DE3855375T2

DE3855375T2 - Proteolytische enzyme

Info

Publication number: DE3855375T2
Application number: DE3855375T
Authority: DE
Inventors: Babru Samal; Yitzhak Stabinsky
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-03-28
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2008-03-29
Also published as: NO179217C; WO1988007581A1; NO179217B; DK672088D0; KR890700675A; NO885391L; JP2731407B2; CA1331154C; FI100602B; JPH01502798A; EP0309550B1; EP0309550A4; FI885635A; AU617996B2; NO885391D0; FI885635A0; EP0309550A1; DE3855375D1; AU1571688A; ATE139567T1

Description

Diese Erfindung betrifft neuartige Serinproteasen, die aus einem Kulturmedium des Pilzes Tritirachium album isoliert werden. Die Serinproteasen der vorliegenden Erfindung besitzen einen hohen Stabilitätsgrad in wäßrigen Lösungen und trockenen Reinigungsmittelformulierungen. Die Erfindung betrifft weiterhin Reinigungsmittelzusammensetzungen, die solche Proteasen enthalten, und die Verwendung der Proteasen in Waschmitteln und Reinigungsmitteln oder Fleckreinigern. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin DNA-Sequenzen, die für die Proteasen codieren, und ein Verfahren zur Herstellung der Proteasen.
Serinproteasen sind proteolytische Enzyme mit einem Serinrest an ihrer aktiven Stelle. Die Modifikation des Aktivstellen-Serinrestes durch Agentien wie etwa Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) inaktiviert diese Enzyme. Es gibt zwei Klassen von Serinproteasen, Chymotrypsin-ähnliche Proteasen und Subtilisinähnliche Proteasen. Subtilisine sind Serinproteasen, die allgemein so wirken, daß sie innere Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden spalten. Subtilisine werden von einer Anzahl von Bacillus-Spezies sekretiert und extensiv kommerziell verwendet (siehe U.S. Patent No. 3,623,957, J. Miller, 1970, J. Appl. Bacteriol., 33, 207; Ward, O.P. 1983, S. 251-317, Enzymes and Biotechnology, ed., W.M. Fogarty, Applied Science Publishers, London). Subtilisine sind in einer Anzahl von Reinigungsmittelformulierungen eingesetzt worden (siehe U.S. Patent Nos. 1,240,058, 3,749,671; 3,790,482; 4,266,031, U.K. Patent No. 1315937).
Die Verwendung von Proteasen in industriellen Verfahren, die Proteinhydrolyse erfordern, ist wegen der Enzym-Instabilität unter den Temperatur- und pH-Bedingungen, die mit solchen Verfahren zusammenhängen, begrenzt gewesen. Obgleich die thermische Inaktivierung der Protease der wichtigste Faktor bei der Beschränkung der industriellen Verwendung einer Protease sein kann, können auch andere Faktoren, wie etwa das Fehlen der Wirksamkeit über breite pH-Bereiche und die Verwendung von Denaturierungsmitteln in Reinigungsmittelformulierungen, eine schädliche Wirkung im Hinblick auf die Verwendung von Proteasen in industriellen Verfahren haben. Die bekannten, aus Bacillus gewonnenen Subtilisine sind nicht für alle Anwendungen als Reinigungsmittelenzyme ideal, insbesondere nicht für Anwendungen, die größere Lagerstabilität und Aktivität bei breiteren Bereichen von pH und Temperatur erfordert. Daher besteht ein Bedürfnis nach einer Klasse von Proteasen, die gekennzeichnet sind durch hohe Stabilität im Hinblick auf Temperatur, pH, Denaturierungsmittel und dergleichen.
Es besteht auch ein Bedürfnis nach Proteasen, die kompatibel mit Reinigungsmitteln sind und ausreichende Lagerbeständigkeit in flüssigen Reinigungsmittelformulierungen haben, um kommerziell einsetzbar zu sein. Thermostabile Pilz-Serinproteasen sind in Reinigungsmittelanwendungen bewertet worden, einschließlich Proteasen, die aus Tritirachium album (Ebeling, W. et al., 1971, German Offenbach, 1965, 281), Malbranchea pulchella (Ong, P.S. et al., Can. J. Microbiol. 22, 165), Acremonium kiliense, Fusarium und Gibberella spp (Isono, M., et al., 1972, U.S. Patent No. 3652399) gewonnen worden sind. Proteinase K (EC 3, 4, 21, 14) wurde aus Tritirachium album (Ebeling, W. et al., 1974, Eur. J. Biochem. 47, 91-97) isoliert und ist von verschiedenen Gruppen (Kraus, E. et al., 1976, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 357, 937-947, ibid. 357, 233-237, und Morihara, K. et al., 1975, Agr. Biol. Chem. 39, 1489-1492) extensiv untersucht worden. Die dreidiminensionale Struktur von Proteinase K ist ähnlich zu derjenigen von Subtilisinen (Paehler, A. et al., 1983, EMBO J. 3, 1311-1314), und es gibt etwa 35% Homologie der Aminosäuresequenz von Proteinase K mit derjenigen von Subtilisinen (Jany, K-D., et al., FEBS Letters, 199, 139-144). Reinigungsmittelkompatibilität von Proteinase K ist aufgrund ihrer Aktivität in der Gegenwart einer hohen Konzentration von Reinigungsmitteln vorgeschlagen worden (Hilz, H. et al., 1975, Eur. J. Biochem., 56, 103-108).
Proteolytische Enzyme katalysieren allgemein die Spaltung von Peptidbindungen nur in einem bestimmten Bereich von pH und Temperatur. Überdies behält ein proteolytisches Enzym, selbst unter optimalen Bedingungen, seine Aktivität nur bei, wenn seine Polypeptidkette in nativer Konformation vorliegt. Die Entfaltung der nativen Struktur tritt oft ein, wenn das Enzym Extremwerten von pH oder Temperatur oder bestimmten Reinigungsmittelzusätzen, wie etwa Tensiden und Metall-chelatierenden Mitteln, ausgesetzt wird. Letztere üben ihre Wirkung insbesondere auf Enzyme aus, die Metall-Ionen, wie etwa Ca²&spplus;, zur Stabilisierung ihrer nativen Struktur benötigen, d. h. bakterielles Subtilisin. Für Proteasen kann die teilweise Entfaltung der nativen Konformation des Enzyms zur Beschleunigung der Selbstverdauung und daher zu irreversibler Enzym-Inaktivierung führen. Weil die meisten kommerziellen Waschmittel einen alkalischen pH besitzen, ist es wünschenswert, daß das Enzym, das in solchen Waschmitteln eingesetzt wird, in einen pH-Bereich von zwischen 7,5 und 13 und in einem Temperaturbereich von zwischen 20 und 65ºC aktiv und stabil ist. Überdies ist es wünschenswert, daß die Aktivität solcher Enzyme relativ unabhängig von Calcium- und Magnesium-Ionen und kompatibel mit Tensiden und Maskierungsmittel-Buildern ist. Bakterielle Serinproteasen der Subtilisin-Familie erfüllen diese Anforderungen bis zu einem gewissen Maße, ihre Stabilität in flüssiger Reinigungsmittelformulierung ist jedoch beschränkt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Serinproteasen, die gekennzeichnet sind durch verbesserte Stabilität in Reinigungsmittelformulierungen. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung neuartiger Serinproteasen, die die Aminosäuresequenzen besitzen, wie sie in den Fig. 3 und 8 angegeben sind, und aus dem Stamm des Pilzes Tritirachium album Limber (ATCC 22563) gewonnen werden. Die Serinproteasen der vorliegenden Erfindung haben sich als überlegene Reinigungsmittelenzyme erwiesen und besitzen einen hohen Grad an thermischer Stabilität in wäßrigen Lösungen, insbesondere bei erhöhten Temperaturen, wodurch die Proteasen geeignet sind zur Verwendung als Zusatzstoffe in kommerziellen flüssigen Reinigungsmittelformulierungen. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Isolierung und Charakterisierung der Gene, die solche Proteasen codieren. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Serinproteasen der vorliegenden Erfindung in Waschmitteln und Reinigern oder Fleckreinigern und Zusammensetzungen, die die Serinproteasen enthalten.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde, die mit komplementären DNA-Sequenzen in den genomischen oder cDNA-Klonen der hierin offenbarten Serinproteasen hybridisiert. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die bei der Sicherstellung der Expression einer Serinprotease, die aus Kulturmedien isoliert worden ist, die einen Stamm von Tritirachium album Limber (ATCC 22563) enthalten, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle brauchbar sind, und das Verfahren zur Isolierung solcher Proteasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine gereinigte und isolierte Serinprotease, die die Strukturkonformation (d. h. die kontinuierliche Sequenz von Aminosäureresten) einer Serinprotease besitzt, die aus einer Kultur von Tritirachium album Limber Stamm ATCC 22563 isoliert worden ist und dadurch gekennzeichnet ist, daß sie das Produkt prokaryontischer oder eukaryontischer Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Serinprotease zur Verfügung, die die Strukturkonformation einer Serinprotease besitzt, die aus einer Kultur von Tritirachium album Limber Stamm ATCC 22563 isoliert worden ist, wobei das Verfahren umfaßt, daß prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die mit einem DNA-Vektor transformiert oder transfiziert worden sind, der eine DNA-Sequenz einschließt, die für die Sicherstellung der Expression der gewünschten Serinprotease in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle brauchbar ist, unter geeigneten Nährstoffbedingungen gezüchtet und die gewünschte Serinprotease der Expression von DNA-Sequenzen in besagtem Vektor isoliert wird.
Auch werden hierin Oligonucleotid-Sonden zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, mit einer DNA-Sequenz zu hybridisieren, die zur Expression einer Serinprotease mit der Strukturkonformation einer Serinprotease, die aus Kulturmedien von Tritirachium album Limber Stamm ATCC 22563 isoliert worden ist, besitzt, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle in der Lage ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt die Nucleotidsequenz des genomischen Klons für Protease TW7 dar;
Fig. 2 stellt die Nucleotidsequenz des cDNA-Klons für Protease TW7 dar;
Fig. 3 stellt die Nucleotidsequenz des codierenden Stranges dar, korreliert mit der Aminosäuresequenz der Protease TW7;
Fig. 4 stellt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von Protease TW7 mit denjenigen von Proteinase K, Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY und Thermitase dar;
Fig. 5 stellt die pH-Profile von Protease TW7 dar;
Fig. 6 stellt die Temperaturprofile der Protease TW7 dar;
Fig. 7 stellt die Nucleotidsequenz des cDNA-Klons für Protease TW3 dar;
Fig. 8 stellt die Nucleotidsequenz des codierenden Stranges, korreliert mit der Aminosäuresequenz der Protease TW3 dar;
Fig. 9 stellt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von Protease TW3 mit denjenigen von Proteinase K, Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY und Thermitase dar;
Fig. 10 stellt die pH-Profile von Protease TW3 dar;
Fig. 11 stellt die Temperaturprofile der Protease TW3 dar; und
Fig. 12 stellt ein Fließdiagramm dar, das die Komponenten veranschaulicht, die bei der Konstruktion von pCFM 1156 TW7 verwendet wurden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Weil T. album Limber ein langsam wachsender Pilz ist, der Mengen von Proteasen nur auf niedrigem Niveau produzieren kann, ist die Produktion von Proteinase K oder allen anderen Subtilisin-ähnlichen Enzymen in großen kommerziellen Mengen durch Fermentation des Pilzes nicht praktikabel. Zusätzlich sind das Wachstum des Pilzes T. album Limber sowie die Produktion von Proteasen langsam, was die Kommerzialisierung eines Subtilisin-ähnlichen Enzyms unwirtschaftlich macht. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Isolierung eines Gens, das die neuartigen Serinproteasen der vorliegenden Erfindung codiert, aus T. album Limber und die Klonierung und Expression solch eines Gens in einem geeigneten Mikroorganismus. Das Gen wurde unter Verwendung eines Desoxyribonucleotidoligomers isoliert, das mit einem Gen hybridisiert, das eine DNA-Sequenz aufweist, die die Aminosäurereste um den aktiven Serinrest herum codiert. Unter Verwendung dieses Ansatzes ist mehr als ein Gen aus der genomischen Bibliothek isoliert worden. Dies legt die Produktion von mehr als einer Serinprotease aus T. album Limber nahe. Es wurde festgestellt, daß die Aminosäuresequenzen der Aminotermini der Proteasen unterschiedlich waren. Die neuartigen Proteasen, Protease TW7 und Protease TW3, wurden isoliert und charakterisiert.
