ES2227508T3 - Composiciones detergentes enzimaticas. - Google Patents
Composiciones detergentes enzimaticas.Info
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- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Abstract
SE PRESENTAN ENZIMAS PRODUCIDAS MUTANDO LOS GENES DE UN NUMERO DE PROTEASAS DE SUBTILICINA Y EXPRESANDO LOS GENES MUTANTES EN UN PORTADOR ADECUADO. LAS ENZIMAS PRESENTAN CARACTERISTICAS DE LAVADO MEJORADAS EN COMPARACION CON LAS ENZIMAS EN BRUTO DE LAS QUE DESCIENDEN. LAS ENZIMAS SON COMPLETAMENTE ADECUADAS PARA SU USO EN COMPUESTOS DETERGENTES.
Description
Composiciones detergentes enzimáticas.
Esta invención se refiere a enzimas mutantes o
variantes enzimáticas novedosas útiles en la formulación de
composiciones detergentes que muestran un rendimiento de lavado
mejorado, y a composiciones de limpieza y detergentes que contienen
dichas enzimas.
En la industria de los detergentes, las enzimas
se han puesto en práctica durante más de 20 años en las
formulaciones de lavado. Las enzimas utilizadas en tales
formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas,
así como otras enzimas, o mezclas de las mismas. Las más
importantes comercialmente son las proteasas.
Aunque las proteasas se han utilizado en la
industria de los detergentes durante más de 20 años, todavía no se
conoce exactamente qué características físicas o químicas son
responsables de un buen rendimiento de lavado o la capacidad de una
proteasa.
Las proteasas utilizadas en la actualidad se han
hallado aislando proteasas de la naturaleza y probándolas en
formulaciones de detergente.
Las enzimas que escinden las uniones amida en
sustratos proteicos se clasifican como proteasas, o (de manera
intercambiable) peptidasas (véase Walsh, 1979, Enzymatic Reaction
Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3).
Las bacterias de la especie Bacillus segregan dos especies
extracelulares de proteasas, una proteasa neutra o metaloproteasa y
una proteasa alcalina que es funcionalmente una serín
endopeptidasa, denominada subtilisina. La secreción de estas
proteasas ha estado asociada con el ciclo de crecimiento
bacteriano, con la mayor expresión de proteasas durante la fase
estacionaria, cuando se produce también la esporulación. Joliffe y
col. (1980, J. Bacterial 141:1199-1208) han
sugerido que las proteasas de Bacillus funcionan en el recambio de
la pared celular.
Una serín proteasa es una enzima que cataliza la
hidrólisis de los enlaces peptídicos y en la que hay un residuo de
serina esencial en el sitio activo (White, Handler y Smith, 1973
"Principles of Biochemistry," Quinta Edición,
McGraw-Hill Book Company, NY, págs.
271-272).
Las serín proteasas bacterianas tienen pesos
moleculares en el intervalo de 20.000 a 45.000. Se inhiben por el
fluorofosfato de diisopropilo, pero a diferencia de las
metaloproteasas, son resistentes al ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) (aunque se estabilizan a altas temperaturas por iones
calcio). Hidrolizan ésteres terminales sencillos y son similares en
actividad a la quimiotripsina de eucariotas, también una serín
proteasa. Un término más limitado, proteasa alcalina, que cubre un
subgrupo, refleja el alto pH óptimo de algunas de las serín
proteasas, desde pH 9,0 hasta 11,0 (para revisión, véase Priest,
1977, Bacteriological Rev. 41:711-753).
En relación con la presente invención, una
subtilisina es una serín proteasa producida por bacterias
gram-positivas u hongos. Se ha identificado una
amplia variedad de subtilisinas y se ha determinado la secuencia de
aminoácidos de varias subtilisinas. Éstas incluyen al menos seis
subtilisinas de cepas de Bacillus, concretamente,
subtilisina 168, subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg,
subtilisina DY, subtilisina amlyosacchariticus y
mesentericopeptidasa (Kurihara y col., 1972, J. Biol. Chem.
274:5629-5631; Wells y col., 1983, Nucleic Acids
Res. 11:7911-7925; Stahl y Ferrari, 1984, J.
Bacteriol. 159:811-819, Jacobs y col., 1985, Nucl.
Acids Res. 13:8913-8926; Nedkov y col., 1985, Biol.
Chem. Hoppe-Seyler 366:421-430,
Svendsen y col., 1986, FEBS Lett 196:228-232), una
subtilisina de un actinomicetales, la termitasa de
Thermoactinomyces vulgaris (Meloun y col., 1985, FEBS Lett.
1983:195-200) y una subtilisina fúngica, la
proteinasa K de Tritirachium album (Jany y Mayer, 1985,
Biol. Chem. Hoppe-Seyler
366:584-492).
Las subtilisinas están bien caracterizadas física
y químicamente. Además del conocimiento de la estructura primaria
(secuencia de aminoácidos) de estas enzimas, se han determinado más
de 50 estructuras de subtilisina por rayos X de alta resolución que
definen la unión al sustrato, el estado de transición, los
productos, al menos tres inhibidores de proteasas diferentes, y
definen las consecuencias estructurales por la variación natural
(Kraut, 1977, Ann. Rev. Biochem. 46:331-358).
En el contexto de esta invención, una proteasa
subtilisina mutada o variante de subtilisina significa una
subtilisina que se ha producido por un organismo que está
expresando un gen mutante derivado de un microorganismo original que
poseía un gen original o parental y que producía una enzima
original correspondiente, habiéndose mutado el gen original con el
fin de producir el gen mutante a partir del cual se produce dicha
proteasa subtilisina mutada cuando se expresa en un huésped
adecuado.
Las mutaciones aleatorias y dirigidas al sitio
del gen de la subtilisina han surgido ambas del conocimiento de las
propiedades físicas y químicas de la enzima y han contribuido a la
información relacionada con la actividad catalítica de la
subtilisina, la especificidad por el sustrato, la estructura
terciaria, etc. (Wells y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.
84; 1219-1223; Wells y col., 1986, Phil. Trans. R.
Soc. Lond. A. 317:415-423: Hwang y Warshel, 1987,
Biochem. 26:2669-2673; Rao y col., 1987, Nature
328:551-554).
Especialmente, la mutagénesis dirigida al sitio
de los genes de subtilisina ha atraído mucho la atención y se han
descrito diversas mutaciones en las siguientes patentes y
solicitudes de patente:
La publicación EP número 130756 (GENENTECH)
(correspondiente a la patente de los EE.UU. número 4.760.025
(GENENCOR)) que se refiere a mutaciones específicas de sitio o
generadas aleatoriamente en "carbonil hidrolasas" y a la
posterior selección de las enzimas mutadas por diversas
propiedades, tales como la razón K_{cat}/K_{m}, el perfil de
actividad según el pH y la estabilidad frente a la oxidación.
Aparte de describir que la mutación específica de sitio es posible
y que la mutación de la subtilisina BPN' en ciertas posiciones
específicas, es decir, ^{-1}Tyr, ^{32}Asp, ^{155}Asn,
^{104}Tyr, ^{222}Met, ^{166}Gly, ^{64}His, ^{169}Gly,
^{189}Phe, ^{33}Ser, ^{221}Ser, ^{217}Tyr, ^{156}Glu o
^{152}Ala proporcionan enzimas que muestran propiedades
modificadas, esta solicitud no contribuye a resolver el problema de
decidir dónde introducir mutaciones para obtener enzimas con las
propiedades deseadas.
La publicación EP número 214435 (HENKEL) que se
refiere a la clonación y la expresión de la subtilisina Carlsberg y
a dos mutantes de la misma. En esta solicitud no se facilita
ninguna razón para la mutación de ^{158}Asp a ^{158}Ser y de
^{161}Ser a ^{161}Asp.
En la publicación de patente internacional número
WO 87/04461 (AMGEN), se propone reducir el número de secuencias de
Asn-Gly presentes en la enzima original con el fin
de obtener enzimas mutadas que muestren estabilidades mejoradas
frente al pH y al calor, en la solicitud se pone énfasis en la
eliminación, mutación o modificación de los residuos de ^{109}Asn
y ^{218}Asn en la subtilisina BPN'.
La publicación de patente internacional número WO
87/05050 (GENEX) describe la mutación aleatoria y la posterior
selección de un gran número de mutantes de la subtilisina BPN' para
obtener propiedades mejoradas. En la solicitud, las mutaciones se
describen las posiciones ^{218}Asn, ^{131}Gly, ^{254}Thr,
^{166}Gly, ^{116}Ala, ^{188}Ser, ^{126}Leu y ^{53}Ser.
En la solicitud EP número 87303761 (GENENTECH) se
describe cómo pueden aplicarse consideraciones de homología en
ambos niveles estructurales primario y terciario para identificar
residuos de aminoácidos equivalentes, se conserven o no. Esta
información, junto con el conocimiento de los inventores de la
estructura terciaria de la subtilisina BPN', condujo a los
inventores a seleccionar varias posiciones susceptibles de mutación
con expectativas de obtener mutantes con propiedades modificadas.
Las posiciones así identificadas son: ^{124}Met, ^{222}Met,
^{104}Tyr, ^{152}Ala, ^{156}Glu, ^{166}Gly, ^{169}Gly,
^{189}Phe, ^{217}Tyr. Además, ^{155}Asn, ^{21}Tyr,
^{22}Thr, ^{24}Ser, ^{32}Asp, ^{33}Ser, ^{36}Asp,
^{46}Gly, ^{48}Ala, ^{49}Ser, ^{50}Met, ^{77}Asn,
^{87}Ser, ^{94}Lys, ^{95}Val, ^{96}Leu, ^{107}Ile,
^{110}Gly, ^{170}Lys, ^{171}Tyr, ^{172}Pro, ^{197}Asp,
^{199}Met, ^{204}Ser, ^{213}Lys y ^{221}Ser, posiciones que
se identifican como las que se espera que influyan en diversas
propiedades de la enzima. Además, se dan como ejemplo varias
mutaciones para apoyar estas sugerencias. Además de las mutaciones
únicas en estas posiciones, los inventores también realizaron
varias mutaciones múltiples. Adicionalmente, los inventores
identificaron ^{215}Gly, ^{67}His, ^{126}Leu, ^{135}Leu y
residuos de aminoácidos dentro de los segmentos
97-103, 126-129,
213-215 y 152-172 que tenían
interés, pero no se dan ejemplos de mutaciones en ninguna de estas
posiciones.
La publicación EP número 260105 (GENENCOR)
describe la modificación de ciertas propiedades en enzimas que
contienen una tríada catalítica mediante la selección de un residuo
de aminoácido dentro de aproximadamente 15 \ring{A} desde la
tríada catalítica y la sustitución del residuo de aminoácido
seleccionado por otro residuo. Las enzimas del tipo subtilisina
descritas en la presente memoria descriptiva se mencionan
específicamente como pertenecientes a la clase de enzimas que
contienen una tríada catalítica. En las subtilisinas, las posiciones
222 y 217 se indican como posiciones preferidas para la
sustitución.
La publicación de patente internacional número WO
88/06624 (GIST-BROCADES NV) describe las secuencias
de ADN y aminoácidos de una proteasa subtilisina denominada PB92
casi con un 100% de homología en la secuencia de aminoácidos con la
secuencia de aminoácidos de la subtilisina 309.
La publicación de patente internacional número WO
88/07578 (GENENTECH) reivindica enzimas mutadas derivadas de una
enzima precursora por sustitución o modificación de al menos un
grupo catalítico de un residuo de aminoácido. Los inventores
establecen que al hacerlo así se obtiene una enzima mutada que es
reactiva con sustratos que contienen el grupo catalítico mutado o
sustituido (catálisis asistida por sustrato).
La teoría general se basa en la subtilisina
(BPN') de B. amyloliquefaciens, en la que se han descrito
modificaciones en las posiciones de ^{64}His que se modificó en
^{64}Ala sola o en combinación con una mutación "cooperadora"
de Ser-24-Cys. También se sugieren
modificaciones en los residuos de aminoácidos ^{32}Asp y
^{221}Ser y una mutación "cooperadora" de
Ala-48-Glu.
La publicación de patente internacional número WO
88/08028 (GENEX) describe modificaciones por ingeniería genética en
torno a los sitios de unión de iones metálicos para la
estabilización de proteínas. Esta publicación también utiliza la
subtilisina BPN' como ejemplo y señala los siguientes residuos de
aminoácidos como candidatos para la sustitución: ^{172}Pro
(P172D, P172E), ^{131}Gly (G131D), ^{76}Asn (N76D; N76D +
P172D(E)), ^{78}Ser (S78D). Además se hacen sugerencias
para los mutantes combinados N76D + S78D + G131D + P172D(E);
N76D + G131D; S78D + G131D; S78D + P172D(E) y S78D + G131D +
P172D(E).
La publicación de patente internacional número WO
88/08033 (AMGEN) describe varios análogos de la subtilisina que
tienen un sitio de unión al calcio modificado y, o bien Asn o bien
Gly sustituidas en cualquier secuencia Asn-Gly
presente en la molécula, obteniendo así enzimas que muestran una
estabilidad térmica y al pH mejorada. Se describe que uno de los
sitios de unión al calcio incluye los residuos de aminoácidos
^{41}Asp, ^{75}Leu, ^{76}Asn, ^{77}Asn, ^{78}Ser,
^{79}Ile, ^{80}Gly, ^{81}Val, ^{208}Thr y ^{214}Tyr; se
sugieren otros posibles sitios de unión a calcio en ^{140}Asp y
^{172}Pro; ^{14}Pro y ^{271}Gln; y ^{172}Pro y ^{195}Glu o
^{197}Asp. También se sugiere la mutación en las posiciones
^{109}Asn y ^{218}Asn. Los mutantes producidos son N109S, N109S
+ N218S, N76D + N109S + N218S, N76D + N77D + N109S + N218S, N76D +
I79E + N109S + N218S.
La publicación de patente internacional número WO
88/08164 (GENEX) describe un método para identificar residuos en
una proteína que pueden sustituirse por una cisteína para permitir
la formación de puentes disulfuro potencialmente estabilizadores.
El método se basa en el conocimiento detallado de la estructura
tridimensional de la proteína y utiliza un ordenador para
seleccionar las posiciones. En relación con las proteasas
subtilisinas, se utilizó la subtilisina BPN' como sistema modelo.
La utilización del método con la subtilisina BPN' dio como
resultado la sugerencia de 11 candidatos para introducir puentes
disulfuro (1: T22C + S87C, 2: V26C + L235C, 3: G47C + P57C, 4: M50C
+ N109C, 5: E156C + T164C, 6: V165C + K170C, 7: V165C + S191C, 8:
Q206C + A216C, 9: A230C + V270C, 10: I234C + A274C, 11: H238C +
W241C). De éstos, se produjeron 4 (1, 2, 4 y 8) de los que 2 no
proporcionaron ningún efecto estabilizador (2 y 4). Se produjeron
mutantes adicionales combinando dos de estos mutantes entre sí y
uno con otra mutación, a saber, T22C + S87C + N218C, y T22C + S87C
+ Q206C + A216C. Además, se produjeron varios mutantes adicionales
no satisfactorios, a saber, A1C + S78C, S24C + S87C, K27C + S89C,
A85C + A232C, I122C + V147C, S249C + A273C y T253C + A273C.
Además, Thomas, Russell y Fersht, Nature 318,
375-376(1985) han demostrado que el
intercambio de ^{99}Asp por ^{99}Ser en la subtilisina BPN'
cambia la dependencia del pH de la enzima.
En un artículo posterior en J. Mol. Biol.
(1987)193, 803-813, los mismos autores
también tratan la sustitución de ^{156}Ser en lugar de
^{156}Glu.
Ambas mutaciones están dentro de una distancia de
aproximadamente 15 \ring{A} desde la ^{64}His activa.
En Nature 328,
496-500(1987), Russel y Fersht tratan los
resultados de sus experimentos y presentan reglas para cambiar los
perfiles de actividad según el pH mutando una enzima para obtener
cambios en la carga superficial.
El punto isoeléctrico, pI_{o}, se define como
el valor de pH en el que el complejo de la molécula enzimática (con
metales u otros iones opcionalmente unidos) es neutro, es decir, la
suma de las cargas electrostáticas (carga electrostática neta,
=NEC) en el complejo es igual a cero. Naturalmente, en esta suma
deben tenerse en cuenta las consideraciones de la naturaleza
positiva o negativa de las cargas electrostáticas individuales.
El punto isoeléctrico se calcula convenientemente
usando consideraciones de equilibrio, usando valores de pK para los
diversos residuos cargados en la enzima en cuestión y después por
iteración, hallar el valor de pH en el que la NEC de la molécula
enzimática es igual a cero.
Un problema con este cálculo es que los valores
de pK para los residuos cargados dependen de su entorno y, en
consecuencia, están sometidos a variación. Sin embargo, pueden
obtenerse muy buenos resultados asignando valores de pK aproximados
específicos a los residuos cargados, independientemente del valor
real. También es posible realizar cálculos más sofisticados,
teniendo parcialmente en cuenta el entorno.
