CN1415011B

CN1415011B - 对蛋渍具有改进洗涤性能的枯草杆菌酶变体

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Publication number: CN1415011B
Application number: CN008178453A
Authority: CN
Inventors: T·S·法诺; F·F·迈克尔森
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2020-12-01
Also published as: JP2012034696A; WO2001044452A1; CA2394971A1; AU782372B2; CN101974375B; EP1244779B1; AR026985A1; JP5859782B2; CA2394971C; JP2014064590A; AU1693901A; EP1244779A1; CN1415011A; CN101974375A

Abstract

本发明涉及枯草杆菌酶变体在从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍中的应用，此枯草杆菌酶变体在第95-103位(BASBPN编号)活性位点(b)环区含有至少一个额外氨基酸残基。在用于例如包括自动洗碗组合物等清洁或洗涤剂组合物时，这些枯草杆菌酶变体有用，表现出对蛋渍优异的或改进的洗涤性能。本发明也涉及新的枯草杆菌酶变体，编码此变体的分离DNA序列，表达载体，宿主细胞及生产和利用本发明变体的方法。本发明还涉及含有本发明变体的清洁和洗涤剂组合物。

Description

对蛋渍具有改进洗涤性能的枯草杆菌酶变体

技术领域

本发明涉及利用枯草杆菌酶(subtilase)变体从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍。本发明特别涉及利用枯草杆菌酶变体从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍，其中此枯草杆菌酶变体在第95-103位(BASBPN编号，见下文)活性位点(b)环区含有至少一个额外氨基酸残基。在用于例如清洁或洗涤剂组合物，如衣服洗涤剂组合物或洗碗组合物，包括自动洗碗组合物时，这些枯草杆菌酶变体有用，表现出对蛋渍优异的或改进的洗涤性能。本发明也涉及新的枯草杆菌酶变体，编码此变体的分离的DNA序列，表达载体，宿主细胞及生产和使用本发明变体的方法。本发明还涉及含有本发明变体的清洁剂和洗涤剂组合物。

发明背景

在洗涤剂工业中，酶被用于洗涤制剂已有30多年的历史。在这些制剂中使用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、以及其它的酶，或它们的混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。

大量增加的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程变体，例如，

(Novo Nordisk A/S)，

(Novo Nordisk A/s)，

(Gist-Brocades N.V.)， (Genencor International，Inc.)。

而且，许多蛋白酶变体在本领域中已有描述。现有技术蛋白酶变体的详细名单已在WO99/27082中列出。

然而，尽管已有大量有用蛋白酶变体的描述，但对于许多工业应用，仍需求新的改进蛋白酶或蛋白酶变体。

具体地说，由于许多蛋白酶被存在于蛋清中的物质抑制，从例如待洗衣物或硬表面除去蛋渍的问题已经被提出。这类物质的例子包括IV-0 型胰蛋白酶抑制剂(卵抑制剂(Ovo-inhibitor))及III-0型胰蛋白酶抑制剂(卵类粘蛋白)。

因此，本发明的目的是提供不被这类物质抑制或仅在有限程度上被抑制的改进的枯草杆菌酶变体。本发明的另外一个目的是提供适于从例如待洗衣物和/或硬表面除去蛋渍的改进的枯草杆菌酶变体。

发明概述

因此，本发明的第一个方面涉及枯草杆菌酶变体在从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍中的应用，此枯草杆菌酶变体在第95-103位(BASBPN编号)的活性位点(b)环区含有至少一个额外氨基酸残基。

本发明的第二个方面涉及枯草杆菌酶变体，此变种选自：在活性位点(b)环含有至少一个额外氨基酸残基，相当于在第98和99位之间至少一个额外氨基酸残基的插入，并且还含有至少一个额外的修饰(BASBPN编号)的变体，和在活性位点(b)环含有至少一个额外氨基酸残基，相当于在第99和100位之间至少一个额外氨基酸残基的插入，并且还含有至少一个额外的修饰(BASBPN编号)的变体，其中此变体在本文实施例4中所示的“蛋抑制分析”中检测时具有至少10％的残留活性。

本发明的第三个方面涉及枯草杆菌酶变体，此变种选自：在第98和99位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在133和143位含有替代的变体，在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在99位含有替代的变体，在第98和99位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在167、170和194位含有替代的变体，在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在第216和217位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入的变体，在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在第217和218位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入的变体，在第99和100位之间含有至少一个氨基酸残基的插入并且还在第42和43位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入的变体，和在第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基的插入并且还在第129和130位之间含有至少一个氨基酸残基的插入的变体。

本发明的第四个方面涉及编码本发明枯草杆菌酶变体的分离的DNA序列。

本发明的第五个方面涉及含有本发明的分离DNA序列的表达载体。

本发明的第六个方面涉及用本发明表达载体转化的微生物宿主细胞。

本发明的第七个方面涉及生产本发明枯草杆菌酶变体的方法，其中在有益于所述变体表达和分泌的条件下培养根据本发明的宿主，并且回收变体。

本发明的第八个方面涉及含有本发明变体的清洁剂或洗涤剂组合物，优选洗衣或洗碗组合物。

本发明的第九个方面涉及从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍的方法，此方法包括将含蛋渍的硬表面或含蛋渍的衣物与含枯草杆菌酶变体的清洁剂或洗涤剂组合物、优选洗衣或洗碗组合物接触，该变体在第95-103位(BASBPN编号)活性位点(b)环区包含至少一个额外氨基酸残基。

本发明的另外的方面将从下面的描述及从附加的权利要求书中得到体现。

关于比对和编号，参考图1，该图显示了枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)(a)和枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)(b)之间的比对。

在本专利申请中这些比对被用作残基编号的参考。

定义

在更为详细地论述本发明之前，将首先定义下面的术语和约定。

变体名称的命名原则和约定

在描述根据本发明产生或设想的各种枯草杆菌酶变体时，为了便于提及，采用下述命名原则和约定：

首先通过分离的或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)之间的比对，定义参照框架。

为了给变体编号，可以通过9.1版本GCG软件包的GAP程序利用下述参数获得该比对：断缺区产生罚分(gap creation penalty)＝8和断缺区延伸罚分(gap extension penalty)＝8，而所有其它参数保留其默认值。

另一种方法是利用枯草杆菌酶之间的已知公认比对，例如描述于WO91/00345中的比对。在大多数情况下，这些差异并不是重要的。

因而，可以参照BASBPN对许多缺失和插入进行定义。在图1中，与BASBPN相比，枯草杆菌蛋白酶309 在第36、58、158、162、163以及164位具有6个缺失。这些缺失在图1中通过星号(*)标明。

在亲本酶中进行的各种修饰通常使用下面三个要素来表示：

原始氨基酸位置替代氨基酸

因此符号G195E是指第195位的甘氨酸被谷氨酸所替代。

在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以使用仅指示位置和替代氨基酸的简写符号：

位置替代氨基酸

关于同源枯草杆菌酶中的修饰，此种符号尤其恰当(见下文)。

同样，当替代氨基酸残基的身份不重要时也可以使用：

原始氨基酸位置

当原始氨基酸和替代氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则仅指明位置，例如：170。

当原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一种以上但又并非所有氨基酸时，则在括号中指出选择的氨基酸：

原始氨基酸位置{替代氨基酸 ₁ ，….，替代的氨基酸 _n}

对于具体变体，使用具体的三字母或一字母代码，包括指示任意氨基酸残基的代码Xaa和X。

替代：

谷氨酸在第195位替代甘氨酸命名为：

Gly195Glu 或 G195E

或任意氨基酸在第195位替代甘氨酸命名为：

Gly195Xaa 或 G195X

或

Gly195 或 G195

因此，丝氨酸在第170位替代任意氨基酸残基将命名为：

Xaa170Ser 或 X170S.

或

170Ser 或 170S

关于同源枯草杆菌酶中的改变，该符号尤其适合(见下文)。因此170Ser意味着包含例如BASBPN中的Lys170Ser改变和BLSAVI中的Arg170Ser改变(参见图1)。

对于原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一种以上但又并非所有氨基酸的改变，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸在第170位替代精氨酸可以通过

Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}

来表示，以指示变体

R170G，R170A，R170S，和R170T.

缺失：

第195位甘氨酸的缺失将表示为：

Gly195^＊或G195^＊

相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，例如第195位甘氨酸和196位亮氨酸缺失将表示为：

Gly195^＊+Leu196^＊或G195^＊+L196^＊

插入：

额外氨基酸残基的插入，例如赖氨酸在G195位之后的插入表示为：

Gly195GlyLys 或 G195GK；或

当插入不止一个氨基酸残基时，例如在G195之后插入一个赖氨酸，丙氨酸和丝氨酸时，这将表示为：

Gly195GlyLysAlaSer 或 G195GKAS(SEQ ID NO：1)

在这种情况下，通过在插入氨基酸残基之前的氨基酸残基位置数后加上小写字母来编号该插入的氨基酸残基。上述例子中的第194-196位序列将因此被表示为：

194 195 196

BLSAVI A - G - L

194 195 195a 195b 195c 196

变体 A - G - K - A - S - L(SEQ ID NO：16)

在插入与已有氨基酸残基相同的氨基酸残基时，很显然在命名中产生了简并性。例如在上述例子的甘氨酸之后插入一个甘氨酸，则表示为G195GG。而对于从

194 195 196

BLSAVI A - G - L

到

194 195 195a 196

变体 A - G - G - L(SEQ ID NO：27)

194 194a 195 196

的改变，实际上相同的变化同样可以表示为A194AG。

这些情况对于技术人员来说是显而易见的，因此表示式G195GG和针对该类型插入的相应表示式旨在包括这种等同简并表示式。

缺口填充：

当与用于编号的枯草杆菌蛋白酶BPN’序列进行的参照比较中，一个酶中存在缺失时，在该位置的插入例如第36位的天冬氨酸插入表示为：

^＊36Asp或^＊36D

多重修饰：

含有多重修饰的变体通过加号分开，例如：

Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E

表示在第170位和195位用酪氨酸和谷氨酸分别替代精氨酸和甘氨酸的修饰。

因此，Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示以下变体：

Tyr167Gly+Arg170Gly，Tyr167Gly+Arg170Ala，

Tyr167Gly+Arg170Ser，Tyr167Gly+Arg170Thr，

Tyr167Ala+Arg170Gly，Tyr167Ala+Arg170Ala，

Tyr167Ala+Arg170Ser，Tyr167Ala+Arg170Thr，

Tyr167Ser+Arg170Gly，Tyr167Ser+Arg170Ala，

Tyr167Ser+Arg170Ser，Tyr167Ser+Arg170Thr，

Tyr167Thr+Arg170Gly，Tyr167Thr+Arg170Ala，

Tyr167Thr+Arg170Ser，和Tyr167Thr+Arg170Thr.

