CN108350443B - 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有黄原胶降解活性的多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同产生和使用这些多肽的方法。

Description

具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸

序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

背景技术

技术领域

本发明涉及具有黄原胶降解活性的多肽。特别地，本发明涉及糖基水解酶家族5(GH5)内的具有黄原胶降解活性的多肽，并且涉及编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同产生和使用这些多肽的方法。

相关技术说明

黄原胶是一种由细菌野油菜黄单胞菌分泌的多糖。黄原胶由野油菜黄单胞菌在水性生长介质中发酵葡萄糖、蔗糖或乳糖而产生。在发酵周期后，用异丙醇将该多糖从生长介质中沉淀，干燥，并磨成细粉。稍后，将该粉末添加至液体介质中，以形成胶质。

黄原胶由五糖亚基组成，形成纤维素主链，其三糖侧链由通过α1,3键附接到主链中的交替葡萄糖残基的甘露糖(β1,4)葡萄糖醛酸(β1,2)甘露糖组成。该生物聚合物由于其优异的假塑性，触变性和粘度而具有巨大的商业意义。

近年来，黄原胶已经被广泛地用作许多消费品中的成分，包括食品(例如，在沙拉酱(salat dressing)和乳制品中作为增稠剂)和化妆品(例如，在牙膏和化妆品中作为稳定剂和增稠剂，以阻止成分分离)和化妆品(例如，防晒霜)。

另外，黄原胶已经在石油工业中得以应用，其中黄原胶被大量使用以增稠钻井泥浆。这些流体用于将由钻头切割的固体携带回表面。当循环停止时，固体仍保持悬浮在钻井液中。水平钻井的广泛使用已经导致其使用范围的扩大。黄原胶还被添加到自固化混凝土中，包括在水下浇筑的混凝土，以增加其粘度。

黄原胶的广泛使用已导致对黄原胶的溶液或凝胶进行降解的需求。黄原胶的完全酶降解现在仍旧需要若干酶活性，包括黄原胶裂解酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。黄原胶裂解酶是切割黄原胶的β-D-甘露糖基α-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶并且已被描述于文献中。黄原胶降解酶在本领域中是已知的，例如两种分离自溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1的黄原胶裂解酶(例如，Ruijssenaars等人(1999)’A pyruvated mannose-specificxanthan lyase involved in xanthan degradation by Paenibacillus alginolyticusXL-1[在由溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1降解黄原胶中涉及的一种丙酮酸甘露糖特异性黄原胶裂解酶]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]65(6):2446-2452，和Ruijssenaars等人(2000)，’A novel gene encoding xanthan lyase of Paenibacillusalginolyticus strain XL-1[一种编码溶藻弧菌类芽孢杆菌菌株XL-1的黄原胶降解酶的新颖基因]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]66(9):3945-3950)。

糖苷水解酶是催化糖基键水解以释放更小的糖的酶。存在超过100种已经被分类的糖苷水解酶，参见Henrissat等人(1991)’A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类]’，J.Biochem.[生物化学杂志]280:309-316和Uniprot网站，www.cazy.org。糖苷水解酶家族5(GH5)包括内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)；β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)。然而，迄今为止未报道鉴定黄原胶降解酶在糖苷水解酶家族5中。

SEQ ID NO:2中的成熟肽与来自Echinicola vietnamensis的基因组的预测的内切葡聚糖酶(UNIPROT：L0FVA9)具有45％一致性并且SEQ ID NO:4中的成熟肽与来自Echinicola vietnamensis基因组的预测内切葡聚糖酶(UNIPROT：L0FVA9)有57％一致性。

SEQ ID NO:6中的成熟肽与来自Barnesiella intestinihominis的基因组的未表征的蛋白质(UNIPROT:K0WXE1)具有47％一致性。

SEQ ID NO:8中的成熟肽与来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的基因组的未表征的蛋白质(UNIPROT:M2V1S3)具有100％一致性。

发明内容

本发明提供了用于降解黄原胶的新的且改进的酶以及此类酶在如钻探和石油工业中的用途。

本发明人令人惊讶地发现了一组新的酶，该组新的酶具有黄原胶降解活性–并且其不属于任何先前已知的包含该酶活性的糖基水解酶家族。这些酶与具有黄原酸降解活性的任何已知的酶没有显着的序列相似性。

本发明提供了具有黄原胶降解活性，即，对黄原胶具有活性和/或对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的多肽。本发明进一步提供了编码这些多肽的多核苷酸。

因此，本发明提供了一种具有黄原胶降解活性的糖基水解酶家族5的多肽。更特别地，本发明提供了一种具有黄原胶降解活性的糖基水解酶家族5的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中任一项的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中任一项的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5或SEQ ID NO:7中任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中的任一项的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；

(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的具有黄原胶降解活性的多肽的片段；以及

(f)包含(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)以及N-末端和/或C-末端His-标签的多肽。

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及使用这些多肽降解黄原胶的方法(例如在用于提取石油和天然气的方法中)，例如用于控制钻井液或钻孔滤饼的粘度。

序列表概述

SEQ ID NO:1是如分离自丰佑菌科(Opitutaceae)物种的EXa基因的DNA序列。

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的EXa GH5多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是如分离自环境样品的EXb基因的DNA序列。

SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的EXb GH5多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是如分离自环境样品的EXc基因的DNA序列。

SEQ ID NO:6是如从SEQ ID NO:5推导的EXc GH5多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是如获得自公共数据库(UNIPROT M2V1S3，起源于从加拉帕戈斯裂谷热液喷口(Galapagos Rift hydrothermal vent)收集的施氏假单胞菌菌株，厄瓜多尔)的EXd基因的DNA序列。

SEQ ID NO:8是如从SEQ ID NO:7推导的EXd GH5多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是编码EXa GH5多肽的合成密码子优化的DNA。

SEQ ID NO:10是编码EXb GH5多肽的合成密码子优化的DNA。

SEQ ID NO:11是编码EXc GH5多肽的合成密码子优化的DNA。

SEQ ID NO:12是编码EXd GH5多肽的合成密码子优化的DNA。

SEQ ID NO:13是EXa GH5多肽+在大肠杆菌中表达的His亲和标签。

SEQ ID NO:14是EXb GH5多肽+在大肠杆菌中表达的His亲和标签。

SEQ ID NO:15是EXc GH5多肽+在大肠杆菌中表达的His亲和标签。

SEQ ID NO:16是EXb GH5多肽+在枯草芽孢杆菌中表达的His亲和标签。

SEQ ID NO:17是EXc GH5多肽+在枯草芽孢杆菌中表达的His亲和标签。

SEQ ID NO:18是EXd GH5多肽+在枯草芽孢杆菌中表达的His亲和标签。

SEQ ID NO:19是His亲和标签序列。

SEQ ID NO:20是克劳氏芽孢杆菌分泌信号的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21是来自类芽孢杆菌属物种的黄原胶裂解酶XLa的氨基酸序列(来自WO 2013167581的SEQ ID NO:8)。

SEQ ID NO:22是来自类芽孢杆菌属物种的黄原胶裂解酶XLb的氨基酸序列(来自WO 2013167581的SEQ ID NO:66)。

SEQ ID NO:23是来自类芽孢杆菌属物种的黄原胶裂解酶XLc的氨基酸序列(来自WO 2013167581的SEQ ID NO:68)。

SEQ ID NO:24是来自类芽孢杆菌属物种的黄原胶裂解酶XLd的氨基酸序列(来自WO 2013167581的SEQ ID NO:120)。

具体实施方式

本发明提供了具有黄原胶降解活性的GH5多肽和编码这些多肽的多核苷酸。多肽不属于已知的包含降解黄原胶的酶的GH家族。此外，黄原胶裂解酶和具有黄原胶降解活性的本发明的酶的组合显示了超过使用黄原胶裂解酶或具有黄原胶降解活性的GH5多肽的协同的改进的洗涤性能。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意思指占据同一染色体基因座的一个基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变天然地产生，并且可能导致群体内的多态性。基因突变可能是沉默的(所编码的多肽没有改变)或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意思指这样一种多核苷酸，该多核苷酸直接地指定了多肽的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

颜色澄清：在洗涤和穿着过程中，松动或破损纤维可以在织物的表面上积聚。一种后果是由于表面污染，织物的颜色看起来不太亮或不太强烈。从纺织品上除去松动或破损纤维将部分地恢复该纺织品的初始颜色和外观。如在此使用，术语“颜色澄清”意指纺织品的原始颜色的部分恢复。

对照序列：术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。这些控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。在最低限度上，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(例如纺织品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的组合物。这些术语涵盖经选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，连同餐具洗涤剂)。除了含有本发明的酶之外，该洗涤剂配制品还可以含有一种或多种另外的酶，和/或组分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂。

餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的餐用器皿，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗、所有形式的刀具(例如匙、刀、叉)、以及服务用具连同陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。

餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。

酶洗涤益处：在此将术语“酶洗涤益处”定义为将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要去污益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污物或污物非常少、阻止或减少在洗涤过程中所释放的污物再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，这些纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改进织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。

表达：术语“表达”包括涉及多肽的产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该DNA分子包含编码多肽的多核苷酸并且有效地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有黄原胶降解活性。

硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的GH5多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为一种(变体)酶(还有酶的共混物，不只是变体还有骨架，以及与某种清洁组合物组合，等)相对于亲本蛋白酶变体的洗涤性能展示出一种蛋白质变体的洗涤性能的改变，例如增加的去污。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。

分离的：术语“分离的”意思指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与它天然相关的一个或多个或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于：任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的物质经过人为改变的任何物质；或(4)相对于与它天然相关的其他组分通过增加该物质的量(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)而改变的任何物质。分离的物质可以存在于发酵液样品中，例如，可以将宿主细胞进行遗传修饰来表达本发明多肽。来自宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至802。在第二方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至808。在第三方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至800。在第四方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸1至657。本领域已知，宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两个或更多个不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有黄原胶降解活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸109至2514。SEQID NO:1的核苷酸1至108编码信号肽。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸112至2493。SEQ ID NO:3的核苷酸1至111编码信号肽。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸106至2505。SEQ ID NO:5的核苷酸1至105编码信号肽。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸109至2079。SEQ ID NO:7的核苷酸1至108编码信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

有效地连接：术语“有效地连接”意思指这样一种配置，在该配置中，一个控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，这样使得该控制序列引导该编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包]，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)的尼德尔(Needle)程序，优选地5.0.0版或更新版本中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有黄原胶降解活性的片段。

