DE3853328T2 - Subtilisin-analoge. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung stellt eine neuartige Klasse von thermisch stabilen und pH-stabilen Subtilisin-Analogen und ein Verfahren zur Herstellung solcher Analoge zur Verfügung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Klasse von Subtilisin-Analogen mit einer modifizierten Calcium-Bindungsstelle, die eine verbesserte Calcium-Bindungsfahigkeit bereitstellt, und fakultativ einer Deletion und/oder einem Ersatz eines Restes von Asn-Gly-Sequenzen, die im Subtilisin vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Waschmittelzusammensetzungen, die solche Subtilisine enthalten, und die Verwendung solcher Subtilisine und Zusammensetzungen in Reinigungsanwendungen.
- Der Begriff Subtilisin bezeichnet eine Gruppe von extrazellulären alkalischen Serin-Proteasen, die von verschiedenen Spezies von Bazilli produziert werden. Diese Enzyme werden auch als Bacillus-Serin-Proteasen, Bacillus-Subtilisine oder bakterielle alkalische Proteasen bezeichnet.
- Bacillus-Subtilisin-Moleküle bestehen aus einer einzelnen Polypeptidkette mit entweder 274 Resten (für Subtilisin-Typ Carlsberg, produziert von Bacillus licheniformis, und für das von Bacillus subtilis-Stamm DY produzierte Subtilisin) oder 275 Resten (für Subtilisin-Typ BPN', produziert von Bacillus amyloliquefaciens, das aprA-Genprodukt von Bacillus subtilis und das Subtilisin von Bacillus mesentericus). Wenn Aminosäuresequenzen von Subtilisin aus verschiedenen Bazillus-Stämmen hierin verglichen werden, wird die Sequenz von Subtilisin BPN' als ein Standard verwendet. Zum Beispiel wird, auf der Grundlage einer Ausrichtung der Sequenzen, die den höchsten Grad an Homologie zwischen Subtilisin Carlsberg und Subtilisin BPN' ergibt, das Serin an der aktiven Stelle der ersteren als Serin 221 bezeichnet, selbst wenn es an Position 220 der Aminosäuresequenz angeordnet ist. Auf derselben Grundlage kann gesagt werden, daß Position 220 der Aminosäuresequenz von Subtilisin Carlsberg Position 221 von Subtilisin BPN' "entspricht". Siehe z.B. Nedkov et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 (1983).
- Die Röntgenstruktur von Subtilisin BPN' [Wright, et al., Nature, 221, 235 (1969)] zeigte, daß die Geometrie der katalytischen Stelle von Subtilisin, einschließlich Asp³², His&sup6;&sup4; und Ser²²¹, nahezu identisch ist mit derjenigen der aktiven Stelle von Säugetier-Serin-Proteasen (z.B. Chymotrypsin), einschließlich der Reste Asp¹&sup0;², His&sup5;&sup7; und Ser¹&sup9;&sup5;. Die Gesamtunterschiede zwischen Bacillus-Serin-Proteasen und Säugetier-Serin-Proteasen weisen jedoch daraufhin, daß diese zwei nicht-verwandte Familien von proteolytischen Enzymen sind.
- In der Familie von Bacillus-Subtilisinen sind vollständige Aminosäuresequenzen für fünf Subtilisine verfügbar: Carlsberg [Smith, et al., J. Biol. Chem., 243, 2184-2191 (1968)]; BPN' [Markland, et al., J. Biol. Chem., 242, 5198-5211 (1967)]; das aprA-Genprodukt [Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)]; DY [Nedkov, et al., aaO] und Bacillus mesentericus [Svendsen, et al., FEBS Letters, 196, 220-232 (1986)]. Subtilisin Carlsberg und Subtilisin BPN' (manchmal bezeichnet als Subtilisin Novo) unterscheiden sich durch 84 Aminosäuren und einen zusätzlichen Rest in BPN' (Subtilisin Carlsberg fehlt ein Aminosäurerest, der Rest 56 von Subtilisin BPN' entspricht). Subtilisin DY umfaßt 274 Aminosäuren und unterscheidet sich von Subtilisin Carlsberg in 32 Aminosäurepositionen und von Subtilisin BPN' durch 82 Aminosäure-Ersetzungen und eine Deletion (subtilisin DY fehlt ein Aminosäurerest, der Rest 56 von Subtilisin BPN' entspricht). Die Aminosäuresequenz des aprA-Genprodukts ist 85% homolog zur Aminosäuresequenz von Subtilisin BPN'. So scheint es, daß eine extensive Homologie zwischen Aminosäuresequenzen von Subtilisinen aus verschiedenen Bacillus-Stämmen besteht. Diese Homologie ist in bestimmten Bereichen des Moleküls vollständig und insbesondere in denjenigen, die eine Rolle im katalytischen Mechanismus und in der Substratbindung spielen. Beispiele solcher Sequenz-Invarianzen sind die primären und sekundären Substratbindungsstellen, Ser¹²&sup5;-Leu¹²&sup6;-Gly¹²&sup7;-Gly¹²&sup8; bzw. Tyr¹&sup0;&sup4; und die Sequenz um das reaktive Serin (221), Asn218-Gly²¹&sup9;-Thr²²&sup0;-Ser²²¹Met²²²-Ala²²³.
- Subtilisin-Moleküle zeigen einzigartige Stabilitätseigenschaften. Obgleich sie nicht vollständig stabil über einen breiten pH-Bereich sind, sind Subtilisine relativ beständig gegen Denaturierung durch Harnstoff- und Guanidinlösungen und ihre enzymatische Aktivität bleibt für einige Zeit in 8 M Harnstoff erhalten. In Lösungen mit einem pH unter 4 verliert Subtilisin schnell und irreversibel seine proteolytische Aktivität. Gounaris, et al., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 35, 37 (1965), wiesen nach, daß die Säure-Desaktivierung von Subtilisin nicht auf einem allgemeinen Ladungseffekt beruht, und spekulierten, daß sie auf anderen Veränderungen im Molekül beruht, wie etwa Protonierung von Histidin-Resten in den inneren, hydrophoben Teilen des Moleküls. Bacillus-Subtilisine durchlaufen irreversible Inaktivierung in wässrigen Lösungen mit einer Geschwindigkeit, die in hohem Maße abhängig von Temperatur und pH ist. Bei pH-Werten unter 4 oder über 11 ist die Inaktivierungsgeschwindigkeit sehr schnell, während die Geschwindigkeit bei pHs von zwischen 4,5 und 10,5, obgleich viel langsamer, ansteigt, wenn die Lösung alkalischer wird. Die Mechanismen dieser Inaktivierung sind nicht vollständig bekannt, aber es gibt Hinweise, die darauf hindeuten, daß Autodigestion wenigstens teilweise für die Enzym-Instabilität in diesem pH-Bereich verantwortlich ist. Im allgemeinen gilt bei jedem pH-Wert, daß die Geschwindigkeit der Subtilisin-Desaktivierung umso schneller ist, je höher die Temperatur ist.
- Die Verwendung von Proteasen in industriellen Verfahren, die die Hydrolyse von Proteinen erfordern, ist aufgrund der Enzym- Instabilität unter Betriebsbedingungen begrenzt gewesen. So hatte zum Beispiel die Einbeziehung von Trypsin in Waschmittel (z.B. Bio-38, Schnyder; Schweiz), um die Entfernung von proteinhaltigen Flecken zu erleichtern, einen sehr begrenzten Erfolg, der unzweifelhaft ein Ergebnis der Enzym-Instabilität unter den Waschbedingungen war. Zusätzlich sind bakterielle alkalische Proteasen, die mit Waschmitteln kompatibel sind, in Waschmittelformulierungen eingesetzt worden.
- Weil viele industrielle Verfahren bei Temperaturen durchgeführt werden, die oberhalb des Stabilitätsbereichs der meisten Enzyme liegen, werden hochthermostabile Proteasen nicht nur für bestimmte Industriezweige vorteilhaft sein, wie etwa Waschmittel und Fellenthaarung, die bereits stabile Proteasen erfordern, sondern werden auch in Industriezweigen nützlich sein, die chemische Mittel verwenden, um Proteine zu hydrolysieren, z.B. Hydrolyse von pflanzlichen und tierischen Proteinen zur Herstellung von Suppenkonzentraten.
- Obgleich thermische Inaktivierung der wichtigste Faktor bei der Beschränkung der industriellen Verwendung von Enzymen sein kann, können auch andere Faktoren, wie etwa die Notwendigkeit der Effektivität über breite pH-Bereiche und die Verwendung von Denaturierungsmitteln, eine nachteilige Wirkung im Hinblick auf die Verwendung von Proteasen in industriellen Verfahren besitzen. Es ist daher wünschenswert, eine Klasse von Proteasen zu erhalten, die gekennzeichnet ist durch verbesserte Stabilität im Hinblick auf Temperatur, pH, Denaturierungsmittel und andere Bedingungen, die von verschiedenen Industriezweigen gefordert werden.
- Über die letzten paar Jahre hat es bedeutende Veränderungen bei waschmittelformulierungen gegeben, insbesondere durch den Ersatz von Phosphaten durch alternative Builder und durch die Entwicklung von flüssigen Waschmitteln um die Anforderungen der Umwelt und der Verbraucher zu erfüllen. Diese Veränderungen schaffen die Notwendigkeit von Veränderungen bei herkömmlichen Waschmittelenzymen. Insbesondere ist es wünschenswert geworden, proteolytische Enzyme einzusetzen, die größere Lagerstabilität in flüssigen Waschformulierungen sowie Stabilität und Aktivität in breiteren Bereichen von pH und Temperatur besitzen.
- Ein Ansatz zur Herstellung modifizierter Subtilisine, die in Waschmittelformulierungen brauchbar sind, wurde in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 130,756 offenbart, in der Mutationen in dem Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) an den Positionen Tyr&supmin;¹, Asp³², Asn¹&sup5;&sup5;, Tyr¹&sup0;&sup4;, Met²²², Gly¹&sup6;&sup6;, His&sup6;&sup4;, Gly¹&sup6;&sup9;, Phe¹&sup8;&sup9;, Ser³³, Ser²²¹, Tyr²¹&sup7;, Glu&sup5;&sup6;, und/oder Ala¹&sup5;² als veränderte Stabilität, veränderte Konformation bereitstellend oder als Veränderungen bei der "Verarbeitung" des Enzyms bewirkend identifiziert wurden. Insbesondere führte eine Mutation von Met²²² zu Ala oder Cys (wobei diese Mutante auch ein schärferes pH-Optimum als der Wildtyp zeigt) oder Ser erklärtermaßen zu verbesserter Oxidationsstabilität. Es wurde vorgeschlagen, daß die Substitution von Gly¹&sup6;&sup6; durch Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Asn, Arg oder Val die kinetischen Parameter des Enzyms veränderen würde. Keine der offenbarten Mutationen stellt jedoch Analoge mit größerer Stabilität bei höheren Temperaturen oder Stabilität über einen breiteren pH-Bereich als das Wildtyp-Enzym zur Verfügung.
- In einem anderen Ansatz offenbaren Thomas et al., Nature, 318, 375-376 (1985), daß die pH-Abhängigkeit von Subtilisin durch Veränderung eines Asp zu Ser in Asp&sup9;&sup9;-Gly¹&sup0;&sup0; von Subtilisin BPN' verändert werden kann. Diese Veränderung stellt eine Änderung der Oberflächenladung 14-15 Angström von der aktiven Stelle dar. Thomas et al. liefern jedoch keinen Hinweis auf eine Verbesserung, wo keine Veränderung in der Oberflächenladung bewirkt wurde, wie dies der Fall ist, wenn ein nicht-geladener Rest einen anderen ersetzt.
- Ein dritter Ansatz, beschrieben in der mitanhängigen U.S.-Anmeldung S.N. 819,241, betrifft eine Klasse von Bacillus-Serin- Protease-Analogen, die gekennzeichnet ist durch Deletion und/oder Modifikationen irgendwelcher Asn-Gly-Sequenzen, die in der Protease vorhanden sind.
- Leszczynski et al, Science (1986) 849-855 und J. Cell Biochem Supple 10A (1986), Abstract E105, betreffen beide eine zweite, unaufgelöste Calcium-Bindungsstelle in Subtilisin.