Das Gen, das für Protease TW7 codiert, wurde aus einer genomischen Bibliothek isoliert. Insbesondere umfaßt die Isolierung von Subtilisin-ähnlichen Genen aus der genomischen Bibliothek von T. album (1) die Konstruktion einer Bibliothek aus der ge-nomischen DNA von T. album Limber in einem pBR322-Plasmid; (2) das Screening der genomischen Bibliothek mit einer markierten Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch mit Subtilisin-ähnlichen Genen hybridisiert; (3) die Restriktionsenzymanalyse positiver Klone, gefolgt von der Southern-blot-Hybridisierung mit verschiedenen Restriktionsfragmenten zur Identifizierung von Klonen, die das vollständige Gen tragen; (4) die Subklonierung restriktiver Fragmente, die das vollständige Gen tragen, in Bakteriophage M13 zur DNA-Sequenzanalyse; (5) die Konstruktion von Oligonucleotid-Primern auf der Basis partieller DNA-Sequenzdaten, um die DNA-Sequenzierung beider Stränge des Gens zu vervollständigen. Die Sequenzierung beider Stränge des genomischen Gens zeigte das Vorliegen von zwei Introns. Um Gene, die Introns enthalten, in Mikroorganismen zu exprimieren, denen Spleiß-Enzyme fehlen, z. B. B. subtilis, E. coli, etc., ist es erforderlich, das Gen zu rekonstruieren (d. h. unter Verwendung von in-vitro- Spleißen) oder das Gen aus einer cDNA-Bibliothek zu gewinnen. Die Gene, die für Protease TW7 und Protease TW3 codieren, wurden aus einer cDNA-Bibliothek isoliert. Die Isolierung von Subtilisin-Genen aus der cDNA-Bibliothek von T. album Limber umfaßt (1) die Isolierung von Gesamt-RNA aus T. album Limber; (2) die Fraktionierung von RNA auf einer Oligonucleotid-dT-Cellulose-Säule und die Isolierung von polyadenylierter mRNA-Fraktion; (3) die Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde für Northern-blot-Analyse, um das Vorliegen von Subtilisin-ähnlicher mRNA zu bestätigen; (4) die cDNA-Synthese und Konstruktion einer cDNA-Bibliothek in einem von pBR322 abgeleiteten Plasmid; (5) das Screening der cDNA Bibliothek mit einer mit ³²P markierten Oligonucleotid-Sonde, die in Schritt 3 verwendet wurde; (6) die Isolierung und Restriktionsanalyse positiver cDNA-Klone; (7) die Subklonierung von Restriktionsfragmenten aus positiven cDNA-Klonen, die die vollständige das Protein codierende Sequenz tragen, in Bakteriophage M13 zur DNA-Sequenzierung; (8) die Verwendung von Oligonucleotid-Primern, um die DNA-Sequenzierung beider Stränge des Gens zu vervollständigen.
Gemäß den obigen Verfahren sind zwei cDNA-Gene identifiziert worden, deren Aminosäuresequenzen, abgeleitet von den DNA-Sequenzen, zeigten, daß ihre Produkte Subtilisin-ähnliche Enzyme sind. Eines der Genprodukte besitzt die Aminosäuresequenz, die in Fig. 3 dargestellt ist, und wurde Protease TW7 genannt. Protease TW7 zeigt ungefähr 53% Aminosäuresequenz-Homologie mit Proteinase K aus T. album Limber. Die mögliche Aminosäuresequenz von Protease TW7 zeigte, daß, im Gegensatz zu Proteinase K, diese Protease eine netto negative Ladung besitzt und daher von den anderen Proteasen unter Verwendung von DEAE-Sepharose- oder DEAE-Cellulose-Chromatographie getrennt werden kann. Das zweite der möglichen Gen-Produkte wurde Protease TW3 genannt. Der Grad der Aminosäuresequenz-Homologie von dieser Protease und Proteinase K aus T. album Limber betrug ungefähr 90%. Die mögliche Aminosäuresequenz von Protease TW3 zeigte, daß das Enzym eine netto positive Ladung besitzt und daher von den anderen Proteasen durch CM-Cellulose-Chromatographie getrennt werden kann.
Die Serinproteasen der vorliegenden Erfindung wurden aus der Kulturbrühe von T. album Limber Stamm (CBS 348.55) ATCC Deposit No. 22563 wie folgt isoliert:
Der besondere T. album-Pilzstamm (ATCC 22563) wurde in Medien angezogen, die nur Proteine enthielten, wie Stickstoffquellen, z. B. Magermilch, Rinderserumalbumin oder Sojamehl. Die Kulturmedien wurden unter Verwendung von Azocasein als dem Substrat auf proteolytische Aktivität getestet. Wenn die proteolytische Aktivität ein Plateau erreichte oder abzunehmen begann, wurde die Kulturbrühe durch Zentrifugation von den Pilzmycelen abgetrennt. Proteine im Überstand wurden unter Verwendung von Ammoniumsulfat ausgefällt. Der Niederschlag wurde in 20 mM Natriumphosphat-Puffer bei pH 6,0 gelöst und die Lösung wurde gegen denselben Puffer dialysiert. Die Lösung wurde durch eine Säule aus CM-52 (Whatman) hindurchgegeben, um Proteinase K-ähnliche Enzyme abzufangen, und dann durch eine DE-52(Whatman)-Säule hindurchgegeben. Proteinase TW7 wurde aus der DE-52-Säule mit 100 mM NaCl in 20 mM Natriumphosphat bei pH 6,0 eluiert. Sie wurde gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Protease TW3 wurde an CM-52 gebunden, von dem sie mit 200 mM NaCl in 20 mM Natriumphosphat bei pH 6,0 eluiert wurde.
Die Reinigungsmittelkompatibilitätseigenschaften der Serinproteasen der vorliegenden Erfindung sind charakterisiert worden. Wie in den Fig. 5 und 10 dargestellt, sind Protease TW7 und Protease TW3 über einen breiten pH-Bereich aktiv. Obgleich die maximale Aktivität ungefähr bei pH 10 auftritt, besitzt Protease TW7 beträchtliche Aktivität im pH-Bereich 9 bis 13. Zusätzlich behält Protease TW7 wenigstens 45% ihrer maximalen Aktivität bei Vorliegen in einem Puffer mit pH 6,0 bei. Wie in Fig. 6 dargestellt, besitzt Protease TW7 enzymatische Aktivität über einen breiten Temperaturbereich. Die maximale Aktivität liegt zwischen 60-65ºC, obgleich bei 20ºC Protease TW7 wenigstens 25% ihrer ursprünglichen Aktivität beibehält. Protease TW7 ist bei 52ºC in Puffern mit verschiedenen pH-Werten stabil. Im Anschluß an eine Inkubation für einen Zeitraum von einer Stunde bei pH 8 und pH 10,3 werden ungefähr 100% der ursprünglichen Aktivität beibehalten, während unter ähnlichen Bedingungen ein kommerzielles Subtilisin nur bis zu 30% seiner ursprünglichen Aktivität beibehielt. In der Gegenwart von 0,5% SDS bei pH 8,0 behielt Protease TW7 100% ihrer Aktivität nach einer Stunde Inkubation bei 52ºC bei, während das kommerzielle Subtilisin nur etwa 5-6% seiner ursprünglichen Aktivität beibehielt.
Wie veranschaulicht in Fig. 10, ist Protease TW3 auch über einen breiten pH-Bereich aktiv. Zum Beispiel besitzt Protease TW3 seine höchste enzymatische Aktivität bei pH 9, obgleich beträchtliche Aktivität in einem pH-Bereich von 7 bis 10 gegeben ist. Wie dargestellt in Fig. 11, ist auch der Temperaturbereich der enzymatischen Aktivität von Protease TW3 breit. Die maximale Aktivität liegt zwischen 55-65ºC, obgleich Protease TW3 bei 25ºC wenigstens 320a ihrer Aktivität beibehält. Dies ermöglicht, daß Protease TW3 in einem breiten Bereich von Waschtemperaturen aktiv ist. Zusätzlich ist Protease TW3 bei 50ºC in Puffern mit verschiedenen pH-Werten sehr stabil. Im Anschluß an eine Stunde Inkubation bei pH 4,0, 8 und 10,0 werden 50-90% der ursprünglichen Aktivität von Protease TW3 beibehalten, während unter ähnlichen Bedingungen ein kommerzielles Subtilisin nur minimale Aktivität beibehält.
Die Stabilität der Serinproteasen der vorliegenden Erfindung sind in verschiedenen Waschmittelformulierungen bewertet worden. Jedes endogene Enzym, das vorlag, wurde vor der Bewertung durch Erhitzen der Waschmittelformulierung bei 65ºC für eine Stunde inaktiviert.
Zusätzlich zum Enzym wird die kommerzielle Waschpulverzusammensetzung der vorliegenden Erfindung im allgemeinen enthalten:
(a) Wenigstens ein Tensid, das anionisch, nicht-ionisch oder amphoter sein kann, oder eine wasserlösliche Seife. Typischerweise wird ein anionisches Tensid (z. B. ein lineares Alkylarylsulfonat) in Vermischung mit einem nicht-ionischen Tensid (z. B. einem Alkylphenylpolyglykolether) in Mengen von 5-30 bzw. 1-5 Gewichtsprozent der Waschmittelzusammensetzung verwendet.
(b) Einen oder mehrere Builder, vorzugsweise mit einer gleichzeitigen Maskierungsfunktion. Natriumtripolyphosphat, Natriumcitrat, Natriumsilicat und Zeolithe sind Beispiele für solche Verbindungen, die üblicherweise von 10 bis 70 Gewichtsprozent der Waschmittelzusammensetzung ausmachen.
(c) Ein Bleichmittel, vorzugsweise eine Peroxyverbindung, wie etwa Natriumperborat, typischerweise eingearbeitet in einer Menge bis zu 30 Gewichtsprozent der Zusammensetzung.
(d) Hilfsstoffe, wie etwa Carboxymethylcellulose, optische Aufheller und Duftstoffe. Falls erforderlich, wird ein Mittel zur pH-Einstellung zugegeben, um einen pH in der Waschlauge im Bereich von 8,0 bis 10,5 zu ergeben.
Die teilchenförmige Proteasezubereitung der Erfindung wird in einer Menge zugegeben, die so berechnet ist, daß sich eine Proteaseaktivität von wenigstens 0,1 Anson-Einheiten (AU, siehe unten), vorzugsweise 0,5-2,5 AU pro 100 g Waschmittelzusammensetzung ergibt. Falls erforderlich kann der Rest bis 100% mit einem anorganischen Füllstoff, vorzugsweise Natriumsulfat, aufgefüllt werden.
Flüssige Waschmittelzusammensetzungen können aus Enzymaufschlämmungen, vorzugsweise in nicht-wäßrigen Medien hergestellt werden. Typischerweise können solche Aufschlämmungen aus einer Suspension von fein vermahlenem Protease-Konzentrat in einem flüssigen nicht-ionischen Tensid, zum Beispiel Tergitol 15 S 9, oder einer Mischung solcher Tenside bestehen. Üblicherweise wird die Aufschlämmung auch einen oder mehrere anorganische Füllstoffe, wie etwa fein vermahlenes Natriumchlorid enthalten, fakultativ in Vermischung mit einem Suspensionsstabilisator, zum Beispiel pyrogene Kieselsäure (Aerosil 200). Tergitol und Aerosil sind Warenzeichen.
Die Protease-Aufschlämmung der Erfindung wird in einer Menge zugegeben, die so berechnet ist, daß sich eine Proteaseaktivität von wenigstens 0,1 AU, vorzugsweise 0,5-2,5 AU pro 100 g flüssiger Waschmittelzusammensetzung ergibt.
Die Waschmittelzusammensetzungen können in der üblichen Weise hergestellt werden, zum Beispiel indem die Komponenten miteinander vermischt werden. Alternativ kann eine Vormischung hergestellt werden, die dann mit den übrigen Inhaltsstoffen vermischt wird.
Die folgenden Beispiele werden weiter dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen, obgleich man verstehen wird, daß die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele beschränkt ist.
Wegen der beschriebenen guten Stabilitäts- und Aktivitätseigenschaften kann das proteolytische Enzym gemäß der Erfindung in allen Gebieten verwendet werden, in denen proteolytische Enzyme im allgemeinen verwendet werden. Insbesondere kann es für Waschmittel und Reinigungsmittel oder Fleckentferner, als ein Enthaarungsmittel beim Gerben und auch in der Nahrungsmittelindustrie zur Herstellung von Proteinhydrolysaten und in der Serologie zum Nachweis unvollständiger Antikörper verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft bei der Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie und in der Serologie, daß das Enzym gemäß der Erfindung eine solch hervorragende Stabilität in der festen und gelösten Form besitzt, daß physiologisch annehmbare Mengen von Calcium-Ionen nicht erforderlich sein müssen, um das Enzym in wäßrigen Lösungen zu stabilisieren, im Gegensatz zu denjenigen anderer Enzymzubereitungen.