纺织品：术语“纺织品”意指任何纺织品材料，该任何纺织品材料包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料，这些材料制造的织物和由这些织物制成的产品(例如，服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非织造物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物其以及纤维素基的和非纤维素基的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如染污的家居衣物。当使用术语织物或服装时，旨在也包括广义术语纺织品。

纺织品护理益处：不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的“纺织品护理益处”对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一纺织品转移至另一纺织品或同一纺织品的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改进纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。

洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于有待清洁的物体上的污物的能力。可以通过计算如在此的’用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)’中所定义的所谓的强度值(Int)来量化洗涤性能的改进。也参见在此的实例18中的洗涤性能测试。

白度：在此将术语“白度”定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转移的着色。白度可以包括来自以下列表的一个或若干问题：着色剂或染料作用；不完全污物去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用过程中纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。

黄原胶裂解酶：在此将术语“黄原胶裂解酶”定义为一种切割黄原胶中的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶(EC 4.2.2.12)。出于本发明的目的，根据在黄原胶裂解酶活性测定中的实例中所述的程序确定黄原胶裂解酶活性。

黄原胶降解活性：在此将术语“黄原胶降解活性”定义为导致黄原胶溶液的粘度下降的能力。黄原胶溶液即使在低的聚合物浓度下也是高度粘度的，并且这种粘度与黄原胶的聚合度有关。因此，粘度下降可以用于监控黄原胶降解。使用实例6中所描述的粘度压力测定法检测粘度下降。

黄原胶降解活性包括对完整的黄原胶的活性以及对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶(改性黄原胶-参见实例8)的活性。

对黄原胶的活性：将术语“对黄原胶具有活性的GH5多肽”或一种“对黄原胶具有活性且属于GH5类的糖基水解酶的多肽”定义为一种多肽，该多肽包含一个属于GH5类的糖基水解酶的结构域，且对黄原胶具有显著活性。在本发明的一方面，对黄原胶具有活性的GH5多肽可以是具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的序列的多肽。

对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的活性将术语“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的GH5多肽”或一种“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性且属于GH5类的糖基水解酶的多肽”定义为一种多肽，该多肽包含一个属于GH5类的糖基水解酶的结构域且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶(改性黄原胶-实例8)具有显著活性。在本发明的一方面，对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的GH5多肽可以是具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的序列的多肽。

具有黄原胶降解活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有黄原胶降解活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的至少至少70％的黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的至少至少75％的黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的至少至少80％的黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的至少至少85％的黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的至少至少90％的黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的至少至少95％的黄原胶降解活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的至少至少100％的黄原胶降解活性。

在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有黄原胶降解活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至802、SEQ ID NO:4的氨基酸1至808、SEQ IDNO:6的氨基酸1至800、或SEQ ID NO:8的氨基酸1至657或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有黄原胶降解活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning,A LaboratoryManual[分子克隆实验指南]，第二版，冷泉港，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:1、3、5、或7中任一项的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的多肽或其片段可以根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有黄原胶降解活性的多肽的DNA。具体而言，此类探针可以遵循标准DNA印迹程序用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。可以使用DNA和RNA探针两者。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有黄原胶降解活性的多肽的DNA对由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该载体材料。

出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1、3、5或7中的任一项；(ii)SEQ ID NO:1、3、5或7中的任一项的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在另一个实施例中，本发明涉及一种多肽，该多肽具有黄原胶降解活性，由与SEQID NO:1、3、5、或7中的任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸标签、抗原性表位或结合结构域。SEQ IDNO:13、14和15显示了具有N-末端多组氨酸标签(His-标签)的本发明的多肽(SEQ ID NO:2、4和6)。SEQ ID NO:16、17和18显示了具有N-末端多组氨酸标签的本发明的多肽(SEQ IDNO:4、6和8)。

保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

具有黄原胶降解活性的多肽的来源

本发明的具有黄原胶降解活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。

在方面，多肽是获得自丰佑菌科物种的多肽。

可使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域已知的。然后可通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可通过利用本领域普通技术人员所知的技术(参见，例如Sambrook等人，1989，见上文)分离或克隆多核苷酸。

多核苷酸

本发明还涉及编码如在此描述的多肽的多核苷酸。在一个实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特征的克隆的DNA片段，来实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application[PCR:方法和应用指南]，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自丰佑菌科物种的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区域的等位基因变体或物种变体。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含有效地连接至一个或多个控制序列的本发明的GH5多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这个或这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可为合意的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。

该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子含有转录控制序列，其介导该多肽的表达。该启动子可为在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短的及杂合的启动子，并可从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述在Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；以及在Sambrook等人，1989，同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶–样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；和突变，截短的和杂合启动子体。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端有效地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用终止子在Romanos等人，1992，见上文中描述。

控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

该控制序列也可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子有效地连接到编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。

对于酵母宿主细胞合适的前导子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列也可为多聚腺苷化序列，与多核苷酸3’-末端有效地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号的序列。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下酶的基因获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman，1995，Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区域。多核苷酸的编码序列的5’-端可固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-末端可含有对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可需要外来的信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，见上文描述。

控制序列也可为编码处于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可从以下酶的基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。

也可为合意的是添加调节序列，所述调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调控序列有效地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的GH5多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在这些位点处的插入或取代。可替代地，多核苷酸可通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列有效地连接。

重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线状或闭合的环状质粒。

载体可为自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒一起含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

载体优选含有一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选用于曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞中的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。

选择性标记可为双选择性标记系统，如WO 2010/039889中描述的。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合入该宿主细胞基因组中，载体可依靠编码多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合入基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列一致性以增强同源重组的可能性。这些整合元件可为与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可为非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可进一步包含使该载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点；ARS1；ARS4；ARS1与CEN3的组合；及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人1991，基因98:61-67；Cullen等人1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明的GH5多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的GH5多核苷酸，该多核苷酸有效地连接于一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择会在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可为在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属、和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnauh和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或者接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见，例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.[叶线形微生物学](布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌词典]，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，剑桥，英国中进行定义的)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。如本申请中使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Skinner、Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)所描述那样定义。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢菌属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢菌、谷类镰孢菌、库威镰孢菌、大刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢菌属物种的适合方法由Malardier等人1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，在阿贝尔森，J.N.和Simon，M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司，纽约；Ito等人1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一方面，该细胞是丰佑菌科物种细胞。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生这些多肽的营养介质中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的介质中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养介质中发生，该介质包含碳和氮来源及无机盐。适合的介质可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养介质中，那么可直接从介质中回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可使用酶测定法来确定多肽的活性。

可使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养介质回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。

可通过本领域已知的多种方法纯化多肽以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification，Janson和Ryden编,VCH Publishers，纽约，1989)。

在一个替代的方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养株在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞的酶表达)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳受限的条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包含至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物。

在一方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如在此描述的，全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所描述的方法来产生。

去污剂组合物

可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗液0.0001-200mg的酶蛋白，例如0.0005-100mg的酶蛋白，优选0.001-30mg的酶蛋白，更优选0.005-8mg的酶蛋白，甚至更优选0.01-2mg的酶蛋白。

用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣粉末中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％、例如0.01％-10％、例如0.05％-5％的酶蛋白。

用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。

可以使用常规稳定试剂稳定洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配置该组合物。

在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。

该洗涤剂组合物可以包含与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的酶。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。

对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包含另外的功能性。

ADW(自动餐具洗涤)组合物可以包含与一种或多种另外的ADW组合物组分相结合的本发明的酶。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。

表面活性剂

该洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在具体实施例中，该洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何常规表面活性剂。

当包括在其中时，该洗涤剂通常将会含有按重量计约1％至约40％的阴离子表面活性剂，如约5％至约30％，包括从约5％至约15％，或从约15％至约20％，或从约20％至约25％的阴离子型表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或脂肪酸盐(皂)的二酯和单酯及其组合。

当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。

当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约0％至约10％的半极性表面活性剂。半极化表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物，及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约0％至约10％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱，如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。

助水溶剂

助水溶剂是以下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如Hodgdon和Kaler的综述，(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体&界面科学新见]，12:121-128。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶剂显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。助水溶剂常规在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。

该洗涤剂可以含有按重量计0-10％，例如按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂

该洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤去污剂中，增洁剂的水平一般为40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合试剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

该洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-50％，如约5％至约30％的洗涤剂共助洗剂。该洗涤剂组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合的共助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。

漂白系统

洗涤剂可以含有按重量计0-30％，如大约1％至大约20％的漂白系统。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化氢―尿素(1:1)、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸及盐、二过氧二羧酸、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括过氧化物基的漂白系统，这些系统可以包含例如与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。在此将使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。该漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：

(i)

(ii)

(iii)及其混合物；

其中每个R¹独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地每个R¹独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地每个R¹独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO2007/087244、WO 2007/087259、EP 1867708(维生素K)以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。

优选地，除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与一种漂白活化剂组合；以及(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

聚合物

洗涤剂可以含有按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

这些洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包含所述洗涤剂组合物的清洗液体接触时沉积在所述织物上并且因此通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO 2007/087243中。

另外的酶

洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶、和/或黄原胶裂解酶。

一般而言，所选一种或多种酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且这种或这些酶应以有效量存在。

纤维素酶

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。

其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme Premium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinas^TMe和Puradax HA^TM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

甘露聚糖酶

适合的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。该甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉。适合的甘露聚糖酶描述在WO 1999/064619中。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。

黄原胶裂解酶

适合的黄原胶裂解酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的酶的实例包括在WO 2013167581中披露的和在此示为SEQID NO:21、22、23和24的黄原胶裂解酶。

蛋白酶

适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；以及描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是描述于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：

Duralase^Tm、Durazym^Tm、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

以及

(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：

Purafect

Purafect

Purafect

Purafect

以及

(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶

适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶(如描述于EP 258 068和EP 305 216中)、来自腐质霉(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO 96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)(这些假单胞菌属中的一些现在重命名为伯克氏菌属(Burkholderia))的脂肪酶(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene))(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、来自稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(Pseudomonas mendocina)(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)、以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(WO 12/137147)的脂肪酶。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。

淀粉酶

可以与本发明的酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的其变体。优选变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或具有90％序列一致性的其变体。这种杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或者

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

另外的适合的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304、以及476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置上具有缺失的那些，如181和182、182和183、或位置183和184。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。

其他可以使用的淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶或与WO 08/153815的SEQ ID NO:2或WO 01/66712的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的其变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:2具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:2的优选变体是具有C末端截短和/或在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或者

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包含取代和/或在位置180和/或位置181处包含缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 13184577中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代的那些：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K、以及G477K中具有取代，和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K