El pI_{o} también puede determinarse
experimentalmente mediante enfoque isoeléctrico o mediante la
titulación de una disolución que contenga la enzima. Además, pueden
determinarse experimentalmente por titulación los diversos valores
de pK para los residuos cargados.
Las proteasas tales como las subtilisinas han
encontrado mucha utilidad en la industria, particularmente en las
formulaciones de detergente, ya que son útiles para eliminar
manchas de proteínas.
En la actualidad, se conocen las siguientes
proteasas y muchas de ellas se comercializan en grandes cantidades
en muchos países del mundo.
La subtilisina BPN' o Novo, disponible de, por
ejemplo, SIGMA, St. Louis, EE.UU;
la subtilisina Carlsberg, comercializada por
Novo-Nordisk a/s (Dinamarca) como ALCALASE® y por
IBIS (Holanda) como MAXATASE®;
una subtilisina de Bacillus lentus,
comercializada por NOVO INDUSTRI A/S (Dinamarca) como
SAVINASE®;
enzimas que se asemejan estrechamente a
SAVINASE®, tales como MAXACAL® comercializada por IBIS, y
OPTICLEAN® comercializada por MILES KALI CHEMIE (FRG);
una subtilisina de Bacillus lentus,
comercializada por Novo-Nordisk a/s (Dinamarca)
como ESPERASE®;
KAZUSASE® comercializada por SHOWA DENKO
(Japón).
Sin embargo, para que tales enzimas sean
eficaces, no sólo deben mostrar actividad en las condiciones de
lavado, sino que también deben ser compatibles con otros
componentes del detergente durante la producción y el almacenamiento
del detergente.
Por ejemplo, las subtilisinas pueden utilizarse
en combinación con otras enzimas activas frente a otros sustratos,
y la subtilisina seleccionada debe poseer estabilidad frente a
tales enzimas, y también la subtilisina seleccionada
preferiblemente no debe catalizar la degradación de otras enzimas.
Además, la subtilisina elegida debe ser resistente a la acción de
otros componentes en la formulación de detergente, tales como
agentes de blanqueo, agentes oxidantes, etc., en particular una
enzima que vaya a utilizarse en una formulación de detergente debe
ser estable con respecto al poder oxidante, a las propiedades de
unión al calcio y a las condiciones de pH dadas por los componentes
no enzimáticos en el detergente durante el almacenamiento y en el
líquido de lavado durante el lavado.
La capacidad de una enzima para catalizar la
degradación de diversos sustratos que se producen de manera
natural, presentes en los objetos que han de limpiarse durante, por
ejemplo, el lavado, a menudo se denomina su capacidad de lavado,
lavabilidad, detergencia o rendimiento de lavado. A lo largo de toda
esta solicitud, se utilizará el término rendimiento de lavado para
englobar esta propiedad.
Se ha encontrado que las subtilisinas que se
producen de manera natural poseen propiedades que son altamente
variables en relación con su capacidad o poder de lavado con
variaciones de parámetros tales como el pH. De hecho, varias de las
proteasas detergentes comercializadas anteriores, tienen un mejor
rendimiento que las comercializadas hace aproximadamente 20 años,
pero para un rendimiento óptimo, cada enzima tiene sus propias
condiciones específicas en relación con la formulación y las
condiciones de lavado, por ejemplo, pH, temperatura, fuerza iónica
(=I), sistema activo (tensioactivos, surfactantes, agente de
blanqueo, etc.), adyuvantes, etc.
Como consecuencia, se encuentra que una enzima
que posee propiedades deseables a pH bajo e I baja puede ser menos
atractiva en condiciones más alcalinas e I alta, o que una enzima
que muestra excelentes propiedades a pH alto e I alta puede ser
menos atractiva en condiciones de pH bajo, I baja.
La llegada y el desarrollo de las técnicas de ADN
recombinante ha tenido una profunda influencia en el campo de la
química de proteínas.
Se ha previsto que estas técnicas harán posible
diseñar péptidos y proteínas, tales como enzimas y hormonas, según
especificaciones deseadas, permitiendo la producción de compuestos
que muestren propiedades deseadas.
Ahora es posible construir enzimas que tengan
secuencias de aminoácidos deseadas y, tal como se indicó
anteriormente, se ha dedicado una cantidad aceptable de
investigación a diseñar subtilisinas con propiedades modificadas.
Entre los propósitos de la técnica de producir y seleccionar un
gran número de enzimas mutadas tal como se describe en la
publicación EP número 130756 (GENENTECH) (patente de los EE.UU.
número 4.760.025 (GENENCOR)) y la publicación de patente
internacional número WO 87/05050 (GENEX) corresponden al método
clásico de aislar enzimas nativas y seleccionarlas por sus
propiedades, pero es más eficaz por el conocimiento de la presencia
de un gran número de enzimas mutantes diferentes.
Puesto que una enzima subtilisina comprende
normalmente 275 residuos de aminoácidos, pudiendo ser cada uno 1 de
20 aminoácidos posibles que se producen de manera natural, un
inconveniente muy grave en ese procedimiento es el número muy
grande de mutaciones generadas que tienen que someterse a una
selección preliminar antes de probar adicionalmente los mutantes
seleccionados que muestran características interesantes en la
primera selección, puesto que no se indica ninguna orientación para
determinar qué residuos de aminoácidos cambiar con el fin de
obtener una enzima deseada con propiedades mejoradas para el uso en
cuestión, tal como, en este caso, la formulación de composiciones
detergentes que muestren un rendimiento de lavado mejorado en las
condiciones especificadas del líquido de lavado.
En consecuencia, un procedimiento tal como se
explica resumidamente en estas solicitudes de patente sólo será
ligeramente mejor que los procedimientos de mutación aleatoria
tradicionales que se conocen desde hace años.
Las otras técnicas conocidas se refieren a
cambiar propiedades específicas, tales como la tasa de hidrólisis y
transesterificación (publicación EP número 260105 (GENENCOR)), el
perfil de actividad según el pH (Thomas, Russel y Fersht, citado
anteriormente) y la especificidad por el sustrato (publicación de
patente internacional número WO 88/07578 (GENENTECH)). Ninguna de
estas publicaciones se refiere al cambio del rendimiento de lavado
de las enzimas.
Una técnica adicional que se ha desarrollado es
utilizar la información detallada sobre la estructura
tridimensional de las proteínas para analizar las consecuencias
potenciales de sustituir ciertos aminoácidos. Este enfoque se ha
utilizado y se ha descrito en los documentos EP 260105 (GENENCOR),
WO 88/07578 (GENENTECH), WO 88/08028 (GENEX), WO 88/08033 (AMGEN) y
WO 88/08164 (GENEX).
Por tanto, tal como se indicó anteriormente,
todavía no se ha identificado ninguna relación entre las
propiedades bien definidas de una enzima, tal como las mencionadas
anteriormente, y el rendimiento de lavado de una enzima.
En la solicitud de patente internacional no
publicada número PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) se propone
utilizar el concepto de comparación por homología para determinar
qué posiciones de aminoácidos deben seleccionarse para la mutación
y qué aminoácidos deben sustituirse en esas posiciones con el fin de
obtener un cambio deseado en el rendimiento de lavado.
Mediante el uso de tal procedimiento, la tarea de
selección se reduce espectacularmente, puesto que el número de
mutantes generado es mucho más pequeño, pero con ese procedimiento
sólo se prevé que pueden obtenerse enzimas que muestran propiedades
útiles combinadas de la enzima original y la enzima utilizada en la
comparación.
El problema parece ser que, aunque se ha dirigido
mucha investigación a revelar el mecanismo de la actividad
enzimática, todavía se conoce poco acerca de los factores en la
estructura y en la combinación de los residuos de aminoácidos que
determinan las propiedades de las enzimas en relación con su
rendimiento de lavado.
En consecuencia, todavía se necesita una mejora y
adaptación adicionales de las enzimas para los sistemas de lavado,
así como una mejor comprensión del mecanismo de la acción de las
proteasas en el uso práctico de las composiciones detergentes o de
limpieza. Tal comprensión daría como resultado reglas que pueden
aplicarse para seleccionar mutaciones que, con un grado razonable de
certeza, darán como resultado una enzima que muestre un rendimiento
de lavado mejorado en las condiciones especificadas en el líquido
de lavado.
Investigaciones adicionales sobre estos problemas
han demostrado ahora sorprendentemente que uno de los factores
críticos en el uso de las enzimas subtilisinas en composiciones
detergentes es la adsorción de la enzima al sustrato, es decir, el
material que ha de eliminarse de los materiales textiles,
superficies duras u otros materiales que haya que limpiar.
En consecuencia, la presente invención se refiere
a mutaciones del gen de la subtilisina que dan como resultado
propiedades cambiadas de la enzima subtilisina mutante expresada
por tal gen mutado, por las que dicha enzima subtilisina mutante
muestra un comportamiento mejorado en las composiciones
detergentes. Las mutaciones se generan en ácidos nucleicos
específicos en el gen de la subtilisina original responsable de la
expresión de aminoácidos específicos en posiciones específicas en
la enzima subtilisina.
La presente invención también se refiere a
métodos de selección de las posiciones y los aminoácidos que van a
mutarse y, de ese modo, cambiando lo que se deba cambiar, a los
ácidos nucleicos que han de cambiarse en el gen de la subtilisina
en cuestión.
La invención se refiere, en parte, pero sin
limitarse a ello, a mutaciones de los genes de la subtilisina 309 y
la subtilisina Carlsberg y a las subsiguientes enzimas subtilisina
309 y Carlsberg mutantes, que muestran un rendimiento de lavado
mejorado en diferentes composiciones detergentes, dando como
resultado líquidos de lavado de diversos valores de pH.
Además, la invención se refiere al uso de las
enzimas mutantes en composiciones de limpieza y a las composiciones
de limpieza que comprenden las enzimas mutantes, especialmente a
las composiciones de limpieza que comprenden las enzimas
subtilisinas mutantes.
| A | = | Ala | = | Alanina |
| V | = | Val | = | Valina |
| L | = | Leu | = | Leucina |
| I | = | Ile | = | Isoleucina |
| P | = | Pro | = | Prolina |
| F | = | Phe | = | Fenilalanina |
| W | = | Trp | = | Triptófano |
| M | = | Met | = | Metionina |
| G | = | Gly | = | Glicina |
| S | = | Ser | = | Serina |
| T | = | Thr | = | Treonina |
| C | = | Cys | = | Cisteína |
| Y | = | Tyr | = | Tirosina |
| N | = | Asn | = | Asparagina |
| Q | = | Gln | = | Glutamina |
| D | = | Asp | = | Ácido aspártico |
| E | = | Glu | = | Ácido glutámico |
| K | = | Lys | = | Lisina |
| R | = | Arg | = | Arginina |
| H | = | His | = | Histidina |
| A | = | Adenina | |
| G | = | Guanina | |
| C | = | Citosina | |
| T | = | Timina | (sólo en ADN) |
| U | = | Uracilo | (sólo en ARN) |
En la descripción de los diversos mutantes
producidos o contemplados según la invención, se adaptaron las
siguientes nomenclaturas para facilitar la referencia:
Aminoácido(s) original(es)
posición(es) aminoácido(s) sustituido(s)
Según esto, la sustitución de glicina por ácido
glutámico en la posición 195 se designa como:
Gly 195 Glu
\hskip1cmo
\hskip1cmG195E
una deleción de glicina en la misma
posición
es:
Gly 195 *
\hskip1cmo
\hskip1cmG195*
y la inserción de un residuo de
aminoácido adicional, tal como la lisina
es:
Gly 195 GlyLys
\hskip1cmo
\hskip1cmG195GK
Cuando se indica una deleción en la tabla I, o
presente en un subtilisina no indicada en la tabla I, una inserción
en tal posición se indica como:
* 36 Asp
\hskip1cmo
\hskip1cm*36D
para la inserción de un ácido
aspártico en la posición
36.
Las mutaciones múltiples se separan por signos
más, es decir:
Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu
\hskip1cmo
\hskip1cmR170Y + G195E
lo que representa mutaciones en las
posiciones 170 y 195 que sustituyen arginina y glicina por tirosina
y ácido glutámico,
respectivamente.
| a \; = | subtilisina BPN' (Wells y col., 1983, citado anteriormente) |
| b \; = | subtilisina amylosacchariticus (Kurihara y col., 1972, citado anteriormente) |
| c \; = | subtilisina 168 (Stahl y Ferrari, 1984, citado anteriormente) |
| d \; = | subtilisina mesentericopeptidasa (Svendsen y col., 1986, citado anteriormente) |
| e \; = | subtilisina DY (Nedkow y col., 1985, citado anteriormente) |
| f \; = | subtilisina Carlsberg (Smith y col., 1968, citado anteriormente) |
| g \; = | subtilisina Carlsberg (Jacobs y col., 1985, citado anteriormente) |
| h \; = | subtilisina 309 (solicitud de patente internacional número PCT/DK 88/00002) |
| i \; = | subtilisina 147 (solicitud de patente internacional número PCT/DK 88/00002) |
| j \; = | termitasa (Meloun y col., 1985, citado anteriormente) |
| k \; = | proteinasa K (Betzel y col., 1988, Eur. J. Biochem. 178: 155 y sig.) y Gunkel y col., 1989, Eur. J. |
| Biochem. 179: 185 y sig.) | |
| l \; = | acualisina ("aqualysin", subtilisina producida por Thermus aquaticus) (Kwon y col., 1988, Eur. J. |
| Biochem. 173:491 y sig.) | |
| m \; = | proteasa PB92 de Bacillus (publicación de patente europea número 0 283 075) |
| n \; = | proteasa TW7 (Tritirachium album) (solicitud de patente internacional número PCT/US88/01040) |
| o \; = | proteasa TW3 (Tritirachium album) (solicitud de patente internacional número PCT/US88/01040) |
| * \; = | deleción asignada |
La invención se describe adicionalmente en
detalle en las siguientes partes de esta memoria descriptiva con
referencia a los dibujos, en los que:
La figura 1 muestra la construcción del plásmido
pSX88,
la figura 2 muestra un mapa de restricción del
plásmido pSX88,
la figura 3 es un ejemplo de construcción de
genes mutantes de la subtilisina 309 para expresar las enzimas de
la invención,
la figura 4 muestra el mapa de restricción del
plásmido pSX92, y
la figura 5 demuestra gráficamente la relación
entre el pH de máximo rendimiento y el pI calculado de las enzimas
mutantes de la invención.
Anteriormente se estableció que la invención se
refiere a subtilisinas mutadas en las que la secuencia de
aminoácidos se ha cambiado mediante la mutación del gen de la
enzima subtilisina, que se desea modificar, en codones responsables
de la expresión de los aminoácidos situados en o cerca de la
superficie de la enzima resultante.
En el contexto de esta invención, una subtilisina
se define como una serín proteasa producida por bacterias
gram-positivas u hongos. En un sentido más
restringido, aplicable a muchas realizaciones de la invención, la
subtilisina también significa una serín proteasa de bacterias
gram-positivas. Según otra definición, una
subtilisina es una serín proteasa, en la que el orden relativo de
los residuos de aminoácidos en las tríadas catalíticas es Asp - His
- Ser (posiciones 32, 64 y 221). Todavía en un sentido más
específico, muchas de las realizaciones de la invención se refieren
a serín proteasas de bacterias gram- positivas que pueden tener una
homología sustancialmente inequívoca en su estructura primaria, con
las subtilisinas enumeradas en la tabla I anterior.
Utilizando el sistema de numeración que se
origina a partir de la secuencia de aminoácidos de la subtilisina
BPN', que se muestra en la tabla I anterior alineada con la
secuencia de aminoácidos de otras subtilisinas conocidas diversas,
es posible indicar inequívocamente la posición de un residuo de
aminoácido en una enzima subtilisina. A las posiciones anteriores al
residuo de aminoácido número 1 en la subtilisina BPN' se les asigna
un número negativo, tal como -6 para la Y en el extremo
N-terminal en la termitasa, o 0, tal como para la A
en el extremo N-terminal en la proteinasa K. Los
residuos de aminoácidos que son inserciones en relación con la
subtilisina BPN' se numeran mediante la adición de letras en orden
alfabético al número de la subtilisina BPN' precedente, tal como
12a, 12b, 12c, 12d, 12e para el "inserto"
S-T-S-P-G
en la proteinasa K entre ^{12}Ser y ^{13}Thr.
Suponiendo que el sustrato en las condiciones de
lavado tiene una carga electrostática opuesta a la de la enzima,
podría esperarse que la adsorción y, por tanto, el rendimiento de
lavado de la enzima para el sustrato mejoraría al aumentar la carga
electrostática neta, NEC, de la enzima.
Sin embargo, se encontró sorprendentemente que
una disminución en la NEC de la enzima en tales circunstancias
podría dar como resultado un rendimiento de lavado mejorado de la
enzima.