Beispiel 1

Produktion von Serinprotease aus Tritirachium album Limber

Der Pilz, Tritirachium album Limber (CBS348.55, ATCC 22563) wurde von der American Type Culture Collection, 912301 Parklawn Dr., Rockville, MD, erhalten. Der Pilz gehört zur Familie Moniliaceae (Limber, 1940, Mycologia, 32, 23-30). Typische Merkmale des Pilzes schließen durchscheinendes Mycel, kaum verzweigte durchscheinende Conidien, rein weiße dichte Myceldecke, die eine niedrige Kuppel oder Halbkugel bildet, ein. Gemäß dem Centralbureau voor Schimmelcultures (Oosterstraat 1, Baarn, P.O. Box 273, 3740 Ag Baarn, Niederlande, ref. MAAS/tvs/714, datiert 4. Oktober 1985) wurde der Stamm ursprünglich von abgestorbener Haut isoliert. Dieser Stamm ist nicht derselbe Stamm (CBS 747.69), aus dem Proteinase K isoliert wurde.
Tritirachium album wurde auf Malz-Pepton-Agar-Platten vermehrt, die 3% Malzextrakt, 0,3% Caseinpepton und 2% Bactoagar enthielten. Man ließ den Pilz bei Raumtemperatur für 7-8 Tage sporulieren. Sporen wurden in 15-20 ml sterilem destilliertem Wasser gesammelt und wurden vor dem Einimpfen in ein flüssiges Medium für wenigstens 30 min bei Raumtemperatur gehalten.
Die Zusammensetzung des flüssigen Mediums für die Produktion von Proteasen war entweder 2% Magermilch und 0,17% Hefestickstoffbasis (Cat. Nr. 0335-15, erhalten von Difco Laboratories, Detroit, MI) oder 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1% Glucose und 0,17% Hefestickstoffbasis. Das BSA enthaltende Medium wurde sterilisiert, indem es durch einen 0,45 µ-Filter hindurchgegeben wurde, während das Magermilch enthaltende Medium für 30 Minuten autoklaviert wurde.
500 ml von jedem Medium wurden mit der Sporen-Suspension inokuliert und die resultierende Mischung wurde gerüttelt. Vier bis fünf Tropfen Antischaummittel wurden verwendet, um das Schäumen während des Rüttelns zu unterdrücken. Die Produktion extramyceliärer Proteasen wurden unter Verwendung von entweder N-Succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanin-nitroanilid (Delmar et al., Anal Biochem. 99, 316) oder Azocasein (Charney, J. et al., 1947. J. Biol. Chem. 177, 501) als Substrat überwacht. Es wurde festgestellt, daß die Produktion von Protease abhängig vom Medium war. Im Magermilch-Medium wurde die größte Proteasemenge innerhalb von 8-9 Tagen Kultur produziert, während im BSA-Medium die maximale Produktion von Protease erst nach etwa 14-15 Tagen Kultur eintrat. In beiden Medien nahm die Proteaseaktivität nach Erreichen des maximalen Produktionsniveaus ab.

Beispiel 2

Planung und Synthese einer Sonde zum Nachweis von Subtilisin-ähnlichen Genen

Subtilisin-ähnliche Enzyme teilen einen hohen Grad an Sequenzhomologie um ihren aktiven Serinrest herum. Serin an Position 221 ist bereits als das reaktive Serin in Serinproteasen identifiziert worden. Überdies beruht die Zuordnung einer Serinprotease zur Subtilisin-Familie auf der Aminosäuresequenz
GLY-THR-SER-MET-ALA
Die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen mehrerer Subtilisinähnlicher Enzyme zeigte, daß die Homologie sich über diese Sequenz hinaus wie folgt erstreckt:
(Stahl, M.L. et al., 1984, aaO.; Wells, J.A. et al., 1983, aaO.; Vasantha, N. et al., 1984, aaO.; Svendsen, I. et al., 1986, FEBS Letters 196, 228-232; Koide, Y. et al., 1986, J. Bacteriol. 167, 110-116; Kaneda, M. et al., 1984; J. Biochem. 95, 825-825; Jany, K.-D. et al., 1985, Biol. Chem. Hoppe Seyler 366, 485-492). Die Analyse der DNA-Sequenzen, die die Aminosäuren in Subtilisin codieren, zeigte auch einen hohen Konservationsgrad. Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde folgendes Desoxyoligonucleotid (41-mer) zum Sondieren von Genen, die ähnliche codierende Sequenzen enthalten, geplant:
Die Sonde wurde unter Verwendung der Phosphotriester-Methode von Beaucage et al. (1981, Tetrahedron Letters 22, 1859-1862) synthetisiert.
Diese Oligonucleotidsonde hybridisiert mit komplementären DNA-Sequenzen im genomischen Klon oder cDNA-Klon der Serinprotease in einem Temperaturbereich von 50-78ºC in Abhängigkeit von der Anzahl der Fehlpaarungen. Wenn man diese Sonde verwendet, ist es daher notwendig, für eine angemessene Stringenz Hybridisierung und Waschen bei mehreren Temperaturen und Salzkonzentrationen einzuschließen. Das 41-mere Oligonucleotid kann zur Sondierung von Genen verwendet werden, die Subtilisin-ähnliche Enzyme in genomischen cDNA-Bibliotheken codieren sowie mRNA, die für Subtilisin-ähnliche Enzyme codiert.