其中这些变体任选地进一步在位置241处包含取代和/或在位置178和/或位置179处包含缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 10104675中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代的那些：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K、以及G478K中具有取代，和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N21D+D97N+V128I

其中这些变体任选地进一步在位置200处包含取代和/或在位置180和/或位置181处包含缺失。

其他的合适的淀粉酶是具有在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的淀粉酶或与SEQID NO:12具有90％序列一致性的其变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314、R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，并且另外在一个或多个选自下组的位置处具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置处具有取代的变体。

其他的实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078、和WO 2013/001087中描述的那些。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、特妙淀粉酶^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100及Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。

过氧化物酶/氧化酶

根据本发明的过氧化物酶是由如由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)陈述的酶分类EC 1.11.1.7包含的过氧化物酶，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。

适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中描述的那些。

根据本发明的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。卤过氧化物酶依据它们对卤离子的特异性来分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。

在一个实施例中，该卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。

已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如，疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。

还已经从细菌，如假单胞菌属(例如，吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。

在一个优选实施例中，该卤代过氧化物酶可源自弯孢属，特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)或不等弯孢，例如如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS102.42或描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS 444.70；或可源自如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii，如描述于WO 01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium物种。

根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。

优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。

来自真菌的适合实例包括可源自以下项的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。

来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。

优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或源自嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。

无尘颗粒例如可以如在US 4,106,991和4,661,452中所披露的那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚乙二醇(PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酯。适合于流化床技术应用的成膜包覆材料的实例提供于GB 1483591。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。

辅料

还可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。

分散剂

该洗涤剂组合物还可以含有分散剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。适合的分散剂例如描述于Powdered Detergent[粉末洗涤剂]，Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]，第71卷，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)。

染料转移抑制剂

该洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂

该洗涤剂组合物将优选地还含有另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，该增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在该组合物中可以使用适合在洗衣洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4’-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐、4,4’-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2’-二磺酸盐、4,4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐、4,4’-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2’-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4’-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2’-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

适当的荧光增白剂水平包括从大约0.01wt％，从0.05wt％，从大约0.1wt％或甚至从大约0.2wt％至上限水平0.5wt％或甚至0.75wt％的较低水平。

污垢释放聚合物

该洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉和聚酯基的织物)去除污垢，特别是从聚酯基的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents[粉末洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷，第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。该核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，随机接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如修饰的纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂

该洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。在以上污垢释放聚合物下描述的纤维素基的聚合物还可以用作抗再沉积剂。

流变改性剂

该洗涤剂组合物还可以包括一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自下组，该组由以下组成：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度，例如如在EP 2169040中所示。

洗涤剂产品的配制

该洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。

袋可以被配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。所述内部体积可以分成袋的隔室。优选的膜是高分子材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司出售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与含有固体的室不同：US 2009/0011970A1。

可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在清洗溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

非单位给药的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且高达95％的水，如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。

液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

洗衣皂条

本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(如洗衣皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地是条的形式但也可能是其他的固体形状如圆形或椭圆。

该洗衣皂条可以含有一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以含有络合剂像EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合的污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定试剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、粘合剂、浸出剂、漂白活化剂、粘土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散剂、增亮剂、织物柔软剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在工艺的不同阶段向肥皂中添加预混料。例如，可以制备含有肥皂、本发明的酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的本发明的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和出条步骤，该工艺可以进一步包括以下步骤：研磨、挤出、切割、冲压、冷却和/或封装。

共颗粒中酶的配制品

本发明的酶可以被配制为颗粒，例如，配制为结合一种或多种酶的共颗粒。然后，每种酶将存在于多种颗粒中，这些颗粒确保酶在洗涤剂中的分布更均匀。这还减少了由于不同的粒度，不同酶的物理隔离。用于生产针对洗涤剂工业的多酶共颗粒的方法披露于IP.com公开内容IPCOM000200739D中。

通过使用共颗粒配制酶的另一个实例披露在WO 2013/188331中，其涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含(a)多酶共颗粒；(b)少于10wt沸石(无水基底)；和(c)少于10wt磷酸盐(无水基底)，其中所述共颗粒包含从10至98wt％水分汇组分，并且该组合物另外包含从20至80wt％的洗涤剂水分汇组分。

WO 2013/188331还涉及处理和/或清洁表面的方法，优选织物表面，该方法包括以下步骤：(i)将所述表面与在含水洗液中如在此要求保护的并且描述的洗涤剂组合物接触，(ii)冲洗和/或干燥该表面。

该多酶共颗粒可以包含本发明的酶和(a)一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：首次洗涤脂肪酶、清洁纤维素酶、木葡聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶以及其混合物；以及(b)一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：半纤维素酶、蛋白酶、护理纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣多糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、淀粉酶及其混合物。

在降解黄原胶中的用途

将黄原胶用作许多消费品(包括食品和化妆品)中的成分并且用于石油与钻探工业中。因此，具有黄原胶降解活性的酶可以应用于改进的清洁过程，例如更容易去除含有黄原胶的污物，连同通常用于石油与钻探工业中的黄原胶的降解。因此，本发明涉及本发明的酶或其组合物用于降解黄原胶的用途。本发明还涉及包含本发明的酶和黄原胶裂解酶的组合物用于降解黄原胶的用途。

可以使用如有关黄原胶的在此描述的粘度减小测定测量黄原胶的降解。可替代地，可以使用由Lever，(1972)，Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279,1972研发的比色测定通过黄原胶上的还原末端测量黄原胶降解活性。

在洗涤剂中的用途

本发明的酶或其组合物可以在清洁过程中使用，例如纺织品和织物的湿洗(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)以及家用和工业硬表面清洁，例如餐具洗涤。可以将本发明的酶添加至包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。

一个实施例是本发明的酶连同黄原胶裂解酶或其组合物在清洁过程中的用途，例如纺织品和织物的湿洗(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)以及家用和工业硬表面清洁，例如餐具洗涤。可以将本发明的酶连同黄原胶裂解酶添加至包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。

本发明还涉及用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的酶的组合物。本发明进一步涉及用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种黄原胶裂解酶的组合物。一个实施例是一种用于纺织品的表面或硬表面上的降解黄原胶的方法(例如餐具洗涤)，该方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的酶连同一种或多种黄原胶裂解酶的组合物。一个实施例是包含如以上所述的一种或多种洗涤剂组分的组合物。

在地下地层的压裂(石油和/或天然气钻探)中的用途

使用水力压裂来创造自钻孔延伸至岩层的地下压裂，以便增加通过地层可以产生的流体的流速。通常，将高粘度压裂液以足够压裂地下地层的压力泵入井中。为了维持向地层的增加的暴露，将固体支撑剂添加至压裂液中，通过施加至流体的高压将其带进压裂处。一旦高粘度压裂液将该支撑剂带进地层中，破碎物用于减少流体的粘度，这允许该支撑剂停留在压裂处中并且由此增加地层向井的暴露。破碎物通过减少聚合物的分子量而工作，以此方式’破碎’或降解聚合物。压裂处然后变为一种高渗透性管道，用于有待产生的流体和天然气回至井中。此类过程进一步披露于美国专利号7,360,593、5,806,597、5,562,160、5,201,370和5,067,566中。

因此，本发明涉及本发明的酶作为酶破碎物的用途。本发明的一个实施例是本发明的酶连同黄原胶裂解酶作为酶破碎物的用途。

因此，本发明提供了一种用于破碎钻井孔中的黄原胶的方法，该方法包括：(i)将包含水性流体的可胶凝压裂液、一种或多种能水合的聚合物、用于交联能水合的聚合物以形成一种聚合物凝胶的适合的交联剂，以及一种或多种本发明的酶(即，酶破碎物)共混在一起；(ii)将交联聚合物凝胶在足够压裂周围地层的压力下泵入钻井孔中；并且(iii)允许酶破碎物降解交联聚合物，以减少流体的粘度，这样使得可以将流体从地层泵回至井表面。因此，本发明的酶可以用于控制压裂液的粘度。此外，一种或多种本发明的酶连同一种或多种黄原胶裂解酶可以用于控制压裂液的粘度。

本发明的酶破碎物可以是压裂液或破碎物-交联剂-聚合物复合物的一种成分，该压裂液或复合物进一步包含一种能水合的聚合物和一种交联剂。压裂液或复合物可以是一种凝胶或可以是可胶凝化的。该复合物在以下方法中是有用的，该方法用于在一种压裂液中使用该复合物以将钻井孔周围的地下地层压裂，这是通过在足够将周围的地下地层压裂的压力下将该流体泵至钻井孔中的所希望的位置。该复合物可以通过维持特定条件的pH和温度来维持基本上非反应的状态，直到该流体被放置在钻井孔中的时刻并且完成所希望的压裂。一旦压力完成，该复合物维持无活性的特定条件便不再维持。当这些条件显著变化时，该复合物变得有活性并且破碎物开始催化聚合物降解，从而导致压裂液变得足够流动，以从地下地层泵至井表面。

降解黄原胶的方法，其中黄原胶用于压裂由钻井孔形成的地下地层

当钻井时，储层钻井液(RDF)在钻探设备内循环以冷却并清洁钻头，去除钻井孔外的钻屑，减少钻柱与钻孔的侧边之间的摩擦力，并且形成滤饼以便阻止流体渗漏进入地层中。用于形成滤饼的驱动力是应用以维持钻孔稳定性的较高的钻井孔压力。这一滤饼限制储层流体在钻探以及完井设备的放置过程中流入钻井孔。如果在井竣工之前或过程中未去除在钻探过程中造成的滤饼损伤，则当该井投入生产时可以出现一系列问题，即完井设备失败和受损的储层生产力。

钻井液(泥浆)(也称为储层钻井液(RDF))可以是合成/油基的或水基的。为了使钻井液对地层的侵入最小化，油基和水基泥浆滤饼两者都典型地含有一种桥接剂或增重剂，通常是碳酸钙颗粒、重晶石或两者的混合物，其桥接在地层的孔喉处并且由此形成相对低渗透性滤饼。油基和水基泥浆滤饼两者还都含有在钻探过程中带出的称作钻屑的固体，与添加在钻井液的配制品中的桥接/增重剂截然相反。这些固体可以是石英(砂)、粉砂和/或页岩，取决于储层地层以及由钻探路径至储层穿过的地层。另外，油基钻井泥浆含有陷于滤饼的孔域中的水滴，而水基泥浆滤饼含有聚合物，例如淀粉和黄原胶，以及其他无机盐。