Expresado de otro modo, se encontró que cambiando
el punto isoeléctrico, pI_{o}, de la enzima en una dirección para
aproximarse a un pH inferior, también cambiaba el pH del
rendimiento de lavado óptimo de la enzima hasta un valor inferior,
lo que significa que con el fin de diseñar una enzima para un
líquido de lavado de pH bajo, en el que la enzima ha de ser activa,
puede obtenerse la mejora en el rendimiento de lavado de una enzima
subtilisina conocida mutando el gen para la enzima subtilisina
conocida, para obtener una enzima mutante que tenga un pI_{o}
inferior.
Este hallazgo condujo a experimentos que
demuestran que lo contrario también es posible. Esto significa que
una enzima subtilisina conocida también puede diseñarse para su uso
en detergentes de pH alto cambiando su pI_{o} a valores
superiores, cambiando así el pH de rendimiento de lavado óptimo para
la enzima hasta valores de pH superiores.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención
se refiere a una composición detergente enzimática que comprende
una proteasa subtilisina mutada, en la que la carga electroestática
molecular neta de la proteasa se ha cambiado en comparación con la
proteasa original en el mismo pH, de manera que, en dicha proteasa
haya, con relación a dicha proteasa original, menos o más
residuo(s) de aminoácidos cargados positivamente y/o más o
menos residuo(s) de aminoácidos cargados negativamente,
caracterizada porque se realiza al menos una mutación entre los
residuos de aminoácidos en una cualquiera o más de las
posiciones
1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 27, 40, 43,
44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117,
133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173, 183, 184,
185, 191, 192, 209, 210, 211, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247,
252, 253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 272,
mediante deleción, sustitución o
inserción (única o múltiple) adyacente a las posiciones indicadas,
caracterizada adicionalmente porque la proteasa es una proteasa
subtilisina mutada que comprende una o más de las mutaciones
seleccionadas de los conjuntos S005, S011, S012, S013, S014, S018,
S022, S024, S204, en las
que
\newpage
| S005) | K251E |
| S011) | R170Y + K251E |
| S012) | R170Y + G195E +K251E |
| S013) | T71D + R170Y + K251E |
| S014) | T71D + R170Y + G195E + K251E |
| S018) | G195E + K251E |
| S022) | *36D + R170Y + G195E + K251E |
| S024) | *36D + H120D + R170Y + G195E + K235L + K251E |
| S204) | H120D + G195E + K235L + K251E, |
en la que dicha proteasa
subtilisina tiene un pH isoeléctrico (pI_{o}) inferior al de la
proteasa original y en la que dicha proteasa subtilisina tiene un
pH isoeléctrico (pI_{o}) inferior o superior, respectivamente, al
de dicha proteasa
original.
En estos aspectos, la invención se refiere, en
resumen, a proteasas mutantes en las que el pI_{o} de la proteasa
mutante es inferior al pI_{o} de la proteasa original, y en las
que el pH para el rendimiento de lavado óptimo también es inferior
al pH óptimo para la proteasa original.
Generalmente se cree (Thomas, Russell y Fersht,
citados anteriormente) que las propiedades cinéticas pueden
resultar influidas por los cambios en la carga superficial
electrostática en las cercanías del sitio activo de la enzima, pero
ahora se ha encontrado sorprendentemente que los cambios en las
propiedades cinéticas de una enzima también pueden ocasionarse
modificando las cargas superficiales alejadas del sitio activo.
En consecuencia, también se considera que la
invención abarca enzimas subtilisinas mutantes, en las que se han
cambiado uno o más residuos de aminoácidos a una distancia de más
de 15 \ring{A} de la tríada catalítica de dicha enzima, en
comparación con la secuencia de aminoácidos de su enzima original,
y de forma que se proporcione una proteasa mutante que tenga un
punto isoeléctrico (=pI_{o}) cambiado en la misma dirección que
se desea cambiar el pH para el rendimiento de lavado óptimo de la
enzima, pH óptimo que debe estar lo más próximo posible al pH del
líquido de lavado, en el que se pretende utilizar dicha proteasa
mutante.
Según varias realizaciones de la invención, se
proporcionan proteasas mutantes y composiciones detergentes que las
contienen, en las que la secuencia de aminoácidos de la proteasa
mutante contiene una mutación por inserción en la posición 36, por
ejemplo, para insertar un residuo de aminoácido cargado
negativamente (por ejemplo, D o E) o un residuo polar neutro (tal
como A, Q o N) o un residuo de aminoácido positivo, tal como R o
K.
Esto es particularmente aplicable, por ejemplo, a
la proteasa subtilisina 309 y 147 y PB92, y a cualquier otra
secuencia para la que la homología indique que le falta de manera
natural un residuo de aminoácido en la posición 36 con respecto a
la secuencia de la subtilisina BPN'.
Los mutantes por inserción en la posición 36
pueden tener mutaciones adicionales, por ejemplo, en una o más de
las posiciones 120, 170, 195, 235 y/o 251 y/o en la posición
76.
Las mutaciones adecuadas en las posiciones 76
son, por ejemplo, residuos cargados negativamente tales como N76D o
N76E.
Las mutaciones en la posición 36 (especialmente
la inserción de un residuo negativo o neutro polar) y en la
posición 76 (sustitución por un residuo cargado negativamente) a
menudo pueden tener un efecto estabilizador sobre la proteasa
mutante, y pueden usarse en combinación. Se ha encontrado que las
mutaciones, por ejemplo en una o más de las posiciones 120, 170,
195, 235 y 251 están asociadas con un aumento de la actividad
enzimática. Incluso en los casos en los que estas últimas
mutaciones están asociadas individualmente con cierta pérdida de
estabilidad, puede ser aceptable y útil combinarlas con mutaciones
en una o ambas de las posiciones 36 y 76.
Entre los ejemplos útiles de tales mutantes de
proteasas están aquellos que tienen las mutaciones siguientes:
| S-022) | *36D + R170Y + G195E + K251E |
| S-024) | *36D + H120D + R170Y + G195E + K235L + K251E |
En determinadas condiciones, puede ser ventajoso
disponer una mutación adicional en una proteasa mutante que tenga
una inserción de un residuo de aminoácido negativo en la posición
36, para insertar una carga positiva en otro sitio de la molécula.
Esto puede aumentar la solubilidad en agua de la proteasa mutante
resultante, por ejemplo, en la que la mutación adicional proporcione
una carga positiva, por ejemplo, un residuo cargado positivamente
en la posición 213, por ejemplo T213K.
Según la invención, se prefiere adicionalmente
que la enzima subtilisina mutante represente una mutación de una
enzima original seleccionada de subtilisina BPN', subtilisina
amylosacchariticus, subtilisina 168, subtilisina
mesentericopeptidasa, subtilisina Carlsberg, subtilisina DY,
subtilisina 309, subtilisina 147, termitasa, proteasa PB92 de
Bacillus y proteinasa K, preferiblemente la subtilisina 309,
subtilisina 147, subtilisina Carlsberg, acualisina, proteasa PB92
de Bacillus, proteasa TW7 o proteasa TW3.
En un aspecto adicional de la invención, las
observaciones anteriores acerca del pI_{o} se utilizan
adicionalmente en un método para determinar o seleccionar
la(s) posición(es) y el (los) aminoácido(s) que
han de delecionarse, sustituirse o insertarse por el (los)
aminoácido(s) en una enzima original, por lo que la
selección se realiza en una forma mediante la que la carga
electrostática neta (=NEC) calculada en una enzima mutante
resultante ha cambiado en comparación con la NEC en la enzima
original de elección calculada en el mismo valor de pH.
Otra forma de expresar este principio cubierto
por la invención es que la(s) posición(es) y el (los)
aminoácido(s) que han de delecionarse, sustituirse o
insertarse por el (los) aminoácido(s) en dicha enzima
original se seleccionan en una forma mediante la que el número
total de cargas o el contenido de carga total (=TCC) y/o la NEC en
una enzima mutante resultante se cambia de manera que se
proporcione una proteasa mutante que tenga un punto isoeléctrico
(=pI_{o}) cambiado en la misma dirección en que se desea cambiar
el pH para el rendimiento de lavado óptimo de la enzima, pH óptimo
que debe estar lo más próximo posible al pH del líquido de lavado
en el que se pretende utilizar dicha proteasa mutante.
Tal como se indicó anteriormente, el pI_{o} de
una macromolécula tal como una enzima se calcula como el pH en el
que la NEC de la molécula es igual a cero. El procedimiento se
ejemplifica en los ejemplos de más adelante, pero los principios se
describen aquí en más detalle.
Se asignan valores de pK a cada residuo de
aminoácido potencialmente cargado. A continuación, se calcula la
razón de la aparición de un residuo de aminoácido, a un pH dado, en
forma cargada o no cargada (cargada/no cargada, C/U(i)) tanto
para la carga positiva como la negativa, usando las fórmulas Ia e
Ib:
(Ia)C/U(i) =
exp(ln_{10} (pH-pK_{i}))
\hskip1,1cm(carga negativa)
(Ib)C/U(i) =
exp(ln_{10} (pK_{i}-pH))
\hskip1cm(carga positiva)
respectivamente.
A partir de las fórmulas Ia y Ib se observa que a
pH igual a pK_{i}, C/U(i) es igual a 1.
A continuación se calcula la carga relativa,
Q_{r}(i),o contribución de carga asignada a cada residuo
cargado usando las fórmulas IIa y IIb:
(IIa)Q_{r} (i)
= C/U(i)/(1+C/U(i))
\hskip1,3cm(carga negativa)
(IIb)Q_{r} (i)
= -C/U(i)/(1+C/U(i))
\hskip1cm(carga positiva)
Se halla el valor de pH en el que la suma de
todas las contribuciones de carga de los residuos cargados es igual
a cero por iteración o mediante interpolación en una tabla de pH -
suma de cargas suficientemente densa.
La presente invención también comprende el uso de
las enzimas mutantes de la invención en composiciones de limpieza y
detergentes, comprendiendo tal composición las enzimas subtilisinas
mutantes.
Tales composiciones comprenden, además de una
cualquiera o más de las enzimas subtilisinas mutantes según
cualquiera de los aspectos anteriores de la invención, solas o en
combinación con cualquiera de los componentes habituales incluidos
en tales composiciones, que son bien conocidos por la persona
experta en la técnica.
Tales componentes comprenden adyuvantes, tales
como adyuvantes de zeolita o fosfato, tensioactivos, tales como
tensioactivos aniónicos, catiónicos o no iónicos, polímeros, tales
como polímeros acrílicos o equivalentes, sistemas de blanqueo,
tales como precursores o activadores del blanqueo que contienen
perborato o grupos amino, estructuradores, tales como
estructuradores de silicato, ácidos o bases para ajustar el pH,
humectantes y/o sales inorgánicas neutras.
En varias realizaciones útiles, las composiciones
detergentes pueden formularse tal como sigue:
a) Una composición detergente formulada como un
polvo detergente que contiene adyuvante de fosfato, tensioactivo
aniónico, tensioactivo no iónico, polímero acrílico o equivalente,
precursor de blanqueo de perborato, activador de blanqueo que
contiene grupos amino, silicato u otro estructurador, base para
ajustar al pH deseado en uso y sal inorgánica neutra.
b) Una composición detergente formulada como un
polvo detergente que contiene adyuvante de zeolita, tensioactivo
aniónico, tensioactivo no iónico, polímero acrílico o equivalente,
precursor de blanqueo de perborato, activador de blanqueo que
contiene grupos amino, silicato u otro estructurador, base para
ajustar al pH deseado en uso y sal inorgánica neutra.
c) Una composición detergente formulada como un
líquido detergente acuoso que comprende tensioactivo aniónico,
tensioactivo no iónico, humectante, ácido orgánico, base cáustica
con un pH ajustado a un valor de entre 9 y 10.
d) Una composición detergente formulada como un
líquido detergente no acuoso que comprende un tensioactivo no
iónico líquido que consiste esencialmente en alcohol primario
alcoxilado lineal, triacetina, trifosfato de sodio, base cáustica,
precursor de blanqueo de perborato monohidratado y activador de
blanqueo de amina terciaria, con un pH ajustado a un valor de entre
aproximadamente 9 y 10.
e) Una composición detergente formulada como un
polvo detergente en la forma de un granulado que tiene una densidad
aparente de al menos 550 g/l, por ejemplo, de al menos 600 g/l, que
contiene tensioactivos aniónicos y no iónicos, por ejemplo
tensioactivo aniónico y una mezcla de tensioactivos no iónicos con
grados de alcoxilación respectivos de aproximadamente 7 y
aproximadamente 3, sal inorgánica neutra de bajo contenido o
sustancialmente cero, adyuvante de fosfato, precursor de blanqueo
de perborato, activador de blanqueo de amina terciaria, silicato de
sodio y componentes minoritarios y humedad.
f) Una composición detergente formulada como un
polvo detergente en la forma de un granulado que tiene una densidad
aparente de al menos 600 g/l, que contiene tensioactivo aniónico y
una mezcla de tensioactivos no iónicos con grados de alcoxilación
respectivos de aproximadamente 7 y aproximadamente 3, sal
inorgánica neutra de bajo contenido o sustancialmente cero,
adyuvante de zeolita, precursor de blanqueo de perborato, activador
de blanqueo de amina terciaria, silicato de sodio y componentes
minoritarios y humedad.
g) Una composición detergente formulada como un
polvo detergente que contiene tensioactivo aniónico, tensioactivo
no iónico, polímero acrílico, jabón de ácidos grasos, carbonato de
sodio, sulfato de sodio, partículas de arcilla con o sin aminas,
precursor de blanqueo de perborato, activador de blanqueo de amina
terciaria, silicato de sodio, y componentes minoritarios y
humedad.
h) Una composición detergente formulada como una
barra (jabón) detergente que contiene jabón a base de una mezcla
saponificada en bandeja de sebo y aceite de coco, neutralizada con
ácido ortofosfórico, mezclada con proteasa, también mezclada con
formiato de sodio, bórax, propilenglicol y sulfato de sodio, y
después se hace pasar lentamente a una cadena de producción de
jabón.
j) Una composición detergente enzimática
formulada para dar un pH del líquido de lavado de 9 o menos cuando
se usa a una tasa correspondiente a 0,4 - 0,8 g/l de
tensioactivo.
k) Una composición detergente enzimática
formulada para dar un pH del líquido de lavado de 8,5 o menos
cuando se usa a una tasa correspondiente a 0,4 - 0,8 g/l de
tensioactivo.
l) Una composición detergente enzimática
formulada para dar una fuerza iónica del líquido de lavado de 0,03
o menos, por ejemplo de 0,02 o menos, cuando se usa a una tasa
correspondiente a 0,4 - 0,8 g/l de tensioactivo.
m) Una composición detergente enzimática
formulada para dar una fuerza iónica del líquido de lavado de 0,01
o más, por ejemplo de 0,02 o más, cuando se usa a una tasa
correspondiente a 0,4 - 0,8 g/l de tensioactivo.
Sorprendentemente se ha encontrado que una
disminución en el punto isoeléctrico, pI, y por tanto en la carga
neta de una proteasa tipo subtilisina en condiciones de lavado,
puede dar como resultado, no sólo un rendimiento de lavado mejorado
de la enzima, sino también una compatibilidad mejorada con
lipasa.
También se ha encontrado sorprendentemente que la
compatibilidad de la proteasa con la lipasa está influida, no sólo
por el pI, sino también por las posiciones en las que se localizan
las cargas en relación con el sitio activo de la proteasa: La
introducción de carga negativa o la eliminación de carga positiva
más cerca del sitio activo proporciona una mejora más marcada de la
compatibilidad de la proteasa con la lipasa.
En consecuencia, ciertas realizaciones de la
invención proporcionan composiciones detergentes enzimáticas, que
comprenden lipasa y que también comprenden proteasa subtilisina
mutada, en las que la carga electrostática molecular neta de la
proteasa mutada se ha cambiado por inserción, deleción o
sustitución de residuos de aminoácidos, en comparación con la
proteasa original, y en las que en dicha proteasa hay, en relación
con dicha proteasa original, menos residuo(s) de aminoácidos
cargados positivamente y/o más residuo(s) de aminoácidos
cargados negativamente, por lo que dicha proteasa subtilisina tiene
un pH isoeléctrico (pI_{o}) inferior al de dicha proteasa
original.
Una clase preferida de lipasas para tal uso tiene
su origen en bacterias gram-negativas e incluye,
por ejemplo, enzimas lipasa del grupo definido en los documentos EP
0 205 208 y 0 206 390 (ambas concedidas a Unilever) (que se
incorporan como referencia al presente documento), incluyendo
lipasas inmunológicamente relacionadas con las de ciertas cepas de
Ps. fluorescens, P. gladioli y Chromobacter.
Las realizaciones preferidas de la enzima
proteasa subtilisina mutante para su uso junto con lipasa tal como
se ha mencionado anteriormente, poseen una o más mutaciones en el
sitio de un residuo de aminoácido localizado dentro del intervalo
de aproximadamente 15A-20A desde el sitio activo,
especialmente, por ejemplo, en las posiciones 170, 120 ó 195.