Beispiel 3

Konstruktion der genomischen Bibliothek und Isolierung des Gens für Protease TW7

Wie bereits beschrieben, wurden Mycele auf Miracloth im Anschluß an 9-15 Tage Pilzwachstum gesammelt. Die Mycele wurden gewogen und in Trockeneis und Isopropanol rasch eingefroren. Zu 10 g gefrorenem Mycel wurden 10 g autoklaviertes Aluminiumoxid und 20 ml Lyse-Puffer (4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,15 M NaCl) hinzugegeben. Die resultierende Mischung wurde für 5 Minuten in einem sterilen Mörser unter Verwendung eines Stößels zermahlen. Weitere 20 ml Puffer und 40 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurden zur zermahlenen Mischung zugegeben und das Lysat wurde für 20-30 min bei Raumtemperatur geschüttelt und für 10 min zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert. Ribonuclease A und Proteinase K wurden zum Lysat zugegeben, um RNA bzw. Protein aus der DNA-Zubereitung zu entfernen. Ethanol wurde zum Lysat zugegeben und DNA wurde aufgewickelt, in TE (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) suspendiert und bei 4ºC aufbewahrt.
Eine vollständige Verdauung der genomischen DNA, die aus T. album isoliert worden war, wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI durchgeführt, um eine Bibliothek in Plasmidvektor pBR322 zu konstruieren. Der Vektor pBR322 wurde ebenfalls mit denselben Enzymen verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Im Anschluß an die Ligation der T. album-DNA-Fragmente mit dem pBR322-Vektor wurde eine Transformation kompetenter HB101-Zellen gemäß den Verfahren von Mandel et al., 1970, J. Mol. Biol. 53, 159-162, durchgeführt. Ampicillin-resistente Kolonien wurden auf das Vorhandensein von Subtilisin-ähnlichen Genen unter Verwendung der 41-meren Oligonucleotidsonde von Beispiel 2 sondiert. Abheben der Kolonien und Hybridisierung wurde gemäß den Verfahren von Grunstein et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961-3965 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine Gensiebmembran (NEF-972, New England Nuclear) anstelle von Nitrocellulose verwendet wurde. Filter wurden zur DNA-Denaturierung in situ weiterverarbeitet, gefolgt von Neutralisation, Trocknen und Backen bei 80ºC im Vacuum. Vorhybridisierung wurde bei 55ºC für 3-4 Stunden in 5X Denhardt-Lösung, die 200 µg tRNA/ml enthielt, durchgeführt. Hybridisierung wurde bei 55ºC für 20 Stunden in 5X SSC, 1% SDS, 1X Denhardt-Lösung und 200 µg tRNA/ml durchgeführt. Die Filter wurden unter stringenten Bedingungen, 2X SSC bei 55ºC, gewaschen, bis die Hintergrundradioaktivität vernachlässigbar war. Eine zweite Screening-Runde von möglichen positiven Kolonien mit der 41-meren Oligonucleotidsonde wurde durchgeführt, indem die möglichen positiven Klone erneut auf L-Agar-Platten, die 50 µg Ampicillin/ml enthielten, inokuliert und die Screening-Schritte, die oben beschrieben sind, wiederholt wurden. Im Anschluß an die zweite Screening-Runde wurde nur ein positiver Klon erhalten. Die positive Kolonie wurde in Luria-Brühe, die 50 µg Ampicillin/ml enthielt, kultiviert. Aus der Übernacht-Kultur wurde ein Plasmid, welches das Gen für Protease TW7 enthielt, unter Verwendung der Verfahren isoliert, die von Birnboim, Methods in Enzymol. 100, 243-154, (1983), beschrieben sind. Für die Zwecke des Southern-blottings und der extensiven Restriktionskartierung wurde das Plasmid unter Verwendung von Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten und Ultrazentrifugation gereinigt. Es wurde festgestellt, daß ein 2,8 kb großes Fragment von T. album-DNA das Gen für Protease TW7 enthielt.
Restriktionsfragmente dieses Plasmids, erzeugt durch verschiedene Enzyme, wurden auf Agarosegelen mit Elektrophorese aufgelöst, auf Gene-Screen-Plus®-Membranen überführt, dann mit der 41-meren Oligonucleotidsonde von Beispiel 2 untersucht, um das Fragment zu identifizieren, das das vollständige Gen für Protease TW7 enthielt. Hieraus wurde bestimmt, daß ein EcoRI-ClaI-Fragment, das 1056 Nucleotide enthielt, das Gen enthielt. Dieses Fragment wurde anschließend in der Bacteriophage M13mp18 und M13mp19 zur Einzelstrang-DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Universal-Primers (Messings, J. 1983; Methods in Enzymol. 101C, 20-75) subkloniert. Das Didesoxykettenterminationsverfahren, das beschrieben ist von Sanger, F. et al., (1977), Proc. National Acad. Sci. USA, 74, 5463, wurde für die DNA-Sequenzierung verwendet. Nachdem erst einmal ein Teil der DNA-Sequenz erhalten wurde, wurden zusätzliche Oligonucleotid-Primer verwendet, um die Sequenzierung der zwei Stränge des Gens zu vervollständigen. Die so charakterisierte Nucleotidsequenz des Gens ist in Fig. 1 dargestellt. Das Gen enthält 1056 Nucleotide und ist definiert durch eine Stelle für das Restriktionsenzym EcoRI am 5'-Ende und für ClaI am 3'-Ende. Die Restriktionskartierung des Fragments zeigt das Vorhandensein singulärer Stellen für die Restriktionsenzyme HindIII, KpnI und BglI. Die mögliche Protease, die von diesem Gen codiert wird, wurde Protease TW7 genannt.
Das isolierte Gen für Protease TW7 codierte die vollständige Aminosäuresequenz des reifen Proteins und 12 Aminosäuren einer möglichen "Pro"-Region. Das Gen, das reife Protease TW7 codiert, ist von 2 Introns unterbrochen. Diese Introns sind 54 und 84 Nucleotide lang. Die genaue Position der Introns wurde durch Vergleich der Nucleotidsequenzen der genomischen DNA mit derjenigen der cDNA für Protease TW7 bestimmt. Die zwei Introns beginnen mit der Nucleotidsequenz GT und enden mit der Sequenz AG. TAG wird als das Terminationscodon verwendet, dem ein weiteres TAG in einem Interval von 8 Codons folgt. Die mögliche Verarbeitung von mRNA tritt zwischen Sequenzen ein, die für Serin (die letzte Aminosäure der möglichen Präprosequenz) und Alanin (die erste Aminosäure) der reifen Protease TW7 codieren.