当涉及到对具有特定共性的氨基酸残基例如带正电荷的残基(K，R，H)，带负电荷的残基(D，E)进行替代、替代、插入或缺失修饰时，或涉及到保守氨基酸修饰例如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}时，这种命名原则尤其恰当。具体参见“发明详述”部分。

蛋白酶

裂解蛋白质底物中酰胺键的酶被归为蛋白酶，或(可互换使用的)肽酶(参见Walsh，1979，酶反应原理(Enzymatic ReactionMechanisms)，W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。

氨基酸位置/残基的编号

如没有另外提及，本文所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN’(BASBPN)序列的编号。BPN’序列的进一步描述参见图1和2，或Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性位点含有一个必需丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973“生物化学原理(Principles of Biochemistry)”，第五版，McGraw-Hill BookCompany，NY，第271-272页)。

细菌丝氨酸蛋白酶具有20,000到45,000道尔顿的分子量。其被二异丙基氟磷酸抑制。它们水解简单末端酯并且在活性上相似于同样是丝氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。更为狭窄的术语，碱性蛋白酶，其包括一个亚族，反映了一些丝氨酸蛋白酶的高最适pH值，从pH 9.0到11.0(综述参见Priest(1977)Bacteriological Rev.41711-753)。

枯草杆菌酶

Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523提议将丝氨酸蛋白酶的一个亚族暂称为枯草杆菌酶(subtilase)。通过对170多个先前被称作枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列同源分析，定义了这些酶。枯草杆菌蛋白酶以前常常被解释为由革兰氏阳性菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人的提议其是枯草杆菌酶的一个亚族。各种各样的枯草杆菌酶已获得鉴定，而且许多枯草杆菌酶的氨基酸序列已被测定。对于这些枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更具体描述，参考Siezen等(1997)。

枯草杆菌酶的一个亚族，I-S1或“真”枯草杆菌蛋白酶，包含“经典的”枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)，枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID NO：38)，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg ( NOVO NORDISK A/S)，以及枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。

Siezen等(上文)识别了枯草杆菌酶的另一个亚族，I-S2或高碱性枯草杆菌蛋白酶。I-S2蛋白酶亚族被描述为高碱性枯草杆菌蛋白酶，其包括酶例如枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(

Gist-Brocades NV)，枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO：49)( NOVO NORDISK A/S)，枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(

NOVONORDISK A/S)，以及碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。

由NOVO NORDISK A/S销售。其是来自迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)的枯草杆菌蛋白酶309，而且其仅在一个位置上不同于BAALKP(N87S，参见本文图1)。

具有在图1中称为b)的氨基酸序列并如SEQ ID NO：49所示。

亲本枯草杆菌酶

术语“亲本枯草杆菌酶”描述了一种根据Siezen等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。更详细的参见刚才上面的“枯草杆菌酶”描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从自然来源分离的枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶特性的同时，对其进行随后的修饰。此外，亲本枯草杆菌酶还可以是通过如J.E.Ness等所述的(Nature Biotechnology，17，893-896(1999))DNA改组技术制备的枯草杆菌酶。或者，术语“亲本枯草杆菌酶”可以被称为“野生型枯草杆菌酶”。

枯草杆菌酶变体的修饰

本文所用术语“修饰”被定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及编码枯草杆菌酶的DNA的遗传操作。修饰可以是在目的氨基酸中或处的氨基酸侧链替代、氨基酸替代、缺失和/或插入。

枯草杆菌酶变体

在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变体和突变的枯草杆菌酶是指由表达突变基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该生物体来源于含有原始或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本生物体，为了产生当在合适宿主中表达时生产所述突变枯草杆菌酶蛋白酶的突变基因，对该亲本基因进行了突变。

同源枯草杆菌酶序列

为了修饰以获得本发明枯草杆菌酶变体，对

枯草杆菌酶的特异活性位点环区和所述环中的氨基酸插入进行了鉴定。

然而，本发明并不限于这种特殊枯草杆菌酶的修饰，而是扩展到与

具有同源一级结构的其它亲本(野生型)枯草杆菌酶。两个氨基酸序列之间的同源性在本发明中用“一致性”参数来描述。

为了确定两个枯草杆菌酶的一致性程度，可以应用9.1版本GCG软件包的GAP程序(下文)以及同上的设置参数。除了氨基酸比对外，该程序还输出两个序列之间的“一致性百分数”计算结果。

基于此描述，鉴定可以根据本发明进行修饰的合适同源枯草杆菌酶和相应的同源活性位点环区，对于本领域的技术人员来说是常规的。

分离的DNA序列

术语“分离的”，当用于DNA序列分子时，表示该DNA序列已从其天然的遗传环境中分离出来，因此不含有其它无关或不需要的编码序列，而且其形式适用于遗传工程蛋白质生产系统。该分离的分子是指那些从其自然环境中分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含有通常与之相关的其它基因，但可以包括自然存在的5’和3’非翻译区例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域的普通技术人员来说是容易的(参见例如，Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。术语“分离的DNA序列”也可以被称作“克隆的DNA序列”。

分离的蛋白质

当应用于蛋白时，术语“分离的”是指该蛋白已从其天然环境中分离出来。

在一种优选的形式中，分离的蛋白质相当大程度上不含有其它蛋白，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参见下述))。

通过SDS-PAGE检测，分离的蛋白质具有大于10％的纯度，优选大于20％的纯度，更优选大于30％的纯度。进一步优选提供高纯度形式的蛋白质，即通过SDS-PAGE检测，其纯度大于40％，大于60％，大于80％，更优选大于95％，甚至更优选大于99％的蛋白质。

术语“分离的蛋白质”也可以被称为“纯化的蛋白质”。

同源杂质

术语“同源杂质”是指来源于最初从其中获得本发明枯草杆菌酶的同源细胞的任何杂质(例如非本发明枯草杆菌酶的另一种多肽)。

获自

与特定微生物来源相连的术语“获自”，在本文中是指由该特定来源产生的，或由其中插入了该来源基因的细胞产生的多核苷酸和/或枯草杆菌酶。

底物

与蛋白酶底物相关的术语“底物”，应以其最广泛形式解释为包含含有至少一个易受枯草杆菌酶水解的肽键的化合物。

产物

与蛋白酶酶解反应得到的产物相关的术语“产物”，在本发明的上下文中应解释为包括涉及枯草杆菌酶蛋白酶的水解反应的产物。产物可以是随后水解反应中的底物。

洗涤性能

在本文中，术语“洗涤性能”用于指在例如清洗或硬表面清洁过程中酶从待清洁物体上除去蛋渍的能力。也见本文实施例3中“模式洗涤剂洗涤性能测试”。

性能因子

术语“性能因子”用以下公式来定义

P＝R_variant-R_parent

其中，P是性能因子，R_variant是如“模式洗涤剂洗涤性能测试”中所述用枯草杆菌酶变体处理后的测试材料的反射率(在460nm测定)，R_parent是如“模式洗涤剂洗涤性能测试”中所述用相应亲本枯草杆菌酶处理后的测试材料的反射率(在460nm测定)。更详细的说明见本文实施例3中的“模式洗涤剂洗涤性能测试”。

残留活性

术语“残留活性”按本文“蛋抑制分析”(见实施例4)中所述定义。

附图简要说明

图1显示了使用上述GAP程序在枯草杆菌蛋白酶BPN’(a)和 (b)之间进行的比对。

发明详述

本发明人发现，其活性位点(b)环区长于目前已知的那些的枯草杆菌蛋白酶变体表现出关于除去蛋渍的改进的洗涤性能。我们在构建与其亲本野生型酶相比在模式洗涤剂组合物中表现出改进的洗涤性能(关于除去蛋渍)的枯草杆菌蛋白酶变体，尤其是枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI或

)的变体的过程中对此进行了鉴定。

不为任何特定的理论所束缚，现在相信，改进的效果是由于阻碍了蛋清抑制剂在枯草杆菌酶变体活性位点(b)环区的结合。这反过来又可能是因为在这个酶的该特定位点的一个或多个额外氨基酸残基的插入而导致活性位点(b)环区结构改变的缘故。

因此，被认为适合本文所描述用途的变体是这样的变体，其中，同野生型枯草杆菌蛋白酶比较，在一个或多个下列位点中插入了一个或多个额外氨基酸残基：第95-96位之间、第96-97位之间、第97-98位之间、第98-99位之间、第99-100位之间、第100-101位之间、第101-102位之间、第102-103位之间、第103-104位之间，及其结合。

优选的插入是在第97-98位之间、第98-99位之间、第99-100位之间和/或第100-101位之间，特别是在第98-99位之间和在第99-100位之间进行。

本发明第一个方面的枯草杆菌酶变体可以是从自然环境鉴定和分离的亲本或野生型枯草杆菌酶。

这种亲本野生型枯草杆菌酶可以通过本领域已知的标准技术来进行特异筛选。

进行此筛选的一个优选方法是从多种不同微生物，优选不同的芽胞杆菌属(Bacillus)菌株，特异PCR扩增已知编码枯草杆菌酶活性位点环的DNA区。

从其DNA和氨基酸序列同源的意义上而言，枯草杆菌酶是一组保守酶。因此，在活性位点环两侧构建相对特异的引物是可能的。

进行此操作的一个方法是研究不同枯草杆菌酶之间的比对(参见，例如Siezen等.蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523)。从此常规工作，本领域技术人员即可构建位于活性位点环两侧的PCR引物，其中所述活性位点环相应于I-S1和I-S2族的任意一个成员例如BLSAVI的第95到103位氨基酸残基之间的活性位点环(b)。使用此引物从大量不同微生物，优选不同芽胞杆菌菌株扩增DNA，之后对所述扩增PCR片段进行DNA测序，这样就可能鉴定出产生与例如BLSAVI相比含有更长活性位点区的这些组枯草杆菌酶的菌株，其中所述活性位点区对应于从第95位至103位的活性位点环区。在鉴定了目的枯草杆菌酶的菌株和部分DNA序列之后，完成枯草杆菌酶的克隆、表达和纯化对于本领域技术人员来说是常规工作。

然而，可以设想本发明的枯草杆菌酶变体主要是亲本枯草杆菌酶的变体。

适合本文所述用途的枯草杆菌酶变体可通过本领域已知的标准技术来构建，例如通过定点诱变/随机诱变或通过不同枯草杆菌酶序列的DNA改组来构建。具体参见本文的″材料和方法″部分(参见下文)。

正如本领域技术人员所知，本发明所述的变体除在第95-103位之间的至少一个插入以外，可以还含有至少一个进一步的修饰。例如，变体可能在活性位点(b)环区含有一个或多个替代以及在此区以外含有一个或多个替代。而且，该变体可以在活性位点(b)环区以外含有一个或多个进一步的插入。

此外，在本文所述的区中的插入可以包括不止一个氨基酸残基的插入。例如，根据本发明的变体可以包含一个插入、两个插入或两个以上的插入，例如三个、四个或五个插入。

在本发明的一个优选实施方案中，进一步的修饰在选自以下组的位置发生：在第99位的替代、在第133位的替代、在第143位的替代、在第167位的替代、在第170位的替代、在第194位的替代、在第42-43位之间的插入、在第129-130位之间的插入、在第216-217位之间的插入、在第217-218位之间的插入，及其组合。

在本发明一个令人感兴趣的实施方案中，额外氨基酸残基被插入到第98-99位之间(BASBPN编号)。

在第98-99位之间的插入优选选自(使用BASBPN的编号方式)

X98X{A，T，G，S}，例如，X98XA，X98XT，X98XG，X98XS；

X98X{D，E，K，R}，例如，X98XD，X98XE，X98XK，X98XR；

X98X{H，V，C，N，Q}，例如，X98XH，X98XV，X98XC，X98XN，X98XQ；和

X98X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X98XF，X98XI，X98XL，X98XM，X98XP，X98XW，X98XY；优选X98XA，X98XT，X98XG或X98XS；

或更为具体地对于枯草杆菌蛋白酶309和紧密相关的枯草杆菌酶例如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK而言：

A98A{A，T，G，S}，例如，A98AA，A98AT，A98AG，A98AS；

A98A{D，E，K，R}，例如，A98AD，A98AE，A98AK，A98AR；

A98A{H，V，C，N，Q}，例如，A98AH，A98AV，A98AC，A98AN，A98AQ；

A98A{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，A98AF，A98AI，A98AL，A98AM，A98AP，A98AW，A98AY；优选A98AA，A98AT，A98AG或A98AS.