La lipasa puede añadirse de manera útil en la
forma de una composición granular (alternativamente como una
disolución o una suspensión) de enzima lipolítica con material
vehículo (por ejemplo, como en el documento EP 258068 (Novo Nordisk
A/S) y en los productos Savinase® y Lipolase® de Novo Nordisk
A/S).
La cantidad añadida de lipasa puede escogerse
dentro de límites amplios, por ejemplo de 50 a 30.000 LU/g
(unidades de lipasa/g) por gramo de sistema tensioactivo o de la
composición detergente, por ejemplo, a menudo al menos 100 LU/g, de
manera muy útil al menos 500 LU/g, a veces preferiblemente superior
a 1000, superior a 2000 LU/g o superior a 4000 LU/g o más, por
tanto, muy a menudo dentro del intervalo 50 - 4000 LU/g y
posiblemente dentro del intervalo de 200 - 1000 LU/g. En esta
memoria descriptiva las unidades de lipasa se definen igual que en
el documento EP 258068.
La enzima lipolítica puede escogerse de entre una
amplia variedad de lipasas: en particular, las lipasas descritas
por ejemplo en las siguientes memorias descriptivas de patente, EP
214761 (Novo Nordisk A/S), EP 0 258 068 y especialmente las lipasas
que muestran reactividad inmunológica cruzada con antisueros
generados contra la lipasa de Thermomyces lanuginosus ATCC
22070, documentos EP 0 205 208 y EP 0 206 390 y especialmente las
lipasas que muestran reactividad inmunológica cruzada con
antisueros generados contra la lipasa de Chromobacter viscosum
var lipolyticum NNRL B-3673, o contra la lipasa
de Alcaligenes PL-679, ATCC 31371 y
FERM-P 3783, también las lipasas descritas en las
memorias descriptivas de los documentos WO 87/00859
(Gist-Brocades) y EP 0 204 284 (Sapporo Breweries).
En particular son adecuadas, por ejemplo, las siguientes
preparaciones de lipasa comercialmente disponibles: Lipolase® de
Novo, lipasas CE, P, B, AP, M-AP, AML y CES de Amano
y las lipasas MY-30, OF y PL de Meito, también la
Esterase® MM, Lipozim®, SP225, SP285, lipasa de Saiken, lipasa de
Enzeco, lipasa de Toyo Jozo y lipasa de Diosynth (marcas
registradas).
La modificación por ingeniería genética de las
enzimas puede lograrse mediante la extracción de un gen de lipasa
apropiado, por ejemplo, el gen para la lipasa de Thermomyces
lanuginosus o de un mutante del mismo, y la introducción y
expresión del gen o derivado del mismo en un microorganismo
productor adecuado tal como un Aspergillus. Pueden aplicarse
y adaptarse las técnicas descritas en los documentos WO 88/02775
(Novo Nordisk A/S), EP 0 243 338 (Labofina), EP 0 268 452
(Genencor) y principalmente EP 0 305 216 (Novo Nordisk A/S) o EP 0
283 075 (Gist-Brocades).
Consideraciones similares se aplican, cambiando
lo que se deba cambiar, en el caso de otras enzimas, que también
pueden estar presentes. Sin limitación: Por ejemplo, puede usarse
amilasa cuando está presente en una cantidad en el intervalo de
aproximadamente 1 a aproximadamente 100 MU (unidades de maltosa)
por gramo de composición detergente (o 0,014 - 1,4, por ejemplo,
0,07 - 0,7 KNU/g (unidades de Novo)). Por ejemplo, puede usarse
celulasa cuando está presente en una cantidad en el intervalo de
aproximadamente 0,3 a aproximadamente 35 unidades CEVU (unidades de
viscosidad equivalente de celulasa) por gramo de composición
detergente.
Las composiciones detergentes pueden incluir
además los siguientes componentes de detergentes habituales en las
cantidades habituales. Pueden tener o no adyuvante y pueden ser de
tipo P cero (es decir, que no contienen ningún adyuvante que
contenga fósforo). Por tanto, la composición puede contener en
total, por ejemplo, desde el 1 - 50%, por ejemplo al menos
aproximadamente el 5% y a menudo hasta el 35 - 40% en peso, de uno
o más adyuvantes orgánicos y/o inorgánicos. Ejemplos habituales de
tales adyuvantes incluyen los ya mencionados anteriormente, y más
ampliamente incluyen orto, piro y tripolifosfatos de metal
alcalino, carbonatos de metal alcalino, bien solos o en mezcla con
calcita, citratos de metal alcalino, nitrilotriacetatos de metal
alcalino, carboximetiloxisuccinatos, zeolitas,
poliacetalcarboxilatos, etcétera.
Además, las composiciones detergentes pueden
contener desde el 1 - 35% de un agente de blanqueo o un precursor
de blanqueo o un sistema que comprende agente y/o precursor de
blanqueo con activador del mismo. Componentes opcionales
adicionales son potenciadores de espuma, reductores de espuma,
agentes anticorrosión, agentes de suspensión de la suciedad,
agentes secuestrantes, agentes de antirredeposición de la suciedad,
perfumes, colorantes, agentes estabilizadores para las enzimas,
etcétera.
Las composiciones pueden usarse para el lavado de
materiales textiles, especialmente pero sin limitación, materiales
textiles a base de algodón y poliéster y mezclas de los mismos. Por
ejemplo, son especialmente adecuados los procesos de lavado
llevados a cabo a temperaturas de aproximadamente 60 - 65ºC o
inferiores, por ejemplo, de aproximadamente 30ºC - 35ºC o
inferiores. Puede ser muy adecuado utilizar las composiciones a una
tasa suficiente para proporcionar aproximadamente, por ejemplo, 0,4
- 0,8 g/l de tensioactivo en el líquido de lavado, aunque
naturalmente es posible utilizar concentraciones inferiores o
superiores si se desea. Sin limitación puede afirmarse, por ejemplo,
que una tasa de utilización de desde aproximadamente 3 g/l y hasta
aproximadamente 6 g/l de la formulación de detergente es adecuada
para su uso en el caso en el que las formulaciones sean como en los
ejemplos.
En la técnica son bien conocidos muchos métodos
para introducir mutaciones en genes. Tras una breve discusión de la
clonación de genes de subtilisina, se tratarán los métodos para
generar mutaciones tanto en sitios aleatorios como en sitios
específicos dentro del gen de la subtilisina.
El gen que codifica para la subtilisina puede
clonarse a partir de cualquier bacteria
gram-positiva u hongo mediante diversos métodos,
bien conocidos en la técnica. En primer lugar, debe construirse una
librería de ADNc y/o genómica de ADN utilizando ADN cromosómico o
ARN mensajero procedente del microorganismo que produce la
subtilisina que va a estudiarse. A continuación, si se conoce la
secuencia de aminoácidos de la subtilisina, pueden sintetizarse
sondas de oligonucleótidos marcados homólogos, y utilizarse para
identificar los clones que codifican para la subtilisina a partir
de una librería genómica de ADN bacteriano, o a partir de una
librería de ADNc fúngico. Alternativamente, podría usarse una sonda
de oligonucleótidos marcados que contiene secuencias homólogas a la
subtilisina procedente de otra cepa de bacterias u hongos como una
sonda para identificar los clones que codifican para la
subtilisina, utilizando condiciones de hibridación y lavado de
menor rigurosidad.
Todavía otro método para identificar los clones
que producen subtilisina supondría insertar fragmentos de ADN
genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido,
transformar bacterias que carecen de proteasa con la librería de
ADN genómico resultante, y después sembrar en placa las bacterias
transformadas, en agar que contiene un sustrato para la subtilisina,
tal como leche desnatada. Aquellas bacterias que contengan un
plásmido que lleve subtilisina producirán colonias rodeadas por un
halo de agar limpio, debido a la digestión de la leche desnatada
por la subtilisina excretada.
Una vez que se ha clonado el gen de la
subtilisina en un vector adecuado, tal como un plásmido, pueden
utilizarse varios métodos para introducir mutaciones aleatorias en
el gen.
Un método sería introducir el gen de la
subtilisina clonado, como parte de un vector recuperable, en una
cepa mutadora de Escherichia coli.
Otro método supondría generar una forma de cadena
sencilla del gen de la subtilisina y después hibridar el fragmento
de ADN que contiene el gen de la subtilisina con otro fragmento de
ADN de manera que una parte del gen de la subtilisina siga siendo
de cadena sencilla. Esta región diferenciada de cadena sencilla
podría exponerse entonces a cualquiera de varios agentes mutágenos
incluyendo, pero sin limitarse a ellos, bisulfito de sodio,
hidroxilamina, ácido nitroso, ácido fórmico o hidralazina. Un
ejemplo específico de este método para generar mutaciones
aleatorias se describe por Shortle y Nathans (1978, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 75: 2170-2174). Según el
método de Shortle y Nathans, el plásmido que lleva el gen de la
subtilisina se cortaría mediante una enzima de restricción que
escinde dentro del gen. Este corte se ensancharía en una abertura
en una hebra ("gap") utilizando la acción exonucleasa de la ADN
polimerasa I. La abertura de la cadena sencilla resultante podría
mutarse entonces utilizando cualquiera de los agentes mutágenos
mencionados anteriormente.
Alternativamente, el gen de la subtilisina
procedente de una especie de Bacillus que incluye el
promotor natural y otras secuencias de control podría clonarse en
un vector plásmido que contiene replicones tanto para E.
coli como para B. subtilis, un marcador fenotífico
seleccionable y el origen de replicación de M13 para la producción
del ADN de plásmido de cadena sencilla tras superinfección con el
fago cooperador IR1. El ADN de plásmido de cadena sencilla que
contiene el gen de la subtilisina clonado se aísla y se hibrida con
un fragmento de ADN que contiene secuencias del vector, pero no la
región codificante de la subtilisina, dando como resultado una
molécula bicatenaria (dúplex) abierta. Se introducen mutaciones en
el gen de la subtilisina con bisulfito de sodio, ácido nitroso o
ácido fórmico o mediante la replicación en una cepa mutágena de
E. coli, tal como se describió anteriormente. Puesto que el
bisulfito de sodio reacciona exclusivamente con citosina en un ADN
monocatenario, las mutaciones creadas con este mutágeno se limitan
sólo a las regiones codificantes. El tiempo de reacción y la
concentración de bisulfito se varían en diferentes experimentos, de
manera que se creen desde una hasta cinco mutaciones por gen de
subtilisina de media. La incubación de 10 \mug de ADN bicatenario
abierto en bisulfito de sodio 4 M, pH 6,0, durante 9 minutos a 37ºC
en un volumen de reacción de 400 \mul, desamina aproximadamente
el 1% de las citosinas en la región de cadena sencilla. La región
codificante de la subtilisina madura contiene aproximadamente 200
citosinas, dependiendo de la cadena de ADN. Ventajosamente, el
tiempo de reacción se varía desde aproximadamente 4 minutos (para
producir una frecuencia de mutación de aproximadamente una de 200)
hasta aproximadamente 20 minutos (aproximadamente 5 de 200).
Tras la mutagénesis, las moléculas abiertas se
tratan in vitro con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) para
obtener moléculas completamente bicatenarias y fijar las
mutaciones. Las E. coli competentes se transforman entonces
con ADN mutado para producir una librería amplificada de
subtilisinas mutantes. Las librerías de mutantes amplificados
también pueden obtenerse haciendo crecer el ADN de plásmido en una
cepa Mud D de E. coli que aumenta el intervalo de mutaciones
debido a su ADN polimerasa propensa a cometer errores.
También pueden utilizarse los mutágenos ácido
nitroso y ácido fórmico para producir librerías de mutantes. Dado
que estos compuestos químicos no son tan específicos para el ADN
monocatenario como el bisulfito de sodio, las reacciones de
mutagénesis se realizan según el siguiente procedimiento. La parte
codificante del gen de la subtilisina se clona en el fago M13
mediante métodos habituales y se prepara el ADN monocatenario del
fago. El ADN monocatenario se hace reaccionar entonces con ácido
nitroso 1 M, pH 4,3, durante 15 - 60 minutos a 23ºC o con ácido
fórmico 2,4 M durante 1 - 5 minutos a 23ºC. Estos intervalos de
tiempos de reacción producen una frecuencia de mutación de desde 1
de 1000 hasta 5 de 1000. Tras la mutagénesis, se hibrida un cebador
universal con el ADN de M13 y se sintetiza ADN bicatenario
utilizando el ADN monocatenario mutado como molde, de manera que la
parte codificante del gen de la subtilisina se convierta por
completo en bicatenario. En este punto, la región codificante puede
cortarse del vector de M13 con enzimas de restricción y ligarse en
un vector de expresión no mutado, de manera que las mutaciones se
produzcan sólo en el fragmento de restricción. (Myers y col.,
Science 229:242-257 (1985)).
Una vez que se ha clonado el gen de la
subtilisina e identificado los sitios deseables para la mutación,
estas mutaciones pueden introducirse usando oligonucleótidos
sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de
nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; los
nucleótidos mutantes se introducen durante la síntesis de los
oligonucleótidos. En un método preferido, se crea una abertura de
cadena sencilla de ADN, que forma un puente con el gen de la
subtilisina, en un vector que lleva el gen de la subtilisina. A
continuación, el nucleótido sintético, que lleva la mutación
deseada, se hibrida con una parte homóloga del ADN monocatenario.
La abertura restante se rellena entonces mediante la ADN polimerasa
I (fragmento Klenow) y el constructo se liga usando ligasa de T4.
Un ejemplo específico de este método lo describen Morinaga y col.,
(1984, Biotechnology 2:646-639). Según Morinaga y
col., se elimina un fragmento dentro del gen usando endonucleasa de
restricción. El vector/gen, que ahora contiene una abertura, se
desnaturaliza entonces y se hibrida con un vector/gen que, en lugar
de contener una abertura, se ha escindido con otra endonucleasa de
restricción en un sitio fuera del área que forma parte de la
abertura. Una región de cadena sencilla del gen está entonces
disponible para su hibridación con los oligonucleótidos mutados, la
abertura restante se rellena mediante el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa I, las inserciones se ligan con la ADN ligasa de T4 y,
tras un ciclo de replicación, se produce un plásmido de doble
cadena que lleva la mutación deseada. El método de Morinaga evita la
manipulación adicional de construir nuevos sitios de restricción y,
por tanto, facilita la generación de mutaciones en múltiples
sitios. La patente de los EE.UU. número 4.760.025 de Estell y col.,
concedida el 16 de julio de 1988, puede introducir oligonucleótidos
que llevan mutaciones múltiples realizando modificaciones menores
en el cassette (fragmento de ADN con extremos cohesivos); sin
embargo, puede introducirse una variedad incluso mayor de mutaciones
en cualquier momento mediante el método de Morinaga, ya que puede
introducirse una multitud de oligonucleótidos, de diversas
longitudes.
Según la invención, un gen de subtilisina mutado
producido mediante los métodos descritos anteriormente, o mediante
cualquier método alternativo conocido en la técnica, puede
expresarse, en forma de enzima, utilizando un vector de expresión.
Un vector de expresión generalmente cae dentro de la definición de
un vector de clonación, puesto que un vector de expresión
normalmente incluye los componentes de un vector de clonación
habitual, concretamente, un elemento que permite la replicación
autónoma del vector en un microorganismo independiente del genoma
del microorganismo y uno o más marcadores fenotípicos con fines de
selección. Un vector de expresión incluye secuencias de control que
codifican para un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma,
señal de iniciación de la traducción y, opcionalmente, un gen
represor o varios genes activadores. Para permitir la secreción de
la proteína expresada, pueden insertarse nucleótidos que codifican
para una "secuencia señal" antes de la secuencia codificante
del gen. Para la expresión bajo la dirección de las secuencias
control, un gen diana que va a tratarse según la invención se une
funcionalmente a las secuencias control en el marco de lectura
adecuado. Las secuencias promotoras que pueden incorporarse en los
vectores plásmidos y que pueden soportar la transcripción del gen
de la subtilisina mutante, incluyen pero sin limitarse a ellos, el
promotor procariota de la \beta-lactamasa
(Villa-Kamaroff, y col., 1978, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 75:3737-3731) y el promotor tac
(DeBoer, y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:21-25). También puede encontrarse
bibliografía adicional en "Useful proteins from recombinant
bacteria" en Scientific American, 1980,
242:74-94.
Según una realización, B. subtilis se
transforma mediante un vector de expresión que lleva el ADN mutado.
Si la expresión ha de tener lugar en un microorganismo de secreción
tal como B. subtilis, una secuencia señal puede seguir a la
señal de iniciación de la traducción y preceder a la secuencia de
ADN de interés. La secuencia señal actúa para transportar el
producto de expresión hasta la pared celular donde se escinde del
producto en la secreción. El término "secuencias de control"
tal como se definió anteriormente pretende incluir una secuencia
señal, cuando está presente.