Beispiel 4

Konstruktion der cDNA-Bibliothek und Isolierung des cDNA-Gens für Protease TW7

Obgleich das vollständige Gen, das die reife Protease TW7 codiert, aus der genomischen Bibliothek erhalten wurde, kann dieses Gen nicht für die Expression des proteolytischen Enzyms in Mikroorganismen wie etwa B. subtilis und E. coli verwendet werden, weil diesen Organismen die Enzyme zur Entfernung der Intron-Sequenzen aus der naszierenden RNA, um die funktionelle Boten-RNA zu bilden, fehlen. Die Isolierung von funktioneller Boten-RNA aus dem Pilz T. album Limber wurde versucht, um ein komplementäres DNA-Gen zu erhalten, das in für die Produktion von Protease TW7 geeigneten Mikroorganismen exprimiert werden kann.
T. album Limber wurde in dem Magermilch-Medium, das in Beispiel 1 beschrieben ist, für 9 Tage angezogen, woraufhin Mycele auf einer Schicht Miracloth gesammelt wurden. Zu etwa 20 g frisch geernteten Mycelen wurden 100 g steriles Aluminiumoxid, 45 ml Lyse-Puffer (4% SDS, 1 mM EDTA, 100 mM Na-Acetat, pH 5,0) und 20 ml Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) zugegeben, dann wurden die Mycele in einem sterilen Mörser mit einem Stößel für 20 min zermahlen. Nach Zugabe von 50 ml Puffer und 50 ml Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol wurde das Lysat bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerüttelt, bevor es bei 5000 x g für 15 Minuten zentrifugiert wurde. Im Anschluß an eine Phenol:Chloroform-Extraktion wurden 0,1 Volumenteile 3M Ammoniumacetat und 2,5 Volumenteile Ethanol zugegeben und die Nucleinsäuren bei -20ºC über Nacht ausfallen gelassen. Die polyadenylierte RNA-Spezies wurde unter Verwendung von oligo-dT-Cellulose gemäß den von Maniatis et al. (1982, aaO.) beschriebenen Verfahren isoliert. Um einen RNA-Abbau während der Manipulation der Proben zu verhindern, wurden alle Puffer mit 0,1% Diethylpyrocarbonat behandelt und anschließend für 60 Minuten autoklaviert. Die isolierte mRNA-Population wurde mit 2,5 Volumenteilen Ethanol im Anschluß an die Zugabe von 0,1 Volumenteilen 3M Ammoniumacetat ausgefällt.
Northern-blot-Analyse der mRNA-Population wurden unter Befolgung des Glyoxal-DMSO-Verfahrens durchgeführt, das von Maniatis et al. (1982) beschrieben worden ist. Die mRNA-Spezies wurden auf einem 1,1% Agarosegel getrennt, auf eine Gen-Screen-Plus-Membran (NEF-976, New England Nuclear) geblottet und mit einer kinasierten Oligomersonde hybridisiert, die den Aminoterminus von Protease TW7 darstellt und die Nukleotidsequenz besitzt:
5, TGGGGCGTCTTCCTGGGTGGC 3'
Die Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 55ºC durchgeführt, gefolgt von stringentem Waschen bei 55ºC und 60ºC. Als man den Filter einem Röntgenfilm aussetzte, wurde bei einer einzelnen mRNA-Spezies mit etwa 2000 Nucleotidbasen Länge in der mRNA-Population identifiziert, daß sie die Sequenz enthielt, die für Protease TW7 codiert.
Doppelsträngige cDNA wurde auf polyA+-mRNA-Matrize unter Befolgung der Verfahren synthetisiert, die von Okayama et al., (1982), Mol. Cell Biol., 2, 161-170, beschrieben worden sind. Kompetente E. coli-HB101-Zellen wurden mit den Plasmidvektoren transformiert, die die cDNA-Inserts enthielten (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). Transformierte Kolonien auf Nitrocellulosefiltern wurden auf einen zweiten Satz Nitrocellulosefilter replikaplattiert. Die Master- und die Replikafilter wurden bei 37ºC auf L-Agar-Platten inkubiert, die 50 µg Ampicillin/ml enthielten, bis die Kolonien heranwuchsen (im allgemeinen 2-3 Stunden für Masterplatten und 5-6 Stunden für Replikas). Masterfilter wurden bei 4ºC aufbewahrt, während die Replikafilter über Nacht auf L-Agar-Platten, die 100 µg Chloramphenicol/ml enthielten, zur Plasmidamplifikation inkubiert wurden. Die Replikafilter wurden weiterverarbeitet zur DNA-Denaturierung, Renaturierung, Backen, Vorhybridisierung, gefolgt von Hybridisierung mit der oligomeren Sonde, wie verwendet für den mRNA-Nachweis, für Northern-blot. Im Anschluß an eine zweite Screening-Reihe, in der die isolierten einzelnen positiven Kolonien identifiziert wurden, wurde Plasmid-DNA gemäß dem Verfahren von Birnboim, (1983, aaO.) hergestellt. Nucleotidsequenzierung der positiven Klone wurde im wesentlichen durchgeführt, wie für den genomischen Klon gemäß Beispiel 3 beschrieben.

Beispiel 5

Charakterisierung des cDNA-Gens für Protease TW7

Die Nucleotidsequenz des cDNA-Klons ist aus einzelsträngiger und doppelsträngiger DNA bestimmt worden. Fig. 2 stellt die Nucleotidsequenz der cDNA für Protease TW7 dar. Die Sequenz ist 1016 Basen lang und endet mit einem polyA-Schwanz. Die Restriktionskarte des Klons zeigt das Vorhandensein einer EcoRI-Stelle proximal zum 5'-Ende der Sequenz, die für die reife, sekretierte Form des Gen-Produktes codiert.
Die Nucleotidsequenz des cDNA-Klons für das Protease-TW7-Gen ist identisch zum genomischen Klon, mit Ausnahme des Fehlens von Introns im cDNA-Klon.

Beispiel 6

Konstruktion der cDNA-Bibliothek und Isolierung des cDNA-Gens für Protease TW3

Die Isolation von funktionaler Boten-RNA aus dem Pilz T. album wurde versucht, um ein komplementäres DNA-Gen zu erhalten, das schließlich in industriellen Mikroorganismen für die Produktion von Protease TW3 im Großmaßstab exprimiert werden könnte.
T. album wurde in einem BSA-Medium für 15 Tage angezogen, woraufhin die Mycele auf einer Schicht Miracloth gesammelt wurden. Zu etwa 20 g frisch geernteten Mycelen wurden 100 g steriles Aluminiumoxid und 45 ml Lyse-Puffer (4% SDS, 1 mM EDTA, 100 mM Na-Acetat, pH 5,0), 20 ml Phenol:Chloroform: Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) zugegeben, anschließend wurden die Mycele in einen sterilen Mörser mit einem Stößel für 20 min zermahlen. Im Anschluß an die Zugabe von 50 ml Puffer und 50 ml Phenol: Chloroform:Isoamylalkohol wurde das Lysat bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerüttelt, bevor es bei 5000 x g für 15 Minuten zentrifugiert wurde. Im Anschluß an eine Extraktion mit Phenol:Chloroform wurden 0,1 Volumenteile 3M Ammoniumacetat und 2,5 Volumenteile Ethanol zugegeben und die Nucleinsäuren bei -20ºC über Nacht ausfallen gelassen.
Die Isolierung von polyadenylierten mRNA-Spezies wurde unter Verwendung von oligo-dT-Cellulose gemäß den von Maniatis et al. (1982, aaO.) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die isolierte mRNA-Population wurde mit 2,5 Volumenteilen Ethanol im Anschluß an die Zugabe von 0,1 Volumenteilen 3M Ammoniumacetat ausgefällt.
Northern-blot-Analyse der mRNA-Population wurde unter Befolgung des Glyoxal-DMSO-Verfahrens, das von Maniatis et al. (1982) beschrieben worden ist, durchgeführt. mRNA-Spezies wurden auf einem 1,1% Agarosegel getrennt, auf eine Gene-Screen-Plus®-Membran (NEN-976, New England Nuclear) geblottet und mit kinasierten Oligomersonden hybridisiert, die in Beispiel 2 hergestellt worden sind. Die Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 55ºC durchgeführt, gefolgt von stringentem Waschen bei 55ºC und 60ºC. Als der Filter einem Röntgenfilm ausgesetzt wurde, wurde bei einer einzigen mRNA mit etwa 2000 Nukleotidbasen Länge in der mRNA-Population identifiziert, daß sie die Sequenz enthielt, die für Protease TW3 codiert.
Um RNA-Abbau zu verhindern, wurden alle in diesen Beispielen verwendeten Puffer mit 0,1% Diethylpyrocarbonat behandelt und für 60 Minuten autoklaviert. Doppelsträngige cDNA wurde auf polyA+-mRNA-Matrize unter Befolgung des Verfahrens von Okayama et al. (1982) Mol. Cell Biol., 2, 161-170, synthetisiert. Kompetente E. coli-HB101-Zellen wurden mit den Plasmidvektoren transformiert, die die cDNA-Inserts enthielten (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). Transformierte Kolonien auf Nitrocellulosefiltern wurden auf einen zweiten Satz Nitrocellulosefilter replikaplattiert. Die Master- und Replikafilter wurden bei 37ºC auf L-Agar-Platten, die 50 µg Ampicillin/ml enthielten, inkubiert, bis die Kolonien heranwuchsen (im allgemeinen 2-3 Stunden für Masterplatten und 5-6 Stunden für Replikas). Masterfilter wurden bei 4ºC aufbewahrt, während die Replikafilter über Nacht auf L-Agar-Platten, die 100 µg Chloramphenicol/ml enthielten, zur Plasmidamplifikation inkubiert.
Replikafilter wurden behandelt zur DNA-Denaturierung, Renaturierung, Backen, Vorhybridisierung, gefolgt von Hybridisierung mit der oligomeren Sonde, die für den mRNA-Nachweis verwendet wird, für Northern-blot. Nach einer zweiten Screening-Reihe, in der die isolierten einzelnen positiven Kolonien identifiziert wurden, wurde Plasmid-DNA hergestellt (Birnboim, 1983, Methods in Enzymol. 101C, 20-75). Nukleotidsequenzierung der positiven Klone wurde wie folgt durchgeführt: Auf eine vollständige Restriktionsanalyse des Klons folgte die Subklonierung verschiedener Fragmente in M13mp18 und mp19 für Einzelstrang-DNA-Sequenzierung. Doppelstrangsequenzierung wurde unter Verwendung von sequenzspezifischen Primern durchgeführt. Das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren (Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Science USA, 74 : 5463) wurde zur DNA-Sequenzierung verwendet.

Beispiel 7

Charakterisierung des cDNA-Gens für Protease TW3

Ein cDNA-Klon über die gesamte Länge wurde für die Protease TW3 erhalten. Der Klon codiert für die reife Protease sowie für die mögliche Präproregion der Protease. Es gibt vier ATGs im offenen Leserahmen, der der Sequenz vorangeht, die für das reife Protein codiert. Höchstwahrscheinlich codiert der erste ATG für das anfängliche Methionin, da ihm ein Bereich folgt, der an hydrophoben Aminosäuren angereichert ist (Von He&ijlig;ne, G. 1986, Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690). Die mögliche Proregion besteht aus etwa 100 Aminosäuren, eine Situation, die sehr ähnlich zu der in Subtilisin ist (Stahl et al., 1984, aaO.).
Die Aminosäuresequenz des reifen Proteins bestimmt aus der Nucleotidsequenz, besitzt einen großen Prozentsatz an Homologie mit derjenigen von Proteinase K. Es gibt ungefähr 90% Homologie zwischen diesen zwei Proteasen. Es gibt bestimmte Positionen, in denen die Aminosäure derjenigen in Subtilisinen ähnelt, aber nicht zu Proteinase K. Zum Beispiel tritt in den Positionen 143 in allen Subtilisinen sowie in Protease TW3 ein Methioninrest auf, während in dieser Position in Proteinase K ein Leucinrest vorliegt. In ähnlicher Weise liegt in Position 219 in Protease TW3 und Subtilisinen ein Alaninrest vor, nicht aber in Proteinase K. Zusätzlich fehlt das Aminosäurefragment Ser-Thr- in Proteinase K, während es in allen anderen in Fig. 9 an Position 226 und 227 vorliegt.