形成泥浆滤饼对于钻探而言通常是必须的，特别是在具有钻井孔稳定性问题并且典型地具有高渗透性的疏松地层中。然后将滤饼用不同化学品处理，例如螯合剂或酸，以溶解方解石组分；和/或酶或氧化剂，以降解聚合物组分，从而恢复渗透性。

在一方面，本发明提供了一种用于降解黄原胶的方法，其中黄原胶用于压裂由钻井孔造成的地下地层，该方法是通过施用包含一种或多种本发明的酶的组合物。该方法可以包括以下步骤：(i)将包含一种或多种本发明的酶的处理流体泵入与有待去除的滤饼接触的钻孔中，以在该处理流体与邻接该滤饼的地层之间建立不同的压力并且(ii)在不同的压力周期过程中均匀地传播滤饼的处理，以通过该处理流体延迟突破。

在一个实施例中，该方法包括在地层与钻孔之间通过处理的滤饼建立渗透性。在另一个实施例中，该滤饼可以包括钻井固体和黏土，并且可以形成自水性钻井液。如果希望的话，用于处理水性钻井液滤饼的处理流体还可以包括一种氧化剂和/或螯合剂，或它可以是基本上不含螯合剂和氧化剂添加剂的。在另一个实例中，该滤饼可以形成自油或反相乳化钻井液。如果希望的话，用于处理油或反相乳化钻井液滤饼的处理流体还可以包括互溶剂、水润湿剂或其组合,从而将疏水性组分分散在滤饼中。

在一个实施例中，该处理流体包含一种或多种本发明的GH5多肽。在另一个实施例中，该处理流体包含一种或多种黄原胶裂解酶。在一个优选实施例中，该处理流体包含一种或多种GH5多肽以及一种或多种黄原胶裂解酶。

降解黄原胶的方法，其中黄原胶是钻孔滤饼中的一种组分

在一方面，本发明提供了一种一旦滤饼被泵至表面，用于清洁该滤饼的方法，该滤饼包含聚合物，例如黄原胶和钻井液固体。钻井泥浆从泥浆池泵至钻头然后再泵出至表面，在该过程中带出除其他东西之外的破碎的或切碎的岩石(钻屑)。将钻屑滤出并且将泥浆返回至泥浆池，在泥浆池中细粒可以沉淀和/或可以将添加化学品或酶(破碎物)进行添加。

用于降解黄原胶的方法(其中黄原胶是钻孔滤饼中的一种组分)可以包括以下步骤：(i)用一种处理流体处理该钻孔滤饼，该处理流体包含一种或多种本发明的酶并且(ii)将固体与流体分离。在一个优选实施例中，该处理流体包含一种或多种本发明的酶以及一种或多种黄原胶裂解酶。

可以将钻孔滤饼在泥浆池中用一种或多种本发明的酶处理并且可以再循环钻井液。可替代地，一旦滤饼已经被一种或多种本发明的酶处理，使用固液分离方法(例如离心)将固体与流体分离。

本发明在下面各段中进行了进一步的定义：

1.一种具有黄原胶降解活性的糖基水解酶家族5的多肽。

2.如段落1所述的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2中任一项的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1中任一项的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1中任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:2中任一项的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；

(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的具有黄原胶降解活性的多肽的片段；以及

(f)包含(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)以及N-末端和/或C-末端His-标签的多肽。

3.如段落1所述的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:4中任一项的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:3中任一项的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:3中任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:4中任一项的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；

(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的具有黄原胶降解活性的多肽的片段；以及

(f)包含(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)以及N-末端和/或C-末端His-标签的多肽。

4.如段落1所述的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:6中任一项的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:5中任一项的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:5中任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:6中任一项的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；

(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的具有黄原胶降解活性的多肽的片段；以及

(f)包含(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)以及N-末端和/或C-末端His-标签的多肽。

5.如段落1所述的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:8中任一项的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:7中任一项的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:7中任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；

(d)SEQ ID NO:8中任一项的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；

(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的具有黄原胶降解活性的多肽的片段；以及

(f)包含(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)以及N-末端和/或C-末端His-标签的多肽。

6.如段落1至5中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2、4、6、或8中任一项的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

7.如段落1至6中任一项所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中-高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1、3、5、或7中任一项的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交。

8.如段落1至7中任一项所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、3、5、或7中任一项的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

9.如段落1至8中任一项所述的多肽，该多肽由SEQ ID NO:2、4、6、或8中任一项或SEQ ID NO:2、4、6、或8中任一项的成熟多肽组成。

10.如段落1至9中任一项所述的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、或8中任一项或SEQ ID NO:2、4、6、或8中任一项的成熟多肽。

11.如段落1至10中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、4、6、或8中任一项的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处(例如多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个位置)包含取代、缺失和/或插入。

12.如段落1至11中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、4、6、或8中任一项的片段，其中该片段具有黄原胶降解活性。

13.一种编码如段落1-12中任一项所述的多肽的多核苷酸。

14.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落13所述的多核苷酸，该多核苷酸有效地连接至指导该多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。

15.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如段落13所述的多核苷酸，该多核苷酸有效地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。

16.一种产生如段落1-12中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。

17.如段落16所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

18.一种产生具有对黄原胶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落15所述的宿主细胞。

19.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码如段落1-12中任一项所述的多肽的多核苷酸转化。

20.一种产生具有对黄原胶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如段落19所述的转基因植物或植物细胞。

21.如段落20所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

22.一种包含如段落1-12中任一项所述的多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。

23.一种包含如段落1-12中任一项所述的多肽的组合物。

24.如段落23所述的组合物，该组合物进一步包含具有黄原胶裂解酶活性的多肽。

25.如段落24所述的组合物，其中具有黄原胶裂解酶活性的多肽是具有SEQ IDNO:21、22、23或24中任一项的氨基酸序列的多肽。

26.根据段落23至25中任一项所述的组合物用于降解黄原胶的用途。

27.如段落30所述用于控制钻井液的粘度的用途。

28.一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括向黄原胶施用根据段落23至25中任一项所述的组合物。

29.如段落28所述的方法，其中该黄原胶在纺织品或硬表面的表面上，例如在餐具洗涤中。

30.如段落28所述的方法，其中该黄原胶在由钻井孔穿透的地下地层的压裂中使用。

31.如段落28所述的方法，其中该黄原胶是钻孔滤饼中的组分。

32.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括：用根据段落23至25中任一项所述的酶组合物或在如段落1至12中任一项所述的多肽的存在下处理纤维素材料。

33.如段落32所述的方法，其中该纤维素材料是经预处理的。

34.如段落32或33所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或过氧化物酶。

35.如段落34所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

36.如段落35所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

37.如段落32至36中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收降解的纤维素材料。

38.如段落37所述的方法，其中该降解的纤维素材料是糖，该糖优选地选自下组，该组由以下组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。

39.一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括：

(a)在段落1-13中任一项的多肽或根据段落23至25中任一项所述的酶组合物的存在下使纤维素材料糖化；

(b)用一种或多种发酵微生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且

(c)从发酵中回收该发酵产物。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实例

活性测定

黄原胶裂解酶活性测定

将0.8mL 100mM HEPES缓冲液(pH 6.0)与溶解于的水中的0.2mL黄原胶(5mg/mL)混合在1mL 1cm比色杯中。将比色杯插入将温度控制设置在40℃的分光光度计(安捷伦(Agilent)G1103A 8453A，加利福尼亚州，美国)中。将溶液预孵育10min并且添加0.1mL样品，并且通过使用移液管将溶液吸液并分配至少5次来混合该溶液。总反应体积是1.1mL。使用30sec测量间隔，将235nm处的吸光度收集10min。通过使用软件(紫外-可见化学工作站版本(UV-Visible Chemstation Rev)

A.10.01[81]，安捷伦)计算初始活性。

实例1：菌株和DNA

编码SEQ ID NO:2的GH5多肽EXa的SEQ ID NO:1中的DNA获得自从在丹麦收集的环境土壤样品分离的丰佑菌科物种。

编码SEQ ID NO:4的GH5多肽EXb的DNA SEQ ID NO:3分离自在丹麦收集的环境样品。

编码SEQ ID NO:5的GH5多肽EXc的DNA SEQ ID NO:5分离自在丹麦收集的环境样品。

编码SEQ ID NO:8的GH5多肽EXd的DNA SEQ ID NO:7获得自公共数据库(UNIPROTM2V1S3)，但是起源自从厄瓜多尔的加拉帕戈斯裂谷热液喷口收集的施氏假单胞菌的菌株。

制备编码四个多肽(SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12)的成熟肽序列的密码子优化的合成DNA。

实例2：GH5多肽的克隆和表达

GH5编码基因或者通过常规技术从以上表明的菌株克隆，或者从合成的DNA克隆，并插入如下所述的合适的质粒中。

实例2a：大肠杆菌中GH5多肽的克隆和表达

用标准的重组技术，在来自诺瓦根公司的大肠杆菌pET-32a(+)载体中，对GH5内切葡聚糖酶基因，SEQ ID NO:1、3、5和7的成熟肽编码部分在甲硫氨酸后插入具有额外的脯氨酸和精氨酸的N端多组氨酸标签(HHHHHHPR)(SEQ ID NO:19)。从具有该质粒的大肠杆菌转化体纯化含有该插入的表达质粒，并转化到大肠杆菌Xjb(DE3)宿主细胞(来自Zymo研究公司)中。含有pET32-GH5载体的大肠杆菌Xjb(DE3)的新克隆在含有100ug/ml氨苄青霉素的Terrific肉汤中生长过夜。次日，用1ml过夜培养物接种新鲜的500ml培养物，并且培养细胞(37℃，250rpm)至6-8之间的光密度(OD600)。在20℃，通过1mM异丙基硫代-D-半乳糖苷酶(IPTG)和6mM阿拉伯糖诱导蛋白质表达4.5小时。继续培养后，通过离心收获细胞并由

(诺瓦根公司)裂解。如实例4中所述，将可溶级分用于GH5多肽SEQ ID NO:13、14和15的聚组氨酸标签纯化。

实例2b：枯草芽孢杆菌中的GH5多肽的克隆和表达

将合成的密码子优化的基因SEQ ID NO:10、11和12克隆至描述于WO 2012/025577中的芽孢杆菌表达载体中。通过将天然分泌信号用克劳氏芽孢杆菌分泌信号MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQ ID NO:20)(在该信号肽的C-末端具有额外的亲和标记序列(HHHHHHPR)(SEQ ID NO:19))替换来表达这些基因以促进纯化过程。这导致了在成熟的野生型序列的N-末端的前面具有His标签的重组成熟多肽(SEQ ID NO:16、17和18)。