B. subtilis 309 y 147 son variantes de
Bacillus lentus, depositadas con la NCIB (National
Collection of Industrial Bacteria, Colección Nacional de Bacterias
Industriales de los EE.UU.) y para las que se concedieron los
números de registro NCIB 10147 y NCIB 10309, y se describen en la
patente de los EE.UU. número 3.723.250, concedida el 27 de marzo de
1973 e incorporada en su totalidad como referencia en el presente
documento.
B. subtilis DN 497 se describe en el
documento de los EE.UU. número de serie 039.298 presentado el 17 de
abril de 1987, correspondiente a la publicación EP número 242.220,
también incorporada como referencia en el presente documento, y es
un transformante aro+ de RUB 200 con ADN cromosómico de SL 438, una
cepa deficiente en proteasa y esporulación obtenida de la Dra. Kim
Hardy de Biogen.
E. coli MC 1000 r^{-m}+ (Casadaban, M.J.
y Cohen, S.N. (1980), J. Mol. Biol. 138:
179-207) se convirtió en r^{-m}+ mediante métodos
convencionales y también se describe en el documento de los EE.UU.
número de serie 039.298.
B. subtilis DB105 se describe en:
Kawamura, F., Doi, R.H. (1984), Construction of a Bacillus
subtilis double mutant deficient in extracelular alkaline and
neutral porteases, J. Bacteriol. 160 (2) 442 - 444.
pSX50 (descrito en la solicitud de patente de los
EE.UU. número de serie 039.298, e incorporada como referencia en el
presente documento) es un derivado del plásmido pDN 1050 que
comprende el promotor - operador P_{1}O_{1}, el gen xyn B de
B. pumilus y el gen xyl R de B. subtilis.
pSX62 (descrito en la solicitud de patente de los
EE.UU. número de serie 039.298, citada anteriormente) es un
derivado de pSX52 (en el mismo punto), que comprende un gen de
fusión entre el gen de la proquimosina de ternero y el gen xyn B de
B. pumilus insertado en pSX50 (citado anteriormente). pSX62
se generó insertando el terminador rrn B de E. coli en pSX52
detrás del gen de la proquimosina.
pSX65 (descrito en la solicitud de patente de los
EE.UU. número de serie 039.298, citada anteriormente) es un
derivado del plásmido pDN 1050, que comprende el promotor -
operador P_{2}O_{2}, el gen xyn B de B. pumilus y el gen
xyl R de B. subtilis.
pSX88 (descrito en la solicitud de patente
internacional no publicada número PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI
A/S) es un derivado de pSX50 que comprende el gen de la subtilisina
309.
pSX92 se produjo clonando la subtilisina 309 en
el plásmido pSX62 (citado anteriormente) cortado en Cla I y Hind
III, y se llenó Cla I antes de la inserción de los fragmentos
DraI-NheI y NheI-Hind III del gen de
la subtilisina 309 clonado.
pSX93, mostrado en la figura 3, es pUC13 (Vieira
y Messing, 1982, Gene 19:259-268) que
comprende un fragmento XbaI-Hind III de 0,7 kpb del
gen de subtilisina 309 que incluye el terminador insertado en una
secuencia poliunidor (secuencia con múltiples dianas únicas para
enzimas de restricción).
pSX119 (descrito en la solicitud de patente
internacional no publicada PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S)) es
pUC13 que alberga un fragmento EcoRI-XbaI del gen
de subtilisina 309 insertado en el poliunidor.
pSX120 es un plásmido en el que el fragmento
HpaI-HindIII con el gen de subtilisina 309 de pSX88
se inserta en EcoRV-HindIII en pDN 1681, de una
forma mediante la que el gen de proteasa se expresa por los
promotores amy M y amy Q. pDN 1681 se obtiene de pDN 1380
(Diderichsen, B. y Christiansen, L.: 1988, FEMS Microbilogy Letters
56:53-60) con un fragmento ClaI de 2,85 pb de B.
amyloliquefaciens insertado que lleva el gen amy Q con promotor
(Takkinen y col.: 1983, J. Biol. Chem. 258: 1007 y sig.)
pUC13 se describe en: Vieira J. y Messing J.:
1982, Gene 19: 259-268.
pUC19 se describe en:
Yanisch-Perron, C. y Vieira, J., Messin J., 1985,
Gene 33: 103-119.
pUB110 se describe en: Lacey, R.W., Chopra, J.
(1974), Genetic studies of a multiresistant strain of
Staphylococcus aureus, J. Med Microbiol. 7,
285-297, y en: Ziprian, E., Matzura, H. (1986),
Characterization of signals promoting gene expression on the
Staphyloccoccus aureus plasmid pUB110 and development of a
Gram-positive expresion vector system, DNA 5 (3),
219-225.
Los genes para las diversas subtilisinas se
obtuvieron tal como se alude en la bibliografía mencionada
anteriormente. En particular, los genes para las enzimas
subtilisina 309 y 147 se obtuvieron tal como se describe en la
solicitud de patente internacional no publicada número PCT/DK
88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S), que se incorpora en su totalidad como
referencia en el presente documento.
Se diseñó un gen sintético basándose en la
secuencia codificante de la proteasa subtilisina Carlsberg madura y
su terminador de transcripción (Jacobs, M. Eliasson, M., UhLen M.,
Flock, J.-I. (1985), Cloning, sequencing and expression of
subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis. Nucleic
Acids Res. 13 (23), 8913-8926), unido a las
secuencias codificantes pre y pro de la proteasa subtilisina BPN'
(Wells, J. A., Ferrari, E., Henner, D. J., Estell., D. A., Chen, E.
Y. (1983), Cloning, sequencing and secretion of Bacillus
amyloliquefaciens subtilis in Bacillus subtilis, Nucleic
Acids Res. 11 (22), 7911-7925). El gen se
subdividió en siete fragmentos de longitud que oscilaba desde 127
hasta 313 pares de bases, construyéndose cada fragmento a partir de
oligonucleótidos químicamente sintetizados de 16 a 77 nucleótidos.
El solapamiento entre los oligonucleótidos de las dos cadenas se
optimizó con el fin de facilitar una hibridación en una etapa de
cada fragmento (Mullenbach, G. T., Tabrizi, A., Blacher, R. W.,
Steimer, K. S. (1986), Chemical synthesis and expression in Yeast
of a gene encoding connective tissue activating
peptide-III, J. Biol. Chem. 261 (2),
719-722). Cada fragmento se unió y se clonó en un
vector de secuenciación y clonación de E. coli. Se realizó
el análisis de la secuencia de estos fragmentos clonados para
confirmar la corrección de la secuencia de cada fragmento. A
continuación, se unieron todos los fragmentos y se clonaron en el
vector pUB110 (Lacey, R. W., Chopra, J. (1974), Genetic studies of
a multiresistant strain of Staphylococcus aureus, J. Med.
Microbiol. 7, 285-297) y se llevaron a B.
Subtilis DB105 (Kawamura, F., Doi, R. H. (1984), Construction
of a Bacillus subtilis double mutant deficient in
extracellular alkaline and neutral proteases, J. Bacteriol. 160 (2)
442 - 444). Se inició la transcripción del gen por el promotor
HpaII del vector plásmido pUB110 (Zyprian, E., Matzura, H. (1986),
Characterization of signals promoting gene expression on the
Staphylococcus aureus plasmid pUB110 and development of a
Gram-positive expression vector system, DNA 5 (3),
219-255). En el proceso de construcción del gen
resultó que el fragmento más largo (nº 5; 313 pares de bases de
longitud) necesitaba fragmentación adicional (fragmentos nº 8 y nº
9) con el fin de evitar problemas con la unión de este fragmento
bastante largo.
La secuencia de aminoácidos deducida a partir de
la secuencia de nucleótidos difiere de la secuencia de subtilisina
Carlsberg publicada anteriormente en las posiciones 129, 157, 161 y
212 (Smith, E. L., DeLange, R. J., Evans, W. H., Landon, W.,
Markland, F. S. (1968), Subtilisin Carlsberg V. The complete
sequence: comparison with subtilisin BPN', evolutionary
relationships., J. Biol. Chem. 243 (9), 2184-2191).
Una quinta alteración notificada por Jacobs et al (1985) no
pudo confirmarse en el clon del gen Carlsberg descrito en el
presente documento.
El cálculo del punto isoeléctrico de la enzima
subtilisina 309 de tipo natural (S000) se ejemplifica a
continuación con el fin de demostrar el procedimiento utilizado.
Naturalmente, el mismo procedimiento es aplicable al cálculo de
cualquier enzima, ya sea una enzima mutante o no.
Se asignaron valores de pK a cada residuo de
aminoácido potencialmente cargado (Tyr, Asp, Glu, Cys, Arg, His,
Lys, N-terminal, C-terminal,
Ca^{2+}). En este caso, se tuvo en cuenta el entorno, por lo que
se usaron diferentes valores de pK para el mismo residuo de
aminoácido dependiente de sus vecinos. Los valores asignados se
indican en la tabla II.
A continuación, se calculó la razón de aparición
de un residuo de aminoácido a un pH dado en forma cargada o no
cargada (cargada / no cargada, C/U(i)) para la carga
positiva y la negativa, usando las fórmulas Ia y Ib,
respectivamente. En la tabla II, esta razón sólo se indica para el
pH igual al pI_{o}.
Posteriormente, se calculó la carga relativa,
Q_{r}(i), o contribución de carga asignada a cada residuo
cargado usando las fórmulas IIa y IIb:
Se halló por iteración el valor de pH en el que
la suma de todas las contribuciones de carga de los residuos
cargados es igual a cero.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Tal como se indicó anteriormente y en la tabla
II, el valor de pK asignado a cada aminoácido fue diferente
teniendo en cuenta las variaciones locales en el entorno. Esto sólo
da como resultado un aumento de la precisión en el cálculo, pero la
experiencia ha demostrado que los valores de pK estimados constantes
son útiles para demostrar en qué dirección se moverá el pI_{o}
para una enzima mutante dada, en comparación con el pI_{o} de la
enzima original. Esto se indica en la tabla III, en la que se
indican los valores del pI_{o} para los valores de pK
estimados.
Con el fin de comparar diversas enzimas y enzimas
mutantes, se han llevado a cabo pruebas de lavado descritas en
detalle más adelante. En la tabla III, a continuación, se han
tabulado los resultados de estas pruebas que utilizan la enzima
original y enzimas mutantes de la subtilisina 309 (designada S000,
etc) y la subtilisina Carlsberg (designada C000, etc.) con el fin
de demostrar la correlación entre el pI_{o} y el rendimiento de
lavado a diferentes valores de pH del líquido de lavado utilizado.
En las pruebas de lavado, se utilizó una formulación de detergente
líquida, con bajo contenido de sal, de pH 8,3 según el ejemplo D7
de detergente y un detergente en polvo con contenido normal de sal
de pH 10,2, según el ejemplo D2 de detergente.
En la tabla III se indican los resultados como
resultados relativos comparados con las enzimas de tipo natural
(S000 y C000, respectivamente). Además, se indican los pI_{o}
calculados y observados para las enzimas.
A partir de la tabla III, se observa que
cambiando el pI_{o} a valores inferiores (series S) se
proporciona una mejora en el rendimiento de lavado a pH bajo (pH =
8,3), mientras que un cambio ascendente en el pI_{o} (serie C)
proporciona una mejora en el rendimiento de lavado a pH alto (pH =
10,2).
Por tanto, se ha encontrado que el concepto de
punto isoeléctrico es muy útil para seleccionar las posiciones de
los aminoácidos en la enzima original que deben cambiarse.
Generalmente, se ha encontrado que las mutaciones
deben realizarse en codones correspondientes a los aminoácidos
situados en o cerca de la superficie de la molécula enzimática,
manteniéndose así la estructura interna de la enzima parental lo
más posible.
El procedimiento se refiere a una purificación
habitual de una fermentación a escala de 10 litros de la enzima
subtilisina 147, la enzima subtilisina 309 o mutantes de las
mimas.
Aproximadamente, se centrifugaron 8 litros de
caldo de fermentación a 5000 rpm durante 35 minutos en vasos de
precipitados de 1 litro. Los sobrenadantes se ajustaron a pH 6,5
usando ácido acético al 10% y se filtraron en placas filtrantes
Seitz Supra S100.
Los filtrados de concentraron hasta
aproximadamente 400 ml usando una unidad de UF (ultrafiltración)
CH2A de Amicon dotada con un cartucho de UF S1Y10 de Amicon. El
concentrado de la UF se centrifugó y se filtró antes de la absorción
a temperatura ambiente en una columna de afinidad de bacitracina a
pH 7. La proteasa se eluyó de la columna de bacitracina a
temperatura ambiente usando 2-propanol al 25% y
cloruro de sodio 1 M en una disolución tampón con ácido
dimetilglutárico 0,01, ácido bórico 0,1 M y cloruro de calcio 0,002
M ajustado a pH 7.
Las fracciones con actividad proteasa procedentes
de la etapa de purificación con bacitracina se combinaron y se
aplicaron a una columna Sephadex G25 de 750 ml (5 cm de diámetro)
equilibrada con un tampón que contenía ácido dimetilglutárico 0,01,
ácido bórico 0,2 M y cloruro de calcio 0,002 M ajustado a pH
6,5.
Las fracciones con actividad proteolítica
procedentes de la columna Sephadex G25 se combinaron y se aplicaron
a una columna de intercambio catiónico CM-Sepharose
CL 6B de 150 ml (5 cm de diámetro) equilibrada con un tampón que
contenía ácido dimetilglutárico 0,01 M, ácido bórico 0,2 M y
cloruro de calcio 0,002 M ajustado a pH 6,5.
La proteasa se eluyó usando un gradiente lineal
de cloruro de sodio 0 - 0,1 M en 2 litros del mismo tampón (cloruro
de sodio 0 - 0,2 M en el caso de la subtilisina 147).
En una etapa de purificación final, las
fracciones que contenían proteasa procedentes de la columna de
CM-Sepharose se combinaron y se concentraron en una
celda de ultrafiltración de Amicon dotada con una membrana GR81PP
(de Danish Sugar Factories, Inc).
- Gly 195 Glu (G195E (S001)):
- Arg 170 Tyr (R170Y (S003)):
- Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu (R1070Y + G195E (S004)):
- Lys 251 Glu (K251E (S005)):
- His 120 Asp (H120D (S006)):
- Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 251 Glu (R1070Y + G195E + K251E (S012)):
- Lys 235 Leu (K235L (S015):
- His 120 Asp + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D + G195E + K251E (S017)):
- His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D + R170Y + G195E + K235L (S019)):
- His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu + Lys 251 Glu (H120D + R1070Y + G195E + K235L + K251E (S020)):
se purificaron mediante este
procedimiento.
Los medios de fermentación se aplicaron, o bien
directamente en una columna de afinidad de bacitracina (5 cm de
diámetro * 15 cm; equilibrada con tampón Tris 10 mM / HCl, pH 7,9;
velocidad de flujo de aproximadamente 500 ml/h) o bien se
concentraron hasta 500 ml mediante un dializador Nephross Andante
H.F. (Organon Tchenika) usando una contrapresión de
10-12 p.s.i. y agua desmineralizada en el circuito
externo. En este último caso, la proteasa se precipitó a partir del
concentrado añadiendo sulfato de amonio 600 g/l. El precipitado se
recogió mediante centrifugación y se redisolvió en aproximadamente
500 ml de agua desmineralizada. Se eliminó el sulfato de amonio de
la disolución de proteasa usando el mismo dializador descrito
anteriormente. El volumen final fue de aproximadamente 300 ml,
mientras que el pH se ajustó hasta pH 6,0. La proteasa se eluyó de
las columnas de bacitracina (mencionadas anteriormente) usando un
tampón Tris 10 mM (pH 7,9) que contenía NaCl 2,7 M e isopropanol al
18%.
Tras la diálisis del material de proteasa
concentrado o purificado con bacitracina, se llevó a cabo una
purificación adicional mediante la aplicación de una columna de
intercambio iónico CM-Trisacryl (5 cm de diámetro *
15 cm, equilibrada con fosfato de sodio 0,03 M, pH 6,0) usando una
velocidad de flujo de 200 ml/h. La proteasa se eluyó de la columna
con un gradiente lineal de NaCl desde 0 hasta 0,3 M (2 * 500 ml) en
el tampón fosfato. Las fracciones que contenían actividad proteasa
se reunieron y se almacenaron a -20ºC en presencia de sales tampón
tras liofilización.
Todos los cebadores con emparejamiento incorrecto
se sintetizaron en un sintetizador de ADN 380 A de Applied
Biosystem y se purificaron mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE).
La actividad proteolítica de las enzimas mutantes
se sometió a ensayo con el fin de determinar en qué grado se
mantuvo la actividad catalítica de la enzima. Las determinaciones
se llevaron a cabo mediante el método de la
dimetil-caseína (DMC) descrito en la publicación
NOVO AF 200-gb (o ediciones posteriores) disponible
de Novo-Nordisk a/s, Bagsv\aerd, Dinamarca,
publicación que se incorpora como referencia al presente
documento.
