

図９において示される結果に基づいて、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼは、４０℃で液体の界面活性剤とで優れた能力を有する。血液／ミルク／インク汚点（ポリエステル＋綿）におけるＦｅ＿ＲＦ６３１８の効率は、同じ量のプロテアーゼ活性を投与したとき、市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １４ Ｌと比較してかなり高かった。洗浄溶液１ｍｌあたりの４−８単位の市販の酵素の用量は、界面活性剤の重量当たり約０．２−０．５％の酵素調製物の用量と等しかった。これは、界面活性剤酵素に対して典型的な使用レベルである。

実施例９．３０℃での異なる液体の界面活性剤濃度での組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８調製物（実施例４に記載されている）を、３０℃で１−５ｇ／ｌの濃度で液体の界面活性剤との血液／ミルク／インク標準汚点を除去する能力について試験した。酵素なしで、２５％の洗浄活性な物質、ポリオールおよびポリマーを含む色付き織物に対する液体ベースの界面活性剤を含むＡｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（Procter & Gamble, England）（表４）を、界面活性剤として使用し、標準汚点Ａｒｔ．１１７（血液／ミルク／インク、綿＋ポリエステル、ＥＭＰＡ）を試験物質として使用した。市販のプロテアーゼ調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌ、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ Ｌおよび酵素なしの処理（コントロール）を、比較のために使用した。それぞれの酵素を、１ｍｌの洗浄溶液あたり０、０．２、０．４、０．８、１．６、４および８活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、実施例６に記載されているとおりに測定した。
表４．色付き織物に対する液体ベースの界面活性剤の組成

１、３．３および５ｇの量の液体の界面活性剤を、１リットルの水道水（ｄＨ≦４）に溶解し、磁気撹拌棒でよく混合し、３０℃に加減した。洗浄溶液のｐＨは、界面活性剤濃度に依存して、塩基性界面活性剤で約７．３−７．５またはＡｒｉｅｌで約７．６−８．０であった。汚点織物を実施例６に記載されているように一片に切った。生地見本をマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ １５０２００）のウェルに置き、水中（６０μｌ未満）の界面活性剤および酵素希釈物を含む１．５ｍｌの洗浄溶液を、織物の上に加えた。サンプルを有するプレートを、３０℃で６０分１２５ｒｐｍで水平震盪器においてインキュベートした。その後、生地見本を流水下で注意深く／完全に濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。

処理後の生地見本の色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊ 色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ ＣＭ ２５００ 分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例６に記載されているΔＬ＊として計算した。

色付き織物に対する塩基性界面活性剤で得られた結果は図１０Ａ−Ｄに示されており、Ａｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅで得られた結果は図１１Ａ−Ｄに示されている。血液／ミルク／インク汚点に対するＦｅ＿ＲＦ６３１８の効率は、同じ量の活性を投与したとき、全ての界面活性剤濃度で、両方の界面活性剤で市販の調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １４ Ｌと比較してかなり高かった。また、投与量を加えられたタンパク質の量として計算すると（図１０Ｂおよび１１Ｂ）、汚点除去効率はＦｅ＿ＲＦ６３１８で特に高い。酵素調製物からのタンパク質の量は、標準としてウシガンマグロブリン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）により測定した。これらの試験の結果は、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼが３０℃のような低い温度で液体の界面活性剤とで優れた能力を有することを示す。

実施例１０．３０℃での液体の界面活性剤とで異なる汚点における組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の効率（Ｌａｕｎｄｅｒ Ｏｍｅｔｅｒ）
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８調製物（実施例４に記載されている）を、３０℃で液体の界面活性剤とで異なる汚点を除去する能力について試験し、市販のプロテアーゼ調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌおよび／またはＳａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標） １６ Ｌと比較した。ＥＭＰＡからの以下の人工的に汚された試験布を使用した：血液／ミルク／インク（Ａｒｔ．１１７、ポリエステル＋綿）、血液／ミルク／インク（Ａｒｔ．１１６、綿）、草（Ａｒｔ．１６４、綿）およびココア（Ａｒｔ．１１２、綿）。織物を、９ｃｍ×１２ｃｍの生地見本に切り、端をジグザグ縫いで整えた。２つの試験シリーズを行った：第１に、酵素なしでＡｒｉｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅとで、第２に色付き織物に対する液体ベースの界面活性剤で（実施例８）。汚点の異なる一団を、上記２つの実験において使用した。