- Die vorliegende Erfindung stellt eine Klasse von Subtilisin- Analogen zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie verbesserte pH- und thermische Stabilität besitzen, wodurch solche Analoge besonders brauchbar für Waschmittelformulierungen sowie anderen Verfahren, die stabile Proteasen erfordern, gemacht werden.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Subtilisin-Analog zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Bacillus- Subtilisins besitzt, das dadurch modifiziert worden ist, das:
- (a) daß eine oder mehrere der Aminosäuren, die in einer Calcium-Bindungsstelle vorhanden sind, repräsentiert durch Asp&sup4;¹, Leu&sup7;&sup5;, Asn&sup7;&sup6;, Asn&sup7;&sup7;, Ser&sup7;&sup8;, Ile&sup7;&sup9;, Gly&sup8;&sup0;, Val&sup8;¹, Thr²&sup0;&sup8; und Tyr²¹&sup4;, des natürlich vorkommenden Bacillus-Subtilisins durch eine negativ geladene Aminosäure ersetzt sind; und
- (b) daß eine oder beide der Aminosäuren, umfassend jede Asn- Gly-Sequenz des natürlich vorkommenden Bacillus-Subtilisins, deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt sind.
- Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Waschmittelzusammensetzungen zur Verfügung, die die Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung umfassen, und die Verwendung solcher Subtilisin-Analoge und Zusammensetzungen in Reinigungsanwendungen.
- Die Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung zeigen verbesserte thermische und pH-Stabilität, erhöhte spezifische Aktivität und breite Substratspezifität, wodurch das Reinigungsvermögen von Reinigungsformulierungen, die solche Analoge enthalten, erhöht wird. Insbesondere stellen die Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung verbesserte Thermostabilität, erhöhte pH-Stabilität und höhere spezifische Aktivität zur Verfügung, als in "Wildtyp"-Subtilisinen anzutreffen sind.
- Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die Codons besitzen, die ein Subtilisin-Analog kodieren, wie oben beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Subtilisin-Analogen zur Verfügung, welches eine Wirtszelle umfaßt, die Nucleinsäure besitzt welche ein Subtilisin-Analog kodiert, wie oben beschrieben. In solch einer Zelle kann die Nucleinsäure, die das Subtilisin-Analog kodiert, chromosomal oder extrachromosomal sein. Die Wirtszelle ist vorzugsweise ausgewählt aus einem Stamm, dem es an sekretierten Proteasen fehlt, was leichte Isolierung der Analoge der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
- Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der thermischen und pH-Stabilität von Subtilisinen durch Modifizierung der Calcium-Bindungsstelle und Substitution eines Asparagins in einer Asn-Gly-Sequenz und insbesondere des Asparagin-Restes an der Position in der Aminosäuresequenz des Subtilisins, die Position 218 in der Aminosäuresequenz entspricht, wie sie in Tabelle 1 offenbart ist, durch eine andere Aminosäure als Asparagin zur Verfügung.
- Fig. 1 veranschaulicht schematisch die Zyklisierung von Asn- Gly-Resten, wie etwa denjenigen, die an den Positionen 218 und 219 von Subtilisin zu finden sind, wie dargestellt in Tabelle 1, um Anhydroaspartylglycin zu bilden, und zeigt auch die basenkatalysierte Hydrolyse derselben;
- Fig. 2 ist eine partielle Restriktionskante eines aprA-Gen enthaltenden EcoRI-KpnI-Genfragments von Bacillus subtilis(B. subtilis)-Stamm QB127 und schließt eine partielle Restriktionskarte des aprA-Gens und der flankierenden Sequenzen ein;
- Fig. 3 ist eine partielle Restriktionskarte eines Plasmids pAMB11;
- Fig. 4 ist ein Flußdiagramm, das die Stufen bei der Konstruktion von pAMB113 veranschaulicht, einem Plasmid, das die Synthese von [Ser]²¹&sup8;-Subtilisin steuert, aus B. subtilis-Wirtszellen;
- Fig. 5 ist eine partielle Restriktionskarte von pAMB30-Plasmid;
- Fig. 6 veranschaulicht die Konstruktion von pAMB106;
- Fig. 7 veranschaulicht die Konstruktion von M13 mp18 apr4.
- Es sollte angemerkt werden, daß der Begriff "Subtilisin", wie er hierin verwendet wird, eine reife, sekretierte Form des Enzyms bezeichnet, der Leader-Sequenzen fehlen, die vom reifen Enzym vor oder bei der Sekretion abgespalten werden. Beispiele für Subtilisine, die gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können, schließen natürlich vorkommende Subtilisine, repräsentiert durch die Aminosäuresequenz von Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN', dem aprA-Genprodukt von Bacillus subtilis, Subtilisin DY und dem Subtilisin von Bacillus mesentericus ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die Aminosäuresequenz für Subtilisin Carlsberg ist beschrieben von Smith, et al., J. Biol. Chem., 243, 2184-2191 (1968). Die Aminosäuresequenz Subtilisin BPN' ist beschrieben von Markland, et al., J. Biol. Chem., 242, 5198-5211 (1967). Die Aminosäuresequenz für Subtilisin DY ist beschrieben von Nedlov, et al., Hoppe- Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 (1983). Die Aminosäuresequenz für das Subtilisin von Bacillus mesentericus ist beschrieben von Svedsen, et al., FEBS Letters, 196, 220-232 (1986). Die Aminosäuresequenz des aprA-Genproduktes von Bacillus subtilis ist beschrieben von Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). Die Aminosäuresequenzen solcher Subtilisine sind hierin durch Bezugnahme einbezogen. Solche Subtilisine sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Calcium-Bindungsstellen besitzen, die zur Stabilisierung des Moleküls notwendig sind.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Klasse von Subtilisin-Analogen zur Verfügung gestellt, die verbesserte Fähigkeit besitzen, sich an Calcium zu binden. Calcium ist verwendet worden, um Subtilisin in Pulvern und flüssigen Waschmitteln zu stabilisieren, insbesondere in Anwendungen, die höhere Temperaturen erfordern. Die vorliegende Erfindung betrifft die Modifikation einer gegebenen Calcium-Bindungsstelle des Subtilisin-Moleküls, um die Calcium-Bindung zu erhöhen. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Modifikation der Calcium- Bindungsstelle" den Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren in der Region einer Calcium-Bindungsstelle, die in der Aminosäuresequenz von Subtilisin vorhanden ist, durch eine negativ geladene Aminosäure, wodurch ermöglicht wird, daß das resultierende Subtilisin-Analog eine zusätzliche negative Ladung besitzt. Es ist festgestellt worden, daß besagte Calcium-Bindungsstelle in einem Subtilisin folgende Aminosäuren umfaßt: Asp&sup4;¹, Leu&sup7;&sup5;, Asn&sup7;&sup6;, Asn&sup7;&sup7;, Ser&sup7;&sup8;, Ile&sup7;&sup9;, Gly&sup8;&sup0;, Val&sup8;¹, Thr²&sup0;&sup8; und Tyr²¹&sup4;, bezogen auf die Aminosäuresequenz, die in Tabelle 1 dargestellt ist. Die vorliegende Erfindung umfaßt den Ersatz einer oder mehrerer der Aminosäuren, die in der Calcium-Bindungsstelle vorhanden sind, durch eine "negativ geladene" Aminosäure, wie etwa Asp und Glu und bevorzugter Asp. Es sollte angemerkt werden, daß, obgleich Asp&sup4;¹ in der Calcium-Bindungsstelle eine negativ geladene Aminosäure ist, eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Änderung von Asp&sup4;¹ zu Glu&sup4;¹ umfaßt. Die anderen Ausführungsformen betreffen andere Verbindungen als zu Asp&sup4;¹.
- Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Subtilisin-Analog, in dem Asn&sup7;&sup6; zu Asp&sup7;&sup6; umgewandelt ist. Eine andere Ausführungsform umfaßt die Umwandlung der Ile&sup7;&sup9; zu Asp&sup7;&sup9;. Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt ein Subtilisin-Analog, in dem Asn&sup7;&sup7; zu Asp&sup7;&sup7; umgewandelt ist. Die bevorzugteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die obigen bevorzugten Modifikationen an der Calcium- Bindungsstelle und Substitutionen von Asn¹&sup0;&sup9; und Asn²¹&sup8; zu Ser¹&sup0;&sup9; und Ser²¹&sup8;, wodurch zwei instabile Asn-Gly-sequenzen eliminiert werden.
- Zusätzlich zu den oben beschriebenen Calcium-Bindungsstellen, können Subtilisine eine oder mehrere zusätzliche Calcium-Bindungsstellen besitzen. Die Ansprüche der vorliegenden Erfindung umfassen die weitere Modifikation einer oder mehrerer Calcium-Bindungsstellen, die im Subtilisin vorhanden sein können. Die Anzahl anderer Calcium-Bindungsstellen in irgendeinem besonderen Subtilisin, die auch modifiziert werden können, hängt von vielen Faktoren ab, d.h. von dem spezifischen Subtilisin, der besonderen Anwendung für das in Subtilisin-Analog. Andere potentielle calcium-Bindungsstellen, die Subtilisinen vorhanden sein können, schließen die folgenden ein (1) Asp¹&sup4;&sup0; und Pro¹&sup7;²; (2) Pro¹&sup4; und Gln²&sup7;¹; und (3) Pro¹&sup7;² und Glu¹&sup9;&sup5; oder Asp¹&sup9;&sup7;. Die spezifische Calcium-Bindungsstelle, die in jedem Molekül vorhanden ist, hängt von dem besonderen Subtilisin ab, das modifiziert werden soll. Wie zuvor erwähnt, wird der weitere Ersatz einer oder mehrerer der Aminosäuren in den obigen potentiellen Calcium-Bindungsstellen zu einem Subtilisin mit verbesserter thermischer und pH-Stabilität führen. Beispiele für Ersetzungen schließen Asp¹&sup4;&sup0; durch Glu¹&sup4;&sup0;, Pro¹&sup7;² durch Asp¹&sup7;², Pro¹&sup4; durch Asp¹&sup4;, Gln²&sup7;¹ durch Glu²&sup7;¹, Glu¹&sup9;&sup7; durch Asp¹&sup9;&sup7; ein.
- Zusätzlich zur Modifizierung der Calcium-Bindungsstellen eines Subtilisin-Moleküls wird wenigstens eine Asn-Gly-Sequenz, die im Subtilisin vorhanden ist, deletiert oder ersetzt. Wie zuvor in U.S.-Anmeldung S.N. 819,241 offenbart, ist eine konservierte Sequenz, Asn-Gly, an den Positionen 109-110 und insbesondere an den Positionen 218-219 von Bacillus-Subtilisinen als ein wesentlicher Faktor identifiziert worden, der für die pH-Instabilität dieser Substanzen verantwortlich ist. Um das instabile Element, Asn²¹&sup8;-Gly²¹&sup9;, aus dem Subtilisin-Molekül zu eliminieren, wurde offenbart, daß entweder Asn²¹&sup9; durch irgendeine andere Aminosäure als Asparagin ersetzt und/oder Gly²¹&sup9; zu irgendeiner anderen Aminosäure als Glycin verändert wird. In einer ähnlichen Weise wurde die Modifikation des instabilen Asn-Gly-Elements an den Positionen 109-110 als Stabilität für die darin beschriebenen Analoge bereitstellend beschrieben.
- Zusätzlich haben Analoge eines Bacillus-Subtilisins gemäß der vorliegenden Erfindung, wie zuvor angemerkt, eine Aminosäuresequenz in der zusätzlich zu einer Modifikation einer Calcium- Bindungsstelle Positionen, die eine Asn-Gly-Sequenz im Bacillus-Subtilisin umfassen, keine Asn-Gly-Sequenz im Analog umfassen und in denen es insbesondere weniger Asn-Gly-Sequenzen gibt als im Bacillus-Subtilisin. Am bevorzugtesten umfaßt eine Position, die Position 218 in der Aminosäuresequenz, wie sie in Tabelle 1 dargestellt ist, entspricht, nicht einen Asparaginyl-Rest, sondern umfaßt vielmehr einen Rest einer anderen Aminosäure, insbesondere einer Aminosäure, die ausgewählt ist aus Serin, Valin, Threonin, Cystein, Glutamin und Isoleucin. In dem Maße, in dem der Ersatz von Asparagin durch bestimmte Aminosäuren zu einer gegenseitigen Beeinflussung mit der Konformation der aktiven Stelle führen könnte (z.B. wegen sterischer Hinderung, die durch das Vorhandensein einer aromatischen Aminosäure eingeführt werden könnte, oder Veränderungen in der tertiären Struktur, wie solche, die durch das Vorhandensein eines Prolins eingeführt werden könnten), wäre die Substitution durch solche Aminosäuren gewöhnlich weniger bevorzugt. In ähnlicher Weise wäre, in dem Maße, wie der Ersatz von Asparagin durch andere Aminosäuren eine geladene Gruppe (z.B. Asparaginsäure) in die Nachbarschaft der aktiven Stelle einführen könnte, solche Substituion weniger bevorzugt. Beispielhaft für eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform ist ein Analog mit einer modifizierten Calcium-Bindungsstelle und einer [Ser²¹&sup8;]-Modifikation der Asn-Gly-Sequenz des Subtilisins. Alternative Ausführungsformen von Analogen innerhalb der Betrachtung der Erfindung sind diejenigen mit einer modifizierten Calcium-Bindungsstelle, und in denen Asn¹&sup0;&sup9; von Subtilisin BPN' oder dem aprA-Genprodukt vorzugsweise durch ein Serin ersetzt ist und in denen Glycin-Reste an den Positionen 110 und/oder 219 durch andere Aminosäurereste ersetzt sind. In anderen Subtilisinen sind auch die Modifikation der Calcium- Bindungsstelle oder -stellen und die Substitution von Asn an Rest 62 oder Gly an Rest 63 der Subtilisine Carlsberg oder DY von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
- Wegen ihrer Fähigkeit, beträchtliche Mengen an Proteinen zu sekretieren, und weil sie gegenwärtig verwendet werden, um Waschmittel-Proteasen herzustellen, stellen Bacillus-Mikroorganismen einen bevorzugten Wirt für die rekombinante Produktion der Subtilisin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung dar. Weil die meisten Bacilli alkalische und neutrale Proteasen sekretieren, ist es bevorzugt, daß Mutationen in die endogenen Gene für alkalische und neutrale Proteasen von B. subtilis eingeführt werden, so daß das mutierte Subtilisin in einem von anderen Proteasen freien Medium von B. subtilis produziert und sekretiert werden kann. So stellt die vorliegende Erfindung auch mutante Stämme von B. subtilis zur Verfügung, die im Hinblick auf die Synthese von endogenen Proteasen blockiert sind, die aber die Fähigkeit beibehalten, die hierin offenbarten Subtilisin-Analoge zu synthetisieren und zu sekretieren.