此外，目前优选在第98-99之间的插入结合进一步的修饰，即在第133和143位的氨基酸残基替代，以及在第167、170和194位的氨基酸残基替代。

在(除了在第98-99之间的插入外)第133和134位的替代分别优选选自

X133{A，T，G，S}，例如，X133A，X133T，X133G，X133S；

X133{D，E，K，R}，例如，X133D，X133E，X133K，X133R；

X133{H，V，C，N，Q}，例如，X133H，X133V，X133C，X133N，X133Q ；

X133{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X133F，X133I，X133L，X133M，X133P，X133W，X133Y；

X143{A，T，G，S}，例如，X143A，X143T，X143G，X143S；

X143{D，E，K，R}，例如，X143D，X143E，X143K，X143R ；

X143{H，V，C，N，Q}，例如，X143H，X143V，X143C，X143N，X143Q；和

X143{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X143F，X143I，X143L，X143M，X143P，X143W，X143Y.

在一个优选实施方案中，在第133位的替代选自X133{D，E，K，R}，优选X133D或X133E，特别是X133E。

在另一个优选实施方案中，在第143位的替代选自X143{D，E，K，R}，优选X143K或X143R，特别是X143K。

一个优选变体的例子是含有以下插入和替代的枯草杆菌酶变体：X98XS+X133E+X143K。一个特定的优选变体是含有以下插入和替代的

变体：A98AS+A133E+T143K。

而且，在第167、170和134位的替代(除了在第98-99之间的插入外)分别优选选自

X167{A，T，G，S}，例如，X167A，X167T，X167G，X167S；

X167{D，E，K，R}，例如，X167D，X167E，X167K，X167R；

X167{H，V，C，N，Q}，例如，X167H，X167V，X167C，X167N，X167Q；

X167{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X167F，X167I，X167L，X167M，X167P，X167W，X167Y；

X170{A，T，G，S}，例如，X170A，X170T，X170G，X170S；

X170{D，E，K，R}，例如，X170D，X170E，X170K，X170R；

X170{H，V，C，N，Q}，例如，X170H，X170V，X170C，X170N，K170Q；

X170{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X170F，X170I，X170L，X170M，X170P，X170W，X170Y；

X194{A，T，G，S}，例如，X194A，X194T，X194G，X194S；

X194{D，E，K，R}，例如，X194D，X194E，X194K，X194R；

X194{H，V，C，N，Q}，例如，X194H，X194V，X194C，X194N，X194Q；和

X194{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X194F，X194I，X194L，X194M，X194P，X194W，X194Y.

在一个优选实施方案中，在第167位的替代选自X167{A，T，G，S}，特别是X167A；在第170位的替代选自X170{A，T，G，S}，特别是X170S；且在第194位的替代选自X194{F，I，L，M，P，W，Y}，特别是X194P。

一个优选变体的例子是含有以下插入和替代的枯草杆菌酶变体：X98XT+X167A+X170S+X194P。一个特定的优选变体是含有以下插入和替代的

变体：A98AT+Y167A+R170S+A194P。

在本发明另一个令人感兴趣的实施方案中，额外氨基酸残基被插入到第99-100位之间(BASBPN编号)。

在第99-100位之间的插入优选选自(使用BASBPN编号方式)

X99X{A，T，G，S}，例如，X99XA，X99XT，X99XG，X99XS；

X99X{D，E，K，R}，例如，X99XD，X99XE，X99XK，X99XR；

X99X{H，V，C，N，Q}，例如，X99XH，X99XV，X99XC，X99XN，X99XQ；和

X99X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X99XF，X99XI，X99XL，X99XM，X99XP，X99XW，X99XY；优选X99X{D，E，K，R}，特别是X99XD或X99XE；

或更具体的，对于枯草杆菌蛋白酶309和紧密相关的枯草杆菌酶例如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK而言：

S99S{A，T，G，S}，例如，S99SA，S99ST，S99SG，S99SS；

S99S{D，E，K，R}，例如，S99SD，S99SE，S99SK，S99SR；

S99S{H，V，C，N，Q}，例如，S99SH，S99SV，S99SC，S99SN，S99SQ；

S99S{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，S99SF，S99SI，S99SL，S99SM，S99SP，S99SW，S99SY；优选S99S{D，E，K，R}，特别是S99SD或S99SE.

关于在第99-100位之间的插入，在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，优选插入与第99位的替代相结合。因此，除了上面提到的所期待的插入以外，下列在第99位的替代被认为是相关的：

X99{A，T，G，S}，例如，X99A，X99T，X99G，X99S；

X99{D，E，K，R}，例如，X99D，X99E，X99K，X99R；

X99{H，V，C，N，Q}，例如，X99H，X99V，X99C，X99N，X99Q；和X99{FI，L，M，P，W，Y}，例如，X99F，X99I，X99L，X99M，X99P，X99W，X99Y.

在一个优选实施方案中，在第99位的替代选自X99{A，T，G，S}，特别是X99A或X99T。

一个优选变体的例子是含有以下插入和替代的枯草杆菌酶变体：X99XD+X99A或X99XR+X99T。一个特定的优选变体是含有以下插入和替代的

变体：S99SD+S99A或S99SR+S99T。

关于在第99-100位之间的插入，在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，优选插入与第216-217位之间至少一个氨基酸残基的进一步插入结合。因此，除了上面提到的所期待的插入以外，下列在第216-217位之间的插入被认为是相关的：

X216X{A，T，G，S}，例如，X216XA，X216XT，X216XG，X216XS；

X216X{D，E，K，R}，例如，X216XD，X216XE，X216XK，X216XR；

X216X{H，V，C，N，Q}，例如，X216XH，X216XV，X216XC，X216XN，X216XQ；和

X216X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X216XF，X216XI，X216XL，X216XM，X216XP，X216XW，X216XY.

在一个优选实例中，在第216-217位之间的插入选自X216X{F，I，L，M，P，W，Y}，特别是X216XP。

优选变体的例子是含有以下插入和替代的枯草杆菌酶变体：X99XD+X99A+X216XP及X99XD+X99A+X216XDP。特定的优选变体是含有以下插入和替代的

变体：S99SD+S99A+S216SP及S99SD+S99A+S216SDP。

关于在第99-100位之间的插入，在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，优选插入与第217-218位之间至少一个氨基酸残基进一步的插入结合。因此，除了上面提到的所期待的插入以外，下列在第217-218位之间的插入被认为是相关的：

X217X{A，T，G，S}，例如，X217XA，X217XT，X217XG，X217XS；

X217X{D，E，K，R}，例如，X217XD，X217XE，X217XK，X217XR；

X217X{H，V，C，N，Q}，例如，X217XH，X217XV，X217XC，X217XN，X217XQ；和

X217X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X217XF，X217XI，X217XL，X217XM，X217XP，X217XW，X217XY.

在一个优选实施方案中，在第217-218位之间的插入选自X217X{F，I，L，M，P，W，Y}，特别是X217XP。

优选变体的例子是含有以下插入和替代的枯草杆菌酶变体：X99XD+X99A+X217XP及X99XD+X217XDP。特定的优选变体是含有以下插入和替代的

Figure DEST_PATH_G00817845320030912D000011

变体：S99SD+S99A+L217LP及S99SD+L217P。

关于在第99-100位之间的插入，在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，优选插入与第42-43位之间至少一个氨基酸残基进一步的插入结合。因此，除了上面提到的所期待的插入以外，下列在第42-43位之间的插入被认为是相关的：

X42X{A，T，G，S}，例如，X42XA，X42XT，X42XG，X42XS；

X42X{D，E，K，R}，例如，X42XD，X42XE，X42XK，X42XR；

X42X{H，V，C，N，Q}，例如，X42XH，X42XV，X42XC，X42XN，X42XQ；和

X42X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X42XF，X42XI，X42XL，X42XM，X42XP，

X42XW，X42XY.

在一个优选实施方案中，在第42-43位之间的插入选自X42X{H，V，C，N，Q}，特别是X42XN。

优选变体的例子是含有以下插入和替代的枯草杆菌酶变体：X99XD+X42XN及X99XD+X99A+X42XN。特定的优选变体是含有以下插入和替代的

Figure DEST_PATH_G00817845320030912D000012

变体：S99SD+L42LN及S99SD+S99A+L42LN。

关于在第99-100位之间的插入，在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，优选插入与第129-130位之间至少一个氨基酸残基进一步的插入结合。因此，除了上面提到的所期待的插入以外，下列在第129-130位之间的插入被认为是相关的：

X129X{A，T，G，S}，例如，X129XA，X129XT，X129XG，X129XS；

X129X{D，E，K，R}，例如，X129XD，X129XE，X129XK，X129XR；

X129X{H，V，C，N，Q}，例如，X129XH，X129XV，X129XC，X129XN，X129XQ；和

X129X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X129XF，X129XI，X129XL，X129XM，X129XP，X129XW，X129XY.

在一个优选实施方案中，在第129-130位之间的插入选自X129X{D， E，K，R}。

优选变体的例子是含有以下插入和替代的枯草杆菌酶变体：X99XD+X129XD及X99XD+X99A+X129XD。特定的优选变体是含有以下插入和替代的

变体：S99SD+P129PD及S99SD+S99A+P129PD。

正如本领域所熟知的，所谓一个氨基酸残基对一个相似氨基酸残基的保守替代应该对酶的特性仅产生微小的改变。

下面表I列出了多组保守氨基酸替代：

表I

保守氨基酸替代

共有性质氨基酸

碱性(带正电荷) K＝赖氨酸

H＝组氨酸

酸性(带负电荷) E＝谷氨酸

D＝天冬氨酸

极性 Q＝谷氨酰胺

N＝天冬酰胺

疏水性 L＝亮氨酸

I＝异亮氨酸

V＝缬氨酸

M＝甲硫氨酸

芳香族 F＝苯丙氨酸

W＝色氨酸

Y＝酪氨酸

小分子 G＝甘氨酸

A＝丙氨酸

S＝丝氨酸

T＝苏氨酸

基于此原则，含有保守替代的枯草杆菌酶变体应该表现出彼此不会明显不同的特性。

基于此处公开的和/或示例的枯草杆菌酶变体，为了获得显示出相似改进洗涤能力的其它枯草杆菌酶变体，鉴定这些变体的合适保守修饰对于本领域的技术人员来说是常规的工作。

不论为了从自然或人工产生的多样性中分离酶，还是为了从亲本枯草杆菌酶设计和产生变体，优选亲本枯草杆菌酶均属于I-S1和I-S2亚族，尤其是I-S2亚族。

关于来自I-S1亚族的变体，优选从下组选择亲本枯草杆菌酶：BSS168(BSSAS，BSAPRJ，BSAPRN，BMSAMP)，BASBPN，BSSDY，BLSCAR(BLKERA，BLSCA1，BLSCA2，BLSCA3)，BSSPRC和BSSPRD，或者它们的保留了I-S1亚族特性的功能性变体。

关于来自I-S2亚族的变体，优选从下组选择亲本枯草杆菌酶：BSAPRQ，BLS147(BSAPRM，BAH101)，BLSAVI(BSKSMK，BAALKP，BLSUBL)，BYSYAB，BAPB92，TVTHER和BSAPRS，或它们的保留了I-S2亚族特性的功能性变体。