Beispiel 8

Bestimmung der proteolytischen Aktivität

Die proteolytische Aktivität von Serinproteasen in den folgenden Beispielen wurde unter Verwendung von Azoalbumin als einem Substrat bestimmt. Aliquote (20 µl) Enzymlösung oder Enzympuffer (für Kontrollversuche) wurden mit 1 ml 0,6% Azoalbumin in 0,05 M Tris-HCl pH 8,2 (sofern nichts anderes erwähnt) vermischt und die Hydrolysereaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktion wurde nach 20 min durch Zugabe von 10% Trichloressigsäure (400 µl) abgebrochen. Das Hydrolysat wurde von ausgefälltem Protein durch Zentrifugation abgetrennt und seine optische Dichte bei 410 nm, verglichen mit dem Kontrollversuch, wurde gemessen.
Proteaseaktivität wurde ebenfalls unter Verwendung von Azocasein als dem Substrat untersucht. Zu einem Endvolumen von 500 µl wurden 20 µl Azocasein (5%ige Lösung in 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM CaCl&sub2;), 20 µl Enzym (1-10 µg) und 460 µl von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zugegeben. Die Proben wurden bei 37ºC für 30 min inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 500 µl 10%ige TCA zu den Proben zugegeben und die Proben wurden auf Eis für 15 min inkubiert. Nach Zentrifugation für 2 min wurden 800 µl Überstand zu einem Röhrchen zugegeben, das 200 µl 1,8 N NaOH enthielt. Die optische Dichte der Probe wurde dann bei 420 nm gegen den Kontrollversuch gemessen.

Beispiel 9

Isolierung und Reinigung von Protease TW7 aus der Kulturbrühe von Tritirachium album Limber

Protease TW7 wurde aus dem extrazellulären Medium der T. album-Kultur abgetrennt und gereinigt. Ein 0,5 l-Aliquot der T. album-Kulturbrühe, erhalten nach 15 Tagen Fermentation im BSA-Glucose-Medium, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde für 10 min zentrifugiert. Proteine im klaren Überstand wurden unter Verwendung von Ammoniumsulfat (180 g) ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Der Niederschlag wurde in 0,02 M Natriumphosphat, pH 6,0 (50 ml) suspendiert und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Proteine im Überstand wurden mit Aceton erneut ausgefällt (2,5 Volumenteile). Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und auf einem gesinterten Glastrichter gesammelt. Der Niederschlag wurde dann in Wasser (40 ml) gelöst und die resultierende Lösung wurde bei 4ºC gegen 0,02 M Natriumphosphat bei pH 6,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt und dann durch eine Säule (2,5 x 10 cm) aus Carboxylmethylcellulose (CM-52, Whatman) mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute hindurchgegeben, gefolgt von einem Waschen der Säule mit 0,02 M Natriumphosphat pH 6,0 (30 ml). Der Durchfluß und die Waschlösungen wurden vereinigt und die Proteine wurden durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Das Aceton-Pulver (185 mg) wurde in 0,02 M Natriumacetat pH 5,0 (2 ml) gelöst und auf eine Säule (2,5 x 90 cm) aus Sephadex-G-75-Molekularsieb geladen. Fraktionierung auf der Molekularsiebsäule wurde mit 0,02 M Natriumacetat pH 5,0 bei einem Durchfluß von 6 ml pro Stunde durchgeführt. Fraktionen von 2 ml wurden gesammelt und auf UV-Extinktion bei 275 nm überwacht. Von den drei größten Peaks, die aus der Säule eluiert wurden, zeigte nur einer proteolytische Aktivität bei der Hydrolyse des chromogenen Protein-Substrates Azoalbumin. Das Enzym in diesem Peak (zwischen 102-110 ml) wurde mit Aceton (2,5 Volumenteile) ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Der Niederschlag wurde in 2 mM Calciumacetat (20 ml) gelöst und die Lösung wurde bei 4ºC gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. SDS-PAGE der reduzierten Probe ergab Protease TW7 als eine hauptsächliche Bande (> 95%) mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 35.000 Daltons.

Beispiel 10

Aminoterminus-Analyse von Protease TW7

Protease TW7 wurde aus dem Kulturüberstand gereinigt, wie beschrieben in Beispiel 9. Das gereinigte Protein wurde dann mit PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) inaktiviert und unter Verwendung von HPLC weiter gereinigt. Der Aminoterminus wurde durch Rekonstitution das Proteins in 50%iger Trifluoressigsäure (TFA), die 1 mM PMSF enthielt, bestimmt. Automatisierter Gasphasen-Abbau nach Edman wurde für die Analyse des Aminoterminus durchgeführt und der Aminoterminus wurde als Ala-Thr-Gln-Glu-Asp-Ala-Pro-Trp-Leu-Ala-Arg-Ile-Ser-Ser bestimmt.

Beispiel 11

pH-Profil von Proteinase TW7

Das pH-Profil von Proteinase TW7 bei 25ºC wurde unter Verwendung von Azoalbumin als einem Substrat bestimmt. Substratlösungen, die 0,6% Azoalbumin in Natriumphosphat-Natriumborat-Puffern enthielten, die den pH-Bereich zwischen 5,0 und 12,75 abdeckten, wurden hergestellt. Zu den Azoalbumin-Lösungen wurden entweder 10 µl einer 1 mg/ml-Lösung Proteinase TW7 in Wasser oder 10 µl Wasser (Kontrollversuch) zugegeben und die proteolytische Aktivität jeder Lösung wurde bestimmt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Das pH-Profil von Proteinase TW7 ist in Fig. 5 dargestellt, in der der Prozentanteil der maximalen proteolytischen Aktivität gegen den pH aufgetragen worden ist. Der optimale pH-Bereich von Proteinase TW7 ist in einem pH-Bereich von 9 bis 11 bestimmt worden.

Beispiel 12

Temperaturprofil von Proteinase TW7

Das Temperaturprofil von Proteinase TW7 in 0,05 Natriumphosphat bei pH 8,5 wurde durch Messung der proteolytischen Aktivität über einen Temperaturbereich von zwischen 20ºC und 70ºC bestimmt. Aliquote (1 ml) 0,6% Azoalbumin in 0,05 M Natriumphosphat pH 8,5 wurden bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, und nach der Zugabe der Enzymlösung (20 µl von 0,5 mg Proteinase TW7 pro ml desselben Puffers) oder 20 µl Puffer (Kontrollversuch) ließ inan die Reaktion für 10 Min. fortschreiten und brach sie dann durch Zugabe von 10%iger Trichloressigsäure (400 µl) ab. Das Temperaturprofil von Proteinase TW7 ist in Fig. 6 dargestellt, in der der Prozentanteil der maximalen Enzymaktivität gegen die Temperatur aufgetragen ist. Wie in Fig. 6 veranschaulicht, liegt die bevorzugte Temperatur von Proteinase TW7 in einem Bereich zwischen 57ºC bis 62ºC.

Beispiel 13

Bestimmung der Protease-Stabilität in der Gegenwart von Reinigungsmittel

Die Stabilität von Protease TW7 wurde in Reinigungsmittel- sowie Nicht-Reinigungsmittel-Lösungen mit derjenigen von Subtilisin Carlsberg und zu derjenigen von Proteinase K verglichen. Lösungen der Enzyme, die bewertet werden sollen, wurden in geeigneten Puffern hergestellt, so daß die anfänglichen proteolytischen Aktivitäten der verschiedenen Enzymlösungen, gemessen mit dem Azoalbumin-Test, der in Beispiel 8 beschrieben ist, ähnlich waren. Die Lösungen wurden bei 52ºC inkubiert und Aliquote wurden entnommen und auf Restenzymaktivität gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Die Restenzymaktivität ist ausgedrückt als ein Prozentsatz der anfänglichen Enzymaktivität. Tabelle 1 Stabilität von Protease TW7 gegenüber Proteinase K und Subtilisin Carlsberg in 0,1 M Natriumphosphat pH 8,0 mit und ohne SDS Ohne SDS: Protease 0 Stunden 1 Stunde 2 Stunden Protease TW7 Proteinase K Subtilisin Carlsberg Mit 0,5% SDS: Protease 0 Stunden 1 Stunde 2 Stunden 24 Stunden Protease TW7 Proteinase K Subtilisin Carlsberg Tabelle 2 Stabilität von Protease TW7 gegenüber Subtilisin Carlsberg in 0,1 M Natriumglycinat pH 10,30, das 0,5% SDS enthält Protease Protease TW7 Subtilisin Carlsberg Subtilisin BPN