- Wie unten im größeren Detail beschrieben, wurde festgestellt, daß die pH- und thermische Stabilität und die Stabilität in Waschmittelformulierungen der Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung signifikant größer ist als diejenige des Wildtyp-aprA-Genprodukt-Subtilisins und -Carlsberg-Subtilisins.
- Ein Subtilisin-Analog gemäß der vorliegenden Erfindung kann gemäß der folgenden Vorgehensweisen hergestellt werden:
- 1) Isolation des repräsentativen Subtilisin-Gens aprA aus B. subtilis;
- 2) Klonieren des aprA-Gens auf einem Vektor, der die Ausnutzung ortsgerichteter Oligonucleotid-Mutagenese erlaubt, um gewünschte Modifikationen zu schaffen;
- 3) Ortsgerichtete Mutagenese und Sequenzieren der resultierenden DNA, um das Vorhandensein der gewunschten Mutation zu bestätigen;
- 4) Konstruktion eines Expressionsvektor, um die Synthese des mutierten Enzyms in B. subtilis zu steuern;
- 5) Konstruktion mutierter B. subtilis-Stämme, die Subtilisin und neutrale Protease nicht synthetisieren;
- 6) Isolation des Enzyms im extrazellulären Wachstumsmedium und seine Reinigung;
- 7) Praktizieren von Verfahren zur Insertion des Gens, das für das verbesserte Enzym kodiert, in das Chromosom eines B. subtilis-Stammes, das zuvor mutiert worden ist, um die Synthese von endogenen Proteasen zu blockieren.
- Wie hierin verwendet, werden die spezifischen Subtilisin-Analoge angegeben, indem die ersetzte oder deletierte Aminosäure in Klammern dargestellt wird. Zum Beispiel bezeichnet ein [Ser¹&sup0;&sup9;]-Subtilisin ein Subtilisin-Molekül mit einem Serin in Aminosäureposition 109 und ein [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin bezeichnet ein Subtilisin-Molekül mit einem Serin an den Aminosäurepositionen 109 und 218.
- In Beispiel 1 wird das aprA-Gen, das Subtilisin kodiert, aus dem B. subtilis-Genom isoliert. In Beispiel 2 wird das aprA- Gen ortsgerichteter Mutagenese unterzogen. In Beispiel 3 wird ein Expressionsvektor konstruiert, der das mutierte aprA-Gen enthält. In Beispiel 4 wird ein [Ser¹&sup0;&sup9;]-Subtilisin-Analog hergestellt. Beispiel 5 beschreibt die Herstellung eines [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analogs. Beispiel 6 beschreibt die Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analogs. In Beispiel 7 wird ein [Asp&sup7;&sup6;, Asp&sup7;&sup7;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analog hergestellt. Beispiel 8 beschreibt die Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analogs. In Beispiel 9 werden zwei mutante Stämme von B. subtilis konstruiert, die keine nachweisbaren extrazellulären Proteasen produzieren. Beispiel 10 beschreibt Verfahren zur Integration eines mutierten aprA-Gens in das Chromosom von B. subtilis. In Beispiel 11 werden Wildtyp- und mutante aprA-Subtilisine isoliert und gereinigt. Die Beispiele 12 bis 14 vergleichen Thermostabilität von [Ser²¹&sup8;]-Subtilisin mit derjenigen von Wildtyp-aprA-Genprodukt.
- Zusätzlich zu einem Subtilisin-Analog der vorliegenden Erfindung können Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen:
- (a) Wenigstens ein Tensid, das anionisch, nicht-ionisch oder amphoterisch sein kann, oder eine wasserlösliche Seife. Typischerweise wird ein anionisches Tensid (z.B. ein lineares Alkylarylsulfonat) in Vermischung mit einem nicht-ionischen (z.B. einem Alkylphenylpolyglykolether) in Mengen von 5-30 bzw. 1-5 Gewichtsprozent der Waschmittelzusammensetzung verwendet.
- (b) Einen oder mehrere Gerüststoffe, vorzugsweise mit einer gleichzeitigen Maskierungsfunktion. Natriumtripolyphosphat, Natriumcitrat, Natriumsilicat und Zeolithe sind Beispiele solcher Verbindungen, die üblicherweise von 10 bis 70 Gewichtsprozent der Waschmittelzusammensetzung ausmachen.
- (c) Ein Bleichmittel, vorzugsweise eine Peroxyverbindung, wie etwa Natriumperborat, das typischerweise in einer Menge von bis zu 30 Gewichtsprozent der Zusammensetzung enthalten ist.
- (d) Hilfsstoffe, wie etwa Carboxymethylcellulose, optische Aufheller und Duftstoffe. Falls erforderlich, wird ein Mittel zur pH-Einstellung zugegeben, um einen pH im Waschmedium im Bereich von 8,0 bis 10,5 zu ergeben.
- Die Waschmittelzusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge eines oder mehrerer der Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung. Wie hierin verwendet, bedeutet "wirksame Menge eines Subtilisin-Analogs" die Menge an Subtilisin-Analog, die notwendig ist, um die enzymatische Aktivität zu erreichen, die in der spezifischen Waschmittelzusammensetzung notwendig ist. Solche wirksamen Mengen werden von einem Fachmann auf diesem Gebiet leicht ermittelt und beruhen auf vielen Faktoren, wie etwa dem bestimmten eingesetzten Subtilisin-Analog, der Reinigungsanwendung, der spezifischen Zusammensetzung der Waschmittelzusammensetzung, ob eine flüssige oder trockene Zusammensetzung erforderlich ist und dergleichen.
- Die teilchenförmige Subtilisin-Analog-Zubereitung der Erfindung wird in einer Menge zugegeben, die so berechnet ist, daß sie eine Enzymaktivität von wenigstens 0,1 Anson-Einheiten (AU, siehe unten), vorzugsweise 0,5-2,5 AU pro 100 g Waschmittelzusammensetzung ergibt. Falls erforderlich, kann der Rest auf 100% anorganischer Füllstoff sein, vorzugsweise Natriumsulfat.
- Flüssigwaschmittelzusammensetzungen können aus Enzym-Aufschlämmungen hergestellt werden, vorzugsweise in nicht-wässrigen Medien. Typischerweise können solche Aufschlämmungen aus einer Suspension von fein vermahlenem Subtilisin-Analog-Konzentrat in einem flüssigen nicht-ionischen Tensid, zum Beispiel Tergitol 15 S 9, oder einer Mischung solcher Tenside bestehen. Üblicherweise wird die Aufschlämmung auch einen oder mehrere anorganische Füllstoffe enthalten, wie etwa fein vermahlenes Natriumchlorid, fakultativ in Vermischung mit einem Suspensionsstabilisator, zum Beispiel pyrogenom Siliciumdioxid (Aerosil 200). Tergitol und Aerosil sind Warenzeichen.
- Ein Subtilisin-Analog der Erfindung wird in einer Menge zugesetzt, die so berechnet ist, daß sich eine Proteaseaktivität von wenigstens 0,1 AU, vorzugsweise 0,5-2,5 AU pro 100 g Flüssigwaschmittelzusammensetzung ergibt
- Die Waschmittelzusammensetzungen können in der üblichen Art und Weise hergestellt werden, zum Beispiel durch Vermischen der Bestandteile miteinander. Alternativ wird ein Vorgemisch hergestellt, das dann mit den restlichen Inhaltsstoffen vermischt wird.
- Wegen der beschriebenen guten Stabilitäts- und Aktivitätseigenschaften können die Subtilisin-Analoge gemäß der Erfindung in allen Bereichen verwendet werden, in denen proteolytische Enzyme im allgemeinen verwendet werden. Insbesondere kann es für Waschmittel und Reinigungsmittel oder Fleckentferner, als ein Enthaarungsmittel beim Gerben und auch in der Nahrungsmittelindustrie zur Herstellung von Proteinhydrolysaten und in der Serologie zum Nachweis unvollständiger Antikörper verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie und in der Serologie, daß die Subtilisin-Analoge gemäß der Erfindung hervorragende Stabilität in der festen oder gelösten Form besitzen, so daß physiologisch annehmbare Mengen Calcium-Ionen nicht erforderlich sein müssen, um das Subtilisin-Analog in wässrigen Lösungen zu stabilisieren, im Gegensatz zu denjenigen anderer Enzymzubereitungen.
- Die folgenden Beispiele werden weiter dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen, obgleich man verstehen wird, daß die Erfindung nicht auf diese spezischen Beispiele beschränkt ist.
- B. subtilis-Stamm QB127 (trpC2 leuA8 sacUh200) [Lepesant, et al., Molec. Gen. Genet., 118, 135-160 (1982)] wurde vom Bacillus Genetic Stock Center an der Ohio State University, Columbus, Ohio erhalten. Dieser Stamm überproduziert extrazelluläre Serin- und Metall-Proteasen, α-Amylase und Levansucrase relativ zu isogenen sacU&spplus;-Stämmen wegen dem pleiotropen Effekt der sac-Uh200-Mutation [Lepesant, et al., in Schlessinger, D., Hrg., Microbiology, 1976, American Society for Microbiology, Washington, D.C., S. 65 (1976)]. So ist Stamm QB127 eine geeignete Quelle für DNA zum Isolieren des aprA-Gens, das für Subtilisin kodiert.
- Genom-DNA wurde aus Zellen von B. subtilis-Stamm QB127 gemäß dem Verfahren von Saito et al., Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963) isoliert. Gereinigte chromosomale DNA wurde vollständig mit der EcoRI-Restriktionsendonuclease verdaut.
- Die resultierenden DNA-Fragmente wurden auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese getrennt und Fragmente im Bereich von 4,4 bis 8,0 Kilobasen (kb) wurden isoliert. Diese Fragmente wurden an pCFM936(A.T.C.C. No. 53,413 von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) einem Escherichia coli(E. coli)-Plasmid ligiert, das höhere Kopienzahlen bei erhöhten Temperaturen zeigt und das Kanamycin-Resistenz verleiht. Der Vektor wurde mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Kalbsintestinal-Phosphatase vor der Ligation dephosphorylisiert.
- Die Ligationsprodukte wurden in E. coli C600 (A.T.C.C. No. 23724 von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive' Rockville, Maryland) eingeführt, und im Anschluß an Inkubation über Nacht auf L-Agar, ergänzt mit 10 ug/ml Kanamycin, wurden Kanamycin-resistente Wirtszellen selektioniert. Plasmid-DNA wurde durch Inkubieren der selektionierten Wirtszellen bei 42ºC für 4 Stunden amplifiziert. Kolonien wurden dann auf Nitrocellulose-Filter überführt und gemäß einem Koloniehybridisierungsverfahren weiterverarbeitet, das von Grunstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 72, 3961 (1975), beschrieben ist.
- Eine Oligonucleotid-Sonde wurde verwendet, um auf Kolonien zu screenen, die das Subtilisin-Gen auf pCFM936 enthielten. Die Sonde, die mit dem Phosphitverfahren synthetisiert worden war, das von Beaucage, et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862 (1981) beschrieben ist, besaß die Nucleotidsequenz
- 5' GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 3'
- die dem Amino-Terminus des aprA-Genproduktes entspricht (Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1184-1188 (1984); Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)). Eine Hybridisierungstemperatur von 55ºC wurde verwendet und 5 positive Kolonien wurden aus insgesamt 400 identifiziert. Die Plasmid-DNA aus einer der positiven Kolonien wurde mit pCFM936 apr2 bezeichnet.