A:
Se produjeron tejidos de prueba (2,2 cm x 2,2 cm,
aproximadamente 0,1 g) haciendo pasar tejido de algodón
desaprestado (algodón 100%, DS 71) a través del recipiente en una
unidad de lavado y secado Mathis tipo TH (Werner Mathis AG, Zurich,
Suiza) que contenía jugo de hierba.
Finalmente, el tejido se secó en una fuerte
corriente de aire a temperatura ambiente, se almacenó a temperatura
ambiente durante 3 semanas y posteriormente se mantuvo en -18ºC
antes de su uso.
Todas las pruebas se realizaron en un sistema
modelo de minilavado. En este sistema se lavaron 6 tejidos de
prueba en un vaso de precipitados de 150 ml que contenía 60 ml de
disolución detergente. Los vasos de precipitados se mantuvieron en
un baño de agua con termostato a 30ºC con agitación magnética.
Como detergente se utilizó el siguiente
detergente líquido habitual:
| AE (alcohol etoxilado, Berol 160) | 15% |
| LAS (ácido alquilbencenosulfónico lineal), Nasa 1169/P | 10% |
| Ácido graso de coco | 9% |
| Ácido oleico | 1% |
| Trietanolamina | 9% |
| Glicerol | 10,5% |
| Etanol | 1,5% |
| Tri\cdotNa\cdotCitrato\cdot2H_{2}O | 8% |
| CaCl\cdot2H_{2}0 | 0,1% |
| NaOH | 1% |
| Agua del LAS | 23,3% |
| Agua del glicerol | 1,5% |
| Agua añadida | 34,9% |
Los porcentajes dados son el porcentaje de
contenido activo.
El pH se ajustó con NaOH 1 N hasta 8,14. El agua
usada fue de aproximadamente 6º dH (dureza alemana).
Las pruebas se realizaron a concentraciones de
enzima de: 0, 1,0 mg de proteína enzimática/l y 10,0 mg de proteína
enzimática/l, y se realizaron dos conjuntos independientes de
pruebas para cada uno de los mutantes. Los resultados mostrados a
continuación son las medias de estas pruebas.
Los lavados se realizaron durante 60 minutos y
posteriormente al lavado, los tejidos se enjuagaron con agua
corriente del grifo durante 25 minutos en un cubo.
Los tejidos se secaron entonces al aire durante
la noche (protegidos de la luz) y se determinó la remisión, R, en
un fotómetro ELREPHO 2000 de Datacolor S.A., Dietkilon, Suiza, a
460 nm.
Como medida del rendimiento de lavado se usó la
remisión diferencial, delta R, que era igual a la remisión tras el
lavado con enzima añadida menos la remisión tras el lavado sin
enzima añadida.
B:
Se probó el rendimiento de lavado de diversos
mutantes frente a tejidos de algodón manchados con jugo de hierba,
según el método descrito anteriormente.
Se usaron 2,0 g/l de detergente líquido comercial
en los EE.UU.
El detergente se disolvió en un tampón de
etanolamina 0,005 M en agua sometida a intercambio iónico. El pH se
ajustó a pH 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0, respectivamente, con
NaOH/HCl.
La temperatura se mantuvo en 30ºC isotérmica
durante 10 minutos.
Los mutantes se dosificaron a 0,25 mg de proteína
enzimática/l cada uno.
C:
Se realizaron pruebas de lavado usando las
composiciones detergentes ejemplificadas en los ejemplos de
detergentes facilitados más adelante en una minilavadora,
utilizando tejidos de prueba a base de algodón que contenían
pigmentos, grasa y proteína (caseína). Las condiciones fueron:
a) 2 g/l de detergente D3 en agua de 6º fH
(dureza francesa) a pH 8,3 o
b) 5 g/l de detergente D2 en agua de 15º fH a pH
10,2.
Tras el aclarado y el secado, se midió la
reflexión a 460 nm.
El factor de mejora se calculó a partir de una
curva de dosis - respuesta, y se relaciona con la cantidad de
enzima necesaria para obtener un valor de delta R dado, en
comparación con la enzima de tipo natural en cuestión (S000 y C000),
lo que significa que un factor de mejora de 2 indica que sólo se
necesita la mitad de la cantidad de enzima para obtener el mismo
valor de delta R.
Los resultados de estas pruebas se muestran en la
tabla III anterior.
D:
Se llevaron a cabo pruebas experimentales de
estabilidad de la lipasa, por ejemplo, usando los materiales
siguientes:
1 LU/ml de lipasa de Pseudomonas cepacia
se incubó en líquido de lavado de cada uno de dos tipos, O y W
(descritos más adelante). Se tomaron alícuotas a intervalos y se
probaron para determinar la actividad lipasa. Se realizaron
incubaciones paralelas sin proteasa o con proteasa de diversos
tipos, tal como se indica más adelante, para probar el efecto de la
proteasa sobre la conservación de la actividad lipasa. Las
proteasas de tipo natural se probaron a 20 GU (unidades de
glicina)/ml, las proteasas mutadas se probaron a 0,5
microgramos/ml.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención que contiene adyuvante de fosfato para
que contenga: detergente activo total aproximadamente el 16%,
detergente aniónico aproximadamente el 9%, detergente no iónico
aproximadamente el 6%, adyuvante que contiene fosfato
aproximadamente el 20%, polímero acrílico o equivalente
aproximadamente el 3,5% (alternativamente, hasta sólo
aproximadamente el 2%), precursor de blanqueo de perborato
aproximadamente el 6 - 18%, alternativamente, aproximadamente el 15
- 20%, activador de blanqueo que contiene grupos amino
aproximadamente el 2%, silicato u otro estructurador
aproximadamente el 3,5%, alternativamente hasta aproximadamente el
8%, enzima de actividad de aproximadamente 8 unidades de
glicina/mg, con una base para ajustar hasta el pH deseado en uso, y
una sal inorgánica neutra, y enzimas (aproximadamente el 0,5% de
cada enzima).
El detergente aniónico es una mezcla de
dodecilbencenosulfonato de sodio, alternativamente
alquilbencenosulfonato de sodio lineal, 6%, y alquilsulfato
primario, 3%. El detergente no iónico es un etoxilato de un alcohol
primario de aproximadamente C13-C15 con 7 residuos
de etoxilato por mol. El adyuvante de fosfato es tripolifosfato de
sodio. El polímero es poli(ácido acrílico), alternativamente
copolímero acrílico / maleico. El precursor de blanqueo de
perborato es tetraborato de sodio tetrahidratado o monohidratado. El
activador es tetraacetiletilendiamina. El estructurador es silicato
de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio.
Las enzimas comprenden proteasa según el mutante
S001, alternativamente proteasa S003, S004, S005, C001, C002, C003,
C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226, S223, S224 o S225.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención que contiene adyuvante de fosfato para
que contenga: detergente activo total aproximadamente el 15%,
detergente aniónico aproximadamente el 7%, detergente no iónico
aproximadamente el 6%, adyuvante que contiene fosfato
aproximadamente el 25%, polímero acrílico o equivalente
aproximadamente el 0,5%, precursor de blanqueo de perborato
aproximadamente el 10%, activador de blanqueo que contiene grupos
amino aproximadamente el 2%, silicato u otro estructurador
aproximadamente el 6%, enzima proteasa de grado de aproximadamente 8
unidades de glicina/mg, con una base para ajustar hasta el pH
deseado en uso, y una sal inorgánica neutra, y enzimas
(aproximadamente el 0,5% de cada enzima).
El detergente aniónico es alquilbencenosulfonato
de sodio lineal. El detergente no iónico es un etoxilato de un
alcohol primario de aproximadamente C13-C15 con 7
residuos de etoxilato por mol o una mezcla de éste con el alcohol
correspondiente etoxilado hasta el grado de 3 residuos por mol. El
adyuvante de fosfato es tripolifosfato de sodio. El precursor de
blanqueo de perborato o perácido es tetraborato de sodio
tetrahidratado. El activador es
tetraacetiletilen-diamina. El estructurador es
silicato de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio.
Las enzimas comprenden proteasa según el mutante S001,
alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005,
C008, S015, S017, S021, S226.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención que contiene adyuvante de zeolita para
que contenga: detergente activo total aproximadamente el 16%,
detergente aniónico aproximadamente el 9%, detergente no iónico
aproximadamente el 6%, adyuvante que contiene zeolita
aproximadamente el 20%, polímero acrílico o equivalente
aproximadamente el 3,5%, precursor de blanqueo de perborato
aproximadamente el 6 - 18%, activador de blanqueo que contiene
grupos amino aproximadamente el 2%, silicato u otro estructurador
aproximadamente el 3,5%, alternativamente hasta sólo aproximadamente
el 2,5%, enzima de grado de aproximadamente 8 (alternativamente,
aproximadamente 15) unidades de glicina/mg, con una base para
ajustar hasta el pH deseado en uso, y una sal inorgánica neutra, y
enzimas (aproximadamente el 0,5% de cada enzima).
El detergente aniónico es una mezcla de
dodecilbencenosulfonato de sodio, alternativamente
alquilbencenosulfonato de sodio lineal, 6%, y alquilsulfato
primario, 3%. El detergente no iónico es un etoxilato de un alcohol
primario de aproximadamente C13-C15 con 7 residuos
de etoxilato por mol. El adyuvante de zeolita es zeolita de tipo A.
El polímero es poli(ácido acrílico). El precursor de blanqueo de
perborato es tetraborato de sodio tetrahidratado o monohidratado.
El activador es tetraacetiletilendiamina. El estructurador es
silicato de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio.
Las enzimas comprenden proteasa según el mutante S001,
alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005,
C008, S015, S017, S021, S226.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención que contiene adyuvante de zeolita para
que contenga: detergente activo total aproximadamente el 14%,
detergente aniónico aproximadamente el 7%, detergente no iónico
aproximadamente el 7%, adyuvante que contiene zeolita
aproximadamente el 25%, polímero acrílico o equivalente
aproximadamente el 3%, precursor de blanqueo de perborato o
perácido aproximadamente el 10%, activador de blanqueo que contiene
grupos amino aproximadamente el 2%, silicato u otro estructurador
aproximadamente el 0,5%, enzima de grado de aproximadamente 6
unidades de glicina/mg, con una base para ajustar hasta el pH
deseado en uso, y una sal inorgánica neutra, y enzimas
(aproximadamente el 0,5% de cada enzima).
El detergente aniónico es alquilbencenosulfonato
de sodio lineal, el detergente no iónico es una mezcla de
etoxilatos de un alcohol primario de aproximadamente
C13-C15 con 7 residuos de etoxilato por mol,
respectivamente. El adyuvante de zeolita es zeolita de tipo A. El
polímero es un copolímero acrílico/maleico. El precursor de
blanqueo de perborato es tetraborato de sodio monohidratado. El
activador es tetraacetiletilendiamina. El estructurador es silicato
de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio. Las enzimas
comprenden proteasa según el mutante S001, alternativamente S003,
S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021,
S226.
Se formula un líquido detergente acuoso según una
realización de la invención para que contenga: ácido
dodecilbencenosulfónico 16%, alcohol lineal C12-C15
condensado con 7 moles/mol de óxido de etileno 7%, monoetanolamina
2%, ácido cítrico 6,5%, xilenosulfonato de sodio 6%, hidróxido de
sodio aproximadamente 4,1%, proteasa 0,5%, componentes minoritarios
y agua hasta el 100%. El pH se ajusta hasta un valor de entre 9 y
10. La enzima es una proteasa según el mutante S020,
alternativamente S029, S012, S004, S001, S003, S005, S015, S017,
S021, S022, S023, S035, S201, S22306 o S235.
Se formula un líquido detergente no acuoso según
una realización de la invención usando un 38,5% de alcohol primario
lineal C13-C15 etoxilado con 4,9 moles/mol de óxido
de etileno y 2,7 moles/mol de óxido de propileno, 5% de triacetina,
30% de trifosfato de sodio, 4% de ceniza de sosa, 15,5% de
perborato de sodio monohidratado que contiene una proporción
minoritaria de oxoborato, 4% de TAED (tetraacetiletilendiamina),
0,25% de EDTA del que el 0,1% está como ácido fosfónico, 0,6% de
Aerosil, 1% de SCMC (carboximetilcelulosa de sodio) y 0,6% de
proetasa. El pH se ajusta hasta un valor de entre 9 y 10, por
ejemplo, de aproximadamente 9,8. La enzima comprende proteasa según
el mutante S001, alternativamente S003, S004, S021, S035, S201,
S225, S226 o S235.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención en la forma de un granulado que tiene
una densidad aparente de al menos 600 g/l, que contiene
aproximadamente el 20% en peso de tensioactivo, del cual
aproximadamente el 10% es dodecilbencenosulfonato de sodio y el
resto es una mezcla de Synperonic A7 y Synperonic A3
(aproximadamente del 5,5% al 4,5%), y sal inorgánica neutra cero
(por ejemplo, sulfato de sodio), más adyuvante de fosfato
aproximadamente el 33%, perborato de sodio tetrahidratado
aproximadamente el 16%, activador de TAED aproximadamente el 4,5%,
silicato de sodio aproximadamente el 6%, y componentes minoritarios
incluyendo carbonato de sodio aproximadamente el 2% y contenido de
humedad de aproximadamente el 10%. Se incluyen enzimas
(aproximadamente el 0,5% de cada enzima). La enzima comprende
proteasa según el mutante S001, alternativamente S003, S004, S005,
C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 o
S235.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención en la forma de un granulado que tiene
una densidad aparente de al menos 600 g/l, alternativamente de
aproximadamente 550 g/l, que contiene aproximadamente el 20%,
alternativamente hasta sólo aproximadamente el 16%, en peso de
tensioactivo, del cual aproximadamente el 9%, alternativamente
aproximadamente el 7%, es dodecilbencenosulfonato de sodio,
alternativamente alquilbencenosulfonato de sodio lineal, y el resto
es una mezcla de Synperonic A7 y Synperonic A3 (o etoxilatos
similares) (respectivamente, aproximadamente del 5% y el 6%,
alternativamente de aproximadamente el 4% y el 7%), y sal
inorgánica neutra cero (por ejemplo, sulfato de sodio), más
adyuvante de zeolita aproximadamente el 30%, alternativamente de
aproximadamente el 25%, perborato de sodio tetrahidratado,
alternativamente monohidratado, aproximadamente el 14% o el 15%,
activador de TAED aproximadamente el 3,6%, y componentes
minoritarios incluyendo carbonato de sodio aproximadamente el 9%, o
hasta el 15%, Dequest\eta 2047 aproximadamente el 0,7%, y
contenido de humedad de aproximadamente el 10%. Se incluyen enzimas
(aproximadamente el 0,5% de cada enzima, o aproximadamente el 0,2%
de lipasa y aproximadamente el 0,7% de proteasa). La enzima
comprende proteasa según el mutante S001, alternativamente S003,
S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225,
S226 o S235.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención en la forma de un granulado que tiene
una densidad aparente de al menos 600 g/l, que contiene
aproximadamente el 15% en peso de tensioactivo, del cual
aproximadamente el 7% es alquilbencenosulfonato de sodio lineal, el
2% es sulfato de alcohol primario y el resto es Synperonic A7 o un
etoxilato similar, y sal inorgánica neutra cero (por ejemplo,
sulfato de sodio), más adyuvante de zeolita aproximadamente el 22%,
perborato de sodio tetrahidratado aproximadamente el 15%, activador
de TAED aproximadamente el 7%, y componentes minoritarios
incluyendo carbonato de sodio aproximadamente el 15%, Dequest\eta
2047 aproximadamente el 0,7%, y contenido de humedad de
aproximadamente el 10%. Las enzimas (aproximadamente el 1,2%)
incluyen proteasa según el mutante S001, alternativamente S003,
S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225,
S226 o S235.
Se formula un polvo detergente según una
realización de la invención para que contenga: ácido
dodecilbencenosulfónico 6%, alcohol lineal C12-C15
condensado con 7 moles/mol de óxido de etileno 5%, jabón de ácido
graso 3%, polímero Sokolan\eta CP5 3%, zeolita A 22%, carbonato
de sodio 10%, sulfato de sodio 17%, partículas de arcilla 8%,
perborato de sodio tetrahidratado 13%, tetraacetiletilendiamina 2%,
proteasa 0,5%, componentes minoritarios y agua hasta el 100%. El pH
se ajusta hasta un valor de entre 9 y 10. La enzima proteasa
comprende proteasa según el mutante S001, alternativamente S003,
S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225,
S226 o S235.