选择一个具有正确重组基因序列的克隆并且通过同源重组将对应的质粒整合进枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组(果胶酸裂解酶位点)中并且在三联启动子系统的控制下表达该基因构建体，如在WO 99/43835中所描述的。将编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记(如Diderichsen(狄代丽柯森)等人，1993,Plasmid[质粒]30:312-315中所描述的)。

通过PCR分析氯霉素抗性转化体，以验证扩增片段的正确大小。选择含有整合的表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆，并且在旋转摇床上在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中进行培养，每个锥形瓶含有100ml酵母提取物基的介质。将该克隆在30℃培养5天。收获含有酶的上清液并如实例5中所述的将该酶进行纯化。

实例3：来自天然丰佑菌科菌株的野生型GH5多肽的纯化

将丰佑菌科菌株在旋转摇床上在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中培养，每个锥形瓶含有100ml具有0.5％黄原胶的矿物溶液。将该菌株在30℃培养20天。通过离心收获总共2.0L上清液并且使用0.2μm瓶顶部过滤器(Nalgene Nunc)进行过滤。使用具有30kDa截留值的超滤(赛多利斯公司(Sartorius))将肉汤浓缩至300mL。在连续搅拌下，缓慢添加等体积的在40mM Tris-HCl(pH 7.9)中的3.2M硫酸铵。使用沃特曼(Whatman)玻璃过滤器(1.7μm-0.7μm)过滤样品以除去较大的颗粒。将样品应用于用在20mM Tris-HCl(pH7.9)(平衡缓冲液)中的1.6M硫酸铵预平衡的20mL苯基-琼脂糖高性能柱(GE Healthcare[通用电气医疗集团])上。将未结合的蛋白通过两个柱体积的平衡缓冲液进行洗脱。通过在20mMTris-HCl(pH 7.9)中的从1.6M至0.0M硫酸铵的12个柱体积的线性梯度进行洗脱。用平衡缓冲液的4个柱体积的最后的洗脱步骤被用于洗脱紧紧地结合的蛋白。在整个纯化期间，记录280nm处的吸光度。通过SDS-PAGE(NuPAGE，英杰公司(Invitrogen))分析含有由色谱图中280nm处的吸光度鉴定的级分的蛋白质。合并判断为纯的级分。使用具有3kDa截留值(Pall(颇尔公司))的Macrosep超滤装置将样品从30浓缩至4mL。通过使用计算的消光系数测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度，其中1mg/mL等于1.89吸光度单位。

实例4：在大肠杆菌中产生的重组GH5多肽的纯化

通过Fast PES 0.2μm瓶顶过滤器过滤200mL裂解细胞(如实例2a生长的)以去除碎片和未破碎的细胞。将200mL平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5+500mM NaCl)添加至该粗蛋白溶液。将装载Ni²⁺的20mL HisPrep柱用平衡缓冲液平衡，直到获得稳定的UV基线。在整个纯化过程中连续监测280nm处的吸光度。使用4mL/min的流速在柱上装载粗蛋白。通过用平衡缓冲液洗涤该柱来去除未结合的蛋白直到获得稳定的UV基线。使用20mM Tris-HCl(pH7.5)+500mM NaCl+500mM咪唑(洗脱缓冲液)通过2步线性梯度进行洗脱。第一洗脱梯度是从0至40％洗脱缓冲液的10个柱体积，然后从40％至100％的4个柱体积。通过SDS-PAGE(NuPAGE，英杰公司)分析280nm处吸收的峰。将含有具有正确表观分子量的蛋白质的级分合并。使用用20mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡的Sephadex G-25超细脱盐柱将该池脱盐并进行缓冲液交换。将该池应用在用20mM Tris-HCl(pH 8.0)预平衡的20mL Source15Q柱上。使用20mM Tris-HCl(pH 8.0)洗掉未结合的蛋白，直到获得稳定的UV基线。通过在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中的从0至500mM NaCl的10个柱体积线性NaCl梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析含有级分的蛋白质并且合并判断为纯的级分。使用计算的消光系数，使用280nm处的吸光度测量蛋白质浓度，其中1mg/mL对应于1.86吸光度单位。

实例5：在枯草芽孢杆菌中产生的重组GH5多肽的纯化

在5mL HisTrap Excel柱(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences))上，使用Ni²⁺作为金属离子，通过固定化金属层析(IMAC)纯化所有His-标记的酶。在pH 8下进行纯化并用咪唑洗脱结合的蛋白。通过SDS-PAGE对经纯化的酶的纯度进行检查并在缓冲剂交换后通过Abs 280nm确定每种酶的浓度。

实例6：通过测量粘度下降，GH5多肽和黄原胶裂解酶对黄原胶的黄原胶降解活性

使用WO 2011/107472中所描述的粘度压力测定并且遵循WO 2013167581中所描述的方法进行粘度下降测量。呈现的结果是三个测量值的平均值并且示于下表1和2中。

使用400μL的样品尺寸。水解条件如下所示：在30℃，在50mM MES缓冲液+0.01％triton x-100(pH 7.0)或100mM CHES缓冲液+0.01％triton x-100(pH 10)中的0.25％或0.5％黄原胶(XG)。热平衡后添加酶。使用之前，所有的酶使用NAP 5柱(GE医疗集团)进行缓冲液交换为MES缓冲液。

将浓度在31.25mg/L的实例5的纯化的酶制剂用于分析。

以上呈现的结果显示在pH 7下，GH5多肽单独以及与黄原胶裂解酶的组合可以降解存在于介质中的黄原胶，因此导致粘度下降。在Gh5和黄原胶裂解酶的组合的情况下，获得了协同作用。

以上呈现的结果显示在pH 10下，GH5多肽单独或与黄原胶裂解酶的组合可以降解存在于介质中的黄原胶，因此导致粘度下降。

以上呈现的结果显示在pH 7下，GH5多肽单独以及与黄原胶裂解酶的组合可以降解存在于介质中的黄原胶，因此导致粘度下降。

以上呈现的结果显示在pH 7，GH5多肽、EXa、EXb和EXc单独以及与黄原胶裂解酶的组合可以降解存在于介质中的黄原胶，因此导致粘度下降。在GH5多肽和黄原胶裂解酶的组合的情况下，获得了协同作用。

以上呈现的结果显示在pH 7，GH5多肽、EXa、EXb和EXc单独以及与黄原胶裂解酶的组合可以降解存在于介质中的黄原胶，因此导致粘度下降。在GH5多肽和黄原胶裂解酶的组合的情况下，获得了协同作用。

以上呈现的结果显示在pH 10下，GH5多肽GH5、EXb和EXc与黄原胶裂解酶的组合可以降解存在于介质中的黄原胶，因此导致粘度下降。

实例8：通过测量粘度下降，GH5多肽和黄原胶裂解酶对黄原胶的黄原胶降解活性

使用WO 2011/107472中所描述的粘度压力测定进行粘度测量。每1mL水解或对照的150μL是样品大小。呈现的结果是四个测量值的平均值并且示于下表8和9中。

通过Nankai等人，1999，“Microbial system for polysaccharidedepolymerization:enzymatic route for xanthan depolymerization by Bacillussp.Strain GL1[微生物系统多糖解聚：用于通过芽孢杆菌属菌株GL1解聚的黄原胶的酶途径]”，Applied and Environmental Microbiology[应用与环境微生物]，第65卷(6)，第2520-2526页的改编本制备改性黄原胶。

在2L的烧杯中，用5mL的96％乙醇湿润2.5g黄原胶(CP Kelco[斯比凯可公司])。添加500mL 100mM ACES缓冲液(pH 7.00)并且将该溶液在环境温度下搅拌2h。添加250μL黄原胶裂解酶(芽孢杆菌属物种，Megazyme[梅格泽姆公司])并且将该溶液在50℃下孵育20h。然后通过将烧杯放置在冰上冷却该样品。在水解后，在搅拌下，将1400mL的冰冷的96％乙醇添加至500mL样品。发生沉淀，并且在大约5min后，倾析出乙醇，去除丙酮酸甘露糖残余物。将该样品真空过滤并转移至玻璃板。将该玻璃在50℃下干燥20h。收集样品、称重、并研磨。

水解条件如下所示：40℃，0.35％黄原胶(XG)在50mM HEPES缓冲液+0.01％tritonX-100pH 7.0中。如以上所述制备改性黄原胶粉末(mXG)并且使用如对XG所概述的相同的程序制备0.7％的溶液。热平衡后添加酶。在添加酶之前、热平衡后测量初始粘度。对照与代替酶的添加的缓冲液相同。检测缓冲液以确定总水解的最终的终点。

实例9：Gh5多肽和黄原胶裂解酶的洗涤性能

在衣物洗涤实验中使用微量洗涤测定来评估GH5酶的洗涤性能，该洗涤测试是一种测试方法，其中将弄脏的纺织品在测试溶液中连续地提起并放下并且随后漂洗。在表10中指定的实验条件下进行洗涤实验。

随后将纺织品风干并且将洗涤性能测量为这些纺织品的颜色的亮度。可以将亮度表示为反射比(R)，反射比是当用白光照射时，从测试材料反射或发射的光的量度。使用Zeiss MCS 521VIS分光光度计在460nm处测量纺织品的反射比(R)。根据制造商的方案进行测量。

将新酶(组合)的性能与单独的洗涤剂(空白)的性能进行比较。如果一种酶(组合)比单独的洗涤剂性能更好(即，R_酶>R_空白)(参见表13和14)，则认为酶(组合)表现出改进的洗涤性能。

实例10：在具体菌株上测试GH5多肽和黄原胶裂解酶的组合的洗涤性能

通过使用以下标准化的菌株(所有可获得自CFT(测试材料中心)公司，弗拉尔丁恩，荷兰)来确定液体和粉末洗涤剂中的变体的洗涤性能：

A：液体组成：产品号PCS17

B：液体组成：产品号CS17

对于在液体洗涤剂中的测试，将具有以下组成的液体洗涤剂用作基本配制品(所有的值都以重量百分比计)：0％至0.5％黄原胶、0.2％至0.4％消泡剂、6％至7％甘油、0.3％至0.5％乙醇、0至7％FAEOS(脂肪醇醚硫酸酯)、10％至28％非离子型表面活性剂、0.5％-1％硼酸、1％至2％柠檬酸钠(二水合物)、2％至4％苏打、0至16％椰子脂肪酸、0.5％HEDP(1-羟基乙烷-(1,1-二磷酸))、0至0.4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0至0.05％光学增亮剂、0至0.001％颜料、剩余部分为去离子水。