所述亲本枯草杆菌酶尤其是指BLSAVI(

NOVO NORDISKA/S)，因此本发明的优选枯草杆菌酶变体是的变体。因此，令人感兴趣的特定变体是变体，即BLSAVI变体，其中

1.在第98-99位之间插入了Ser，在第133位的Ala被Glu替代，并且在第143位的Thr被Lys替代(BASBNP编号)；或

2.在第99-99位之间插入了Asp，在第99位Ser被Ala替代(BASBNP编号)；或

3.在第98-99位之间插入了Thr，在第167位Tyr被Ala替代，在第170位Arg被Ser替代并且在第194位Ala被Pro替代(BASBNP编号)；或

4.在第99-100位之间插入了Asp，在第99位Ser被Ala替代，并且在第217-218位之间插入了Pro(BASBNP编号)。

5.在第99-100位之间插入了Asp，在第99位Ser被Ala替代，且在第216-217位之间插入了Pro(BASBNP编号)。

6.在第99-100位之间插入了Asp，在第99位Ser被Ala替代，且在第216-217位之间插入了Asp-Pro(BASBNP编号)。

7.在第99-100位之间插入了Asp，在第99位Ser被Ala替代，且在第129-130位之间插入了Asp(BASBNP编号)。

8.在第99-100位之间插入了Asp，且在第42-43位之间插入了Asn(BASBNP编号)。

9.在第99-100位之间插入了Asp，在第99位Ser被Ala替代，且在第42-43位之间插入了Asn(BASBNP编号)。

10.在第99-100位之间插入了Arg，且在第99位Ser被Thr替代。

11.在第99-100位之间插入了Asp，在第99位Ser被Ala替代，且在第133位Pro被Thr替代。

本发明还包括使用所有组合了对其氨基酸序列的任何其它修饰的上述枯草杆菌酶变体。特别是设想了与本领域已知其它修饰的组合以提供改进的酶性质。本领域描述了许多具有不同改良特性的变体，而且在本文的“发明背景”部分(参见上文)也提及了许多这样的枯草杆菌酶。在此公开这些参考文献作为鉴定可以有利地与本文所描述的枯草杆菌酶变体组合的枯草杆菌酶变体的参考。

这些组合包括第222位(提高氧化稳定性)，第218位(提高热稳定性)，在稳定该酶的Ca-结合位点中例如第76位的替代，以及许多现有技术已知的其它位置。

在其它实施方案中，可以有利地将本文所描述的枯草杆菌酶变体与任意下述位置的一个或更多修饰组合起来：

27，36，56，76，87，97，101，103，104，120，123，159，167，170，206，218，222，224，232，235，236，245，248，252和274.

特别是下列BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK和BAALKP的变体被认为适用于进行组合：

K27R，^＊36D，S56P，N76D，S87N，G97N，S101G，S103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，H120D，N123S，G159D，Y167，R170，Q206E，N218S， M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，Q245R，N248D，N252K和T274A.

而且，包含与上述任意一个或多个修饰组合的如下任意变异：S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A，或者这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)或S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K的其它组合的变体表现出改进的特性。

此外，本发明主要方面的枯草杆菌酶变体优选在第129、131及194位的任何位置结合一个或多个修饰，优选129K、131H及194P修饰，并且最优选P129K、P131H及A194P修饰。任何这些修饰都预期会在枯草杆菌酶变体的制备中使其表达水平更高。

如上所述，本文所公开的变体仅在有限程度上被IV-0型胰蛋白酶抑制剂抑制，由此，它们表现出了对蛋渍优良的洗涤性能。因此，为了使技术人员能够在其开发工作的早期为了此目的而选择有效的及优选的变体，本发明人提供了一种合适的初步测试方法，技术人员可很容易实施此方法以对所研究变体的性能进行初步鉴定。

因此，在本文实施例4所公开的“蛋抑制分析”可被用来对所选择的变体作初步评估。换句话来说，“蛋抑制分析”可被用来评价所选变体是否会被IV-0型胰蛋白酶抑制剂所抑制，以及被抑制到什么程度。采用这种测试，就可以评价所选变体在除去蛋渍上的适宜性，基本原理是如果所选变体被IV-0型胰蛋白酶抑制剂强烈抑制，通常就没必要对其进行进一步的测试试验。

因此，在本文所述应用上特别令人感兴趣的变体是这样的一种变体，在本文实施例4所描述的“蛋抑制分析”中测试时，其具有至少10％的残留活性，例如至少15％，例如至少20％，优选至少25％，例如至少30％，更优选至少35％的残留活性。在本发明一个特别令人感兴趣的实施方案中，当在本文实施例4所描述的“蛋抑制分析”中测试时，变体具有至少40％的残留活性，例如至少45％，例如至少50％，优选至少55％，例如至少60％，更优选至少65％，例如至少70％，再更优选至少75％，例如至少80％，例如至少90％的残留活性。

很明显，优选本发明变体在至少所述最低水平上达到上述标准，更优选在所述中等水平上达到上述标准，最优选在所述最高水平上达到上述标准。

作为上述分析的替代选择或补充，所选变体的适宜性可采用本文实施例3公开的“模式洗涤剂洗涤性能测试”进行测试。“模式洗涤剂洗涤性能测试”可被用来评价与参照系统即亲本枯草杆菌酶(在同样的模式洗涤剂系统内并在相同条件下测试)相比较，变体在掺入标准洗涤剂组合物后从标准纺织品上除去蛋渍的能力。采用这种测试，可以初步测定所选变体除去蛋渍的适宜性，基本原理是如果所选变体在测试中没有表现出比亲本枯草杆菌酶显著的改进，则通常没必要对其进行进一步的测试试验。

因此，在本文所述应用上特别令人感兴趣的变体是这样的变体，其在本文实施例3公开的“模式洗涤剂洗涤性能测试”所描述的含下列组分的模式洗涤剂组合物中进行测试时，与亲本枯草杆菌酶相比在相同条件下表现出对蛋渍改进的洗涤性能：

6.2％LAS(Nansa 80S)

2％ C₁₆-C₁₈脂肪酸钠盐

4％非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

22％沸石P

10.5％Na₂CO₃

4％ Na₂Si₂O₅

2％羧甲基纤维素(CMC)

6.8％丙烯酸酯液CP5(Acrylate liquid CP5)40％

20％过硼酸钠(实验式NaBO₂·H₂O₂)

0.2％ EDTA

21％ Na₂SO₄

水(平衡)

可以采用本文实施例3中定义的所谓“性能因子”对洗涤性能的提高进行量化。

在本发明一个非常令人感兴趣的实施方案中，本发明的变体在“洗涤性能测试”中测试时具有至少1的性能因子，例如至少1.5，例如至少2，优选至少2.5，例如至少3，例如至少3.5，特别是至少4，例如至少4.5，例如至少5的性能因子。

如上所述，本发明也提供了新的枯草杆菌酶变体。可以理解关于本发明新枯草杆菌酶方面的细节和特性将与在本发明应用方面上面讨论过的变体的细节和特性相同或类似。这意味着在任何适当时候，关于本文详细讨论的应用的说明(例如，优选的插入和替代等)，经过必要的修改，适用于新枯草杆菌酶变体以及本发明的方法方面和本发明清洁剂与洗涤剂组合物方面。

制备枯草杆菌酶变体

用以克隆枯草杆菌酶以及将插入导入基因(例如：枯草杆菌酶基因)的方法是本领域所熟知的，参考在“发明背景”部分引用的文献。

通常，为了获得本发明的枯草杆菌酶变体，可以使用用以克隆基因和将(随机和/或定点)插入导入所述基因的标准程序。对于适合技术的进一步描述，参见本文实施例(见下文)和(Sambrook等人.(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A laboratory manual)，冷泉港实验室.冷泉港，NY；Ausubel，F.M.等(编)″现代分子生物学实验指南(Current protocols in Molecular Biology)″.John Wileyand Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编)″芽胞杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)″.John Wiley and Sons，1990)；以及WO 96/34946。

此外，枯草杆菌酶变体可以通过人工产生多样性的标准技术来构建，例如不同枯草杆菌酶基因的DNA改组(WO 95/22625；Stemmer WPC，自然(Nature)370：389-91(1994))。例如将实际上已被鉴定与相比含有更长活性位点环(b)区的一个或多个枯草杆菌酶部分序列和编码的基因进行DNA改组，在随后对具有改进洗涤性能的变体进行筛选之后，即可提供适合本文所述用途的枯草杆菌酶变体。

表达载体

含有编码本发明酶的DNA结构的重组表达载体可以是任意可方便地进行重组DNA操作的载体。载体的选择通常取决于其将要导入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在并且其复制独立于染色体复制的载体，例如质粒。

或者，该载体可以是当被导入宿主细胞后部分或全部整合到宿主细胞基因组中并且随其整合的染色体一起复制的载体。

该载体优选是表达载体，而且在该表达载体中编码本发明酶的DNA序列可操作地与DNA转录所需的其它片段连接。通常，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或可以含有二者的元件。术语“可操作地连接”是指对片段进行排列以使其按预期目的发挥功能，例如，转录在启动子中起始并沿着编码酶的DNA序列前进。

启动子可以是在所选宿主细胞中显示出转录活性的任意DNA序列，可以来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

用于细菌宿主细胞的适合启动子的例子包括嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)基因，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因，或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因的启动子，或λ噬菌体PR或PL启动子，或大肠杆菌(E.coli)lac，trp或tac启动子。

如有必要，编码本发明酶的DNA序列也可以可操作地连接一个合适的终止子。

本发明的重组载体可以进一步含有使得载体能够在所述宿主细胞中复制的DNA序列。

该载体还可以含有一个选择标记，例如：其产物弥补了宿主细胞缺陷的基因，或编码例如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素，壮观霉素等抗生素抗性，或重金属或除草剂抗性的基因。

为了引导本发明酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列，前原序列(prepro sequence)或前序列(pre sequence))。分泌信号序列在正确阅读框中与编码酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码酶的DNA序列的5`端。分泌信号序列可以是正常与酶联系的分泌信号序列，也可以来自编码另一种分泌蛋白的基因。

用于分别地将编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列连接起来，或通过合适的PCR扩增方案装配这些序列，然后将它们插入含有复制或整合所需信息的适合载体中的方法，是本领域技术人员所熟知的(参见，例如Sambrook等，同上)。

宿主细胞

被导入宿主细胞的编码本发明酶的DNA序列可以与所述宿主同源或异源。如果该DNA序列与宿主细胞同源，即由宿主细胞天然产生，则其典型地是与另一个启动子序列或，如果适用，与另一个分泌信号序列和/或终止子序列可操作地连接，而不是存在于其天然环境中。术语“同源的”旨在包括编码所述宿主生物天然产生的酶的DNA序列。术语“异源的”旨在包括宿主细胞天然并不表达的DNA序列。因此，该DNA序列可以来自另一种生物，或其可以是合成序列。

本发明DNA结构或重组载体所导入的宿主细胞可以是能够产生本发明酶的任意细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核生物包括植物的细胞。

在培养过程中能够产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子包括革兰氏阳性细菌例如芽胞杆菌属(Bacillus)菌株如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus )、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans )、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，或链霉菌属(Streptomyces)菌株，如浅青紫链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(Echerichia coli)。

细菌的转化可通过原生质体转化、电穿孔、接合、或通过使用感受态细胞，按本来已知的方式进行(参见Sambrook等，见上文)。

当在细菌例如大肠杆菌中表达该酶时，该酶可以典型地以不可溶颗粒(称作包涵体)形式留在细胞质中，或可以被细菌分泌序列引导至周质间隙。在前一种情况中，裂解细胞并回收颗粒，变性，之后通过稀释变性剂使该酶重新折叠。在后一种情况中，可以通过破碎细胞从周质间隙回收该酶。例如，通过超声处理或渗压震扰来释放周质间隙的内容物并回收该酶。

当在革兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，酶可以保留在细胞质中，或可以被细菌分泌序列引导至细胞外培养基中。在后一种情况中，可以按下文所述方法从培养基中回收该酶。

生产枯草杆菌酶变体的方法

本发明提供生产本发明的分离酶的方法，其中在允许该酶产生的条件下培养用编码此酶的DNA序列转化的合适宿主细胞，并且从培养物中回收产生的酶。

当含有编码此酶的DNA序列的表达载体被转化到异源宿主细胞中时，即可以进行本发明酶的重组异源产生。

因此生产高纯度的其特征在于不含有同源杂质的枯草杆菌酶组合物是可能的。

在本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明酶的同源细胞的任何杂质(例如，除本发明酶之外的其它多肽)。