- Plasmid pDCM936 apr2 wurde mit EcoRI allein, mit HindIII allein und mit EcoRI und HindIII in Kombination verdaut. Die Größen der EcoRI-Fragmente des Subtilisin-Gens entsprachen denjenigen, die bei Stahl et al., aaO, beschrieben sind, aber mehrere, an anderer Stelle nicht beschriebene HindIII-Stellen wurden entdeckt. Wie hierin in Beispiel 3 beschrieben, wurden zwei der HindIII-Stellen bei den genetischen Manipulationen des Subtilisin-Gens eingesetzt.
- Es wurde festgestellt, daß ein großes, 6,5 kb langes EcoRI- Fragment von B. subtilis-QB127-Genom-DNA das aprA-Gen, seine Regulator-Sequenzen und nicht damit zusammenhängende flankierende Sequenzen trug, indem verifiziert wurde, daß Restriktionsenzym-Verdauungsprodukte den Ergebnissen entsprachen, die von Stahl et al., aaO, berichtet worden waren. Dies wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Didesoxykettenterminationsverfahrens bestätigt, das von Sanger, et al., J. Mol. Biol., 143, 161-178 (1980) beschrieben ist. Es wurde auch festgestellt, daß ein 3,0 kb langes EcoRI-KpnI-Subfragment des 6,5 kb langen EcoRI-Fragmentes, wie dargestellt in Fig. 2, das aprA-Gen, seine Regulatorsequenzen und nicht damit zusammenhängende flankierende Sequenzen enthielt. Obgleich von dem KpnI-EcoRI-Fragment von Stahl et al. und in der Legende zu Fig. 1 darin berichtet wird, daß es 2,5 kb lang ist, zeigt ein Vergleich des Maßstabs von Fig. 1 und der mit Maßstab versehenen Darstellung des Fragmentes darin, daß das KpnI-EcoRI- Fragment sogar bei Stahl et al. beträchtlich größer als 2,5 kb ist.
- Ein Klonierungsvektor für Bacillus-Wirtssysteme, Plasmid pAMB11, wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid pTG402 (Northern Regional Research Laboratories, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, Stamm-Nummer NRRL B-15264) wurde mit der RsaI-Restriktionsendonuclease partiell verdaut. Fragmente wurden an M13 mp18 ligiert (erhältlich von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland als Katalog-Nummer 8227SA), das zuvor mit HincII verdaut worden war. Ligationsprodukte wurden in E. coli JM103 (erhältlich von Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey als Katalog-Nummer 27- 1545-01) durch Transformation gemäß dem Verfahren von Mandel, et al., J. Mol. Biol., 53, 154, (1970), eingeführt. Bakteriophagen-Plaques wurden mit 0,5M Catechol (hergestellt in destilliertem Wasser) besprüht, um die funktionale Expression eines xylE-Gens, abgeleitet von pTG402, nachzuweisen. Das E-Gen kodiert Catechol-2,3-Dioxygenase und ist nützlich zum Nachweis von Promotoren in einer Vielzahl von Organismen [Zukowski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80, 1101-1105 (1983)].
- Das xylE-Gen wurde dann als ein 1,0 kb langes EcoRI-PstI-Fragment überführt in das E. coli/B. subtilis-Plasmid pHV33 (erhältlich von der American Type Culture Collection als A.T.C.C. 39217) [Primose, et al. Plasmid, 6, 193-201 (1981)], erhalten von R. Dedonder (Institut Pasteur, Paris, Frankreich). Das pHV33-Plasmid war zuvor mit EcoRI und PstI verdaut worden, so daß das xylE-enthaltende Fragment, wenn es in dieser Region ligiert wird, ein Gen für Ampicillin-Resistenz inaktivieren würde. Das resultierende Plasmid, pAMB21, enthält ein funktionales xylE-Gen in E. coli-Wirtszellen, erfordert aber das Hinzufügen eines Promotors für xylE, um in B. subtilis-Wirtszellen exprimiert werden zu können. E. coli-Zellen, die pAMB21 enthalten, sind gegenüber Tetracyclin (15 ug/ml) und Chloramphenicol (20 ug/ml) resistent, während B. subtilis-Zellen, die pAMB21 enthalten, nur gegen Chloramphenicol (5 ug/ml) resistent sind.
- Die toop-Transkriptionsterminationssequenz von Bakteriophage Lambda wurde von Plasmid pCFM936 (auf einem 400 Basenpaare langen PstI-BglII-Fragment) zur einzigen PstI-Stelle von pAMB21 transferiert. Ein synthetisches Nucleotid mit der Sequenz, 5' GATCTGCA 3', wurde konstruiert, um die BglII-Extremität des toop-Fragmentes an die PstI-Stelle des Vektors pAMB21 zu binden. Das resultierende Plasmid wurde mit pAMB22 bezeichnet und hatte mit pAMB21 identische Eigenschaften, ausgenommen den Einschluß eines Transkriptionsterminators. Das pAMB22- Plasmid ist nützlich zum Nachweis starker Promotoren, die in B. subtilis funktional sind.
- Das 1,4 kb lange EcoRI-BglII-Fragment von DNA aus pAMB22, das xylE und toop enthält, wurde aus einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt nach Elektrophorese restringierter Fragmente isoliert. Das 1,4 kb lange DNA-Stück wurde ligiert an Plasmid pBD64 (erhältlich vom Bacillus Genetic Stock Center, Nummer 1E22), das zuvor mit EcoRI und BamHI verdaut worden war. Das resultierende 5,3 kb lange Plasmid, pAMB11, enthält die Polylinker-Sequenz von M13mp18 (EcoRI, SstI, XmaI, Sma, BamHI und XbaI) flußaufwärts des xylE-Gens, dem toop folgt, wie in Figur 3 dargestellt. Das pAMB11-Plasmid ist, zur Replikation in B. subtilis und verleiht Wirtszellen Resistenz gegen Chloramphenicol (5 ug/ml) und/oder Kanamycin (5 ug/ml).
- Wie in Fig. 4 veranschaulicht, wurde das gereinigte EcoRI- KpnI-Fragnent, das aprA enthielt, auf pAMB11 kloniert, um pAMB111 zu bilden. Ligationsprodukte wurden in B. subtilis MI112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (erhältlich vom Bacillus Genetic Stock Center als No 1A423) durch das Protoplastentransformationsverfahren, das von Chang et al., Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979), beschrieben ist, eingeführt. B. subtilis MI112 ohne Plasmid-DNA ist proteaseprofizitär (Prt&spplus;- Phänotyp), aber die sekretierten Subtilisin-Gehalte sind recht niedrig. Chloramphenicol-resistente (Cmr) Transformanten wurden auf L-Agarplatten überführt, die mit 1,5% (w/v) Magermilch und 5 ug/ml Chloramphenicol ergänzt waren, dann bei 37ºC inkubiert.
- Nach Inkubation bei 37ºC für ungefähr 16 Stunden, produzierten Kolonien von MI112, die Plasmid pAMB111 enthielten, einen klaren Halo, der jede Kolonie umgab. Halos wurden durch die proteolytische Wirkung von Subtilisin auf der Caseinkomponente des Magermilch-Mediumergänzungsstoffes gebildet. MI112, das den pAMB11-Vektor allein enthielt, besaß keinen sichtbaren Halo nach 16 Std. Inkubationl obgleich ein schwacher Halo sich letztendlich nach 40 Std. Inkubation bei 37ºC entwickelte. Zellen, die pAMB111 trugen, waren durch einen Unterschied in der Halogröße deutlich unterschieden von Zellen, die pAMB11 trugen. Die Klonierung des aprA-Gens in einer vollständig funktionalen Form führte so zu einer Produktion und Sekretion von Subtilisin durch B. subtilis auf hohem Niveau.
- Wie in Fig. 4 veranschaulicht, wurde ein 3,0 kb langes EcoRI- KpnI-Genomfragment, dessen Isolierung in Beispiel 1 beschrieben ist, mit HindIII verdauut, um drei Fragmente herzustellen: (1) ein 1,1 kb langes EcoRI-HindIII-Fragment, das genetische Regulatorsequenzen für aprA-Genexpression, die "Präpro"-Region des Gens, das für extrazellulären Export von Subtilisin erforderlich ist, und die DNA-Sequenz, die für die ersten 49 Aminosäuren von reifem Subtilisin kodiert, trägt; (2) ein 1,1 kb langes HindIII-HindIII-Fragment, das DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuren 50 bis 275 (Carboxyl-Terminus) von Subtilisin kodieren, zusammen mit einer Transkriptionsterminationssequenz und 3' nicht-kodierenden Sequenzen trägt; und (3) ein 0,8 kb langes HindIII-KpnI-Fragment, das 3' nicht-kodierende Sequenzen enthält.
- Das 1,1 kb lange Fragment, das von HindIII-Stellen flankiert ist, wurde an die einzige HindIII-Stelle von Bakteriophage M13 mp18 für die Zwecke der DNA-Sequenzierung und ortsgerichteten Mutagenese kloniert. Einer der Rekombinanten, bezeichnet mit M13 mp18 apr2, lieferte einzelsträngige Matrizzen-DNA, die für ortsgerichtete Mutagenese des aprA-Gens erforderlich ist.
- Die Kodierungsregion des aprA-Gens wurde sequenziert und die Ergebnisse der Sequenz sind in Tabelle 1 hierin angegeben. Es sollte bemerkt werden, daß die spezifische Identität der anfänglichen 5 Codons der Leader-Region dem Bericht von Stahl et al., aaO, und Wong et al., aaO, über Sequenzinformation für das aprA-Gen zuzuschreiben ist und daß Codon-Sequenzunterschiede von Stahl et al., aaO, an den Aminosäurepositionen 84 und 85 bestehen. Genauer gesagt berichten Stahl et al., aaO, über ein Codon GTT (das für Valin kodiert) an Aminosäureposition 84, während in Tabelle 1 das Codon GTA (das auch für Valin kodiert) auftaucht. Stahl et al., aaO, berichten auch über ein Codon AGC (das für Serin kodiert) an Aminosäureposition 85, im Gegensatz zum Codon GCG (das für Alanin kodiert) in Tabelle 1. TABELLE 1 TABELLE 1 (FORTSETZUNG) TABELLE 1 (FORTSETZUNG)
- Bakteriophage M13 mp18 apr2 wurde durch Inserieren eines 1,1 kb langen HindIII-HindIII-Fragmentes von B. subtilis-QB127- Genom-DNA, die Nucleotidsequenzen trägt, die für die Aminosäuren 50 bis 275 (Carboxyl-Terminus) von aprA-Subtilisin zusammen mit einer Transkriptionsterminationssequenz und 3' nichtkodierenden Sequenzen kodiert, in die einzige HindIII-Stelle von Bakteriophage M13 mp18 konstruiert. Um die 3' nicht-kodierenden Sequenzen zu eliminieren, wurde eine KpnI-Restriktionsendonucleasestelle durch ortsgerichtete Mutagenese an einer Position unmittelbar im Anschluß an die Transkriptionsterminationssequenz eingeführt.
- Ortsgerichtete Mutagenese wurde gemäß einem Verfahren durchgeführt, das von Norrander et al., Gene, 26, 101-106 (1983) beschrieben ist. Einzelsträngige DNA aus M13 mp18 apr2 wurde an einen Primer,
- 5' TCCTGAGGTACCGGCGCATTC 3',
- anneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et. al., Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981) beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden in dieser Region mit Ausnahme der zwei (durch Sternchen markierten), wo ein Thymin (T) zu Guanin (G) geändert wurde und ein anderes Thymin (T) zu Adenin (A) geändert wurde, wodurch eine KpnI-Stelle (unterstrichen) in dieser Region geschaffen wurde.
- Der Primer wurde an M13 mp18 apr2-DNA bei 65ºC anneliert und die annelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und dann für 2 Std. bei 15ºC in einer Reaktionsmischung polymerisiert, die aus 12,5 ul Lösung von annelierter DNA, 2,5 ul von je 10 mM dATP, dCTP und dGTP, 20 ul von 12 mM ATP, 0,1 ul Klenow DNA-Polymerase, 0,1 ul T4-DNA-Ligase und 13 ul sterilem destillierten Wasser bestand. Die resultierende doppelsträngige, kovalent geschlossene, zirkuläre DNA wurde durch Transfektion in E. coli JM103 eingeführt.