Beispiel 14

Stabilität von Protease TW7 in Waschmittelzusammensetzungen

Die Stabilität von Protease TW7 und Proteinase K wurden in drei enzymhaltigen kommerziellen Waschmitteln bestimmt, Era Plus® (hergestellt von Procter & Gamble), Tide® (hergestellt von Procter & Gamble) und Dynamo® (hergestellt von Colgate-Palmolive). Die konzentrierten Basiswaschmittel wurden zehnfach in entionisiertem Wasser verdünnt. Die endogene Protease wurde inaktiviert, indem das verdünnte Waschmittel bei 65ºC für 1 Stunde vor der Zugabe der Protease, die bewertet werden sollte, inkubiert wurde. Die relative Aktivität der Protease, die bewertet werden sollte, in jeder Waschmittelformulierung wurde so eingestellt, daß sie ähnlich war zu der enzymatischen Aktivität, die in der ursprünglichen Waschmittelformulierung vorlag.
Deaktiviertes Waschmittel, das die Proteasen, die bewertet werden sollten, enthielt, wurde bei 52ºC zusammen mit dem Waschmittel, das aktives endogenes Enzym enthielt, inkubiert. Die proteolytische Restaktivität nach verschiedenen Inkubationszeiträumen wurde quantifiziert, indem Proben entnommen und gemäß den Verfahren, wie sie in Beispiel 8 beschrieben sind, untersucht wurden.
Protease TW7 erwies sich als stabil in allen getesteten Waschmittelformulierungen. Zum Beispiel behielt Protease TW7 in einer Formulierung, die deaktiviertes Era Plus® enthielt, 100% der Enzymaktivität nach 6 Stunden Inkubation bei, verglichen mit nur 12% des endogenen Enzyms. In einer Formulierung, die deaktiviertes Dynamo® enthielt, behielt Protease TW7 76% der Enzymaktivität nach 29 Stunden Inkubation bei.
Die Stabilität der Protease TW7 wurde auch in einer Formulierung getestet, die das Waschmittel Wisk® enthielt, das keine Enzyme in seiner Formulierung enthält. Im Anschluß an eine 1 : 10-Verdünnung des Basiswaschmittels in entionisiertem Wasser wurden Proteinase K oder Protease TW7 zugegeben und die resultierende Zusammensetzung wurde bei 52ºC für verschiedene Zeitdauern inkubiert. Die Restaktivität wurde unter Verwendung der Verfahren, die in Beispiel 8 beschrieben sind, untersucht. Protease TW7 war stabiler als Proteinase K, wie in Tabelle 4 veranschaulicht, wobei nach 3,5 Stunden Inkubation Proteinase K nur 20,1% der ursprünglichen Aktivität beibehielt, während Protease TW7 ungefähr 90% ihrer ursprünglichen enzymatischen Aktivität beibehielt. Tabelle 3 Waschmittelformulierung (Enzym) Era Plus® Zeit (Protease TW7) (Proteinase K) (endogenes Enzym) Tide® (Protease TW7) (Proteinase K) Dynamo® (Protease TW7) (Proteinase K) (endogenes Enzym) Wisk® (Protease TW7) (Proteinase K)
Die Experimente wurden durchgeführt, wie in Beispiel 14 beschrieben. Der Prozentanteil der ursprünglichen Aktivität, der nach verschiedenen Zeitpunkten übrigbleibt, ist angegeben.

Beispiel 15

Expression von Proteinase TW7

Ein Oligonucleotid-Adaptor wurde synthetisiert, um das Gen, das die reife Protease TW7 codiert, in den Expressionsvektor pCFM 1156 zur Expression in E. coli zu inserieren. Der Adaptor hat die folgende Sequenz:
Die Konstruktion des rekombinanten Plasmids zur Expression in E. coli umfaßte die folgenden Schritte:
(1) Konstruktion eines doppelsträngigen Oligonucleotids, das den Abschnitt des Expressionsvektors pCFM 1156 von der XbaI-Stelle bis zur NdeI-Stelle enthält, einschließlich der ATG-Sequenz, gefolgt von der aminoterminalen Sequenz des Gens für die reife Protease TW7, beginnend bei GCC bis zur ersten NcoI-Stelle. Zusätzliche Nucleotide wurden am 5'-Ende hinzugefügt, um eine weitere EcoRI-Stelle zu erhalten, die die Konstruktion erleichtern wird.
(2) Wie dargestellt in Fig. 12 wurde die cDNA für Protease TW7 vollständig mit dem Restriktionsenzym EcoRI und teilweise mit NcoI verdaut, um das große EcoRI-Ncol-Fragment zu erhalten, an das kinasierter EcoRI-NcoI-Adaptor ligiert wurde, um ein cDNA-Gen für Protease TW7 mit dem Adaptor zu erhalten.
(3) Die rekonstruierte cDNA für Protease TW7 wurde anschließend mit EcoRI und Cla verdaut, um das Gen für die Protease TW7 zu erhalten, das in M13mp18 inseriert wurde, der schon mit EcoRI und AccI verdaut worden war.
(4) Der M13mp18, der das Gen für die Protease TW7 enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII verdaut, um das Gen für die Protease TW7 zu befreien.
(5) Der Expressionsvektor pCFM 1156 wurde ebenfalls mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII verdaut, um das Gen für die Protease TW7, das aus M13mp18 als ein XbaI-HindIII-Fragment erhalten worden war, zu inserieren.
Das resultierende rekombinante Expressionsplasmid, das so konstruiert worden war, enthielt einen pL-Promotor, eine Shine-Dalgarno-Sequenz, ein ATG, gefolgt von der Nucleotidsequenz, die für das reife Protease-TW7-Protein codiert.
Kompetente E. coli-FMII-Zellen (ln&supmin;, ptr3&supmin;) wurden mit diesem rekombinanten Plasmid transformiert.
Plasmid-DNA wurde aus den transformierten Zellen isoliert und die positiven Klone wurden identifiziert, indem die Plasmid-DNA mit XbaI und HindIII verdaut wurde. Einer der positiven Klone wurde über Nacht angezogen, um ein Medium aus Luria-Brühe, die 20 µg Kanamycin/ml enthielt, zu inokulieren. Die Zellen wurden bei 30ºC bis zu einer optischen Dichte von 0,25 bei 600 nm angezogen. Die Inkubationstemperatur wurde dann zur Induktion von Plasmid-getragenen Genprodukten für 2 Stunden auf 42ºC verschoben.
E. coli-Zellen wurden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gesammelt. Der Pellet wurde gewogen und anschließend in 10 Volumenteilen 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 suspendiert. Die Zellen wurden durch 3 Durchgänge durch eine French-Press lysiert. Die Pellet-Fraktion, die nach einer weiteren Zentrifugation erhalten wurde, wurde mit 5 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 extrahiert. Die harnstofflöslichen Proteine wurden unter Verwendung verschiedener Techniken analysiert.
Die Proteine wurden mit β-Mercaptoethanol reduziert und in einem 10%igen Polyacrylamidgel in der Gegenwart von SDS einer Elektrophorese unterzogen. Ein einziges 35.000 Dalton schweres Protein war die Hauptbande, die in der harnstofflöslichen Fraktion vorlag, abgeleitet von E. coli, welches das rekombinante Plasmid enthält, aber nicht den Vektor allein. Es wanderte gemeinsam mit der Protease TW7, die aus T. album gereinigt worden war. Dieses Protein reagierte in einer Westernblot-Analyse auch spezifisch mit dem Antikörper, der gegen die Pilz-Protease TW7 gezogen worden war. Dieses Protein wurde aus dem Polyacrylamidgel isoliert, um die Sequenzen in der aminoterminalen Region zu identifizieren, die mit derjenigen der Pilz-Protease TW7 übereinstimmten.
Die rekombinante Protease TW7 ist enzymatisch inaktiv, wenn sie vor der Rückfaltung aus E. coli isoliert wird. Zur Reaktivierung wurde das Protein in 8 M Harnstoff, 10 mM DTT, 25 mM Tris-HCl, pH 8,5 in einer Endkonzentration von 1 mg Protein pro ml suspendiert und anschließend an DE52-Harz gebunden, das mit 25 mM Tris-HCl, pH 8,5 bei Raumtemperatur voräquilibriert worden war. Harnstoff wurde durch Waschen des Harzes mit demselben Puffer ohne und anschließend mit 4 mM Glutathion (reduziert) und 0,4 mM Glutathion (oxidiert) entfernt. Nach Übernacht-Inkubation der Harze in der Gegenwart der obigen Reagenzien, d. h. 25 mM Tris-HCl, pH 8,5, 4 mM Glutathion (reduziert) und 0,4 mM Glutathion (oxidiert), wurde das Protein aus der Säule mit 50 mM Tris-HCl pH 7,5, das 0,3 M NaCl enthielt, eluiert und mit 3 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Dieses renaturierte Protein besaß Proteaseaktivität gegenüber dem chromogenen Substrat (Beispiel 1) und Casein.

Beispiel 16

Isolierung und Reinigung von Proteinase TW3 aus der Kulturbrühe von Tritirachium album Limber

0,5 Liter Tritirachium album Limber-Kulturbrühe, gewonnen nach 15 Tagen Fermentation im BSA-Glucose-Medium, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde bei 15.000 g für 10 Min. zentrifugiert. Proteine im klaren Überstand wurden mit Ammoniumsulfat (180 g) ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Der Niederschlag wurde in 0,02 M Natriumphosphat pH 6,0 (50 ml) suspendiert, und im Anschluß an die Entfernung von unlöslichem Material durch Zentrifugation wurden die Proteine im Überstand mit Aceton (2,5 Volumenteile) erneut ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und auf einem gesinterten Glastrichter gesammelt. Der Niederschlag wurde in Wasser (40 ml) gelöst und die Lösung wurde bei 4ºC gegen 0,02 M Natriumphosphat bei pH 6,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt und durch eine Säule (2,5 x 10 cm) aus Carboxylmethylcellulose (CM-52, Whatman) mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute hindurchgegeben, gefolgt vom Waschen der Säule mit 0,02 M Natriumphosphat pH 6,0 (30 ml). Der Durchfluß und die Waschlösungen wurden vereinigt und die Proteine wurden durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen Aceton ausgefällt.
Elution aus der CM-52-Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl in Natriumphosphat pH 6,0 durchgeführt. Die Fraktionen wurden spektrophotometrisch (bei 420 nm) auf proteolytische Aktivität bei pH 8,2 untersucht, wie beschrieben in Beispiel 8. Peak-Fraktionen, die die Enzymaktivität enthielten, wurden gepoolt, bei 4ºC gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. SDS-PAGE von mit 2-Mercaptoethanol behandelter Probe zeigte Protease TW3 als eine Hauptbande (> 96%, auf der Basis einer Anfärbung mit Coomassieblau) mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 31.000 Daltons.

Beispiel 17

Aminoterminus-Analyse von Protease TW3

Protease TW3 wurde aus dem Kulturüberstand gereinigt, wie in Beispiel 16 beschrieben. Gereinigtes Protein wurde anschließend mit PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) inaktiviert und unter Verwendung von HPLC weiter gereinigt. Der Aminoterminus wurde durch Rekonstitution des Proteins in 50%iger Trifluoressigsäure (TFA), die 1 mM PMSF enthielt, bestimmt. Automatisierter Gasphasen-Edman-Abbau wurde für die Aminoterminus-Analyse durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß der Aminoterminus Ala-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Pro-Trp-Gly-Leu-Ala-Arg-Ile-Ser-Ser-Thr ist.