用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适用于所述宿主细胞生长的任何常规培养基。可以将表达的枯草杆菌酶方便地分泌至培养基中，并由此通过熟知程序进行回收，这些程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，采用盐例如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，然后进行层析如离子交换层析、亲和层析等等。

清洁和洗涤剂组合物

通常，清洁和洗涤剂组合物在本领域中已有很好的描述，对于适合的清洁和洗涤剂组合物的进一步描述，参见WO 96/34946，WO97/07202，WO 95/30011。

此外，本文的实施例阐明了许多枯草杆菌酶变体在对蛋渍洗涤性能上的改进。

洗涤剂组合物

枯草杆菌酶变体可以被加入洗涤剂组合物中并因此成为洗涤剂组合物的一个成分。

本发明的洗涤剂组合物可以例如配制成手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，其中包括适用于污染的纺织物预处理的洗衣添加组合物以及加入了织物软化剂的漂洗组合物，或配制成用于一般家用硬物体表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制成用于手工或机械洗碟操作的洗涤剂组合物。

在一个具体方面，本发明提供含有本发明枯草杆菌酶的洗涤添加剂。该洗涤添加剂与所述洗涤剂组合物均可以含有一或多种其它酶例如其它蛋白酶、脂酶、角质酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabanase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

通常，所选酶的性质应与所选洗涤剂相适应(即最适pH、与其它的酶和非酶成分的兼容性，等等)，并且该酶应当以有效的量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物，植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源的蛋白酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选微生物的碱性蛋白酶，或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，尤其是来自芽胞杆菌属的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和描述于WO 89/06270和WO 94/25583中的镰孢属(Fusarium)蛋白酶。

有用蛋白酶的例子是描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO98/20116和WO 98/34946中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上可获得蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM以及Kannase^TM(Novo Nordisk A/S)、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的脂肪酶的例子包括来自腐殖霉属(Humicola)(同义词Thermomyces)的脂肪酶例如EP 258068和EP 305216中描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶、或WO 96/13580中描述的来自H.insolens的脂肪酶，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株 SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽胞杆菌属脂肪酶例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它例子包括例如描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中的脂肪酶变体。

优选的商业上可获得脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novo Nordisk A/S)。

淀粉酶：合适的(α和/或β)淀粉酶包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学修饰的突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。淀粉酶包括，例如，从芽胞杆菌属例如地衣芽孢杆菌的特定菌株中获得的α-淀粉酶，更详细的描述在GB 1,296,839中。

有用淀粉酶的例子是描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上可获得的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novo Nordisk A/s)、Rapidase^TM和Purastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐殖霉属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)，梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如Humicola insolens，Myceliophthora thermophila和尖镰孢 (Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶，这些酶公开于US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO89/09259。

特别合适的纤维素酶是具有护色功能的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是例如描述于EP 0495257、EP 0531372、WO96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其它例子是描述于WO 94/07998、EP 0531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的纤维素酶变体。

商业上可获得的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(NovoNordisk A/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor InternationalInc.)，以及KAC-500(B)^TM(Kao公司)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物，细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的过氧化物酶的例子包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的，来自鬼伞菌属(Coprinus)的过氧化物酶例如来自(C.Cinereus)的过氧化物酶，及其变体。

商业上可获得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novo Nordisk A/S)。

可以通过加入含有一或多种酶的分开的添加剂，或通过加入含有所有这些酶的组合添加剂，将这些洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂即分开的添加剂或组合添加剂，可以配制成例如颗粒、液体或浆液等等。优选的洗涤剂添加剂制品是颗粒，尤其是非起尘(non-dusting)颗粒，液体，尤其是稳定的液体，或浆液。

非起尘颗粒可以按例如US 4,106,991和4,661,452中所公开的方法生产，并且可以任选地通过本领域已知方法进行包被。蜡样包被材料的例子是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚(ethoxylated nonylphenol)；其中具有15到80个环氧乙烷单位并且醇含有12到20个碳原子的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单、二和三甘油酯。适于通过流化床技术应用的薄膜形成包被材料见GB 1483591。液体酶制品可以根据已有技术通过例如加入多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。可以根据EP 238,216中公开的方法制备受保护的酶。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便形式例如条形、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或是非水性的。

该洗涤剂组合物含有一或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子包括半极性，和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。这些表面活性剂典型地按重量计以0.1％到60％的水平存在。

当包括在内时，洗涤剂通常含有大约1％到大约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。

当包括在内时，洗涤剂通常含有大约0.2％到大约40％的非离子表面活性剂例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺或氨基葡糖(“葡糖酰胺”)的N-酰基N-烷基衍生物。

该洗涤剂可以含有0-65％的洗涤助剂或络合剂例如沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸酯，碳酸盐，柠檬酸盐，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

该洗涤剂可以包含一或多种聚合物。例子有羧甲基纤维素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。

该洗涤剂可以含有漂白体系，该漂白体系可以包括H₂O₂来源物质例如过硼酸盐或过碳酸盐，这些物质又可以与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰羟苯磺酸盐结合。或者，该漂白体系可以含有例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。

本发明洗涤剂组合物中的酶可以通过使用常规稳定剂来稳定，例如多元醇例如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且该组合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述的方法配制。

该洗涤剂还可以含有其它常规去污成分，例如织物调理剂，其包括粘土、发泡增效剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、光漂白剂、增溶剂、晦暗抑制剂或香料。

目前我们正在考虑，在该洗涤剂组合物中加入任何酶，尤其是本发明的酶，加入量为每升洗涤液中加入相当于0.01-100mg的酶蛋白，优选每升洗涤液中加入0.05-5mg的酶蛋白，尤其是每升洗涤液中加入0.1-1mg的酶蛋白。

另外可以将本发明的酶加入WO 97/07202中所公开的洗涤剂制品中，其中WO 97/07202在此以参考文献方式并入。

在下述实施例中对本发明进行了更为详细的描述，这些实施例并不旨在以任何方式对本发明要求保护的范围进行限制。

在洗涤剂组合物中，缩写的成分标识符具有以下含义：

LAS：线性C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS：牛油烷基硫酸钠

XYAS：C_1X-C_1Y烷基硫酸钠

SS：式2-丁基辛酸的次级肥皂表面活性剂(secondary soapsurfactant)

25EY：与平均Y摩尔的环氧乙烷缩合的C₁₂-C₁₅主要是线性的伯醇

45EK：与平均Y摩尔的环氧乙烷缩合的C₁₄-C₁₅主要是线性的伯醇

XYEZS：每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C_1X-C_1Y烷基硫酸钠

Nonionic：由BASF GmbH以商品名Plurafax LF404出售的、平均乙氧基化度为3.8、平均丙氧基化度为4.5的C₁₃-C₁₅混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇

CFAA：C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖胺

TFAA：C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖胺

Silicate：无定形硅酸钠(SiO₂∶Na₂O比率＝2.0)

NaSKS-6：式δ-Na₂Si₂O₅的结晶层状硅酸盐

Carbonate：无水碳酸钠

Phosphate：三磷酸钠

MA/AA：1∶4马来酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量约为80,000

Polyacrylate：由BASF Gmbh以PA30商品名出售的平均分子量为8,000的聚丙烯酸匀聚物

Zeolite A：式Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂·27H₂O的水合硅酸铝钠，其初级粒子大小在1至10微米范围内

Citrate：二水合柠檬酸三钠

Citric：柠檬酸

Perborate：无水过硼酸钠一水合物漂白剂，实验式为NaBO₂·H₂O₂

PB4：无水过硼酸钠四水合物

Percarbonate：实验式为2Na₂CO₃·3H₂O₂的无水过碳酸钠漂白剂

TAED：四乙酰基乙二胺

CMC：羧甲基纤维素钠

DETPMP：二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto以Dequest 2060商品名出售

PVP：聚乙烯吡咯烷酮聚合物

EDDS：乙二胺-N，N’-二丁二酸，钠盐形式的[S，S]异构体

Suds抑制剂：25％Mpt(熔点)为50℃的石蜡，17％疏水硅石，58％石蜡油

粒状Suds抑制剂：12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％粒状淀粉

Sulphate：无水硫酸钠

HMWPEO：高分子量聚环氧乙烷

TAE 25：乙氧基化牛油醇(25)

洗涤剂实施例I

可按如下制备本发明粒状织物清洁组合物：

线性C₁₂烷基苯磺酸钠 6.5

硫酸钠 15.0

Zeolite A 26.0

次氮基三乙酸钠 5.0

酶 0.1

PVP 0.5

TAED 3.0

硼酸 4.0

Perborate 18.0

苯酚磺酸盐 0.1

次要成分至 100％

洗涤剂实施例II

根据本发明的致密粒状织物清洁组合物(密度800g/l)可制备如下：

45AS 8.0

25E3S 2.0

25E5 3.0

25E3 3.0

TFAA 2.5

Zeolite A 17.0

NaSKS-6 12.0

柠檬酸 3.0

Carbonate 7.0

MA/AA 5.0

CMC 0.4

酶 0.1

TAED 6.0

Percarbonate 22.0

EDDS 0.3

粒状suds抑制剂 3.5

水/次要成分至100％

洗涤剂实施例III

根据本发明在有色织物洗涤中特别有用的粒状织物清洁组合物可制备如下：

LAS 10.7 -

TAS 2.4 -

TFAA - 4.0

45AS 3.1 10.0

45E7 4.0 -

25E3S - 3.0

68E11 1.8 -

25E5 - 8.0

Citrate 15.0 7.0

Carbonate - 10.0

柠檬酸 2.5 3.0

Zeolite A 32.1 25.0

Na-SKS-6 - 9.0

MA/AA 5.0 5.0

DETPMP 0.2 0.8

酶 0.10 0.05

Silicate 2.5 -

Sulphate 5.2 3.0

PVP 0.5 -

聚(4-乙烯基吡啶) - 0.2

-N-氧化物/乙烯基咪唑与

乙烯基吡咯烷酮的共聚物

Perborate 1.0 -

苯酚磺酸盐 0.2 -

水/次要成分至100％

洗涤剂实施例IV

根据本发明提供“通过洗涤而软化”的能力的粒状织物清洁组合物可制备如下：

45AS - 10.0

LAS 7.6 -

68AS 1.3 -

45E7 4.0 -

25E3 - 5.0

氯化椰油烷基-二 1.4 1.0

甲基羟乙基铵

Citrate 5.0 3.0

Na-SKS-6 - 11.0

Zeolite A 15.0 15.0

MA/AA 4.0 4.0

DETPMP 0.4 0.4

Perborate 15.0 -

Percarbonate - 15.0

TAED 5.0 5.0

绿土粘土 10.0 10.0

HMWPEO - 0.1

酶 0.10 0.05

Silicate 3.0 5.0

Carbonate 10.0 10.0

粒状suds抑制剂 1.0 4.0

CMC 0.2 0.1

水/次要成分至100％

洗涤剂实施例V

根据本发明重垢型液体织物清洁组合物可制备如下：

LAS酸形式 - 25.0

柠檬酸 5.0 2.0

25AS酸形式 8.0 -

25AE2S酸形式 3.0 -

25AE7 8.0 -

CFAA 5

DETPMP 1.0 1.0

脂肪酸 8 -

油酸 - 1.0

乙醇 4.0 6.0

丙二醇 2.0 6.0

酶 0.10 0.05

氯化椰油烷基二 - 3.0

甲基羟乙基铵

绿土粘土 - 5.0

PVP 2.0 -

水/次要成分至100％

粉状自动洗碗组合物I

非离子表面活性剂 0.4-2.5％

硅酸钠 0-20％

二硅酸钠 3-20％

三磷酸钠 20-40％

碳酸钠 0-20％

过硼酸钠 2-9％

四乙酰基乙二胺(TAED) 1-4％

硫酸钠 5-33％

酶 0.0001-0.1％

粉状自动洗碗组合物II

非离子表面活性剂 1-2％

(例如脂肪醇乙氧基化物)