- Bakteriophagen-Plaques wurden dann auf Gene Screen (New England Nuclear, Beverly, Massachusetts)-Hybridisierungsmembranen überführt. Plaques, die DNA mit der gewünschten Basenänderung enthielten, wurden durch Hybridisierung an das radioaktiv markierte (γ-³²P) synthetische Oligonucleotid, das für die oben beschriebene mutagene Priming-Reaktion verwendet wurde, identifiziert. Hybridisierung wurde bei einer restriktiven Temperatur (65ºC) durchgeführt, damit nur DNA, die eine KpnI-Mutation trug, an das synthetische Oligonucleotid hybridisieren würde. Das Vorhandensein der KpnI-Mutation flußabwärts des aprA-Gens auf DNA aus einem einzelnen gereinigten Plaque, bezeichnet mit M13 mp18 apr2 KpnI, wurde bestätigt durch DNA- Sequenzierung mit dem Verfahren, das von Sanger et al., aaO, beschrieben ist, und Restriktionsenzymanalyse.
- Ein 1,1 kb langes Segment, das den größten Teil der 3' nichtkodierenden Region trug, wurde deletiert durch Verdauen von M13 mp18 apr2 KpnI mit KpnI, Religieren der Verdauungsprodukte bei einer Konzentration von 500 ng DNA/ml, dann Einführen der Ligationsprodukte in E. coli JM103 durch Transfektion. Bakteriophagen-Plaques, die DNA mit der gewünschten 0,35 kb langen Deletion enthielten, wurden durch Restriktionsendonucleaseanalyse identifiziert. Bakteriophage aus einem solchen Plaque wurde bezeichnet mit M13 mp18 apr4 (Fig.7). M13 mp18 apr4 lieferte einzelsträngige Matrizen-DNA für ortsgerichtete Mutagenese des aprA-Gens, hierin im weiteren in Beispiel 3 beschrieben.
- Um mutierte Subtilisin-Gene in B. subtilis zu exprimieren, wurde das Plasmid pAMB106 als ein Vehikel für das mutierte Gen wie folgt konstruiert:
- 1) pAMB111 wurde mit HindIII verdaut. Ein 1,1 kb langes Segment, das den größten Teil des aprA-Gens trug, wurde durch erneutes Ligieren von HindIII-Verdauungsprodukten von pAMB111 bei einer Konzentration von ungefähr 1 ug/ml deletiert. Dies führte zur Bildung von pAMB110, wie in Fig. 4 veranschaulicht. Das pAMB110-Plasmid trägt genetische Regulator-Sequenzen für die Expression des Subtilisin-Gens, die "Präpro"-Region, die für die Sekretion von Subtilisin erforderlich ist, und die DNA-Sequenz, die für die 3' nicht-kodierende Region von reifem Subtilisin und die ersten 49 Aminosäuren von reifen Subtilisin kodiert.
- 2) Plasmid pAMB110 wurde mit BamHI und PstI in Kombination verdaut. Dies erzeugte DNA-Fragmente in zwei Größen, 6,2 kb und 1,0 kb. Das 1,0 kb lange Fragment trägt das xylE-Gen, das für Catechol-2,3-dioxygenase kodiert, aus dem TOL-Plasmid von Pseudomonas putida mt-2 (Zukowski et al., aaO).
- 3) Das größere, 6,2 kb lange -BamHI-PstI-Fragment wurde mit Hilfe eines einzelsträngigen synthetischen Oligonucleotids, 5' GATCTGCA 3', das mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et al., aaO, beschrieben ist, und T4- DNA-Ligase selbstligiert. Ligationsprodukte wurden in B. subtilis MI112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (erhältlich vom Bacillus Genetic Stock Center als No. 1A423) durch das Protoplastentransformationsverfahren, das von Change et al., Mol. Gen. Genet. 168, 111-115 (1979) beschrieben ist, eingeführt.
- Chloramphenicol-resistente (CmR) Kolonien wurden auf Plasmidgehalt gescreent. Das 6,2 kb lange Plasmid pAMB106 wurde durch Restriktionsendonucleaseanalyse identifiziert. Es ist identisch mit Plasmid pAMB110, mit der Ausnahme, daß xylE deletiert worden ist (Figur 6).
- Weil ihm DNA-Kodierung für die Aminosäuren 50 bis 275 von aprA-Subtilisin fehlt, synthetisiert pAMB106 nicht Subtilisin, wenn es in B. subtilis-Wirtszellen eingeführt wird. Subtilisin wird nur nach Insertion des Restes des Subtilisin-Gens synthetisiert, d.h. entweder der nativen DNA-Sequenz oder einer ein Analog kodierenden Sequenz.
- Einzelsträngige DNA aus Bakteriophage M13mp18 apr4 wurde an einen Primer
- anneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et al., aaO, beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, die Codons für die Aminosäuren 106 bis 113 von aprA-Subtilisin umfassen, mit Ausnahme einer Basenänderung (markiert mit einem Sternchen), wo ein A zu einem G verändert wurde, um den Übergang zu ermöglichen, der Asn¹&sup0;&sup9; (Codon AAC) zu Ser¹&sup0;&sup9; (Codon AGC) ändern würde.
- Der Primer wurde an M13mp18 apr4-DNA bei 65ºC anneliert und die annelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und dann polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen überführt, dann wurden diejenigen, die DNA mit der gewünschten Basenänderung enthielten, durch Hybridisierung an ein radioaktiv markiertes (α-³²P) Oligonucleotid identifiziert, das für die oben beschriebene mutagene Priming-Reaktion verwendet wurde. Hybridisierung wurde bei 65ºC durchgeführt. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, die als M13mp18 apr4[Ser¹&sup0;&sup9;] bezeichnet wurde. Doppelsträngige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, dann wurde das 750 bp lange Fragment, das den mutierten Teil des aprA- Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und Kpnl verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB129, kann für die Synthese und Sekretion von [Ser¹&sup0;&sup9;]- Subtilisin in geeignete B. subtilis-Wirtszellen eingeführt werden.
- Einzelsträngige DNA aus M13mp18 apr4[Ser¹&sup0;&sup9;] wurde an einen Primer:
- anneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et al., aaO, beschrieben ist. Der Primer war homolog zu Nucleotiden, die Codons für die Aminosäuren 215 bis 220 von aprA-Subtilisin umfassen, mit Ausnahme einer Basenänderung (markiert mit einem Sternchen), wo ein A zu einem G verändert wurde, um den Übergang zu ermöglichen, der Asn²¹&sup8; (Codon AAC) zu Ser²¹&sup8; (Codon AGC) verändern würde. Die Bedingungen für Annelierung, Polymerisation, Ligation, Transfektion und Identifikation von positiven Plaques waren, wie in Beispiel 2 beschrieben. Ein einziger gereinigter Plaque enthielt Bakteriophage, die als M13mp18 apr4 [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] bezeichnet wurde. Doppelsträngige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, dann wurde ein 750 bp langes Fragment, das die zwei Mutationen trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB130, kann für die Synthese und Sekretion von [Ser109, Ser3²¹&sup8;]-Subtilisin in B subtilis-Wirtszellen eingeführt werden.
- Einzelsträngige DNA aus M13mp18 apr4 [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] wurde an einen Primer:
- anneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et al., aaO, beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, die Codons für die Aminosäuren 74 bis 79 von aprA-Subtilisin umfassen, mit Ausnahme einer Basenänderung (markiert mit einem Sternchen), wo ein A zu einem G verändert wurde, um den Übergang zu ermöglichen, der Asn&sup7;&sup6; (Codon AAT) zu Asp&sup7;&sup6; (Codon GAT) verändern würde.
- Der Primer wurde an M13mp18 [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-DNA bei 65ºC anneliert und die annelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen und diejenigen, die DNA mit der gewünschten Basenänderung enthielten, wurden durch Hybridisierung identifiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 46ºC durchgeführt wurde. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, die mit M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] bezeichnet wurde. Doppelsträngige DNA aus der Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, dann wurde ein 750 bp langes Fragment, das die drei Mutationen des aprA.-Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB131, kann für die Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin in B. subtilis-Wirtszellen eingeführt werden.
- Einzelsträngige DNA aus M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] wurde an einen Primer:
- anneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et al., aaO, beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, die Codons für die Aminosäuren 74 bis 80 von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin umfassen, mit Ausnahme zweier Basenänderungen (markiert durch Sternchen), wo ein A zu einem G verändert wurde und ein C zu einem T verändert wurde, für die Übergänge, die Asn&sup7;&sup7; (Codon AAC) zu Asp&sup7;&sup7; (Codon GAT) änderte.
- Der Primer wurde an M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-DNA bei 65ºC anneliert und die annelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen überführt und diejenigen, die DNA mit den gewünschten Basenänderungen enthielten, wurden durch Hybridisierung identifiziert, wie beschrieben in Beispiel 2, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 45ºC durchgeführt wurde. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, die als M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Asp&sup7;&sup7;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] bezeichnet wurde. Doppelsträngige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, dann wurde das 750 bp lange Fragment, das die vier Mutationen des aprA-Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB132, kann für die Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Asp&sup7;&sup7;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin in B. subtilis- Wirtszellen eingeführt werden.
- Einzelsträngige DNA aus M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] wurde an einen Primer:
- anneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et al., aaO, beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, die Teilcodons für die Aminosäuren 75 und 83 und Gesamtcodons für die Aminosäuren 76 bis 82 von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin umfaßten, mit der Ausnahme von drei Basenänderungen (markiert durch Sternchen), bei denen ein A zu einem G verändert wurde, ein T zu einem A verändert wurde und ein C zu einem A verändert wurde, was Ile&sup7;&sup9; (Codon ATC) zu Glu&sup7;&sup9; (Codon GAA) änderte.
- Der Primer wurde an M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-DNA bei 65ºC anneliert und die annelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und wurde polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen und diejenigen, die die gewünschten Basenänderungen enthielten, wurden durch Hybridisierung identifiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 45ºC durchgeführt wurde. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, die als M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] bezeichnet wurde. Doppelsträngige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, dann wurde ein 750 bp langes Fragment, das die vier Mutationen des aprA-Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB133, kann für die Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin in B. subtilis-Wirtszellen eingeführt werden.
- Weil die meisten Bacilli alkalische und/oder neutrale Proteasen in das sie umgebende Wachstumsmedium sekretieren, ist es bevorzugt, daß Mutationen in endogene Gene für alkalische und neutrale Proteasen von B. subtilis eingeführt werden, um deren Synthese zu blockieren, so daß mutierte Subtilisin-Gene, wenn sie in die mutante Zelle eingeführt sind, mutierte Subtilisine produzieren können, die dann in einem Medium sekretiert werden, das frei ist von anderen Proteasen, die wahrscheinlich die Isolierung von intakten Subtilisin-Analogen beeinflussen würden. Zwei mutante B. subtilis-Stämme BZ24 und BZ25, die keine nachweisbaren extrazellulären Proteasen produzieren, wurden gemäß der folgenden Vorgehensweise konstruiert:
- Zunächst wurde ein Plasmidvehikel, das zur Replikation in E. coli in der Lage ist, aber nicht in B. subtilis, sofern nicht durch homologe Rekombination in das B. subtilis-Chromosom integriert, wie folgt konstruiert. Plasmid pBD64 (Bacillus Genetic Stock Center, Nummer 1E22) wurde vollständig mit HpaII verdaut, um drei Fragmente mit einer Größe von 2,95 kb, 1,0 kb und 0,75 kb zu erzeugen. Diese Fragmente wurden dann als eine Mischung an Plasmid pBR322 (A.T.C.C. 37017) ligiert, das zuvor mit ClaI verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden in E coli C600 (erhältlich von der American Type Culture Collection als A.T.C.C. 23724) durch Transformation [Mandel, et al., J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)] eingeführt. Selektion erfolgte auf Zellen, die gegen Chloramphenicol (20 pg/ml) und Ampicillin (50 pg/ml) resistent waren. Plasmid-DNA aus zwölf Transformanten wurde mit einem alkalischen Extraktionsverfahren hergestellt, das von Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979), beschrieben ist, dann mit HindIII und EcoRI in Kombination verdaut, um das Vorhandensein von inseriertem(n) Fragment(en) zu verifizieren. Es wurde festgestellt, daß ein solches Plasmid, bezeichnet als pAMB30, das 1,0 und das 0,75 kb lange HpaII-Fragment von pBD64 in der ClaI-Stelle von pBR322 trug. Diese Fragmente enthalten das Chloramphenicol-Acetyltransferase(cat)-Gen, das in E. coli und B. subtilis funktional ist. Verdauungen mit BglII und getrennt mit Sau3A bestätigten die Identität und Orientierung des cat-Gens auf pAMB30, wie veranschaulicht in Fig.5.