Beispiel 18

pH-Profil von Proteinase TW3

Das pH-Profil von Protease TW3 bei 25ºC wurde unter Verwendung von Azocasein als einem Substrat bestimmt. Substratlösungen (0,6%) M Puffer, die den pH-Bereich von zwischen 5,0 und 10 abdeckten, wurden hergestellt. Zu diesen Azocasein-Lösungen wurden entweder 20 µl einer 1 mg/ml Lösung Protease TW3 in Wasser oder 20 µl Wasser (Kontrollversuch) zugegeben und die proteolytische Aktivität wurde bestimmt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Das pH-Profil von Proteinase TW3 ist in Fig. 10 dargestellt, in der der Prozentanteil der maximalen Aktivität gegen den pH aufgetragen ist. Das pH-Optimum von Protease TW3 wurde als pH 9 bestimmt.

Beispiel 19

Temperaturprofil von Proteinase TW3

Das Temperaturprofil von Protease TW3 in 0,05 Natriumphosphat bei pH 8,5 wurde aus der proteolytischen Aktivität (Azocasein-Test) im Temperaturbereich zwischen 4ºC und 65ºC bestimmt. Für diese Messungen wurden Aliquote (1 ml) von 0,6% Azocasein in 0,05 M Natriumphosphat pH 8,5 bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, und im Anschluß an die Zugabe der Enzymlösung (20 µl 0,5 mg Proteinase TW3 pro ml desselben Puffers) oder 20 µl Puffer allein (Kontrollversuch) ließ man die Reaktion für 10 Minuten fort schreiten und brach sie dann durch Zugabe von 10%iger Trichloressigsäure (400 µl) ab. Das Temperaturprofil von Protease TW3 ist in Fig. 11 dargestellt, in der der Prozentanteil der maximalen proteolytischen Aktivität gegen die Temperatur aufgetragen worden ist. Wie in Fig. 5 veranschaulicht, liegt die optimale Temperatur von Protease TW3 im Bereich zwischen 55ºC und 60ºC.

Beispiel 20

Vergleichende Stabilitätsstudie von der Protease TW3 und Subtilisin

Protease TW3 und ein kommerzielles Subtilisin (Sigma, Protease VII, Cat. No. 5255) wurde auf ihre Stabilität bei 52ºC in der Abwesenheit von Substraten getestet. Die Tests wurden bei 3 verschiedenen pH-Werten (4,0, 8,0 und 10,0) durchgeführt.
Ungefähr 0,2 mg Enzym/ml wurden bei 50ºC inkubiert. Die Restaktivität nach einem definierten Zeitintervall wurde quantifiziert, indem 10 µl Probe entnommen und die proteolytische Aktivität untersucht wurde, wie in Beispiel 8 angegeben. Tabelle 4 stellt die erhaltenen Ergebnisse dar. Die Daten stellen die übriggebliebene enzymatische Aktivität als eine Prozentzahl der ursprünglichen enzymatischen Aktivität dar. Protease TW3 zeigte die beste Stabilität. Zum Beispiel wurden, bei pH 8,0 nach einer Stunde Inkubation bei 50ºC, 90% der ursprünglichen Aktivität von Protease TW3 beibehalten, während nur 2% der ursprünglichen Aktivität von Subtilisin beibehalten wurden. Im Anschluß an 2 Stunden Inkubation blieben 96% der Aktivität von Protease TW3 übrig, verglichen mit 0,6% der Aktivität des Subtilisins. Protease TW3 war auch bei pH 4,0 und 10,0 stabiler als Subtilisin. Tabelle 4 pH 8,0: Zeit Enzym Subtilisin

Beispiel 21

Stabilität von Protease TW3 in kommerziellen Waschmitteln

Die Stabilität von Protease TW3 sowie von Subtilisin wurde in drei enzymhaltigen kommerziellen Waschmitteln getestet. Diese waren Era Plus® (hergestellt von Procter & Gamble), Tide® (hergestellt von Procter & Gamble) und Dynamo® (hergestellt von Colgate-Palmolive). Die konzentrierten Basiswaschmittel wurden 200-fach in entionisiertem Wasser verdünnt. Die endogene Protease wurde inaktiviert, indem das verdünnte Waschmittel bei 65ºC für 1 Stunde inkubiert wurde, bevor entweder Protease TW3, Protease TW7, Proteinase K oder Subtilisin zugegeben wurde, um die Enzymaktivität zu erreichen, die in der ursprünglichen Waschmittelformulierung vorlag.
Inaktiviertes Waschmittel mit zugesetzten Proteasen wurde bei 50ºC für verschiedene Zeitpunkte zusammen mit dem Waschmittel, das aktives endogenes Enzym enthielt, inkubiert. Die proteolytische Restaktivität, die nach verschiedenen Inkubationszeiträumen verblieb, wurde quantifiziert, indem Proben entnommen und gemäß den in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren untersucht wurden.
Wie in Tabelle 5 veranschaulicht ist Protease TW3 in allen getesteten Waschmittelformulierungen sehr stabil. Zum Beispiel wurden in einer Formulierung, die Era Plus® enthielt, 94% ihrer Aktivität nach 1 Stunde Inkubation beibehalten, während die Formulierung, die endogenes Enzym enthielt, vollständig inaktiviert wurde. In einer Formulierung, die Dynamo® enthielt, verblieben 80% der Aktivität von Protease TW3 nach einer Stunde Inkubation, verglichen mit nur einem nicht-nachweisbaren Aktivitätsniveau in einer Formulierung, die endogenes Enzym enthielt. In einer Formulierung, die Tide® enthielt, wurden 48% der ursprünglichen Aktivität von TW3 beibehalten, während 23% der Aktivität in der Formulierung, die endogenes Enzym enthielt, nach einer Stunde verblieben. In allen Fällen wurde Subtilisin innerhalb einer Stunde inaktiviert.
Die Stabilität der Protease TW3 wurde auch im Waschmittel Wisk® getestet, das kein Enzym in seiner Formulierung enthält. Im Anschluß an eine 1 : 200-Verdünnung des Basiswaschmittels in entionisiertem Wasser wurde Subtilisin oder Protease TW3 zum verdünnten Waschmittel zugegeben und die Proben wurden bei 50ºC inkubiert. Die proteolytische Aktivität wurde unter Verwendung des in Beispiel 8 angegebenen Verfahrens untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Waschmittelformulierung (Enzym) Zeit ERA Plus® (Subtilisin) (endogenes Enzym) (Proteinase K) Tide® Dynamo® (Subtilisin) (endogenes Enzym) (Proteinase K) Wisk®
Verschiedene andere Beispiele und Modifikationen der vorstehenden Beschreibung und Beispiele werden einem Fachmann auf diesem Gebiet beim Lesen der vorliegenden Offenbarung deutlich werden, ohne den Geist und Schutzumfang der Erfindung zu verlassen, und es ist beabsichtigt, daß alle derartigen Beispiele und Modifikationen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sein sollen.

Claims

1. Eine Serinprotease mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 3 angegeben ist.

2. Eine Serinprotease mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 8 angegeben ist.

3. Eine Serinprotease nach Anspruch 1 oder 2, mit einem aminoterminalen Rest an Ala¹.

4. Eine DNA-Sequenz zur Verwendung für die Sicherstellung der Expression einer Serinprotease in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle, wobei besagte Sequenz ausgewählt ist aus

a) den DNA-Sequenzen, die angegeben sind in Fig. 1, 2 oder 7; und

b) DNA-Sequenzen, die an die in (a) definierten Sequenzen hybridisieren und für die durch die Sequenzen in (a) codierte Protease codieren.

5. Eine Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Serinprotease nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfaßt, in einer Reinigungsmittelzusammensetzung.

6. Ein Expressionsvektor, der in der Lage ist, in einer transformierten Zellkultur, eine DNA-Sequenz nach Anspruch 4 zu exprimieren.

7. Eine Zellkultur, die mit einem Expressionsvehikel nach Anspruch 6 transformiert ist.

8. Ein Mikroorganismus nach Anspruch 7, der durch Transformation eines E. coli-Stammes erhalten ist.

9. Ein E. coli-Stamm, der in der Lage ist, eine Serinprotease mit einer Aminosäuresequenz, die in Fig. 3 angegeben ist, zu produzieren.

10. Ein E. coli-Stamm, der in der Lage ist, eine Serinprotease mit einer Aminosäuresequenz, die in Fig. 8 angegeben ist, zu produzieren.

11. Eine Serinprotease mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 3 oder Fig. 8 angegeben ist, und dadurch gekennzeichnet, daß sie das Produkt prokaryontischer oder eukaryontischer Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.

12. Eine Serinprotease nach Anspruch 11, wobei die exogene DNA-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.

13. Eine Serinprotease nach Anspruch 11, wobei die exogene DNA-Sequenz eine genomische DNA-Sequenz ist.

14. Eine Serinprotease nach Anspruch 11, wobei die exogene DNA-Sequenz eine künstlich hergestellte DNA-Sequenz ist.

15. Eine Serinprotease nach Anspruch 11, die das Produkt von E. coli-Expression ist.

16. Ein Verfahren zur Herstellung einer Serinprotease, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a) Züchten prokaryontischer oder eukaryontischer Wirtszellen, die mit einem DNA-Vektor, einschließlich einer DNA-Sequenz nach Anspruch 4, der für die Sicherstellung der Expression einer gewünschten Serinprotease in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle brauchbar ist, transformiert oder transfiziert worden sind, unter geeigneten Nährstoffbedingungen; und

b) Isolieren der gewünschten Serinprotease, die durch die Expression besagter DNA-Sequenzen in besagter Wirtszelle produziert worden ist.