二硅酸钠 2-30％

碳酸钠 10-50％

磷酸钠 0-5％

二水合柠檬酸三钠 9-30％

次氮基三乙酸钠(NTA) 0-20％

一水合过硼酸钠 5-10％

四乙酰基乙二胺(TAED) 1-2％

聚丙烯酸共聚物 6-25％

(例如马来酸/丙烯酸共聚物)

酶 0.0001-0.1％

香料 0.1-0.5％

水 5-10

粉状自动洗碗组合物III

非离子表面活性剂 0.5-2.0％

二硅酸钠 25-40％

柠檬酸钠 30-55％

碳酸钠 0-29％

碳酸氢钠 0-20％

一水合过硼酸钠 0-15％

四乙酰基乙二胺(TAED) 0-6％

马来酸/丙烯酸共聚物 0-5％

粘土 1-3％

聚氨基酸 0-20％

聚丙烯酸钠 0-8％

酶 0.0001-0.1％

粉状自动洗碗组合物IV

非离子表面活性剂 1-2％

沸石MAP 15-42％

二硅酸钠 30-34％

柠檬酸钠 0-12％

碳酸钠 0-20％

一水合过硼酸钠 7-15％

四乙酰基乙二胺(TAED) 0-3％

聚合物 0-4％

顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物 0-5％

有机膦酸酯 0-4％

粘土 1-2％

酶 0.0001-0.1％

硫酸钠余量

粉状自动洗碗组合物V

非离子表面活性剂 1-7％

二硅酸钠 18-30％

柠檬酸三钠 10-24％

碳酸钠 12-20％

单过硫酸盐(Monopersulphate) 15-21％

(2KHSO₅·KHSO₄·K₂SO₄)

漂白稳定剂 0.1-2％

顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物 0-6％

二亚乙基三胺 0-2.5％

五乙酸盐，五钠盐

酶 0.0001-0.1％

硫酸钠，水余量

含清洁表面活性剂体系的粉状及液体洗碗组合物VI

非离子表面活性剂 0-1.5％

十八烷基二甲基胺N-氧化物二水合物 0-5％

十八烷基二甲基胺N-氧化物二水合物和十 0-4％

六烷基二甲基胺N-氧化物二水合物的

80∶20重量C18/C16共混物

无水十八烷基二(羟乙基)胺N-氧化物和 0-5％

无水十六烷基二(羟乙基)胺N-氧化物的

70∶30重量C18/C16共混物

平均乙氧基化度为3的 0-10％

乙氧基C₁₃-C₁₅烷基硫酸酯

平均乙氧基化度为3的 0-5％

乙氧基C₁₂-C₁₅烷基硫酸酯

平均乙氧基化度为12的 0-5％

乙氧基化C₁₃-C₁₅醇

平均乙氧基化度为9的 0-6.5％

乙氧基化C₁₂-C₁₅醇混合物

平均乙氧基化度为30的 0-4％

乙氧基化C₁₃-C₁₅醇混合物

二硅酸钠 0-33％

三聚磷酸钠 0-46％

柠檬酸钠 0-28％

柠檬酸 0-29％

碳酸钠 0-20％

一水合过硼酸钠 0-11.5％

四乙酰基乙二铵(TAED) 0-4％

顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物 0-7.5％

硫酸钠 0-12.5％

酶 0.0001-0.1％

无水液体自动洗碗组合物VII

液态非离子表面活性剂 2.0-10.0％

(例如脂肪醇乙氧基化物)

碱金属硅酸盐 3.0-15.0％

碱金属磷酸盐 20.0-40.0％

选自高级二醇、聚二醇、 25.0-45.0％

多氧化物、二醇醚的

液体载体

稳定剂(例如 0.5-7.0％

磷酸和C₁₆-C₁₈烷醇的偏酯)

泡末抑制剂(例如硅氧烷) 0-1.5％

酶 0.0001-0.1％

无水液体自动洗碗组合物VIII

液态非离子表面活性剂 2.0-10.0％

(例如脂肪醇乙氧基化物)

硅酸钠 3.0-15.0％

碱金属碳酸盐 7.0-20.0％

柠檬酸钠 0.0-1.5％

稳定体系(例如磨碎的硅氧烷与低 0.5-7.0％

分子量二烷基乙二醇醚混合物)

低分子量聚丙烯酸酯聚合物 5.0-15.0％

粘土凝胶增稠剂(例如皂土) 0.0-10.0％

羟丙纤维素聚合物 0.0-0.6％

酶 0.0001-0.1％

选自高级二醇、聚二醇、余量

多氧化物、二醇醚的液体载体

触变性液体自动洗碗组合物IX

C₁₂-C₁₄脂肪酸 0-0.5％

嵌段共聚物表面活性剂 1.5-15.0％

柠檬酸钠 0-12％

三聚磷酸钠 0-15％

碳酸钠 0-8％

三硬脂酸铝 0-0.1％

异丙基苯磺酸钠 0-1.7％

聚丙烯酸酯增稠剂 1.32-2.5％

聚丙烯酸钠 2.4-6.0％

硼酸 0-4.0％

甲酸钠 0-0.45％

甲酸钙 0-0.2％

正癸基联苯氧化物二磺酸钠 0-4.0％

单乙醇胺(MEA) 0-1.86％

氢氧化钠(50％) 1.9-9.3％

1，2-丙二醇 0-9.4％

酶 0.0001-0.1％

Suds抑制剂、染料、香料、水余量

液体自动洗碗组合物X

脂肪醇乙氧基化物 0-20％

脂肪酸酯磺酸盐 0-30％

十二烷基硫酸钠 0-20％

烷基多苷 0-21％

油酸 0-10％

一水合二硅酸钠 18-33％

二水合柠檬酸钠 18-33％

硬脂酸钠 0-2.5％

一水合过硼酸钠 0-13％

四乙酰基乙二铵(TAED) 0-8％

顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物 4-8％

酶 0.0001-0.1％

含被保护漂白颗粒的液体自动洗碗剂组合物XI

硅酸钠 5-10％

焦磷酸四钾 15-25％

三磷酸钠 0-2％

碳酸钾 4-8％

被保护漂白颗粒，例如氯 5-10％

聚合增稠剂 0.7-1.5％

氢氧化钾 0-2％

酶 0.0001-0.1％

水余量

XII：如I、II、III、IV、VI和X中所描述的自动洗碗组合物，其中以过碳酸盐代替过硼酸盐。

XIII：如I-VI中所描述的自动洗碗组合物，另外还含有锰催化剂。锰催化剂，例如，可以是在“用于低温漂白的有效锰催化剂”(Nature， (1994)，369，637-639)中所描述的化合物之一。

材料和方法

纺织品

来源于WFK Testgewbe GmbH(Christenfeld 10，D-41379Brgüggen-Bracht，德国)的WFK10N标准织物片(含蛋渍)。

菌株：

枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen等，1990)。

迟缓芽孢杆菌309和147是保藏在NCIB且编号为NCIB 10309和10147的迟缓芽胞杆菌的特定菌株，其描述于美国专利3,723,250，该文献以参考文献方式并入本文。

大肠杆菌MC 1000(M.J.Casadaban和SN.Cohen(1980)；分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)138179-207)通过常规方法被制备成r-、m+，其也描述于美国专利申请039,298.中。

质粒：

pJS3(SEQ ID NO：60)：大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，含有编码枯草杆菌酶309的合成基因(由Jacob Schiфdt等人描述于“蛋白质和肽通讯”(Protein and peptide letters)3：39-44(1996)中)。

pSX222：枯草芽孢杆菌表达载体(描述于WO 96/34946中)。

普通分子生物学方法：

除非另有说明，DNA操作和转化采用分子生物学的标准方法来进行(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等(编)″现代分子生物学实验指南″.John Wileyand Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编)″芽胞杆菌的分子生物学方法″.John Wiley and Sons，1990).

DNA操作用的酶依据供应商的说明书进行使用。

DNA操作用的酶

除非另有说明，所有DNA处理用的酶例如限制性核酸内切酶，连接酶等均从New England Biolabs公司获得。

蛋白水解活性

在本发明的上下文中，蛋白水解活性以Kilo NOVO蛋白酶单位(KNPU)表示。该活性的测定是相对于酶标准进行的，并且以标准条件下蛋白水解酶对二甲基酪蛋白的消化为基础，所述标准条件是50℃、pH 8.3、反应时间9分钟、测量时间3min。文件AF 220/1可从Novo Nordisk A/S，丹麦索取获得，此文件以参考文献方式并入本文。

GU是甘氨酸单位，定义为在标准条件下，40℃孵育15分钟时，以N-乙酰酪蛋白作为底物产生相当于1mmole甘氨酸的NH₂基团量的蛋白水解酶活性。

酶活性也可以采用PNA实验，根据与可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基酚的反应来测定，该方法描述于美国石油化工产品学会杂志(Journal of American Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，LA.，(1988)。

发酵

用于生产枯草杆菌酶的发酵在含有100ml BPX培养基的500ml带挡板的锥形瓶中于30℃在旋转摇床(300r，p.m)上进行5天。

因此为了制备例如2升细菌培养液，20个锥形瓶同时进行发酵。

培养基：

BPX培养基成分(每升)

马铃薯淀粉 100g

碾碎的大麦 50g

大豆粉 20g

Na₂HPO₄x12H₂O 9g

Pluronic 0.1g

酪蛋白酸钠 10g

该培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，并且该培养基通过120℃加热45分钟进行灭菌。灭菌后通过加入NaHCO₃至0.1M将培养基的pH调整到9。

实施例1

酶变体的构建和表达：

定点诱变：

含有特定插入和含有特定替代的本发明枯草杆菌酶309

定向位点变体可以通过DNA片段的传统克隆方法制备(Sambrook等.，分子克隆，实验室手册，第二版.，冷泉港，1989)，其中所述DNA片段是通过含有目的插入片段之寡核苷酸的PCR扩增所产生的(见下文)。

模板质粒DNA是pJS3，或其含有枯草杆菌酶309变体的类似物。

通过寡核苷酸指导的诱变导入插入而和替代物以构建变异体。

将该枯草杆菌酶309变体转化到大肠杆菌中。通过限制性核酸内切酶消化、DNA片段的纯化、连接以及枯草芽孢杆菌的转化，将从这些大肠杆菌转化体的过夜培养物中纯化的DNA转化到枯草芽孢杆菌中。枯草芽孢杆菌的转化按Dubnau等，1971，分子生物学杂志.56，第209-221页所述的方法进行。

用于在特定区域导入插入和替代的定点诱变：

用于进行定点诱变的整个策略是：

合成对应于插入和替代位点两侧DNA序列的诱变引物(寡核苷酸)，由定义该插入和替代片段的DNA碱基对分隔开。

随后，所获的诱变引物与修饰质粒pJS3(见上)一起用于PCR反应。纯化产生的PCR片段并在第二次PCR反应中延伸该片段，再次纯化产生的PCR片段，并将其克隆至大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体中(见下文)，或者再在第三次PCR反应中延伸该片段，之后用核酸内切酶进行消化并克隆至大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体中(见下文)。PCR反应在常规的条件下进行。