- Weil pAMB30 eine Replikationsursprung-Sequenz fehlt, die in B. subtilis funktional ist, kann es nicht als ein autonomes Replikon in B. subtilis-Wirtszellen replizieren. Andererseits enthält pAMB30 den von pBR322 abgeleiteten Replikationsursprung, der in E. coli funktional ist, das Plasmid kann somit in E. coli-Wirtszellen vermehrt werden. Plasmid pAMB30 ist auf wenigstens zwei Weisen nützlich. Zunächst kann ein DNA-Fragment, das einen funktionalen Replikationsursprung in B. subtilis enthält, nachgewiesen werden, wenn es auf pAMB30 kloniert wird, so daß das Plasmid im extrachromosomalen Zustand autonom replizieren wird. Zweitens kann Plasmid pAMB30 sich in das Genom von B. subtilis an einer Homologiestelle zwischen dem Chromosom und der B. subtilis-DNA, die auf pAMB30 kloniert ist, integrieren. Dies ist von Haldenwang, et al., J. Bacteriol., 142, 90-98 (1980) und Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983) unter Verwendung von Plasmidvehikeln nachgewiesen worden, die ähnlich zu, aber nicht identisch zu pAMB30 sind.
- Plasmid pAMB2l (beschrieben in Beispiel 1) wurde mit EcoRI und PstI verdaut, um das xylE-Gen auf einem 1,0 kb langen Fragment zu isolieren. Das Fragment wurde an pAMB30 ligiert, das zuvor mit EcoRI und PstI verdaut worden war. Ligationsprodukte wurden in E. coli C600 durch Transformation eingeführt. Selektion erfolgte auf Chloramphenicol-resistente (20 ug/ml) Wirtszellen, die auf Ampicillin empfindlich waren (50 ug/ml), wegen der Insertion des xylE-Fragments von pAMB21 in das Strukturgen für Ampicillin-Resistenz von pAMB30. Das resultierende Plasmid, pAMB30/21, besitzt Eigenschaften, die identisch sind mit pAMB30, besitzt aber zusätzlich ein funktionales xylE-Gen.
- Plasmid pAMB110, welches das aprA-Gen trägt, das von einer Region deletiert ist, die für die letzten 226 Aminosäuren von reifen Subtilisin kodiert, wurde mit EcoRI und KpnI verdaut. Das 1,9 kb lange Fragment von B. subtilis-DNA, die genetische Regulator-Sequenzen für die aprA-Genexpression, die "Präpro"- Region, die DNA-Sequenz, die für die ersten 49 Aminosäuren von reifem Subtilisin kodiert, und 3' nicht-kodierende Sequenzen enthielt, wurde an pAMB30/21 ligiert, das zuvor mit EcoRI und KpnI verdaut worden war. Ligationsprodukte wurden in E. coli C600 durch Transformation eingeführt. Plasmid-DNA aus mehreren Transformanten wurde mit dem alkalischen Extraktionsverfahren von Birnboim et al., aaO, isoliert und das Vorhandensein des inserierten 1,9 kb langen Fragments wurde durch mehrfache Restriktionsendonucleaseverdauungen verifiziert. Ein solches Plasmid, bezeichnet als pAMB301, wurde zur weiteren Verwendung zurückbehalten.
- B. subtilis-Stamm BGSC1A274 (Bacillus Genetic Stock Center) trägt eine Mutation am npr-Locus und ist nicht in der Lage, extrazelluläre neutrale Protease zu produzieren. Das Plasmid pAMB301 wurde in das Genom von B. subtilis BGSC1A274 durch Transformation von kompetenten Zellen integriert [Spizizen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 44, 1072-1078 (1958)]. Selektion erfolgte auf Chloramphenicol-resistente (5 ug/ml) Wirtszellen, die dann mit sterilen Zahnstochern auf L-Agar überführt wurden, das mit 1,5% (w/v) Magermilchpulver und (5 ug/ml) Chloramphenicol ergänzt war. Diesen Zellen, die keinen klaren Halo erzeugten, der die Kolonie umgab, fehlte die Fähigkeit, extrazelluläre neutrale und Serin-Proteasen zu produzieren, wegen der Kombination der npr-Mutation zusammen mit der neu eingeführten aprA-Mutation. Die aprA-Mutation war eine Deletion der letzten 226 Aminosäuren von reifem Subtilisin wegen des Ersatzes des Wildtyp-aprA-Gens durch die deletierte Version, die auf pAMB301 zu finden ist. Ein solcher Stamm, bezeichnet als BZ24, besitzt den Npr&supmin; Apr&supmin; Cmr-Phänotyp, er produziert somit weder nachweisbare extracelluläre neutrale Protease, noch extrazelluläre alkalische Protease und ist resistent gegenüber Chloramphenicol bei 5 ug/ml. Southern-Blotting [Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)] wurde verwendet, um die Deletion im aprA-Gen auf dem Chromosom von B. subtilis BZ24 zu bestätigen. Kultivierung von B. subtilis BZ24 in Antibiotic Medium No. 3 (Penassay Broth, Difco, Detroit, Michigan) in der Abwesenheit von Antibiotika-Selektion für ungefähr 32 Generationen führte zur Isolierung eines derivativen Stammes von BZ24, in dem das cat-Gen, das den Wirtszellen Chloramphenicol- Resistenz verleiht, wegen seiner Instabilität in BZ24-Chromosom verlorengegangen war. Solch ein Phänomen ist zuvor von Stahl et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984), beobachtet worden. Ein Chloramphenicol-empfindliches Derivat von BZ24 wurde mit BZ25 bezeichnet. B. subtilis BZ25 besitzt den Npr&supmin; Apr&supmin;-Phänotyp, er produziert somit weder nachweisbare extracelluläre neutrale Protease, noch extrazelluläre alkalische Protease. Southern-Blotting wurde verwendet, um die Deletion im aprA-Gen auf dem Chromosom von B. subtilis BZ25 zu bestätigen.
- Weil B. subtilis BZ25 weder nachweisbare extrazelluläre neutrale Protease noch Subtilisin produziert, ist er ein nützlicher Wirtsstamm für die Einführung von Plasmid-DNA, wie etwa pAMB113, für die Produktion von mutierten Subtilisinen, die frei von anderen Proteasen in das sie umgebende Wachstumsmedium sekretiert werden können.
- B subtilis BZ25 produziert keine nachweisbaren extrazellulären Proteasen, wenn Kulturüberstände untersucht werden, wie unten beschrieben. B. subtilis BZ25/pAMB113, der BZ25 ist, welcher Plasmid pAMB113 enthält (eingeführt mit dem Protoplastentransformationsverfahren von Chang et al., aaO), produziert nennenswerte Mengen [Ser²¹&sup8;]-Subtilisin, wenn Kulturüberstände untersucht wurden, wie beschrieben.
- Man glaubte, daß die Integration des [Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Gens in das Chromosom von B. subtilis einen effizienten Weg zur Erhöhung der genetischen Stabilität dieses mutanten Gens zur Verfügung stellt. Solch ein Ansatz vermeidet auch das Erfordernis nach Chloramphenicol im Fermentationsmedium, das ansonsten für die Anwendung von selektivem Druck erforderlich ist, um Plasmid-DNA im extrachromosomalen Zustand zu halten. Daher wurde das [Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Gen, zusammen mit seinen genetischen Regulator-Sequenzen und flankierender DNA, homolog zum B. subtilis-Chromosom, aus einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt nach Elektrophorese von pAMB113 isoliert, das mit EcoRI und PstI in Kombination verdaut worden war. Das 4,0 kb lange EcoRI-PstI-Fragment (dargestellt in Fig. 4) wurde dann an pAMB30 (dargestellt in Fig. 5) ligiert, das mit EcoRI und PstI in Kombination verdaut worden war. Ligationsprodukte wurden in E. coli HB101 (A.T.C.C. 33694) durch Transformation eingeführt. Selektion erfolgte auf gegen Chloramphenicol resistente Zellen (20 ug/ml). Plasmid-DNA aus vier Transformanten, die die obigen Kriterien erfüllten, wurde mit dem alkalischen Extraktionsverfahren von Birnboim et al., aaO, isoliert, dann mit EcoRI und PstI in Kombination verdaut. Alle vier Plasmide enthielten das 4,0 kb lange Insert und den 5,6 kb langen restlichen Teil von pAMB30. Ein solches Plasmid, bezeichnet als pAMB302, wurde gereinigt und für weitere Verwendung zurückbehalten.
- Wiederholte Versuche, Plasmid pAMB302 in das Chromosom von B. subtilis BZ25 mit dem Kompetenzverfahren [Spizizen, aaO] zu integrieren, waren nicht erfolgreich. Dies könnte daran gelegen haben, daß die BZ25-Zellen mit dem eingesetzten Verfahren nicht kompetent wurden. Daher wurde pAMB302 in B. subtilis- BZ25-Zellen mit dem Protoplastentransformationsverfahren von Chang et al., aaO, eingeführt. Dieses Ergebnis ist besonders bedeutungsvoll, indem Forschungsstämme, in denen Integration erreicht worden ist, auf der Grundlage einer Transformation mit dem Kompetenzverfahren ausgewählt wurden. Stämme, die nicht in der Lage sein könnten, kompetent zu werden, und insbesondere industrielle Stämme, die nicht auf der Grundlage einer Transformation mit dem Kompetenzverfahren ausgewählt wurden, könnten sehr viel wahrscheinlicher nicht in der Lage sein, kompetent zu werden.
- Selektion erfolgte auf Chloramphenicol-resistente Zellen (5 ug/ml), Zellen, die dann mit sterilen Zahnstochern auf L-agar überführt wurden, das mit 1,5% (w/v) Magermilch und 5 ug/ml Chloramphenicol ergänzt war. Zellen wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Deutliche Halos mit unterschiedlichen Durchmessern wurden um die Cmr-Kolonien beobachtet. Dies zeigt an, daß Subtilisin von diesen Zellen produziert und sekretiert wurde. Ein Versuch wurde unternommen, Plasmid-DNA aus acht von diesen Kolonien mit dem alkalischen Extraktionsverfahren zu isolieren. Keine Plasmid-DNA wurde auf Agarosegelen nachgewiesen, die mit Ethidiumbromid (1 ug/ml) angefärbt wurden, um DNA nach Elektrophorese sichtbar zu machen. Das Nichtvorhandensein von extraktchromosomaler Plasmid-DNA in Cmr-Zellen, die Subtilisin produzierten, war ein starker Hinweis darauf, daß pAMB302 in das Chromosom von B. subtilis integriert worden war.
- Mehrere Kolonien, die aus diesem Experiment stammten, wurden isoliert und als BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 und BZ33 bezeichnet. Jeder Stamm wurde über Nacht bei 37ºC unter heftigem Rütteln in Hirn-Herz-Infusionsmedium (BHI, Difco), ergänzt mit 5 ug/ml Chloramphenicol, gezüchtet. Kulturüberstände wurden auf Subtilisin-Aktivität untersucht. Die B. subtilis-Stämme BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 und BZ33 produzierten alle Subtilisin und sekretierten es in das sie umgebende Wachstumsmedlum, wobei einige Stämme mehr als andere produzierten. Die Subtilisin-Menge, die in der flüssigen Kulturbrühe beobachtet wurde, war direkt proportional zur Größe des Halos der auf Magermilch-L-Agar-Platten beobachtet wurde. Weil die von diesen Zellen sekretierten Subtilisin-Mengen unterschiedlich waren, waren Mehrfachkopien von pAMB302 in das Chromosom integriert oder hatte Gen-Amplifikation [Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983); Albertini, et al., J. Bacteriol., 162, 1203-1211 (1985)] stattgefunden.
- Wildtyp-Subtilisin, aus BZ25/pAMB111, und [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analog, aus BZ25/pAMB131, wurden wie folgt isoliert und gereinigt. Jede Kulturbrühe wurde bei 15.000 g für 30 Minuten zentrifugiert und Protein im klaren Überstand wurde mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (350 g pro Liter) ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit 75% Aceton verrieben, filtriert und unter Vakuum getrocknet.
- Um das Enzym weiter zu reinigen wurde der getrocknete Niederschlag in Wasser gelöst und die Lösung wurde filtriert und dann gegen 0,02 M Natriumphosphat-Puffer bei pH 6,3 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch eine Säule (2,5 x 15 cm) aus Carboxymethylcellulose mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute gegeben. Nach Waschen der Säule mit 0,02 M Natriumphosphat (pH 6,3) wurde das Enzym mit demselben Puffer, der 0,15 M NaCl enthielt, eluiert. Peakfraktionen wurden gepoolt und Protein aus den Fraktionen, die das Enzym enthielten, wie identifiziert durch eine Farbänderung in einer Probe der Fraktion, die mit Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L- phenylalanyl-p-nitroanilid (Vega Biochemicals) vermischt wurde, wurde durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und dann in 0,005 M Calciumacetat (etwa 1 ml pro 10 mg) gelöst. Die resultierende Lösung wurde bei 4ºC gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert.