基于这种基本配制品，通过添加如表15中所指示的对应的酶组合来制备洗涤剂。作为参考，使用不添加酶组合的洗涤剂组合物。

液体洗涤剂的剂量之比是4.7克/升洗涤液体，并且在40℃的温度下进行60分钟洗涤程序，水具有在15.5与16.5°(德国硬度)之间的水硬度。

对于在固体洗涤剂中的测试，使用欧洲高级洗涤剂作为基础配制品。

白度(即污物的增白)被光度测定地确定为洗涤性能的指示。使用美能达(Minolta)CM508d分光仪装置，该装置事先使用提供有单位的白标准进行校准。

获得的结果是用洗涤剂获得的反射单位(remission unit)与用含有酶组合的洗涤剂获得的反射单位之间的差值。因此，正值指示由于洗涤剂中存在的酶组合而改进的洗涤性能。从表15明显看出，根据本发明的酶组合显示了改进的洗涤性能。

表15：在液体洗涤剂中的洗涤性能

表16：在固体洗涤剂中的洗涤性能

实例11：有和没有黄原胶裂解酶的GH5多肽的洗涤性能

在该实例中，在自动机械应力测定(AMSA)中，在20℃或40℃下洗涤的液体标准洗涤剂A中评估GH5多肽的洗涤性能。单独或与黄原胶裂解酶组合评估酶的洗涤性能。使用的洗涤条件如在下表17中指定。

表17.实例11中使用的洗涤条件：

将酶和洗涤液添加至AMSA板中并根据表17中列出的条件洗涤。洗涤后，将织物在自来水中沖洗并风干。随后，将酶的性能作为该纺织品样品颜色的亮度进行测量。亮度作为在白光照射纺织品样品时从纺织品样品反射的光的强度进行测量。用专业平板扫描仪EPSON EXPRESSION 10000XL，用专门设计的软件来测量强度，该软件通过标准矢量计算从扫描的图像中提取强度值。

将酶(或酶的组合)的性能与单独的洗涤剂(空白)或具有黄原胶裂解酶(XL)的洗涤剂的性能进行比较。如果酶(或酶的组合)比单独的洗涤剂表现更好(即，R_酶>R_空白)(参见表18、19、20和21)，则认为酶(或酶的组合)表现出改进的洗涤性能。

表18.在标准洗涤剂A中在20℃下，在AMSA中所测试的GH5多肽EXb(SEQ ID NO:16)和EXc(SEQ ID NO:17)的强度和δ强度。

表19.在标准洗涤剂A中在40℃下，在AMSA中所测试的GH5多肽EXb(SEQ ID NO:16)和EXc(SEQ ID NO:17)的强度和δ强度。

表20.在AMSA中在20℃，在标准洗涤剂A中测试的具有黄原胶裂解酶(XLb，SEQ IDNO:22)的GH5多肽EXb(SEQ ID NO：16)和EXc(SEQ ID NO：17)的强度和δ强度。

表21.在标准洗涤剂A中在40℃下，在AMSA中所测试的具有黄原胶裂解酶XLb(SEQID NO:22)的GH5多肽EXb(SEQ ID NO:16)和EXc(SEQ ID NO:17)的强度和δ强度。

上表中的结果表明，当单独或与黄原胶裂解酶例如XLb组合评估时，GH5多肽(例如EXb和EXc)具有改进的洗涤性能。

本申请中描述并且要求保护的本发明不限于在此公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面意欲在本发明的范围之内。实际上，除本申请中所示和描述的那些之外，对于本领域的技术人员而言本发明的多种修改将从前述的描述变得显然。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

序列表

<110> 诺维信公司

<120> 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸

<130> 12815-WO-PCT

<160> 24

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 2517

<212> DNA

<213> 丰佑菌科物种

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2514)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(108)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (109)..(2514)

<400> 1

atg caa tca tca agc tca aat tcg gtc gta tcc gct tcc cgg ata ctc 48

Met Gln Ser Ser Ser Ser Asn Ser Val Val Ser Ala Ser Arg Ile Leu

-35 -30 -25

cga cgc ttc tcc ctc ccg ctg ctc gcc gcc gcg ctg ggc ctc gcc gcg 96

Arg Arg Phe Ser Leu Pro Leu Leu Ala Ala Ala Leu Gly Leu Ala Ala

-20 -15 -10 -5

ccc gcc cgc gcc gcc gac tat tac ctg aag gcc agc caa ggc gca tcc 144

Pro Ala Arg Ala Ala Asp Tyr Tyr Leu Lys Ala Ser Gln Gly Ala Ser

-1 1 5 10

aac cac tgg tcc tcc cat ctc acc gac tgg acc gcc aac gcc gac ggc 192

Asn His Trp Ser Ser His Leu Thr Asp Trp Thr Ala Asn Ala Asp Gly

15 20 25

acc ggc gcc aac ccg acg gtc atc ggc ctg gcc gac acc ttc gac acc 240

Thr Gly Ala Asn Pro Thr Val Ile Gly Leu Ala Asp Thr Phe Asp Thr

30 35 40

aac aac cgc acg ctt cgc act ccc gcc gtc aac gcc acc acc acc tac 288

Asn Asn Arg Thr Leu Arg Thr Pro Ala Val Asn Ala Thr Thr Thr Tyr

45 50 55 60

ccg ggc ggc gtg ctc cgc ctt tcc ggc ggc gcc ggc gtc atc ggc atg 336

Pro Gly Gly Val Leu Arg Leu Ser Gly Gly Ala Gly Val Ile Gly Met

65 70 75

aag act ggc ggc acc gcc gtc gcc atc gtg ccc aag ctc gtc tcc acc 384

Lys Thr Gly Gly Thr Ala Val Ala Ile Val Pro Lys Leu Val Ser Thr

80 85 90

gcc ggc acc gtg gac gcc tgg cac acc ggc acc caa tac ttc cgc gcc 432

Ala Gly Thr Val Asp Ala Trp His Thr Gly Thr Gln Tyr Phe Arg Ala

95 100 105

gac gac tgg gag aac ctc gcc tcc ggc acc ggg ttc acc gcg ctc aag 480

Asp Asp Trp Glu Asn Leu Ala Ser Gly Thr Gly Phe Thr Ala Leu Lys

110 115 120

gcc gtc gcc ggc cgc acg ctc aag gtc agc gtc ggc aag ctc acc ggc 528

Ala Val Ala Gly Arg Thr Leu Lys Val Ser Val Gly Lys Leu Thr Gly

125 130 135 140

tcc ggc gag acc cgt ctt cac ggc ggc ggc gcc gtc cgc ctc gac gtc 576

Ser Gly Glu Thr Arg Leu His Gly Gly Gly Ala Val Arg Leu Asp Val

145 150 155

acc gac ggc gaa cgc tac ctc ggc gtc gtc cgc gtc tcc tcc ggc gcg 624

Thr Asp Gly Glu Arg Tyr Leu Gly Val Val Arg Val Ser Ser Gly Ala

160 165 170

gcc gac ttc gac aac aac gtg ttc gtc tcc ggc ccg ctc gtg atc gag 672

Ala Asp Phe Asp Asn Asn Val Phe Val Ser Gly Pro Leu Val Ile Glu

175 180 185

acc ggc gcg acc gtc gtg ctc gac cag gcc gtc tcc ttc gcc ggc ctg 720

Thr Gly Ala Thr Val Val Leu Asp Gln Ala Val Ser Phe Ala Gly Leu

190 195 200

acc gtc gcc ggc acc gag tat tcg ccc ggc aac tac acc ttc gcc gcg 768

Thr Val Ala Gly Thr Glu Tyr Ser Pro Gly Asn Tyr Thr Phe Ala Ala

205 210 215 220

ctc cag gcc gcg cat cct acg gtg ttc acc tcc ggc acc gcc ggc ggc 816

Leu Gln Ala Ala His Pro Thr Val Phe Thr Ser Gly Thr Ala Gly Gly

225 230 235

tcg atc acc gtc cgc gcc ccg cgc acc tgg tat ctc acc gtg aat cag 864

Ser Ile Thr Val Arg Ala Pro Arg Thr Trp Tyr Leu Thr Val Asn Gln

240 245 250

ggc ggc gtg cag aac tgg acc gag acc tac ctt tcg aac tgg aac tcc 912

Gly Gly Val Gln Asn Trp Thr Glu Thr Tyr Leu Ser Asn Trp Asn Ser

255 260 265

gcc gcc aat ggc tcc ggc gtc gcg ccg act tcg atc aac ggc tac gac 960

Ala Ala Asn Gly Ser Gly Val Ala Pro Thr Ser Ile Asn Gly Tyr Asp

270 275 280

ttc tac atc gat cag gtc tcc aac cgc gag atc cgc acg ccc tcc acc 1008

Phe Tyr Ile Asp Gln Val Ser Asn Arg Glu Ile Arg Thr Pro Ser Thr

285 290 295 300

gcc tcc acc ttc ggc ggc ggc gcg ctc gcc ctc gcc agc ggc gcc aag 1056

Ala Ser Thr Phe Gly Gly Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ser Gly Ala Lys

305 310 315

ctc acc ctc aag agt tcg ccc ggc gtc gtc agc acc atc ccg gcg ttc 1104

Leu Thr Leu Lys Ser Ser Pro Gly Val Val Ser Thr Ile Pro Ala Phe

320 325 330

gtg aac acg aac tcc ccg atc atc gtg aac ggc ggc ggt agc ttc cgc 1152

Val Asn Thr Asn Ser Pro Ile Ile Val Asn Gly Gly Gly Ser Phe Arg

335 340 345

caa agt ctc gcc ctc ggt gac tgg gag atc gcc tcc ggc atc acc aag 1200

Gln Ser Leu Ala Leu Gly Asp Trp Glu Ile Ala Ser Gly Ile Thr Lys

350 355 360

ctc tcc gcc ggc tcc ggt cgc agc ctc ggc ttc gac atc gac tac ctc 1248

Leu Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ser Leu Gly Phe Asp Ile Asp Tyr Leu

365 370 375 380

ggc ggc gcg ggt ggc ctt gtc acc caa aac ggc ggc tct tac ttc ctc 1296

Gly Gly Ala Gly Gly Leu Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Tyr Phe Leu