通过此策略，在

中构建了插入和替代，其中按照下表导入了插入和替代。列出了每个PCR步骤使用的引物及所利用的克隆位点。

根据以上策略的详细实例如下：

向

导入了两个插入和一个替代，其中插入分别被导入到第99位(*99aD)与第217位(*217aP)，替代被导入到S99A位(见下)。

第99位的插入和替代在PCR反应用反向引物(5’GAG TTA AGC CCAGAA GAT GTG GAC GCG 3’(反义))(SEQ ID NO：83)和诱变引物(5’CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3’(有义))(SEQ ID NO：71)导入。

使用引物5’CAT CGA TGT ACC GTT TGG TAA GCT GGC ATA TGT TG 3’(SEQ ID NO：94)，通过第二轮PCR在第217位导入插入，使产生的PCR片段向Savinase的C端延伸。使用位于pJS3中Mlu I位点下游的引物5’AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3’(SEQID NO：105)，通过第三轮PCR使第二轮PCR产物向Savinase的C端延伸。所有的PCR反应使用质粒pJS3作为模板。经过第三轮PCR延伸了的DNA片段被克隆到修饰质粒pJS3的Sal I和Mlu I位点(见上)。

以熟知的技术将质粒DNA导入到大肠杆菌中去，对一个大肠杆菌菌落进行测序以证实所设计的突变。

用类似的方法构建所有其它变体。

为了纯化本发明的枯草杆菌酶变体，用含有本发明变体的枯草芽孢杆菌pJS3表达质粒转化感受态枯草芽孢杆菌菌株，并按上述方法在含有10μg/ml氯霉素(CAM)的培养基中进行发酵。

引物和克隆位点：

变体	第1步 PCR引物	第2步 PCR引物	第3步 PCR	克隆位点
					S99SR+S99T	有义：(5′ CAG AAG ATG TGG ACG CGC TTG 3′) (SEQ ID NO：2) 反义： (5′TGA ACC GCT GGT GGG GCC TAG GAC TTT AAC AG 3′)(SEQ ID NO：7)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′GAT TAA CGC GTT GCC GCT TCT G 3′)(SEQ ID NO：8)	HindIII- XbaI
S99SQ+S99T	有义：(5′ CAG AAG ATG TGG ACG CGC TTG 3′) (SEQ ID NO：9) 反义： (5′GAC CGA ACC TGA ACC CTG AGT GGC GCC TAG GAC 3′)(SEQ ID NO：10)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′GAT TAA CGC GTT GCC GCT TCT G 3′)(SEQ ID NO：11)		HindIII- XbaI
					S99SD+M222S	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：12) 反义： (5′GAC CGA ACC TGA ACC ATC GCT CGC CCC TAG GAC 3′)(SEQ ID NO：13)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′AGG AGT AGC CGA CGA TGT ACC GTT TAA GC 3′) (SEQ ID NO：14)	SalI-MluI
L96LA+A98T+A108C+A138C	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：15) 反义： (5′CCA TTC CAA TCC CTG GCA AAT CGA GCT GAC CGA ACC TGA ACC GCT GGT ACC CGC TAG GAC TTT AAC	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′AAC GCC TCT AGA AGT CGC GCT ATT AAC ACA TTG CTC GAG TGT GG 3′)(SEQ ID NO：18)	有义：(第2 步PCR的产物) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：19)	SalI-MluI

	AGC G 3′) (SEQ ID NO：17
				A98AT+G97D	有义：(5′ CAG AAG ATG TGG ACG CGC TTG 3′) (SEQ ID NO：20) 反义： (5′AAC CGC TGG TGG CGT CTA GGA CTT TAA CAG CG 3′)(SEQID NO：21)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′GAT TAA CGC GTT GCC GCT TCT G 3′)(SEQ ID NO：22)	HindIII- XbaI
A98AT+G97E	有义：(5′ CAG AAG ATG TGG ACG CGC TTG 3′) (SEQ ID NO：23) 反义： (5′AAC CGC TGG TGG CTT CTA GGA CTT TAA CAG CG 3′)(SEQ ID NO：24)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′GAT TAA CGC GTT GCC GCT TCT G 3′)(SEQ ID NO：25)	HindIII- XbaI

S99SA	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：26) 反义： (5′ACC GAA CCT GAA CCT GCG CTC GCC CCT AGG 3′) (SEQ ID NO：28)	反义： K828		HindIII- XbaI
					S99SE+S99T	有义：(5′ CAG AAG ATG TGG ACG CGC TTG 3′) (SEQ ID NO：29) 反义： (5′GAC CGA ACC TGA GCC CTC GGT GGC GCC TAG GAC 3′)(SEQ ID NO：30)	反义： (5′GAT TAA CGC GTT GCC GCT TCT G 3′)(SEQ ID NO：31)	HindIII- XbaI
S99SD+S99A+A133E	有义：(5′ CCC TTC GCC AAG TGA GAC TCT CGA GCA AGC TG 3′) (SEQ ID NO：32) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT	有义：(5′ AAA GTC CTA GGG GCC GCC GAC GGT TCA GGT TCG GTC AGC 3′)(SEQ ID NO：34) 反义：(第1 步PCR的产物)	有义：：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：35) 反义：(第2 步PCR的产物)	SalI-MluI

	TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：33)
					S99SD+S99A+T143K	有义：(5′ TGT TAA TAG CGC GAA ATC CAG AGG CGT TCT TG 3′) (SEQ ID NO：36) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：37)	有义：(5′ AAA GTC CTA GGG GCC GCC GAC GGT TCA GGT TCG GTC AGC 3′)(SEQ ID NO：39) 反义：(第1 步PCR的产物)	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：40) 反义：(第2 步PCR的产物)	SalI-MluI
S99SD+S99A+S216SP	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：41) 反义： (5′CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′)(SEQ ID NO：42)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′GAT GTA CCG TTT AAA GGG CTG GCA TAT GTT GAA CC 3′)(SEQ ID NO：43)	有义：(第2 步PCR的产物) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：44)	SalI-MluI
					S99SD+S99A+S216SDP	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)SEQ ID NO：45) 反义： (5′CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C) SEQ ID NO：46)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′GTA CCG TTT AAA GGA TCG CTG GCA TAT GTT GAA CC 3′)(SEQ ID NO：47)	有义：(第2 步PCR的产物) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：48)	SalI-MluI
S99SD+S99A+P129PD	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：50) 反义： (5′CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′)(SEQ ID NO：51)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′GTGTGG CAC TTG GCG AGT CAG GGC TTC CTA AAC TC 3′)(SEQ ID NO：52)	有义：(第2 步PCR的产物) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：53)	SalI-MluI
					S99SD+S99SA+P129PR	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT	反义： (5GTG TGG CACT TGG CGA	有义：(第2 步PCR的产物)	SalI-MluI

	GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：54) 反义： (5′CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′)(SEQ ID NO：55)	TCG AGG GCT TCC TAA ACT C 3′)(SEQ ID NO：56)	反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：57)
					S99SD+S99A+L217F+ A228V+A230V	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：58) 反义： (5′CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′)(SEQ ID NO：59)	反义： (5′(AAG GGC GGC CAC ACC TAC AAC ATG AGG AGT AGC CAT CGA TGT ACC GTT AAA GCT GGC ATA TGT TGA AC 5′)(SEQ ID NO：61)	有义：(第2 步PCR的产物) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：62)	SalI-MluI
S99SD+S99A+L217LP	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：63) 反义： (5′CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′)(SEQ ID NO：64)	反义： (5`CAT CGA TGT ACC GTT TGG TAA GCT GGC ATA TGT TG 3′)(SEQ ID NO：65)	有义：(第2 步PCR的产物) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′) (SEQ ID NO：66)	SalI-MluI

	NO：100)
				A98AT+Y167A+R170S+ A194P	有义：(5′ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3′)(SEQ ID NO：102) 反义： (5′TGT GTA AAG TAA CTC ATT TGG TGA GCC AG 3′) (SEQ ID NO：103)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′CCG ACT GCC ATT GCG TTC GCA TAC GAC GCC GGG GCG CTG ATT GAG CCT GCA C 3′)(SEQ ID NO：104)	有义：(第2 步PCR的产物) 反义： (5′CTG CAC GTT TAC CCC GGG TGC GAC AAT GTC AAG GCC TGG GCC ATA CTG TG 3′)(SEQ ID NO：3)	SalI-XmaI
S99SD+L42LN+S99A	有义：(5′ CTC GAT ACA GGG ATA TCC ACT CAT CCA GAT CTA AAC AAT ATT CGT GGT GGC G 3′)(SEQ ID NO：4) 反义： (5′CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′)(SEQ ID NO：5)	有义：(第1 步PCR的产物) 反义： (5′AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3′)(SEQ ID NO：6)	EcoRV-MluI

实施例2

酶变体的纯化：

本方法涉及用于在芽孢杆菌宿主细胞中生产本发明枯草杆菌酶的2升级发酵的纯化。

大约1.6升的发酵培养液在1升的离心杯中5000rpm离心35分钟。上清液用10％醋酸调节pH至6.5并用Seitz Supra S100过滤板过滤。

滤出液使用配有Amicon SlYlO UF柱体的Amicon CH2A UF装置浓缩到大约400ml。离心和过滤UF浓缩液，之后室温下在pH7的杆菌肽(Bacitracin)亲和柱上进行吸附。使用含有25％2-丙醇、1M氯化钠和0.01二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙(调节pH至7)的缓冲液，室温下从该杆菌肽柱中洗脱该蛋白酶。

将来自杆菌肽纯化步骤的具有蛋白酶活性的组分合并，并施加至经如下缓冲液平衡的750ml Sephadex G25柱中(5cm直径)，该缓冲液含有0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙，调节pH至6.5。

合并来自Sephadex G25柱的具有蛋白水解活性的组分，并施加至经如下缓冲液平衡的150ml CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱中(5cm直径)，该缓冲液含有0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙，调节pH至6.5。

使用具有0-0.1M氯化钠线性梯度的2升相同缓冲液(对于枯草杆菌蛋白酶147为0-0.2M氯化钠)洗脱该蛋白酶。

在最后的纯化步骤中，合并含有蛋白酶的来自CM Sepharose柱的组分，并在配有GR81PP膜的Amicon超滤小室(来自Danish SugarFactories公司)中浓缩。

通过使用实施例1中的构建和发酵技术，以及上述的分离操作，我们生产和分离了下列枯草杆菌蛋白酶309变体：

第96位插入变体：

L96LA

L96LA+A98T+A108C+A138C

第97位插入变体：

G97GI+S99T

第98位插入变体：

A98AS+A133E+T143K

A98AT+G97D

A98ATGTG

A98AG

A98AS+R45K+S105G

A98AT+G97E

A98ASGTG

A98AP+A98G+S99A

A98AT+Y167A+R170S+A194P

A98AI+A98G+S99H+G100S+S101A

第99位插入变体：

S99SD+S99A

S99SA

S99SE+S99T

S99SD+S99A+A133E

S99SD+S 99A+T143K

S99SD

S99SE

S99SD+S99A+S216SP

S99SD+S99A+S216SDP

S99SD+S99A+P129PD

S99SD+S99A+P129PR

S99SD+S99A+L217F+A228V+A230V

S99SD+S99A+L217LP

S99SD+S 99A+L42LN

S99SR+S99T

S99SQ+S99T

S99SD+M222S

S99SD+N76D+A194P+A230V

S99SN

S99SD+S99A+P131T

实施例3

“模式洗涤剂洗涤性能测试”：

为了鉴定所选枯草杆菌酶变体在标准洗涤剂组合物中的洗涤性能，可以采用以下实验条件进行标准洗涤实验：

洗涤剂模式洗涤剂

洗涤剂剂量 4.0g/l

pH 10.1

洗涤时间 20min

温度 30℃

水硬度 15°dH

酶浓度 10nm(在洗涤剂溶液中)

测试体系 10ml大口杯带搅动棒

织物/体积 5块织物片(

)/50ml洗涤剂溶液

测试材料 WFK10N(带蛋渍)

模式洗涤剂的组成如下：

6.2％ LAS(Nansa 80S)

2％ C₁₆-C₁₈脂肪酸钠盐

4％非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

22％沸石P

10.5％ Na₂CO₃

4％ Na₂Si₂O₅

2％羧甲基纤维素(CMC)

6.8％丙烯酸酯液体CP540％

20％过硼酸钠(实验式为NaBO₂·H₂O₂)

0.2％ EDTA

21％ Na₂SO₄

水(平衡)

通过加入HCl或NaOH调节洗涤剂的pH值至10.1。通过向测试体系中加入CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺∶Mg²⁺＝4∶1)调节水的硬度至15dH。洗涤之后，以自来水冲洗织物片并进行空气干燥。

使用Macbeth ColorEye 7000光度计(Macbeth，Kollmorgen仪器公司分部，德国)在460nm下对测试材料进行反射率(R_variant)的测定。测定按照产商说明书进行。

为了测定空白值，进行了类似没有加酶的洗涤试验。其后进行的反射率(R_blank)的测定与上面描述的一样。

然后进行如上所描述的参照试验，在其中测试亲本酶的洗涤性能。其后进行的反射率(R_parent)的测定与上面描述的一样。

采用按照以下公式定义的性能因子(P)估计洗涤性能：

P＝(R_variant-R_blank)-(R_parent-R_blank)

＝R_variant-R_parent.