- Reines Subtilisin oder Subtilisin-Analog wurde auf eine FPLC- Superose-12-Säule aufgebracht und das als das intakte (nicht gespaltene) Protein elulierende Material wurde gepoolt, in 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6,3. Proben von Wildtyp- Subtilisin oder Subtilisin-Analog der vorliegenden Erfindung, die bewertet werden sollten, wurden für 10 min in demselben Puffer, dem Puffer +3% SDS oder 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl&sub2; und 15 mM EDTA bei der angegebenen Temperatur inkubiert. Die Proben wurden für 5 min auf Raumtemperatur abgekühlt und dann für 20 min bei Raumtemperatur (20ºC) in Tris-HCl, pH 8,0, mit 0,6% Azocasein untersucht, um proteolytische Aktivität zu bestimmen. Die proteolytische Aktivität jeder Probe wird ausgedrückt als ein Prozentanteil der ursprünglichen Aktivität von entweder Wildtyp oder Analog, bei 20ºC in 10 mM CaCl&sub2;, und ist dargestellt in Tabelle 2. TABELLE 2 Proteolytische Aktivität von Wildtyp-Subtilisin Temperatur Aktivität von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]- Subtilisin-Analog von Beispiel 5 Temperatur
- Intakte Subtilisine wurden durch FPLC auf der Superose-12-Säule erhalten. Die intakten Subtilisine wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20ºC) in 15 mM MES, 0,05 M NaCl, pH 6,3, das entweder 4 mM CaCl&sub2; oder 4 mM EDTA enthielt, und einer variierten Menge SDS inkubiert. Die proteolytische Aktivität des Enzyms wurde dann durch eine 20minütige Inkubation in 0,6% Azocasein in Tris-Cl, pH 8,0, bestimmt. Die proteolytische Aktivität jeder bewerteten Probe ist in Tabelle 3 als ein Prozentanteil der ursprünglichen Aktivität der Probe in 0% SDS und 10 mM Ca²&spplus; ausgedrückt. TABELLE 3 Proteolytische Aktivität von Wildtyp-Subtilisin Proteolytische Aktivität von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]- Subtilisin-Analog
- Die Stabilitäten von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analog, [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analog und, Subtilisin Carlsberg wurden bei drei Temperaturen (25ºC, 37ºC und 50ºC) in zwei Pufferlösungen (0,06 M Natriumphosphat, pH 9,0 oder 0,12 M Natriumglycinat, pH 11,0) bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 als Halbwertszeiten der Enzyme unter spezifizierten Bedingungen ausgedrückt. TABELLE 4 A. In 0,12 M Natriumglycinat pH 11,0 + 0,2% SDS Subtilisin [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Analog Subtilisin Carlsberg 110 Tage B. In 0,06 M Natriumphosphat pH 9,0 + 2,0% SDS Subtilisin [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Analog Subtilisin Carlsberg C. In 0,12 m Natriumglycinat pH 11,0 + 5 mM EDTA Subtilisin [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Analog Subtilisin Carlsberg D. In 0,06 M Natriumphosphat pH 9,0 + 5 mM EDTA
- Obgleich die vorliegende Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird man verstehen, daß den Fachleuten auf diesem Gebiet Modifikationen und Verbesserungen einfallen werden. So wird erwartet, daß die Substitution von Resten an anderen Calcium-Bindungsstellen als dem hierin beschriebenen spezifischen Calcium ebenso die Stabilität verbessern kann. Zusätzliche Verbesserungen in der Stabilität werden für solche Substitutionen erwartet, die in anderen Enzymen vorgenommen werden, die die Asn-Gly-Sequenz besitzen, und in anderen Proteinen, die diese Sequenz umfassen. Außerdem wird erwartet, daß ein Subtilisin-Analog gemäß der vorliegenden Erfindung überlegene Eigenschaften gegenüber Wildtyp-Subtilisinen in Waschmittelformulierungen besitzt, wie etwa denjenigen, die in zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 3,732,170; U.S.-Patent Nr. 3,749,671 und U.S.-Patent Nr. 3,790,482 offenbart sind, die alle hierin durch Bezugnahme miteinbezogen sind.
- Außerdem werden aus praktischen Gründen viele industrielle Verfahren bei Temperaturen durchgeführt, die oberhalb des Stabilitätstemperaturbereiches der meisten Enzyme liegen. Daher glaubt man, obgleich hierin Waschmittelanwendungen hervorgehoben worden sind, thermostabile Subtilisin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur vorteilhaft sind für bestimmte Industriezweige, wie etwa die Waschmittelindustrie, die bereits stabile Subtilisine benötigen, sondern auch in Industriezweigen nützlich sein können, die chemische Mittel verwenden, um Proteine zu hydrolysieren, z.B. Hydrolyse von pflanzlichen und tierischen Proteinen für die Herstellung von Suppenkonzentraten.
Claims (23)
1. Ein Subtilisin-Analog, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden
Bacillus-Subtilisins besitzt, die dadurch modifiziert
worden ist:
(a) daß eine oder mehrere der Aminosäuren, die in einer
Calcium-Bindungsstelle vorhanden sind, repräsentiert
durch Asp&sup4;¹, Leu&sup7;&sup5;, Asn&sup7;&sup6;, Asn&sup7;&sup7;, Ser&sup7;&sup8;, Ile&sup7;&sup9;, Gly&sup8;&sup0;,
Val&sup8;¹, Thr²&sup0;&sup8; und Tyr²¹&sup4;, des natürlich vorkommenden
Bacillus-Subtilisins durch eine negativ geladene
Aminosäure ersetzt sind; und
(b) daß eine oder beide der Aminosäuren, umfassend jede
Asn-Gly-Sequenz des natürlich vorkommenden Bacillus-
Subtilisins, deletiert oder durch eine andere
Aminosäure ersetzt sind, wobei das Analog verbesserte
Calcium-Bindungsfähigkeit im Hinblick auf das natürlich
vorkommende Bacillus-Subtilisin besitzt.
2. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 1, wobei das Analog
ein Analog eines natürlich vorkommenden
Bacillus-Subtilisins ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Subtilisin
Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin BPN', einem aprA-
Subtilisin von Bacillus subtilis und Subtilisin aus
Bacillus mesentericus besteht.
3. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 1 oder 2, in dem Asn&sup7;&sup6;
durch Asp&sup7;&sup6; ersetzt ist.
4. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 3, in dem Asn&sup7;&sup7; durch
Asp&sup7;&sup7; ersetzt ist.
5. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 1 oder 2, in dem Ile&sup7;&sup9;
durch Glu&sup7;&sup9; ersetzt ist.
6. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 1 oder 2, in dem Asn&sup7;&sup6;
durch Asp&sup7;&sup6; ersetzt ist und Asn&sup7;&sup7; durch Asp&sup7;&sup7; ersetzt ist.
7. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 1 oder 2, in dem Asn&sup7;&sup6;
durch Asp&sup7;&sup6; ersetzt ist und Ile&sup7;&sup9; durch Glu&sup7;&sup9; ersetzt ist.
8. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 1, wobei ein Asn-Rest
in der Asn-Gly-Sequenz durch einen Rest einer anderen
Aminosäure ersetzt ist.
9. Das Analog nach Anspruch 8, wobei ein Asn-Rest in
besagter Asn-Gly-Sequenz durch einen Rest einer Aminosäure aus
der Gruppe, die aus Ser, Val, Thr, Cys, Glu und Ile
besteht, ersetzt ist.
10. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 9, wobei der Asn-Rest
in der Asn-Gly-Sequenz durch Ser ersetzt ist.
11. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 10, wobei ein Asp-
Rest an Position 109 durch Ser ersetzt ist.
12. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 10, wobei ein Asn-
Rest an Position 218 durch Ser ersetzt ist.
13. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 10, wobei ein Asn-
Rest an den Positionen 109 und 218 durch Ser ersetzt ist.
14. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 13, das ausgewählt
ist aus der Gruppe, die aus [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;,
Ser²¹&sup8;]-Subtilisin, [Asp&sup7;&sup7;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin, [Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;,
Ser²¹&sup8;]-Subtilisin, [Asp&sup7;&sup6;, Asp&sup7;&sup7;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin
und [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin besteht.
15. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 1, wobei das
Bacillus-Subtilisin eine natürlich vorkommende
Aminosäuresequenz besitzt, die in Tabelle 1 offenbart ist.
16. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 15, [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;,
Ser²¹&sup8;]-Subtilisin.
17. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 15, [Asp&sup7;&sup7;, Ser¹&sup0;&sup9;,
Ser²¹&sup8;]-Subtilisin.
18. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 15, [Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;,
Ser²¹&sup8;]-Subtilisin.
19. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 15, [Asp&sup7;&sup6;, Asp&sup7;&sup7;,
Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin.
20. Ein Subtilisin-Analog nach Anspruch 15, [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;,
Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin.
21. Eine DNA-Sequenz, die ein Analog von Bacillus-Subtilisin
kodiert, wobei besagtes Bacillus-Subtilisin eine
Aminosäuresequenz besitzt, die eine Calcium-Bindungsstelle
umfaßt, repräsentiert durch Asp&sup4;¹, Leu&sup7;&sup5;, Asn&sup7;&sup6;, Asn&sup7;&sup7;,
Ser&sup7;&sup8;, Ile&sup7;&sup9;, Gly&sup8;&sup0;, Val&sup8;¹, Thr²&sup0;&sup8; und Tyr²¹&sup4;, und eine Asn-
Gly-Sequenz, wobei (1) Codons, die eine oder mehrere der
Aminosäuren in der Calcium-Bindungsstelle kodieren,
deletiert oder durch Codons ersetzt werden, die eine negativ
geladene Aminosäure kodieren; und (2) Codons, die eine
oder beide der Aminosäuren in der Asn-Gly-Sequenz
kodieren, deletiert oder durch Codons ersetzt werden, die
einen anderen Aminosäurerest kodieren.
22. Ein Verfahren zur Verbesserung der thermischen und pH-
Stabilität eines Bacillus-Subtilisins mit einer Calcium-
Bindungsstelle, repräsentiert durch Asp&sup4;¹, Leu&sup7;&sup5;,
Asn&sup7;&sup6;,
Asn&sup7;&sup7;, Ser&sup7;&sup8;, Ile&sup7;&sup9;, Gly&sup8;&sup0;, Val&sup8;¹, Thr²&sup0;&sup8; und Tyr²¹&sup4;, wobei das
Verfahren umfaßt, daß ein Aminosäurerest in besagter
Calcium-Bindungsstelle durch eine negativ geladene
Aminosäure ersetzt wird und daß eine oder beide der Aminosäuren
in einer Asn-Gly-Sequenz ersetzt oder deletiert werden.