385 390 395

agc ctc gac gac ggc tcc ggc tac acc ggc acg ctc aac cac gcg tcc 1344

Ser Leu Asp Asp Gly Ser Gly Tyr Thr Gly Thr Leu Asn His Ala Ser

400 405 410

ggc gcg ctc cgc ttc gag tcc gtc ttc tcc acc gag ggc gcg ctc acc 1392

Gly Ala Leu Arg Phe Glu Ser Val Phe Ser Thr Glu Gly Ala Leu Thr

415 420 425

atc ggc tcc tcg gcg acc gtc cac ctc gac caa cag gtt tac gtc acg 1440

Ile Gly Ser Ser Ala Thr Val His Leu Asp Gln Gln Val Tyr Val Thr

430 435 440

tcg ttc tcc gtc gcc ggt gtc gcc aag gcc gcc ggc atc cac acc tac 1488

Ser Phe Ser Val Ala Gly Val Ala Lys Ala Ala Gly Ile His Thr Tyr

445 450 455 460

gcc tcg ctg aac gcc gcg cat ccc gca cag ttc acc gcc ggc gcc gcg 1536

Ala Ser Leu Asn Ala Ala His Pro Ala Gln Phe Thr Ala Gly Ala Ala

465 470 475

ccc gga ctc gtc gct gtt tac acg ccc gac acc gcc ggc ccc gtc cgc 1584

Pro Gly Leu Val Ala Val Tyr Thr Pro Asp Thr Ala Gly Pro Val Arg

480 485 490

atg aac ggc gtc aat atc tcc ggc ccc gag agc aac acc gcc aac ctc 1632

Met Asn Gly Val Asn Ile Ser Gly Pro Glu Ser Asn Thr Ala Asn Leu

495 500 505

ccc ggc acc tac ggc tac aac tac gtt tac ccc acc gag gcc gac ttc 1680

Pro Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Tyr Val Tyr Pro Thr Glu Ala Asp Phe

510 515 520

gac tac tac gcc tcc aag ggc ctc aac ctc atc cgc att ccc ttc cgc 1728

Asp Tyr Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Asn Leu Ile Arg Ile Pro Phe Arg

525 530 535 540

tgg gag cgc atg cag cac ggc ctg aac gtt ccg ctc aac acc gcc cag 1776

Trp Glu Arg Met Gln His Gly Leu Asn Val Pro Leu Asn Thr Ala Gln

545 550 555

ctc ggc tac atg gac acc gcc gtc gcc cgc gcc tcc gcg cgc ggc atg 1824

Leu Gly Tyr Met Asp Thr Ala Val Ala Arg Ala Ser Ala Arg Gly Met

560 565 570

aag gtc atc ctc gat atg cac aac tac gcc cgc tgc aaa gtc ggc gga 1872

Lys Val Ile Leu Asp Met His Asn Tyr Ala Arg Cys Lys Val Gly Gly

575 580 585

gtc acc tac aag ttc ggc gac gcg cag ctc ccc gcc tcg gcc tac gcc 1920

Val Thr Tyr Lys Phe Gly Asp Ala Gln Leu Pro Ala Ser Ala Tyr Ala

590 595 600

gac gtc tgg cgc cgt ctc gcc gac cac tac aaa aac gag ccc gcc atc 1968

Asp Val Trp Arg Arg Leu Ala Asp His Tyr Lys Asn Glu Pro Ala Ile

605 610 615 620

tac ggc ttc gac atc atg aac gag ccc aac ggc ctc tcc ggc ggc gtc 2016

Tyr Gly Phe Asp Ile Met Asn Glu Pro Asn Gly Leu Ser Gly Gly Val

625 630 635

tgg ccc gcc tac gcc cag gcc gcg gtc aac gcc atc cgc gag gtc aat 2064

Trp Pro Ala Tyr Ala Gln Ala Ala Val Asn Ala Ile Arg Glu Val Asn

640 645 650

ctg tcc acc tgg gtc atc gtc gag ggc gag ttt tgg gcc aac gct tgg 2112

Leu Ser Thr Trp Val Ile Val Glu Gly Glu Phe Trp Ala Asn Ala Trp

655 660 665

ggc ttc gag acc aag aac ccg tat ctg cac aac gtc cgc gat ccc gtc 2160

Gly Phe Glu Thr Lys Asn Pro Tyr Leu His Asn Val Arg Asp Pro Val

670 675 680

ggc cgc ctc atg ttc tcc gcc cac tcc tac tgg agc gac gcc ggc acc 2208

Gly Arg Leu Met Phe Ser Ala His Ser Tyr Trp Ser Asp Ala Gly Thr

685 690 695 700

gat gtt tac aag acc tac gac gaa gag ggc gcc tat ccc gag atg ggc 2256

Asp Val Tyr Lys Thr Tyr Asp Glu Glu Gly Ala Tyr Pro Glu Met Gly

705 710 715

gtg aac aac gtg aag ccc ttc atc gac tgg ctg aag aag cac gac gcc 2304

Val Asn Asn Val Lys Pro Phe Ile Asp Trp Leu Lys Lys His Asp Ala

720 725 730

aag ggc ttc gtc ggc gaa tac ggc gtg ccc aac aac gac ccg cgc tgg 2352

Lys Gly Phe Val Gly Glu Tyr Gly Val Pro Asn Asn Asp Pro Arg Trp

735 740 745

ctc gtc gtg ctg gac aac ttc ctc gcc tac ctc gcg gcc gag ggc gtg 2400

Leu Val Val Leu Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Glu Gly Val

750 755 760

agc ggc acc tac tgg gcc ggc ggc gcc tgg tat tcg ggc agc ccg atc 2448

Ser Gly Thr Tyr Trp Ala Gly Gly Ala Trp Tyr Ser Gly Ser Pro Ile

765 770 775 780

agc tgc cac ccg tcc tcc aac tac acc gtg gat cgc gcc gtc atg agc 2496

Ser Cys His Pro Ser Ser Asn Tyr Thr Val Asp Arg Ala Val Met Ser

785 790 795

gtg ctc gaa gac cat cca tga 2517

Val Leu Glu Asp His Pro

800

<210> 2

<211> 838

<212> PRT

<213> 丰佑菌科物种

<400> 2

Met Gln Ser Ser Ser Ser Asn Ser Val Val Ser Ala Ser Arg Ile Leu

-35 -30 -25

Arg Arg Phe Ser Leu Pro Leu Leu Ala Ala Ala Leu Gly Leu Ala Ala

-20 -15 -10 -5

Pro Ala Arg Ala Ala Asp Tyr Tyr Leu Lys Ala Ser Gln Gly Ala Ser

-1 1 5 10

Asn His Trp Ser Ser His Leu Thr Asp Trp Thr Ala Asn Ala Asp Gly

15 20 25

Thr Gly Ala Asn Pro Thr Val Ile Gly Leu Ala Asp Thr Phe Asp Thr

30 35 40

Asn Asn Arg Thr Leu Arg Thr Pro Ala Val Asn Ala Thr Thr Thr Tyr

45 50 55 60

Pro Gly Gly Val Leu Arg Leu Ser Gly Gly Ala Gly Val Ile Gly Met

65 70 75

Lys Thr Gly Gly Thr Ala Val Ala Ile Val Pro Lys Leu Val Ser Thr

80 85 90

Ala Gly Thr Val Asp Ala Trp His Thr Gly Thr Gln Tyr Phe Arg Ala

95 100 105

Asp Asp Trp Glu Asn Leu Ala Ser Gly Thr Gly Phe Thr Ala Leu Lys

110 115 120

Ala Val Ala Gly Arg Thr Leu Lys Val Ser Val Gly Lys Leu Thr Gly

125 130 135 140

Ser Gly Glu Thr Arg Leu His Gly Gly Gly Ala Val Arg Leu Asp Val

145 150 155

Thr Asp Gly Glu Arg Tyr Leu Gly Val Val Arg Val Ser Ser Gly Ala

160 165 170

Ala Asp Phe Asp Asn Asn Val Phe Val Ser Gly Pro Leu Val Ile Glu

175 180 185

Thr Gly Ala Thr Val Val Leu Asp Gln Ala Val Ser Phe Ala Gly Leu

190 195 200

Thr Val Ala Gly Thr Glu Tyr Ser Pro Gly Asn Tyr Thr Phe Ala Ala

205 210 215 220

Leu Gln Ala Ala His Pro Thr Val Phe Thr Ser Gly Thr Ala Gly Gly

225 230 235

Ser Ile Thr Val Arg Ala Pro Arg Thr Trp Tyr Leu Thr Val Asn Gln

240 245 250

Gly Gly Val Gln Asn Trp Thr Glu Thr Tyr Leu Ser Asn Trp Asn Ser

255 260 265

Ala Ala Asn Gly Ser Gly Val Ala Pro Thr Ser Ile Asn Gly Tyr Asp

270 275 280

Phe Tyr Ile Asp Gln Val Ser Asn Arg Glu Ile Arg Thr Pro Ser Thr

285 290 295 300

Ala Ser Thr Phe Gly Gly Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ser Gly Ala Lys

305 310 315

Leu Thr Leu Lys Ser Ser Pro Gly Val Val Ser Thr Ile Pro Ala Phe

320 325 330

Val Asn Thr Asn Ser Pro Ile Ile Val Asn Gly Gly Gly Ser Phe Arg

335 340 345

Gln Ser Leu Ala Leu Gly Asp Trp Glu Ile Ala Ser Gly Ile Thr Lys

350 355 360

Leu Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ser Leu Gly Phe Asp Ile Asp Tyr Leu

365 370 375 380

Gly Gly Ala Gly Gly Leu Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Tyr Phe Leu

385 390 395

Ser Leu Asp Asp Gly Ser Gly Tyr Thr Gly Thr Leu Asn His Ala Ser

400 405 410

Gly Ala Leu Arg Phe Glu Ser Val Phe Ser Thr Glu Gly Ala Leu Thr

415 420 425

Ile Gly Ser Ser Ala Thr Val His Leu Asp Gln Gln Val Tyr Val Thr

430 435 440

Ser Phe Ser Val Ala Gly Val Ala Lys Ala Ala Gly Ile His Thr Tyr

445 450 455 460

Ala Ser Leu Asn Ala Ala His Pro Ala Gln Phe Thr Ala Gly Ala Ala

465 470 475

Pro Gly Leu Val Ala Val Tyr Thr Pro Asp Thr Ala Gly Pro Val Arg

480 485 490

Met Asn Gly Val Asn Ile Ser Gly Pro Glu Ser Asn Thr Ala Asn Leu

495 500 505

Pro Gly Thr Tyr Gly Tyr Asn Tyr Val Tyr Pro Thr Glu Ala Asp Phe

510 515 520

Asp Tyr Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Asn Leu Ile Arg Ile Pro Phe Arg