汚点除去処理を、以下のとおりにＬＰ−２ Ｌａｕｎｄｅｒ Ｏｍｅｔｅｒで行った。最初に、Ｌａｕｎｄｅｒ Ｏｍｅｔｅｒを３０℃にあらかじめ温めた。１リットルの水道水（ｄＨ≦４）当たり５ｇの界面活性剤および酵素希釈物を含む４５０ｍｌの混合洗浄溶液を、汚点Ａｒｔ．１１６およびＡｒｔ．１１７または汚点Ａｒｔ．１６４およびＡｒｔ．１１２を含む容器に加えた。それぞれの酵素を、１ｍｌの洗浄溶液あたり０、２、５、１０、およびいくつかの試験において２０または３０活性単位（μｍｏｌチロシン／分）で投与した。活性を、実施例６に記載されているとおりに測定した。Ｌａｕｎｄｅｒ Ｏｍｅｔｅｒを、３０℃で６０分およびｐＨ約７．５（塩基性界面活性剤）または８（Ａｒｉｅｌ）で行った。その後、生地見本を流水（約２０℃）下で注意深く濯ぎ、日光に対して保護された格子上で屋内空気で一晩乾燥させた。

処理後の生地見本の色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊ 色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ ＣＭ ２５００ 分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例６に記載されているΔＬ＊として計算した。生地見本の両サイドの色を、処理後に測定した。それぞれの値は、生地見本当たり少なくとも２０個の測定の平均であった。測定は、織物の折り畳みのため、処理中に形成されたしわ跡での領域から避けた（綿汚点Ａｒｔ．１１６およびＡｒｔ．１１２）。

Ａｒｉｅｌ（登録商標） Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅで得られた結果（図１２Ａ−Ｃ）は、血液／ミルク／インクおよび草汚点に対する効率が、同じ量のプロテアーゼ活性を投与したとき、３０℃で、市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌと比較してＦｅ＿ＲＦ６３１８でかなり高かったことを示す。また、ココア汚点で得られた結果は、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８よりも良かった（データは示していない）。

色付き織物に対する塩基性界面活性剤（５ｇ／ｌ）で得られた結果（図１３Ａ−Ｄ）は、また、血液／ミルク／インク、草およびココア汚点に対する効率が、同じ量のプロテアーゼ活性を投与したとき、３０℃で、市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌと比較してＦｅ＿ＲＦ６３１８でかなり高かったことを示した。液体１ｍｌ当たりの１０単位の市販の酵素の用量は、界面活性剤の重量当たり約０．４％の酵素調製物の用量と等しかった。これは、界面活性剤酵素に対して典型的な使用レベルである。これらの試験の結果は、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼが３０℃のような低い温度でいくつかの汚点に対して効率的であることを示す。

実施例１１．３０℃でのフルスケール試験における液体中の洗濯洗剤中の組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力の評価
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８調製物（実施例４）の能力を、３０℃で洗浄機におけるフルスケールでの液体の界面活性剤において試験し、市販のプロテアーゼ調製物Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌと比較して、酵素なしの界面活性剤で処理した。実施例９に記載されている色付き織物に対する液体ベースの界面活性剤および８つの異なるプロテアーゼ感受性トレーサー（表５）を使用した。加えて、洗浄物あたり２つの一バラスト汚れ(ballast soil)（ＣＦＴ−ＳＢＬ）を洗浄ネット中に置き、他の生地見本との接触による汚染を回避した。トレーサーはＣＦＴ（Center For Testmaterials BV, The Netherlands）であった。汚点生地見本１０ｃｍ×１０ｃｍをキッチンタオルに縫いつけた。方法パラメーターおよび条件は、表６に記載されている。試験において使用された酵素用量を、酵素活性（ｍｌ洗浄溶液あたり約０−１４活性単位）およびタンパク質の量（リットル洗浄溶液あたり約０−２．２ｍｇ）の両方として計算した。調製物のプロテアーゼ活性およびタンパク質含有量を、実施例６および９に記載されているとおりに測定した。
表５．試験において使用されたプロテアーゼ感受性トレーサー