采用以上测试方法得到了以下结果：

很明显，与亲本枯草杆菌酶即相比较，枯草杆菌酶变体表现出对蛋渍改进的洗涤性能。

实施例4

“蛋抑制分析”

以下抑制分析基于的原理是：待测定的枯草杆菌酶变体将催化肽 -pNA键水解，因而释放出黄色的pNA，后者可在405nm很方便地检测到。以在一定时间后所释放pNA的数量直接衡量枯草杆菌酶的活性。通过分别进行这样的含抑制剂和无抑制剂的水解试验，就可以得到某种枯草杆菌酶变体被抑制程度的定量测定。

反应条件：

酶浓度	0.0003mg/ml
		IV-0型胰蛋白酶抑制剂浓度	0.0015mg/ml
初始底物浓度	0.81mM
		反应时间	11min
测定温度	25℃
		测定pH值	8.6
测定吸光度的波长	405nm

测定溶液：

底物溶液(2nM)：500mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶于4ml DMSO(200mM)。用下述缓冲液将此溶液稀释100倍。所得底物溶液中底物的浓度为2mM。

抑制剂溶液(0.005mg/ml)：5mgIV-0型胰蛋白酶抑制剂(Sigma T-1886)溶于10ml水中。用下述缓冲液将此溶液稀释100倍。所得抑制剂溶液中抑制剂的浓度为0.005mg/ml。

酶溶液(0.001mg/ml)：1mg酶溶于10ml水中。用下述缓冲液将此溶液稀释100倍。所得酶溶液中酶浓度为0.001mg/ml。

缓冲液(pH8.6)：15.7mg Tris溶于适量的水后加入0.75ml 30％(W/V)BRIJ(BRIJ 35聚氧乙烯十二烷基醚，30％(W/V)，Sigma Cat.No.430AG-6)。以4M NaOH调节pH值至8.6，以水将溶液稀释至1升。

有抑制剂的分析

将1体积单位(例如80μl)抑制剂溶液与1体积单位(例如80μl)酶溶液在适合的反应容器(例如，分光光度计小室或微滴定板)中混合，然后在25℃平衡15分钟。向反应容器中加入1.375体积单位 (例如110μl)底物溶液之后监测405nm吸光度11分钟(例如每10秒或30秒测定一次)。用线性回归分析计算吸光度曲线的斜率。以α_inhibitor表示吸光度曲线的斜率。

无抑制剂的分析

将1体积单位(例如80μl)缓冲液与1体积单位(例如80μl)酶溶液在适合的反应容器(例如，分光光度计小室或微滴定板)中混合，然后在25℃平衡15分钟。向反应容器中加入1.375体积单位(例如110μl)底物溶液之后监测405nm吸光度11分钟(例如每10秒或30秒测定一次)。用线性回归分析计算吸光度曲线的斜率。以α表示吸光度曲线的斜率。

空白

将1体积单位(例如80μl)抑制剂溶液与1体积单位(例如80μl)缓冲液在适合的反应容器(例如，分光光度计小室或微滴定板)中混合，然后在25℃平衡15分钟。向反应容器中加入1.375体积单位(例如110μl)底物溶液之后监测405nm吸光度11分钟。这些测定值不用于计算，而仅作为缓冲液和/或底物溶液无酶加入的对照。

残留活性(RA)的计算

按照下列公式计算残留酶活性(RA)：

RA＝(α_inhibitor/α)×100％

通过以上测定，获得了以下结果：

很明显，与亲本枯草杆菌酶即相比枯草杆菌酶变体被抑制的程度要小得多。

实施例5

本发明枯草杆菌酶变体在自动洗碗(ADW)中的性能

采用标准条件在商业来源家庭洗碗组合物(Somat Turbo，来源于Henkel Washimittel GmbH)中对本发明枯草杆菌酶变体在自动洗碗(ADW)中的性能进行了测试。所用的污物是覆盖在钢盘上的鸡蛋/牛奶混合物。此外，还加入了含各种食品的底货污物(ballast soil)。

洗涤剂 Somat Turbo

洗涤剂剂量 4.0g/l

pH 10.7(按原值)

水硬度 3°dH(机械离子交换器)

温度 55℃

酶浓度 20nM与40mM，基于洗碗机中洗涤用水总体积

测试方法如下所述沾有鸡蛋/奶油的钢盘

洗碗机 Cylinda Compact

洗涤程序按程序4，不进行预先冲洗

材料

220ml全脂牛奶

15个鸡蛋，中等大小

钢盘，直径18cm

将Somat Turbo洗碗组合物在微波炉中于85℃下加热5分钟以使组合物中的酶失活。

弄脏钢盘

在Braun UK20厨机中将220ml全脂牛奶与15个生鸡蛋混合2分钟。过滤后，以在混合物浸泡的方式使不锈钢盘弄脏。

使盘子在室温下直立过夜干燥。然后将干燥后的盘子于120℃下加热45分钟以使其表面的蛋白质变性。

ADW实验

对于每个实验，在Cylinda Compact机器中洗涤10个没有预洗(程序4)的污盘。除了污盘以外，机器中还塞有10个瓷盘，4个玻璃杯，4个茶杯及16件刀具。

此外，还向机器中加入了50g底货浆。该浆的组分如下：

马铃薯淀粉(5.43％)，小麦面粉(4.38％)，植物油(4.32％)，人造黄油(4.32％)，猪油(4.32％)，奶油(8.76％)，全脂牛奶(8.76％)，鸡蛋(8.76％)，蕃茄酱(3.00％)，烧烤调味酱(2.19％)，芥末(4.00％)，安息香酸(0.73％)，水(3mM Ca²⁺+Mg²⁺)(36.71％)。

测定和计算

以Minolta Chroma计(型号：CR-300)测定盘子6个不同部位的光反射值(R值)。对干净的盘子(R_干净)、加热后的污盘(R_弄污)及洗涤后的盘子(R_洗后)进行测定。

按照下列公式计算除去了的蛋白质膜(％RPF)：

％RPF＝100％×(R_洗后-R_弄污)/(R_干净-R_弄污)

采用上述测定方法，获得了以下结果(±表示标准差)：

很明显，与

相比，本发明的变体具有更优良的性能。

实施例6

本发明的枯草杆菌酶变体在商业粉状洗涤剂中的洗涤性能

为了评价所选枯草杆菌酶变体在商业洗涤剂组合物中的洗涤性能，采用以下试验条件进行了标准洗涤实验：

洗涤剂剂量 4g/l

洗涤温度 30℃

洗涤时间 20min

水硬度 15°dH(Ca²⁺∶Mg²⁺＝4∶1)

pH 没有调节

酶浓度 1、2、5、10、30nM

测试体系 150ml大口玻璃杯，带搅动棒

织物/体积 5块织物片

/50ml洗涤剂

测试材料 WFK10N(带蛋渍)

所采用的洗涤剂来源于德国的超市(Persil Megapearls)。在使用前用微波炉(5分钟，85℃)使洗涤剂中的所有酶活性丧失。

按本文实例3进行反射率的测定。

数据(R值)按以下方法估算：

比

具有更高R值的变体计分值为1

比具有更低R值的变体计分值为-1

R值与差不多的的变体计分值为0

结果：

很明显，与

相比，枯草杆菌酶变体在商业洗涤剂中表现出了改进的洗涤性能。

Claims

1.枯草杆菌酶变体在从待洗衣物或从硬表面除去蛋渍中的应用，此枯草杆菌酶变体选自在BASBPN编号的第99和100位之间含有至少一个额外氨基酸残基和进一步含有至少一个额外的修饰的变体，其中变体一在本文实施例4公开的“蛋抑制分析”中测试时一具有至少10％的残留活性。

2.根据权利要求1的应用，其中第99和100位之间的至少一个额外氨基酸残基选自：X99XD、X99XE、X99XK及X99XR。

3.根据权利要求1的应用，其中至少一个进一步的修饰选自包含以下的组：在第99位的替代，在第133位的替代，在第143位的替代，在第42和43位之间的插入，在第129和130位之间的插入，在第216和217位之间的插入，在第217和218位之间的插入，及其组合。

4.根据权利要求3的应用，其中在第99位的替代为替代为A。

5.根据权利要求3的应用，其中在第133位的替代为替代为E。

6.根据权利要求3的应用，其中在第143位的替代为替代为K。

7.根据权利要求3的应用，其中在第42和43位之间的插入为N。

8.根据权利要求3的应用，其中在第129和130位之间的插入为D或R。

9.根据权利要求3的应用，其中在第216和217位之间的插入为P或DP。

10.根据权利要求3的应用，其中在第217和218位之间的插入为P。

11.根据权利要求1-10之任意一项的应用，其中亲本枯草杆菌酶属于I-S1亚族。

12.根据权利要求11的应用，其中亲本枯草杆菌酶选自：BSS168、BASBPN、BSSDY及BLSCAR，或其保留有I-S1亚族特性的功能性变体。

13.根据权利要求1-10之任意一项的应用，其中亲本枯草杆菌酶属于I-S2亚族。

14.根据权利要求13的应用，其中所述亲本枯草杆菌酶选自：BLS147、BLSAVI、BAPB92、TVTHER及BYSYAB，或其保留有I-S2亚族特性的功能性变体。

15.根据权利要求13的应用，其中亲本枯草杆菌酶为如SEQ ID NO：1所示的BLSAVI。

16.根据权利要求13的应用，其中变体为

S99SD+S99A＝S99AD

S99SE+S99T＝S99TE

S99SD+S99A+A133E＝S99AD+A133E

S99SD+S99A+T143K＝S99AD+T143K

S99SD+S99A+S216SP＝S99AD+S216SP

S99SD+S99A+S216SDP＝S99AD+S216SDP

S99SD+S99A+P129PD＝S99AD+P129PD

S99SD+S99A+P129PR＝S99AD+P129PR

S99SD+S99A+L217F+A228V+A230V＝S99AD+L217F+A228V+A230V

S99SD+S99A+L217LP＝S99AD+L217LP

S99SD+S99A+D42DN＝D42DN+S99AD

S99SD+S99A+P131T＝S99AD+P131T

S99SD+M222S

S99SD+N76D+A194P+A230V

S99SD+L42LN，或

S99SD+S99A+L42LN。