Se formula una barra (jabón) detergente según una
realización de la invención tal como sigue: jabón a base de 82% de
sebo y 18% de aceite de coco saponificados en bandeja, neutralizado
con un 15% de ácido ortofosfórico, mezclado con proteasa
(aproximadamente 8 GU/ml de la composición en barra) y mezclado con
2% de formiato de sodio, 2% de bórax, 2% de propilenglicol y 1% de
sulfato de sodio, y después se hace pasar lentamente a una cadena de
producción de jabón. La enzima proteasa comprende proteasa según el
mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003,
C004, C005, C008, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225,
S226 o S235.
Los detergentes líquidos estructurados pueden
contener, por ejemplo, además de una proteasa tal como se describe
en el presente documento, el 2 - 15% de tensioactivo no iónico, el
5 - 40% de tensioactivo total, que comprende tensioactivo no iónico
y opcionalmente aniónico, el 5 - 35% de adyuvante que contiene
fosfato o que no contiene fosfato, el 0,2 - 0,8% de espesante
polimérico, por ejemplo polímero acrílico reticulado con peso
molecular superior a 106, al menos el 10% de silicato de sodio, por
ejemplo como un vidrio soluble neutro, base (por ejemplo, una base
que contenga potasio) para ajustar hasta el pH deseado,
preferiblemente en el intervalo de 9 - 10 o superior, por ejemplo,
por encima de pH 11, con una razón de catión sodio : anión silicato
(como sílice libre) (en peso) inferior a 0,7 : 1, y una viscosidad
de 0,3 - 30 Pas (a 20ºC y 20 s^{-1}).
Los ejemplos adecuados contienen aproximadamente
el 5% del tensioactivo no iónico de alcohol C13-15
alcoxilado con aproximadamente 5 grupos de OE (óxido de etileno)
por mol y con aproximadamente 2,7 grupos de OP (óxido de propileno)
por mol, el 15 - 23% de vidrio soluble neutro con una razón en peso
de 3,5 entre la sílice y el óxido de sodio, el 13 - 19% de KOH, el
8 - 23% de STPP (tripolifosfato de sodio), el 0 - 11% de carbonato
de sodio, el 0,5% de Carbopol\eta 941.
La proteasa (por ejemplo, el 0,5%) incluye el
mutante S001, alternativamente S021, S025, S035, S201, S202, S223,
S224, S225, S226 o S235.
Se formula un detergente líquido acuoso,
estructurado y viscoso, adecuado para su uso en el lavado de la
ropa sucia tal como sigue (% en peso):
| Ácido cítrico | 2,5 |
| Bórax (10 ac) | 4 |
| NaOH | 2 |
| Glicerol | 5 |
| Alquilbencenosulfonato lineal C14-C15, | |
| o sulfato de alcohol primario C14-C15 | 6,5 |
| Synperonic A3 | |
| 3 OE C12-C15 no iónico | 1,2 |
| Synperonic A7 | |
| 7 OE C12-C15 no iónico | 3,6 |
| Zeolita | 20 |
| Proteasa | 0,5 |
| Amilasa (Termamyl (MR) 300LDX) | 0,2 |
| Componentes minoritarios y agua | hasta el 100% |
El pH puede ajustarse hasta un valor de entre 9 y
10. La enzima es una proteasa según el mutante S020. En versiones
alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de S019,
S012, S004, S001, S003, S005, S021, S035, S201,
S223-6 o S235.
Se formula un detergente líquido acuoso
isotrópico adecuado para su uso en el lavado de la ropa sucia tal
como sigue (% en peso):
| Ácido cítrico | 2 |
| Ácido bórico | 1 |
| NaOH | 3 |
| KOH | 4,5 |
| Glicerol | 10 |
| Etanol | 6,5 |
| Tensioactivo no iónico | |
| \hskip0,5cm (grupos de etoxilato de | |
| \hskip0,5cm alcohol C12 con 6,5 OE/mol) | |
| \hskip0,5cm o sulfato de alcohol primario de sodio | 10 |
| Ácido oleico | 16 |
| Jabón de aceite de coco (C12) | 11 |
| Proteasa | 0,5 |
| Componentes minoritarios y agua | hasta el 100% |
El pH puede ajustarse hasta un valor de entre 9 y
10. La enzima es una proteasa según el mutante S020. En versiones
alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de S019,
S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201,
S223-6 o S235.
Se formula una composición detergente líquida
acuosa para que contenga:
| Alquilbencenosulfonato de sodio | 14,5 |
| Jabón sódico C18 | 2 |
| Detergente no iónico (C12-15 6 OE) | 9 |
| Ácido graso (ácido oleico) | 4,5 |
| Alquenilsuccinato de sodio | 11 |
| Propanodiol | 1,5 |
| Etanol | 3,6 |
| Citrato de sodio | 3,2 |
| Agente complejante, por ejemplo Dequest 2060 | 0,7 |
| Proteasa | 0,5 |
| Amilasa | 0,1 |
| Cloruro de sodio | 0,5 |
| Componentes minoritarios y agua | hasta el 100% |
El pH puede ajustarse hasta un valor de entre 9 y
10. La enzima es una proteasa según el mutante S020. En versiones
alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de S019,
S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201,
S223-6 o S235.
Se formula una composición detergente líquida
acuosa para que contenga:
| Alquilbencenosulfonato de sodio | 8 |
| Detergente no iónico 6,5 OE | 10 |
| Dietilamida oleica | 10 |
| Ácido graso (C12/C18 75:25) | 18 |
| Citrato de sodio | 1 |
| Trietanolamina | 5 |
| Propano | 7 |
| Etanol | 5 |
| Dequest 2060 | 0,5 |
| Proteasa | 0,5 |
| Amilasa | 0,1 |
| Componentes minoritarios y agua | hasta el 100% |
El pH puede ajustarse hasta un valor de entre 9 y
10. La enzima es una proteasa según el mutante S020. En versiones
alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de S019,
S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201,
S223-6 o S235.
Se formula una composición detergente líquida no
acuosa para que contenga (% en peso):
| Detergente no iónico líquido (C10-12, 6,2 OE) | 41% |
| Triacetina | 5 |
| Ácido alquilbencenosulfónico lineal | 6 |
| Estabilizador de óxido de magnesio | 1 |
| Adyuvante / base de carbonato de sodio | 18 |
| Adyuvante de carbonato de calcio | 8 |
| Activador de blanqueo de TAED | 3,5 |
| Precursor de blanqueo, perborato monohidratado | 10,5 |
| Sílice parcialmente hidrófoba | 2 |
| Proteasa | 0,4 |
| Lipasa (Lipolase\eta) | 3 |
| Componentes minoritarios o tensioactivo | |
| no iónico líquido adicional (sin agua) | hasta el 100% |
Al formular esta composición, se añaden primero
el tensioactivo no iónico líquido y la triacetina, seguido por el
óxido de magnesio, a continuación los otros componentes excepto la
enzima. La mezcla se muele en un molino coloidal y se enfría, y
finalmente se añaden la(s) enzima(s) y cualquier otro
componente minoritario termosensible.
La enzima es una proteasa según el mutante S020.
En versiones alternativas de este detergente, la enzima se
selecciona de S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035,
S201, S202, S223-6 o S235.
También pueden usarse formulaciones de detergente
tal como se ejemplifica en el documento EP 0 342 177, con los
mutantes de proteasa mencionados en el ejemplo D3,
anteriormente.
Se realizaron mutaciones específicas de sitio por
el método de Morinaga y col. (Biotechnology, citado anteriormente).
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para introducir las
mutaciones:
Un cebador con emparejamiento incorrecto de 27
monómeros, Nor-237, que también genera un sitio de
restricción SacI novedoso:
Un cebador con emparejamiento incorrecto de 25
monómeros, Nor-577, que destruye un sitio
HaeIII:
Un cebador con emparejamiento incorrecto de 32
monómeros, Nor-735, que destruye un sitio SphI:
Un cebador con emparejamiento incorrecto de 32
monómeros, Nor-736, que genera un sitio XhoI:
Un cebador con emparejamiento incorrecto de 24
monómeros, Nor77-856, que genera un sitio PstI:
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-577 y Nor 237 en analogía con lo anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-237 y Nor-736 en analogía con lo
anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-577 y Nor-736 en analogía con lo
anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-577, Nor-237 y
Nor-736 en analogía con el anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-237 y Nor-856 en analogía con lo
anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-577, Nor-237 y
Nor-856 en analogía con lo anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-735 y Nor-856 en analogía con lo
anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-735, Nor-237 y
Nor-856 en analogía con lo anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-735, Nor-577,
Nor-237 y Nor-856 en analogía con
lo anterior.
Se llevó a cabo una combinación de
Nor-735, Nor-577,
Nor-237, Nor-856 y
Nor-736 en analogía con lo anterior.
Se llevó a cabo mutagénesis en una molécula
bicatenaria abierta en una de sus hebras usando los plásmidos
pSX93, pSX119 y pSX120 como moldes.
pSX93 se muestra en la figura 3 y es pUC13
(Vieira, J. y Messing, J.: 1982, Gene 19: 259-268)
que alberga un fragmento XbaI-HindIII de 0,7 kb del
gen de la subtilisina 309, incluyendo el terminador insertado en el
poliunidor.
Para la introducción de mutaciones en la parte
N-terminal de la enzima, se utilizó el plásmido
pSX119. pSX119 es pUC13 que alberga un fragmento
EcoRI-XbaI del gen de la subtilisina 309 insertado
en el poliunidor. Los moldes pSX93 y pSX119 cubren así la totalidad
del gen de la subtilisina 309.
El plásmido pSX120 es un plásmido en el que el
fragmento HpaI-HindIII con el gen de la subtilisina
309 procedente de pSX88 se inserta en EcoRV-HindIII
en pDN 1681, de una forma mediante la cual el gen de la proteasa se
exprese por los promotores amy M y amy Q. pDN 1681 se obtiene a
partir de pDN 1380 (Diderichsen, B. y Christiansen, L.: 1988, FEMS
Microbiology Letters 56: 53-60) con un fragmento
ClaI de 2,85 pb insertado procedente de B. amyloliquefaciens
que lleva el gen amy Q con promotor (Takkinen y col.: 1983, J.
Biol. Chem. 258: 1007 y sig.). La construcción de pSX120 se explica
resumidamente en la figura 1, que muestra que pDN1681 se corta con
EcoR5 e HindIII, y pSX88 con HindIII y HpaI, mientras que el
ligamiento da como resultado pSX120 regulado por los promotores amy
M y amy Q.
Se construyeron cuatro plásmidos adicionales
pSX170, pSX172, pSX173 y pSX186 para la mutagénesis en una molécula
bicatenaria abierta en una de sus hebras del gen de la subtilisina
309:
- - pSX170:
- SphI-KpnI, 700 pb de pSX120 insertadas en SphI-KpnI de pUC 19, desde el residuo de aminoácido 170 en la subtilisina 309 madura hasta el terminador.
- - pSX172:
- EcoRI-SphI, 1360 pb de pSX120 insertadas en EcoRI-SphI de pUC 19, desde el promotor hasta el residuo de aminoácido 170 en la subtilisina 309 madura.
- - pSX173:
- igual que pSX170, pero con G195E.
- - pSX186:
- PvuII-EcoRI, 415 pb de pSX120 insertadas en HincI-EcoRI de pUC19, desde el residuo de aminoácido 15 hasta el residuo de aminoácido 206 en la subtilisina 309 madura.
La figura 2 muestra un mapa de restricción algo
detallado de pSX120 en el que se indica qué fragmentos se
utilizaron para la construcción de los plásmidos pSX170, pSX172,
pSX173 y pSX186.
La mutación a) se llevó a cabo cortando pSX93 con
XbaI y ClaI, tal como se indica en la figura 3 y se describe en la
sección "GENERACIÓN DE MUTACIONES DIRIGIDAS AL SITIO EN EL GEN
DE LA SUBTILISINA" y en la solicitud de patente
internacional no publicada número PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI
A/S).
Las mutaciones b), d) y e) se realizaron
correspondientemente cortando pSX170 por SphI y KpnI.
Las mutaciones f) y g) se llevaron a cabo como
anteriormente, pero con pSX173 en lugar de pSX170.
La mutación c) se llevó a cabo
correspondientemente cortando pSX186 por PstI y EcoRI.
Las mutaciones h) a o) se construyeron combinando
fragmentos de ADN con las mutaciones de b) a g) únicas o dobles,
usando los sitios de restricción NheI, XbaI, ClaI, AvaII y KpnI,
según corresponda.
Se produjeron mutantes adicionales usando métodos
similares o métodos generales, tal como se conoce a partir de la
bibliografía.
Para algunos ejemplos de mutaciones en la
subtilisina Carlsberg mencionados en esta memoria descriptiva, se
introdujeron los siguientes cambios en la secuencia nucleotídica
del gen:
Asp 14 Lys (D14K (C001)) (GAT \rightarrow
AAG)
Asp 120 Lys (D120K (C002)) (GAT \rightarrow
AAA)
Asp 140 Lys (D140K (C003)) (GAC \rightarrow
AAA)
Asp 14 Lys + Asp 120 Lys (D14K + D120K
(C004))
Lys 27 Asp (K27D (C005)) (AAA \rightarrow
GAT)
Lys 27 Asp + Asp 120 Lys (K27D + D120K
(C006))
Asp 172 Lys (D172K (C008)) (GAC \rightarrow
AAA)
Asp 14 Lys + Asp 120 Lys + Asp 140 Lys + Asp 172
Lys (D14K +D120K + D140K + D172K (C010))
Val 51 Asp (V51D (C100))
Glu 54 Thr (E54T (C101))
\hskip1cm(GGG \rightarrow ACA)
Glu 54 Tyr (E54Y (C102))
\hskip1cm(GGG \rightarrow TAT)
Estos cambios se introdujeron cambiando los
oligonucleótidos correspondientes en los fragmentos respectivos. La
corrección de las nuevas secuencias se confirmó después de que los
oligonucleótidos originales se sustituyeran por estas nuevas
secuencias y se reunieran en los nuevos fragmentos de ADN.
Finalmente, los fragmentos se volvieron a unir en el nuevo gen de
la subtilisina Carlsberg.
Posteriormente a la confirmación de la secuencia
de la mutación correcta, los fragmentos de ADN mutados se
insertaron en el plásmido pSX92 o pSX120, que se usaron para
producir los mutantes.
El plásmido pSX92 se muestra en la figura 4 y se
produjo clonando el gen Sub 309 en el plásmido pSX62 cortado en
ClaI, rellenado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y
cortado con HindIII antes de la inserción de los fragmentos
DraI-NheI y NheI-HindIII del gen Sub
309 clonado.
Para expresar los mutantes, los fragmentos
mutados (XbaI-ClaI, XbaI-HindIII o
EcoRI-XbaI) se escindieron del plásmido con la
mutación apropiada, pSX93, pSX119, pSX170, pSX172, pSX173 y pSX186,
respectivamente, y se insertaron en pSX92 o pSX120 para obtener
plásmidos capaces de expresar los diversos mutantes.
pSX92 o pSX120 mutados se utilizaron entonces
para transformar B. subtilis DN497.
Las células transformadas se extendieron entonces
sobre placas de agar LB (Luria-Bertani) con fosfato
10 mM, pH 7, cloramfenicol 6\mug/ml y xilosa al 0,2% para inducir
el promotor xyn en el plásmido. Las placas también contenían un 1%
de leche desnatada, de manera que los transformantes que producen
proteasa pudieran detectarse por el halo claro en el que se ha
degradado la leche desnatada.
Tras el crecimiento apropiado, las enzimas
mutadas se recuperaron y se purificaron.
Con el fin de producir enzima proteasa partiendo
de la base de microorganismos que llevan genes mutantes para BPN'
tal como se describió anteriormente, se utilizó generalmente un
fermentador Chemoferm tipo Rushton con un impulsor de 8 paletas
planas y un volumen de trabajo de 8 litros. La configuración del
fermentador se preparó conforme a las normas de seguridad de VMT
(técnicas microbiológicas seguras) y que consisten en:
- a)
- Un controlador de presión (tipo 4-3122, Bell & Howell) que corta el suministro de aire por encima de 0,1 bares de sobrepresión. Esto se realiza para evitar la obstrucción de los filtros de aire de escape.
- b)
- Un separador de espuma en la salida de gas preparado a partir de un recipiente de succión de 20 l que tiene antiespumante en el fondo.
- c)
- Una camisa de agua de refrigeración sin juntas para evitar la contaminación del agua de refrigeración o del drenaje de agua corriente.
- d)
- Se usa un filtro de aire de escape absoluto (Gelman acro 50, 0,45 micras)
- e)
- Toma de muestras mediante un dispositivo de bomba de toma de muestras con un volumen interno pequeño.
Los flujos de gas se controlaron usando
contadores másicos (Brooks, tipo 5852, intervalo 0 - 10 l).
El pH se controló utilizando un transmisor
Hartmann y Braun y un controlador Philips (Witromat). Se utilizó
NaOH concentrado (3 M) como neutralizador.
Los gases de escape se analizaron utilizando un
analizador Unor 4N (CO_{2}) y Oxygor 7N (O_{2}) de Maihak,
Westinghouse. La presión de oxígeno en el medio se determinó
utilizando una sonda polarográfica industrial esterilizable para
oxígeno (Ingold tipo 322756702).