表６．方法パラメーターおよび条件

汚点除去効果の評価は、ＵＶ−フィルターを備えたＤａｔａｃｏｌｏｒ−分光光度計での反射率（Ｒ４５７ｎｍ）の測定に基づき、汚点除去効果パーセント（％ＳＲ）として計算した：

結果を、酵素処理された織物の％ＳＲ マイナス 酵素なしの（界面活性剤のみ）処理の％ＳＲを意味するΔ％ＳＲ（デルタ％ＳＲ）として計算した。

それぞれの汚点の２つの生地見本を含む２つの洗浄物をそれぞれの用量の酵素で行い、３つの測定をそれぞれの汚点生地見本で測定し、値を１２個の測定／汚点／製品に基づく。

全汚れ除去効率性（デルタ％ＳＲ）の結果を図１４Ａ−Ｂおよび図１５Ａ−Ｅに示す。全汚点除去効果は、８つの異なるプロテアーゼ感受性汚点（汚点１−８）での得られた結果の合計に基づき、プロテアーゼを活性の量およびタンパク質／洗浄溶液の容量として投与したとき、表は、市販のプロテアーゼ調製物ｓ Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌと比較してＦｅ＿ＲＦ６３１８で高かった（図１４Ａ−Ｂ）。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８は、血液／ミルク／インク、チョコレート／ミルク、落花生油／ミルクおよび卵黄においてとりわけ効率的であった（図１５Ａ−Ｅ）。

一般的な洗浄力トレーサー（顔料／油）を、異なる機械における反復のコントロールとして使用した。種々の試験間の差異は観察されなかった。

実施例１２．１０℃から６０℃の温度でのｐＨ９バッファーにおける組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８（実施例４に記載されている）を、１０から６０℃の温度で血液／ミルク／インク標準汚点（Ａｒｔ．１１７、ポリエステル＋綿、EMPA Testmaterialen AG, Swizerland）を除去する能力について試験した。市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ Ｌ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００ Ｅおよび酵素なしの処理（コントロール）を、比較のために使用した。試験は、インキュベーション温度範囲が広範であり、汚点物質が異なり、生地見本の濯ぐ水の温度が洗浄温度と同程度であることを除いて、実施例６に記載されているｐＨ９バッファーで行った。処理後の生地見本の色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊ 色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ ＣＭ ２５００ 分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例６に記載されているΔＬ＊として計算した。

結果は、図１６Ａ−Ｆに示されている。Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼ調製物は、市販のプロテアーゼ調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６ＬおよびＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００Ｌと比較して、ｐＨ９バッファー中で１０℃から６０℃の全温度範囲で高い汚点除去能力を示した。また、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００Ｅと比較して、３０℃から６０℃の範囲で高い汚点除去能力を示した。

実施例１３．低い洗浄温度１０℃および２０℃での液体の界面活性剤との組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８の能力
トリコデルマにおいて生産された組換えタンパク質Ｆｅ＿ＲＦ６３１８（実施例２に記載されている）を、低い温度で液体ベースの界面活性剤とで血液／ミルク／インク標準汚点（Ａｒｔ．１１７、綿＋ポリエステル、ＥＭＰＡ）を除去する能力について試験した。３．３ｇ／ｌの界面活性剤濃度ならびに低いインキュベーション温度、１０℃および２０℃を使用することのみを除いて、試験方法は実施例９と同様であった。生地見本の濯ぐ水の温度は、洗浄温度と同様であった。

処理後の生地見本の色を、Ｌ＊ａ＊ｂ＊ 色空間座標を使用してＭｉｎｏｌｔａ ＣＭ ２５００ 分光光度計で測定し、汚点除去効果を実施例６に記載されているΔＬ＊として計算した。酵素なしでの処理（酵素ブランク）のために、界面活性剤溶液を洗浄溶液として使用した。