23. Eine Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an
Subtilisin-Analog von Anspruch 1 in einer
Waschmittel-Formulierung umfaßt.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/036,872 US4914031A (en) | 1987-04-10 | 1987-04-10 | Subtilisin analogs |
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Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3853328D1 DE3853328D1 (de) | 1995-04-20 |
| DE3853328T2 true DE3853328T2 (de) | 1995-07-27 |
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Family
ID=21891131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Families Citing this family (110)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185258A (en) * | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
| EP0254735B2 (de) * | 1986-01-15 | 1998-06-17 | Amgen Inc. | Herstellung von ph- und wärmestabile subtilisinanaloge |
| EP0251446B1 (de) * | 1986-04-30 | 1994-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutante einer nicht menschlichen Carbonyl-Hydrolase, für diese kodierende DNS-Sequenzen und Vektoren und durch diese Vektoren transformierte Wirte |
| ATE371029T1 (de) * | 1987-04-06 | 2007-09-15 | Novozymes As | Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen |
| US5260207A (en) * | 1987-04-06 | 1993-11-09 | Enzon Labs Inc. | Engineering of electrostatic interactions at metal ion binding sites for the stabilization of proteins |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| US5324653A (en) * | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
| PT89702B (pt) * | 1988-02-11 | 1994-04-29 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem |
| US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| US5246849A (en) * | 1988-04-12 | 1993-09-21 | Enzon, Inc. | Thermally stable serine proteases |
| US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
| US5122449A (en) * | 1988-10-07 | 1992-06-16 | Eastman Kodak Company | Use of a protease in the extraction of chlamydial, gonococcal and herpes antigens |
| AU618675B2 (en) * | 1989-05-17 | 1992-01-02 | Amgen, Inc. | Multiply mutated subtilisins |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| DK316989D0 (da) * | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
| JPH04500385A (ja) * | 1989-06-26 | 1992-01-23 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 酵素洗剤組成物 |
| US5658871A (en) * | 1989-07-07 | 1997-08-19 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Microbial lipase muteins and detergent compositions comprising same |
| EP0493398B1 (de) * | 1989-08-25 | 1999-12-08 | Henkel Research Corporation | Alkalisches proteolytisches enzym und verfahren zur herstellung |
| US6271012B1 (en) * | 1989-10-11 | 2001-08-07 | Genencor International, Inc. | Protease muteins and their use in detergents |
| US5541062A (en) * | 1990-02-23 | 1996-07-30 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for preparing protein processing enzymes |
| IT1239733B (it) * | 1990-02-23 | 1993-11-15 | Eniricerche Spa | Mutanti della proteasi neutra termostabili e mezzi e metodi per la loro preparazione |
| DK271490D0 (da) * | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
| US5340735A (en) * | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
| EP0525610A3 (en) * | 1991-07-27 | 1993-03-24 | Solvay Enzymes Gmbh & Co. Kg | Process for increasing the stability of enzymes and stabilized enzymes |
| US5399484A (en) * | 1991-10-08 | 1995-03-21 | Eastman Kodak Company | Use of blocking protein with high pH extraction in method to determine a microorganism associated with periodontal disease and kit useful therefor |
| US5567601A (en) * | 1993-06-01 | 1996-10-22 | University Of Maryland | Subtilisin mutants lacking a primary calcium binding site |
| US5470733A (en) * | 1993-06-01 | 1995-11-28 | University Of Maryland | Calcium free subtilisin mutants |
| US6440717B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6436690B1 (en) * | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| MA23346A1 (fr) | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
| US5679630A (en) * | 1993-10-14 | 1997-10-21 | The Procter & Gamble Company | Protease-containing cleaning compositions |
| CZ105296A3 (en) * | 1993-10-14 | 1996-09-11 | Procter & Gamble | Bleaching agent containing protease enzymes, cleansing agents, agent for cleaning fabrics and fabric cleaning method |
| PT731834E (pt) * | 1993-12-03 | 2000-09-29 | Buckman Labor Inc | Estabilizacao de enzimas por copolimeros em bloco |
| US6599730B1 (en) | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
| US6455295B1 (en) | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6475765B1 (en) * | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| KR100561826B1 (ko) | 1996-11-04 | 2006-03-16 | 노보자임스 에이/에스 | 섭틸라제 변종과 조성물 |
| DE69739020D1 (de) | 1996-11-04 | 2008-11-13 | Novozymes As | Subtilase varianten und verbindungen |
| WO1999011769A1 (en) | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| EP1009815B1 (de) | 1997-08-29 | 2008-01-30 | Novozymes A/S | Proteasevarianten und zusammensetzungen |
| ES2367505T3 (es) * | 1997-10-23 | 2011-11-04 | Danisco Us Inc. | Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes. |
| US6773907B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-10 | Peter Kamp Hansen | Subtilase enzymes |
| BR9814236A (pt) | 1997-11-21 | 2000-10-03 | Novo Nordisk As | Enzima subtilase, sua variante, sequência de dna isolada, vetor de expressão, célula microbiana hospedeira, processo para produzir uma subtilase ou uma variante de subtilase, composição, e, uso de uma subtilase ou de uma variante de subtilase. |
| US6780629B2 (en) | 1997-11-21 | 2004-08-24 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes |
| US6495136B1 (en) | 1998-03-26 | 2002-12-17 | The Procter & Gamble Company | Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties |
| US6908757B1 (en) | 1998-03-26 | 2005-06-21 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions |
| EP1082442A1 (de) * | 1998-03-26 | 2001-03-14 | The Procter & Gamble Company | Serinproteasevarianten mit substituierten aminosäuren |
| US6642011B2 (en) * | 1998-04-15 | 2003-11-04 | Genencor International, Inc. | Human protease and use of such protease for pharmaceutical applications and for reducing the allergenicity of non-human proteins |
| US6831053B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-12-14 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants |
| US6376450B1 (en) | 1998-10-23 | 2002-04-23 | Chanchal Kumar Ghosh | Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants |
| ATE504651T1 (de) | 1998-12-18 | 2011-04-15 | Novozymes As | Subtilase enzyme der i-s1- und i-s2-untergruppen mit einem zusätzlichen aminosäurerest in einer aktiven schleifenregion |
| EP1183342B2 (de) | 1999-05-20 | 2012-06-13 | Novozymes A/S | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 128 und 129 |
| ATE407201T1 (de) | 1999-05-20 | 2008-09-15 | Novozymes As | Subtilase-enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit wenigstens einem zusätzlichen aminosäurerest zwischen positionen 126 und 127 |
| WO2000071685A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 132 and 133 |
| DE60039693D1 (de) | 1999-05-20 | 2008-09-11 | Novozymes As | Subtilase-enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit wenigstens einem zusätzlichen aminosäurerest zwischen positionen 125 und 126 |
| EP1183341B2 (de) | 1999-05-20 | 2012-05-02 | Novozymes A/S | Subtilase enzyme der i-s1 und i-s2 untergruppen mit mindestens einer zusätzlichen aminosäure zwischen position 127 und 128 |
| AU4392700A (en) | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 129 and 130 |
| BR0012693A (pt) * | 1999-07-22 | 2002-04-09 | Procter & Gamble | Variante, de protease tipo subtilisina; composição de limpeza; e composição de cuidado pessoal |
| US6946128B1 (en) | 1999-07-22 | 2005-09-20 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected epitope regions |
| CA2379729A1 (en) | 1999-07-22 | 2001-02-01 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected clip sites |
| CN1399677A (zh) | 1999-07-22 | 2003-02-26 | 宝洁公司 | 在确定表位区有氨基酸取代的枯草杆菌蛋白酶变体 |
| US6727085B2 (en) * | 1999-12-15 | 2004-04-27 | Fanoe Tina Sejersgaard | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
| US6777218B1 (en) | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| WO2002010183A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-07 | Menzel, Rolf | Compositions and methods for directed gene assembly |
| US6541234B1 (en) * | 2000-09-11 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
| US6541235B1 (en) * | 2000-09-29 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
| WO2002069232A2 (en) | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
| RU2311458C2 (ru) * | 2001-03-23 | 2007-11-27 | Джененкор Интернэшнл, Инк. | Белки, вызывающие измененную иммуногенную реакцию, и способы их получения и использования |
| DE10163884A1 (de) | 2001-12-22 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| AU2003210551A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| DK2339016T3 (da) * | 2002-03-29 | 2017-01-23 | Danisco Us Inc | Øget produktion af subtilisiner |
| US7294499B2 (en) | 2003-01-30 | 2007-11-13 | Novozymes A/S | Subtilases |
| US7507569B2 (en) * | 2003-05-07 | 2009-03-24 | Novozymes A/S | Variant subtilisin enzymes (subtilases) |
| JP4880469B2 (ja) | 2003-10-23 | 2012-02-22 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗剤中で改良された安定性を有するプロテアーゼ |
| DE10360805A1 (de) | 2003-12-23 | 2005-07-28 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| EP1713919A2 (de) * | 2004-02-13 | 2006-10-25 | Novozymes A/S | Proteasevarianten |
| JP2007532114A (ja) * | 2004-04-09 | 2007-11-15 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | バチルスにおけるｐｃｋＡ修飾および増強されたタンパク質発現 |
| DE102004019751A1 (de) | 2004-04-23 | 2005-11-17 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen |
| KR100750659B1 (ko) * | 2005-02-18 | 2007-08-20 | 인하대학교 산학협력단 | 계면활성제 및 산화제에 매우 안정한 호염, 호알카리성 단백질 분해효소 및 이를 암호화하는 유전자 |
| US20100029538A1 (en) | 2006-04-14 | 2010-02-04 | Anna-Liisa Auterinen | One-Step Treatment of Textiles |
| JP2009534022A (ja) | 2006-04-20 | 2009-09-24 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 卵のシミに対する洗浄能力が向上したサビナーゼ変異体 |
| US20080090745A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Fox Bryan P | Expression of Streptomyces subtilism inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp. |
| CN101641438B (zh) * | 2007-03-12 | 2013-12-25 | 丹尼斯科美国公司 | 经修饰的蛋白酶 |
| KR101522042B1 (ko) | 2007-04-30 | 2015-05-20 | 다니스코 유에스 인크. | 메탈로프로테아제 세제 제제를 안정화시키기 위한 단백질 가수분해물의 용도 |
| EP2460823B1 (de) | 2007-05-10 | 2014-02-26 | Danisco US Inc. | Modifiziertes Ausscheidungssystem zur Erhöhung der Expression von Polypeptiden in Bakterien |
| SG148934A1 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Novozymes As | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
| DE102007032111B4 (de) | 2007-07-09 | 2017-07-20 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen |
| DE102007036756A1 (de) | 2007-08-03 | 2009-02-05 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Proteasen |
| DE102007051092A1 (de) * | 2007-10-24 | 2009-04-30 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Subtilisin aus Becillus pumilus und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend dieses neue Subtilisin |
| DK2235176T3 (en) | 2007-12-21 | 2017-09-25 | Danisco Us Inc | IMPROVED PROTEIN MANUFACTURING IN BACILLUS |
| KR101683302B1 (ko) * | 2008-03-28 | 2016-12-06 | 다니스코 유에스 인크. | 박테리아 세포 내 로커스 증폭 방법 |
| EP2578680B1 (de) * | 2008-06-06 | 2016-04-27 | Danisco US Inc. | Zusammensetzungen und Verfahren mit mikrobiellen Proteasevarianten |
| AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
| EP2606146A1 (de) | 2010-08-19 | 2013-06-26 | Novozymes A/S | Screeningverfahren für eingeleitete sporulation |
| US20140342433A1 (en) * | 2011-11-25 | 2014-11-20 | Novozymes A/S | Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same |
| EP3089991B1 (de) | 2013-12-31 | 2019-08-28 | Danisco US Inc. | Erhöhte proteinexpression |
| EP3739029A1 (de) | 2014-07-04 | 2020-11-18 | Novozymes A/S | Subtilasevarianten und polynukleotide zur codierung davon |
| CN107250371B (zh) | 2014-12-16 | 2021-11-30 | 丹尼斯科美国公司 | 增强的蛋白质表达 |
| KR20170093247A (ko) | 2014-12-19 | 2017-08-14 | 다니스코 유에스 인크. | 향상된 단백질 발현 |
| WO2018156705A1 (en) | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for increased protein production in bacillus licheniformis |
| WO2019040412A1 (en) | 2017-08-23 | 2019-02-28 | Danisco Us Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EFFICIENT GENETIC MODIFICATION OF BACILLUS LICHENIFORMIS STRAINS |
| EP3682010A1 (de) | 2017-09-13 | 2020-07-22 | Danisco US Inc. | Modifizierte sequenzen von 5'-untranslatierten regionen (utr) für erhöhte proteinproduktion in bacillus |
| EP3703661A1 (de) | 2017-11-02 | 2020-09-09 | Danisco US Inc. | Feste matrixzusammensetzungen mit gesenktem gefrierpunkt für die schmelzgranulation von enzymen |
| FI3735478T3 (fi) | 2018-01-03 | 2023-10-26 | Danisco Us Inc | Mutantit ja geneettisesti modifioidut bacillus-solut ja niihin liittyvät menetelmät proteiinituotannon lisäämiseksi |
| WO2020099490A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising enzymes |
| EP4090738A1 (de) | 2020-01-15 | 2022-11-23 | Danisco US Inc. | Zusammensetzungen und verfahren zur verbesserten proteinproduktion in bacillus licheniformis |
| CN116322625A (zh) | 2020-08-24 | 2023-06-23 | 诺维信公司 | 包含果聚糖酶的口腔护理组合物 |
| CN117881772A (zh) | 2021-08-20 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 编码新型核酸酶的多核苷酸、其组合物及其从蛋白质制剂中消除dna的方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1240058A (en) * | 1968-04-12 | 1971-07-21 | Procter & Gamble | Enzyme-containing detergent compositions |
| US3623957A (en) * | 1970-01-21 | 1971-11-30 | Baxter Laboratories Inc | Preparation of microbial alkaline protease by fermentation with bacillus subtilis, variety licheniformis |
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| JPS60160884A (ja) * | 1984-02-01 | 1985-08-22 | Showa Denko Kk | 酵素安定化法 |
| EP0199405B1 (de) * | 1985-04-15 | 1992-06-24 | The Procter & Gamble Company | Flüssige Reinigungsmittel mit einer oberflächenaktiven Verbindung, einem proteolytischen Enzym und Borsäure |
| WO1987005050A1 (en) * | 1986-02-12 | 1987-08-27 | Genex Corporation | Mutagenesis and screening method and product |
| EP0251446B1 (de) * | 1986-04-30 | 1994-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutante einer nicht menschlichen Carbonyl-Hydrolase, für diese kodierende DNS-Sequenzen und Vektoren und durch diese Vektoren transformierte Wirte |
| JPH0657151B2 (ja) * | 1986-05-15 | 1994-08-03 | 昭和電工株式会社 | 酵素の安定化法 |
| BR8805646A (pt) * | 1987-02-27 | 1989-10-17 | Gist Brocades Nv | Processo para amplificacao de genes estaveis em adn cromossomico de microorganismos procarioticos |
| ATE371029T1 (de) * | 1987-04-06 | 2007-09-15 | Novozymes As | Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen |
-
1987
- 1987-04-10 US US07/036,872 patent/US4914031A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
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