La temperatura del medio se monitorizó utilizando
un sensor PT100 y un controlador de temperatura Honeywell (clase
84). La formación de espuma se mantuvo en un nivel aceptable
utilizando un electrodo de contacto, mientras que un interruptor de
nivel activaba una bomba de dosificación antiespuma.
Todos los controles externos se colocaron bajo el
control de un microordenador Hewlett Packard (HP220).
Los inóculos se prepararon incubando un cultivo
en matraz con agitación a 30ºC durante 16 h a 250 rpm en un
agitador rotatorio (LH Fermentation, tipo MKx). Se utilizó un
inóculo de 300 ml para 8 l de medio que estaba acondicionado a las
condiciones de fermentación reales (pH 7,0, 30ºC, flujo de aire de
3,5 l/min, agitador a 1000 - 1500 rpm). La concentración de oxígeno
disuelto se mantuvo en un 25% por encima de la saturación de aire.
El agente antiespumante utilizado fue un material a base de aceite
de silicio (Rhodorsil R426, Rhone Poulenc).
Las proteasas (mutantes) se produjeron utilizando
la cepa DB105 de B. subtilis que contenía el gen mutante tal
como se describió en la construcción del gen. El medio de cultivo
consiste en: NH_{4}Cl 8 g/l; KH_{2}PO_{4} 4 g/l;
K_{2}HPO_{4} 4 g/l; NaCl 2 g/l; MgSO_{4}.2H_{2}O 1 g/l;
extracto de levadura 10 g/l; sacarosa 40 g/l; pH 7,0 y esterilizado
45 minutos a 120ºC. Tras la esterilización se añadió triptófano 25
mg/l; neomicina 20 mg/l. Las fermentaciones se pararon tras 20 - 30
horas. Los medios se limpiaron de células mediante
centrifugación.
Se probó la actividad proteolítica de diversos
mutantes frente a caseína como sustrato proteico, según el método
DMC, citado anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla
IV.
A partir de la tabla se observa que el mutante
(S005) muestra una actividad ligeramente aumentada en comparación
con el original (S000), mientras que los mutantes restantes
muestran una actividad ligeramente disminuida.
A:
Se probó el rendimiento de lavado de diversos
mutantes en el detergente líquido patrón de pH 8,14 en un sistema
modelo frente a jugo de hierba, según los métodos detallados
anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla V.
A partir de la tabla se observa que todos los
mutantes probados mostraron un rendimiento de lavado mejorado o
igual, en comparación con la enzima original de tipo natural. El
rendimiento de lavado de los mutantes S019 y S020 mejoró de manera
que 1,0 mg/l de esas enzimas explicadas en líneas generales podrían
sustituir a 10,0 mg/l de la enzima original de tipo natural,
indicándose así una mejora sustancial en el rendimiento de lavado
para las enzimas mutantes de la invención.
B:
En la tabla VI, se muestran los resultados de las
pruebas de algunas de las variantes enzimáticas de la invención en
el detergente líquido comercial de EE.UU. modificado a diversos
valores de pH en un sistema modelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran claramente que el cambio
del pI de una enzima en una dirección cuando se desea cambiar el pH
óptimo para el rendimiento de lavado de la enzima para aproximarse
al pH del líquido de lavado mejora el rendimiento de lavado de la
enzima.
D:
Se probó el rendimiento de lavado de diversos
mutantes frente a tejidos de algodón manchados con jugo de hierba,
según el método descrito en el ensayo A.
Se utilizaron 2,0 g/l de un detergente líquido
(detergente D3). El detergente se disolvió en agua sometida a
intercambio iónico. El pH se ajustó a 9,1 con NaOH/HCl.
La temperatura se mantuvo en 20ºC isotérmica
durante 10 minutos.
Los mutantes se dosificaron a 0,25; 0,5; 1,0;
2,0; 5,0 y 10,0 mg de proteína enzimática/l cada uno.
La estabilidad de los mutantes probados se
determinó midiendo la temperatura de desnaturalización (máxima
capacidad térmica en exceso) mediante calorimetría diferencial de
barrido, DSC. La velocidad de calentamiento fue de 0,5ºC/min.
La estabilidad se probó en una disolución que
contenía aproximadamente 2 mg/ml del mutante en detergente líquido
patrón al 91%, cuya composición se describe en el ensayo A. La
disolución se preparó mezclando 100 \mul de disolución enzimática
(aproximadamente 20 mg de enzima/ml en un tampón de ácido
dimetilglutárico 0,01 M, CaCl_{2} 0,002 M, H_{3}BO_{3} 0,2 M y
NaCl 0 - 0,1 M, pH 6,5) con 1000 \mul del detergente líquido
patrón.
Dentro del grupo de los mutantes de la
subtilisina 309, los resultados de estabilidad obtenidos mediante
DSC son coherentes con los resultados de estabilidad obtenidos
mediante las pruebas tradicionales de estabilidad en
almacenamiento.
El rendimiento de lavado de diversos mutantes en
detergente líquido se presenta en la tabla VII. Los resultados se
muestran como factores de mejora en relación con la enzima original
de tipo natural. El factor de mejora se define como en el ensayo
C.
En la tabla VII, también se muestra la
temperatura de desnaturalización en el detergente líquido patrón
mediante DSC y la diferencia entre la temperatura de
desnaturalización de la enzima original de tipo natural y la del
mutante en cuestión.
A partir de la tabla VII se observa que todos los
mutantes probados muestran un rendimiento de lavado mejorado en
comparación con la enzima original de tipo natural. El mejor
rendimiento de lavado se logra por los mutantes que tienen un
pI_{o} igual o justo por debajo del pH de la disolución de
lavado.
La temperatura de desnaturalización obtenida
mediante DSC muestra que la estabilidad de los mutantes únicos S
021 (*36D) y S 201 (N76D) aumenta en 4,0ºC y 4,2ºC,
respectivamente, en relación con la enzima original de tipo
natural.
Entre las mutaciones que se incorporan en uno o
más de los mutantes enumerados en la tabla VII, se ha demostrado
que las mutaciones R170Y y K251E desestabilizan al mutante en
relación con la enzima original de tipo natural, mientras que las
mutaciones H120D, G195E y K235L son indiferentes con respecto a la
estabilidad.
A partir de la tabla VII, se observa que los
mutantes que contienen una mutación desestabilizadora se
desestabilizan, incluso en los casos en los que se incluye una
mutación estabilizadora.
Los efectos estabilizadores de *36D y N76D son
aditivos. Esto se demuestra por los mutantes S 025 y S 035. S 025
contiene tres mutaciones que son indiferentes respecto a la
estabilidad y la mutación estabilizadora *36D. La temperatura de
desnaturalización para S 025 aumenta en 3,9ºC en relación con la
enzima original de tipo natural, lo que es igual al aumento medido
para el mutante único con *36D, S 021. S 035 contiene la misma
mutación N76D. La temperatura de desnaturalización para S 035
aumenta en 7,3ºC en relación con la enzima original de tipo natural
que, dentro del error experimental, es igual a la suma del aumento
medido para los mutantes únicos con *36D, S 021 y con N76D, S
201.
E:
Se probó el rendimiento de lavado de los tres
mutantes frente a tejido de algodón manchado con jugo de hierba,
según el método descrito en el ensayo A.
Se utilizaron 2,0 g/l de detergente líquido D3.
El detergente se disolvió en agua sometida a intercambio iónico. El
pH se ajustó a 9,1 con NaOH/HCl.
La temperatura se mantuvo en 30ºC isotérmica
durante 10 minutos. Los mutantes se dosificaron a 1,0 y 10,0 mg de
proteína enzimática/l cada uno.
Se probó el rendimiento de lavado de tres
mutantes en detergente líquido comercial de EE.UU. frente a jugo de
hierba. Los resultados se muestran en la tabla VIII.
A partir de la tabla VIII se observa que todos
los mutantes muestran rendimiento de lavado mejorado en relación
con la enzima original de tipo natural. Además, se observa que el
mejor rendimiento se logra por el mutante que tiene el pI_{o} más
próximo al pH de la disolución de lavado.
F:
Se probó el rendimiento de lavado de dos mutantes
frente a tejido de algodón manchado con jugo de hierba, según las
condiciones descritas en el ejemplo E.
Se probó el rendimiento de lavado de dos mutantes
en detergente D3 frente a tejido de algodón manchado con jugo de
hierba. Los resultados se muestran en la tabla IX.
A partir de la tabla IX, se observa que todos los
mutantes muestran un rendimiento de lavado mejorado en relación con
la enzima original de tipo natural. Además, se observa que el mejor
rendimiento se logra por el mutante que tiene el pI_{o} más
próximo al pH de la disolución de lavado.
G:
Se probó el rendimiento de lavado de diversos
mutantes con tejido de algodón manchado con jugo de hierba, según
el método descrito en el ensayo A.
Se utilizaron 2,0 g/l del detergente D3.
El detergente se disolvió en tampón (ácido bórico
0,0025 M e hidrogenofosfato de disodio 0,01 M preparado en agua
sometida a intercambio iónico). El pH se ajustó a 7,0, 8,0, 9,0 y
10,0, respectivamente, con NaOH/HCl. La temperatura se mantuvo en
30ºC isotérmica durante 10 minutos.
Los mutantes se dosificaron a 0,2 mg de proteína
enzimática/l cada uno.
El rendimiento de lavado de algunas variantes
enzimáticas de la invención a diversos valores de pH en un sistema
modelo se muestran en la tabla X.
Los resultados en la tabla X muestran claramente
que el cambio del pI de una proteasa hacia el pH del líquido de
lavado mejora el rendimiento de lavado de la proteasa.
Los resultados también muestran que todas las
variantes probadas tienen un rendimiento mejorado en comparación
con la enzima original de tipo natural a pH inferior a 10,0.
H:
Se probó el rendimiento de lavado de diversos
mutantes con tejidos de algodón manchados con jugo de hierba, según
el método descrito en el ensayo A.
Se utilizaron 2,0 g/l del detergente D3. El
detergente se disolvió en glicina 0,005 M preparada en agua
sometida a intercambio iónico. El pH se ajustó a 10,0, 10,25,
10,50, 10,75, 11,0, 11,5 y 12,0, respectivamente, con NaOH. La
temperatura se mantuvo en 30ºC isotérmica durante 10 minutos.
Los mutantes se dosificaron a 0,2 mg de proteína
enzimática/l cada uno.
El rendimiento de lavado de algunas variantes
enzimáticas de la invención a diversos valores de pH en un sistema
modelo se muestran en la tabla XI. En este caso, se investigaron
las variantes con pI ligeramente superior al de la enzima original
de tipo natural. Se investiga el intervalo de pH desde pH 10,0 hasta
12,0 con más detalle que en los ejemplos anteriores.
Los datos de la tabla XI, muestran que a valores
de pH altos se logra un rendimiento máximo a valores de pH un poco
superiores al pI calculado. Aún aumentando el pI de la proteasa
tiende a aumentar el pH del rendimiento máximo. Los efectos no son
tan pronunciados como se observa a valores de pH bajos (ensayo B y
G).
I:
Con el fin de visualizar la correlación entre el
punto isoeléctrico de la proteasa y el pH en el que la proteasa
tiene su rendimiento máximo, se utilizan los resultados de los
ejemplos B, G y H para hallar el pH en el que cada una de las
variantes investigadas (y la enzima original de tipo natural) tiene
su rendimiento máximo. En la figura 5, este pH_{max} se muestra
como una función del pI_{o} calculado.
Teniendo en cuenta que el intervalo de pH se
investiga en las etapas de valor de pH 1,0, la correlación es
obvia.
Con respecto a la combinación de los mutantes de
la invención con lipasa, los resultados experimentales condujeron a
las siguientes conclusiones prácticas:
La lipasa fue estable durante una hora en líquido
de lavado de tipo O a 37ºC. la presencia de Savinase® condujo a la
rápida desactivación. Kazusase® condujo a una inactivación
sustancialmente menor de la lipasa durante el periodo de la
prueba.
Se observó que la proteinasa K era menos agresiva
para la lipasa que Savinase®, pero más que Kazusase®. Sin embargo,
la subtilisina BPN' no inactivó la lipasa en absoluto en estas
condiciones.
Las proteasas preferidas para su uso, por
ejemplo, en relación con la lipasa en las composiciones de lavado
representadas por el tipo O, son los mutantes S001, S003, S004,
S012, S019, S020, S021, S025, S035, S235.
El líquido de lavado de tipo O fue una disolución
de 5 g/l a 37ºC derivada de la siguiente formulación de detergente
(% en peso):
| tensioactivo aniónico | 6 |
| tensioactivo no iónico | 5 |
| ácido graso | 2,8 |
| polímero acrílico | 3 |
| zeolita | 22 |
| carbonato | 10 |
| sulfato | 17,5 |
| arcilla | 8 |
| amina terciaria | 2 |
| perborato monohidratado | 13 |
| componentes minoritarios y agua | hasta 100. |
Las proteasas preferidas para su uso, por
ejemplo, en relación con la lipasa en las composiciones de lavado
representadas por el tipo W, son los mutantes S020, S021, S025,
S035, S235.
El licor de lavado de tipo W fue una disolución
de 2 g/l de un detergente líquido que tiene la siguiente
formulación (% en peso):
| tensioactivo aniónico | 16 |
| tensioactivo no iónico | 7 |
| hidrótropo | 6 |
| ácido cítrico | 6,5 |
| NaOH | 4,1 |
| monoetanolamina | 2 |
| componentes minoritarios y agua | hasta 100. |
Aunque la presente invención se ha tratado y
ejemplificado en relación con diversas realizaciones específicas de
la misma, esto no debe interpretarse como una limitación de la
aplicabilidad y el alcance de la descripción, que se extiende a
todas las combinaciones y subcombinaciones de las características
mencionadas y descritas anteriormente, así como en las
reivindicaciones adjuntas de la patente.
Claims (8)
1. Composición detergente enzimática que
comprende una proteasa subtilisina mutada, en la que la carga
electroestática molecular neta de la proteasa se ha cambiado en
comparación con la proteasa original, en el mismo pH, de manera que
en dicha proteasa haya, con relación a dicha proteasa original, más
o menos residuo(s) de aminoácidos cargados positivamente y/o
más o menos residuo(s) de aminoácidos cargados
negativamente, caracterizada porque se realiza al menos una
mutación entre los residuos de aminoácidos en una cualquiera o más
de las posiciones 1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 27, 40, 43,
44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117,
133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173, 183, 184,
185, 191, 192, 209, 210, 211, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247,
252, 253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 272, por deleción,
sustitución o inserción (única o múltiple) adyacente a las
posiciones indicadas, caracterizada adicionalmente porque la
proteasa es una proteasa subtilisina mutada que comprende una o más
de las mutaciones seleccionadas de los conjuntos S005, S011, S012,
S013, S014, S018, S022, S024, S204, en las que
en la que dicha proteasa
subtilisina tiene un pH isoeléctrico (pI_{o}) inferior al de la
proteasa
original.
2. Composición detergente según la reivindicación
1, caracterizada porque la proteasa se basa en subtilisina
147 como la subtilisina original.
3. Composición detergente según la reivindicación
1, caracterizada porque la proteasa se basa en subtilisina
Carlsberg como la subtilisina original.
4. Composición detergente según la reivindicación
1, caracterizada porque la proteasa se basa en la proteasa
PB92 de Bacillus como la subtilisina original.
5. Composición detergente según las
reivindicaciones 1-4, formulada como un polvo
detergente que contiene adyuvante de zeolita o fosfato, tensioactivo
aniónico, tensioactivo no iónico, polímero acrílico o equivalente,
precursor de blanqueo de perborato, activador de blanqueo que
contiene grupos amino, silicato u otro estructurador, base para
ajustar al pH deseado en uso, y sal inorgánica neutra.
6. Composición detergente según las
reivindicaciones 1-4, formulada como un líquido
detergente acuoso que comprende tensioactivo aniónico, tensioactivo
no iónico, humectante, ácido orgánico, base cáustica con un pH
ajustado a un valor de entre 9 y 10.
7. Composición detergente según las
reivindicaciones 1-4, formulada como un líquido
detergente no acuoso que comprende un tensioactivo no iónico líquido
que consiste esencialmente en alcohol primario alcoxilado lineal,
triacetina, trifosfato de sodio, base cáustica, precursor de
blanqueo de perborato monohidratado y activador de blanqueo de
amina terciaria, con un pH ajustado a un valor de entre
aproximadamente 9 y 10.
8. Composición detergente según las
reivindicaciones 1-4, formulada como una barra
(jabón) detergente que contiene jabón a base de una mezcla
saponificada en bandeja de sebo y aceite de coco, neutralizada con
ácido ortofosfórico, mezclada con proteasa, también mezclada con
formiato de sodio, bórax, propilenglicol y sulfato de sodio, y que
se hace pasar después lentamente a una cadena de producción de
jabón.
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