１０℃および２０℃での３．３ｇ／ｌの液体ベースの界面活性剤濃度で得られた結果は、図１７ＡおよびＢに示されている。血液／ミルク／インク汚点に対するＦｅ＿ＲＦ６３１８の効率は、同じ活性量を投与したとき、１０℃および２０℃の両方で、市販の調製物Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標） Ｕｌｔｒａ １６Ｌ、 Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標） ４０００ＬおよびＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標） ４０００Ｅと比較して、かなり高かった。これらの試験の結果は、Ｆｅ＿ＲＦ６３１８プロテアーゼが非常に低い洗浄温度で液体の界面活性剤とで優れた能力を有することを示す。

実施例１４．プロテアーゼ活性アッセイＩＩ
プロテアーゼ活性を基質としてカゼインを使用するカゼインＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ方法によりアッセイした。プロテアーゼによるカゼイン分解速度を、時間の関数として酸−可溶性フラグメントの放出の分光光度のモニタリングにより測定した。アッセイにおいて使用されるカゼイン基質は、以下のとおりに調製した：６ｇのＣａｓｅｉｎ Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ Ｇｒａｄｅ ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＬＬＣ（１０１２８９）を５００ｍｌの３０ｍＭのＴｒｉｓ、２．０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．７ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＮａＨＣＯ_３に溶解した。基質溶液のｐＨをＨＣｌで８．５に調節した。酵素反応を、０．１１ＭのＴＣＡ溶液を使用して停止した。アッセイにおいて使用されるＦｏｌｉｎ試薬を、２５ｍｌの２ＮのＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕのフェノール試薬（ＳＩＧＭＡ、Ｆ ９２５２）を１００ｍｌに蒸留水により希釈することにより調製した。最初に５０℃で５分間２．５ｍｌの基質溶液をインキュベートすることにより反応を開始し、その後、０．５ｍｌの酵素溶液を加え、反応を３０分間行った。３０分反応後に、２．５ｍｌの反応停止溶液を加え、内容物を混合し、３０分室温で放置した。チューブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心した（Hettich Rotanta 460）。１ｍｌの上清を２．５ｍｌの０．５ＭのＮａ_２ＣＯ_３および０．５ｍｌの希釈されたＦｏｌｉｎ試薬と混合した。少なくとも５分（色発生）待った後、混合物の吸光度（色）を酵素ブランクに対して６６０ｎｍで測定した。酵素ブランクを次のとおりに調製した：０．５ｍｌの酵素溶液を２．５ｍｌの停止溶液および２．５ｍｌの基質と混合し、混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。酵素活性の１単位を、１μｇチロシン／ｍｌ（またはｇ）反応混合物／分に対応する酸可溶性タンパク質加水分解産物を遊離させる酵素量として定義した。

参考文献

Claims (38)

1. セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列または配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする真菌セリンプロテアーゼ酵素。
2. フザリウム・エクイセチ(Fusarium equiseti)から得ることができることを特徴とする、請求項１に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
3. セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
4. 成熟形態が２０から３５ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
5. １５分の反応時間および基質としてカゼインを使用するｐＨ９での該酵素の最適温度が３０℃から７０℃であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
6. 少なくともｐＨ６からｐＨ１１のｐＨ範囲で、１５分の反応時間および基質としてカゼインを使用して５０℃で最適ｐＨを有することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
7. １０℃から６０℃で界面活性剤の存在下でタンパク質汚点を分解し、除去することができることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
8. 受入番号ＤＳＭ２２１７１の下に大腸菌ＲＦ７６６４において寄託されている配列番号：９のヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＡＬＫ２５２１に含まれているポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
9. 配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８酵素のアミノ酸配列または配列番号：１５に定義されている成熟Ｆｅ＿ＲＦ６３１８のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
10. 配列番号：１５に特徴付けられるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子によってコードされることを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
11. 配列番号：１４のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
12. 受入番号ＤＳＭ２２１７２の下に大腸菌ＲＦ７８００において寄託されているｐＡＬＫ２５２９に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
13. 適当な宿主におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を駆動することができる調節配列に作動可能に連結した請求項１から１２のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターから生産されることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
14. 異種宿主において生産されることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
15. 微生物宿主において生産されることを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
16. 属トリコデルマ(Trichoderma)、アスペルギルス(Aspergillus)、フザリウム(Fusarium)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、アカパンカビ(Neurospora)、クモノスカビ(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)またはモルティエラ(Mortiriella)の宿主において生産されることを特徴とする、請求項１から１５のいずれかに記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
17. トリコデルマまたはアスペルギルスにおいて生産されることを特徴とする、請求項１６に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
18. トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)において生産されることを特徴とする、請求項１７に記載の真菌セリンプロテアーゼ酵素。
19. （ａ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５において記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
    （ｂ）セリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
    （ｃ）配列番号：１０において記載されているヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
    （ｄ）ＤＳＭ２２１７１またはＤＳＭ２２１７２に含まれるポリヌクレオチド配列のコード配列を含む核酸分子；
    （ｅ）遺伝子コードの縮重によって、（ｃ）から（ｄ）のいずれか１つの核酸分子のコード配列と異なるコード配列を含む核酸分子；および
    （ｇ）ＤＳＭ２２１７１に含まれる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ活性を有し、配列番号：１５において記載されているアミノ酸配列と少なくとも８６％の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
    からなる群から選択される真菌セリンプロテアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
20. 適当な宿主におけるセリンプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を駆動することができる調節配列に作動可能に連結した請求項１９に記載のヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
21. 請求項２０に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
22. 微生物宿主であることを特徴とする、請求項２１に記載の宿主細胞。
23. 糸状菌であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の宿主細胞。
24. 属トリコデルマ、アスペルギルス、フザリウム、フミコーラ、クリソスポリウム、アカパンカビ、クモノスカビ、ペニシリウムまたはモルティエラであることを特徴とする、請求項２１から２３のいずれかに記載の宿主細胞。
25. トリコデルマまたはアスペルギルスであることを特徴とする、請求項２４に記載の宿主細胞。
26. トリコデルマ・リーゼイであることを特徴とする、請求項２５に記載の宿主細胞。
27. セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、請求項２１から２６のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程、該ポリペプチドを回収する工程を含む方法。
28. 請求項１９に記載の核酸配列によってコードされ、請求項２７に記載の方法により得ることができる、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
29. セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素調製物を得るための方法であって、請求項２１から２６のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程、該細胞から該ポリペプチドを回収する工程、または該培養培地から該細胞を分離して上清を得る工程を含む方法。
30. 請求項２９に記載の方法により得ることができる酵素調製物。
31. 請求項１から１８のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ酵素を含む酵素調製物。
32. プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼまたはオキシダーゼの群から選択される他の酵素を、メディエーターと共にまたはメディエーターなしで含むことを特徴とする、請求項３０または３１に記載の酵素調製物。
33. 安定剤、バッファー、界面活性剤、増進剤、漂白剤、メディエーター、防食剤、再付着防止剤、腐食剤、研磨剤、光学的光沢剤、色素、顔料、および防腐剤の群から選択される適当な添加物を含むことを特徴とする、請求項３０から３２のいずれかに記載の酵素調製物。
34. 液体、粉末または粒状の形態であることを特徴とする、請求項３０から３３のいずれかに記載の酵素調製物。
35. 界面活性剤のための、繊維を処理するための、羊毛を処理するための、髪を処理するための、革を処理するための、食物または飼料を処理するための、またはタンパク質物質の修飾、分解または除去にかかわるあらゆる適用のための、請求項１から１８のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ酵素または請求項３０から３４のいずれかに記載の酵素調製物の使用。
36. 界面活性剤添加物としての、請求項１から１８のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ酵素または請求項３０から３４のいずれかに記載の酵素調製物の使用。
37. 液体の界面活性剤における請求項３６に記載の使用。
38. 粉末の界面活性剤における請求項３６に記載の使用。

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