525 530 535 540

Trp Glu Arg Met Gln His Gly Leu Asn Val Pro Leu Asn Thr Ala Gln

545 550 555

Leu Gly Tyr Met Asp Thr Ala Val Ala Arg Ala Ser Ala Arg Gly Met

560 565 570

Lys Val Ile Leu Asp Met His Asn Tyr Ala Arg Cys Lys Val Gly Gly

575 580 585

Val Thr Tyr Lys Phe Gly Asp Ala Gln Leu Pro Ala Ser Ala Tyr Ala

590 595 600

Asp Val Trp Arg Arg Leu Ala Asp His Tyr Lys Asn Glu Pro Ala Ile

605 610 615 620

Tyr Gly Phe Asp Ile Met Asn Glu Pro Asn Gly Leu Ser Gly Gly Val

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Trp Pro Ala Tyr Ala Gln Ala Ala Val Asn Ala Ile Arg Glu Val Asn

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Leu Ser Thr Trp Val Ile Val Glu Gly Glu Phe Trp Ala Asn Ala Trp

655 660 665

Gly Phe Glu Thr Lys Asn Pro Tyr Leu His Asn Val Arg Asp Pro Val

670 675 680

Gly Arg Leu Met Phe Ser Ala His Ser Tyr Trp Ser Asp Ala Gly Thr

685 690 695 700

Asp Val Tyr Lys Thr Tyr Asp Glu Glu Gly Ala Tyr Pro Glu Met Gly

705 710 715

Val Asn Asn Val Lys Pro Phe Ile Asp Trp Leu Lys Lys His Asp Ala

720 725 730

Lys Gly Phe Val Gly Glu Tyr Gly Val Pro Asn Asn Asp Pro Arg Trp

735 740 745

Leu Val Val Leu Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Glu Gly Val

750 755 760

Ser Gly Thr Tyr Trp Ala Gly Gly Ala Trp Tyr Ser Gly Ser Pro Ile

765 770 775 780

Ser Cys His Pro Ser Ser Asn Tyr Thr Val Asp Arg Ala Val Met Ser

785 790 795

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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Met Asn Thr Thr Pro Gln Pro Thr Pro Ala Arg Arg Thr Pro Arg Arg

-35 -30 -25

ccg ttc ctc gcc acc ctc gct acc atc ctc ggc ctc gcc gcc tcc gtc 96

Pro Phe Leu Ala Thr Leu Ala Thr Ile Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val

-20 -15 -10

tcc tcc gtc tcc gcc gcc gac tgg tat ctc gat aaa aac cag gcc cgc 144

Ser Ser Val Ser Ala Ala Asp Trp Tyr Leu Asp Lys Asn Gln Ala Arg

-5 -1 1 5 10

tac gcc agc tgg gac acc ctc gcc gac tgg aaa ccc aac ccc gac ggc 192

Tyr Ala Ser Trp Asp Thr Leu Ala Asp Trp Lys Pro Asn Pro Asp Gly

15 20 25

agc ggc tcc aac ccc tcc gcc ctc tcc ccc tcc gac acc tac cac ctc 240

Ser Gly Ser Asn Pro Ser Ala Leu Ser Pro Ser Asp Thr Tyr His Leu

30 35 40

aac ggc ttc atg ctc cgc acc ccc gag ggc ggc tcc acc tac acc ttc 288

Asn Gly Phe Met Leu Arg Thr Pro Glu Gly Gly Ser Thr Tyr Thr Phe

45 50 55

acc ggc ggc ctc ctc agc ctc gcc aac aac gcc gac aac ttc gcc ctc 336

Thr Gly Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Asn Ala Asp Asn Phe Ala Leu

60 65 70 75

aag acc acc ggc tcc ggc gtc tcc atc atc ccc gcc ctg cgc acc acc 384

Lys Thr Thr Gly Ser Gly Val Ser Ile Ile Pro Ala Leu Arg Thr Thr

80 85 90

gcc ggc ctc gtc caa aac gtc ggc tcc ggc acg caa aac ctc cag gtt 432

Ala Gly Leu Val Gln Asn Val Gly Ser Gly Thr Gln Asn Leu Gln Val

95 100 105

ggc cac tac caa aac ctc tcc ggc acg acc tcc tac tac gcc cag acc 480

Gly His Tyr Gln Asn Leu Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Tyr Ala Gln Thr

110 115 120

ggg cgc ggc ctc aac ctc gcc atc acc acc ctc gtg ggc tcc ggc cag 528

Gly Arg Gly Leu Asn Leu Ala Ile Thr Thr Leu Val Gly Ser Gly Gln

125 130 135

ttc cgc ttc tac ggc ggc ggc acc tac tac ctc tcc ctc gcc aac tcc 576

Phe Arg Phe Tyr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Leu Ser Leu Ala Asn Ser

140 145 150 155

ccg acc tac gac ggc gac atc tac gtc caa tcc ggc acc atc gat ttc 624

Pro Thr Tyr Asp Gly Asp Ile Tyr Val Gln Ser Gly Thr Ile Asp Phe

160 165 170

aac aac gac ctc gcc acc gcc ggc act ctc acc gtc aac acc ggt gcc 672

Asn Asn Asp Leu Ala Thr Ala Gly Thr Leu Thr Val Asn Thr Gly Ala

175 180 185

aag gtc gcc ctc gac cag gcc gtc acc ttc acc ggc ctc acc ata gcc 720

Lys Val Ala Leu Asp Gln Ala Val Thr Phe Thr Gly Leu Thr Ile Ala

190 195 200

ggc aca gcg tat cca gtt gga aac tac agc tac gcc gcg ctt cag gcc 768

Gly Thr Ala Tyr Pro Val Gly Asn Tyr Ser Tyr Ala Ala Leu Gln Ala

205 210 215

gcc cac ccc gcc gtt ttc gtc tcc ggc acc tcc ggc gga gcc atc aac 816

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240 245 250

gcc agc tgg aac acc ctc gcc cat tgg cgc gcc aac ccc gac ggc acc 912

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255 260 265

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Gly Ala Thr Ala Asp Ser Ile Asn Ser Phe Asp Asn Tyr Ile Asn Gln

270 275 280

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Val Ser Gly Arg Thr Leu Arg Thr Pro Glu Thr Thr Ala Thr Phe Ala

285 290 295

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Pro Ala Gly His Ser Ser Thr Ile Pro Ala Phe Ala Thr Ser Gly Ser

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att tcc atc acc aac ggc ttc agc agc atc acc cag ccc ctc gtc atc 1152

Ile Ser Ile Thr Asn Gly Phe Ser Ser Ile Thr Gln Pro Leu Val Ile

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Gly Asp Trp His Leu Gly Ala Gly Thr Ala Gln Val Ser Val Pro Ser

350 355 360

acc agc acc gtg cag ctc acc gtc gat aaa ctc tcc ggc gac ggc acc 1248

Thr Ser Thr Val Gln Leu Thr Val Asp Lys Leu Ser Gly Asp Gly Thr

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Ala Ser Gln Ile Gly Thr Gly Gly Thr Leu Val Val Glu Ser Thr Gly

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430 435 440

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Val Tyr Pro Pro Asp Thr Thr Gly Pro Ala His Met Phe Gly Val Asn

480 485 490

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Asp Tyr Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Tyr His Gly Lys

510 515 520

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Gly Leu Lys Leu Ile Arg Leu Pro Phe Lys Trp Glu Arg Leu Gln His

525 530 535

acc ctc aac gcc ccc ctc aac gcc gcc gag ctc gcc cgc atc gac acc 1776

Thr Leu Asn Ala Pro Leu Asn Ala Ala Glu Leu Ala Arg Ile Asp Thr

540 545 550 555

gtc gtc ggc tac gcc tcc gcg cgc ggc atg aag gtc gtc ctc gac atg 1824

Val Val Gly Tyr Ala Ser Ala Arg Gly Met Lys Val Val Leu Asp Met

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cac aac tac gcc cgc cgc aaa gaa agc ggc acc acc tac ctc atc ggc 1872

His Asn Tyr Ala Arg Arg Lys Glu Ser Gly Thr Thr Tyr Leu Ile Gly

575 580 585

acc ggc ccc gtc acc atg gac gcc ttc ggc gac gtc tgg cgt cgc atc 1920

Thr Gly Pro Val Thr Met Asp Ala Phe Gly Asp Val Trp Arg Arg Ile

590 595 600

gcc gat cac tac aag ggc aac ccc gcc atc tac ggc tac ggc atc atg 1968

Ala Asp His Tyr Lys Gly Asn Pro Ala Ile Tyr Gly Tyr Gly Ile Met

605 610 615

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Ala Val Asn Ala Ile Arg Thr Val Asp Leu Thr Thr His Val Ile Val

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tgc tac ttc gat tcc aac ctc tcc ggc acc tac acc caa agc tac gat 2208

Cys Tyr Phe Asp Ser Asn Leu Ser Gly Thr Tyr Thr Gln Ser Tyr Asp

685 690 695

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Gly Val Pro Gly Asn Asp Pro Arg Trp Leu Val Val Leu Asp Asn Phe

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Leu Ala Tyr Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Thr Tyr Trp Ala Gly

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<212> PRT

<213> 未知的

<220>

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Ser Ser Val Ser Ala Ala Asp Trp Tyr Leu Asp Lys Asn Gln Ala Arg

-5 -1 1 5 10

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Asn Asn Asp Leu Ala Thr Ala Gly Thr Leu Thr Val Asn Thr Gly Ala

175 180 185

Lys Val Ala Leu Asp Gln Ala Val Thr Phe Thr Gly Leu Thr Ile Ala

190 195 200

Gly Thr Ala Tyr Pro Val Gly Asn Tyr Ser Tyr Ala Ala Leu Gln Ala

205 210 215

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Ala Ser Trp Asn Thr Leu Ala His Trp Arg Ala Asn Pro Asp Gly Thr

255 260 265

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270 275 280

Val Ser Gly Arg Thr Leu Arg Thr Pro Glu Thr Thr Ala Thr Phe Ala

285 290 295

Gly Gly Ser Leu Val Leu Ala Asp Gly Gly Asn Leu Ser Leu Lys Ala

300 305 310 315

Pro Ala Gly His Ser Ser Thr Ile Pro Ala Phe Ala Thr Ser Gly Ser

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Ile Ser Ile Thr Asn Gly Phe Ser Ser Ile Thr Gln Pro Leu Val Ile

335 340 345

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350 355 360

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365 370 375

Leu Gln Phe Gln Asn Gly Gly Lys Tyr Thr Leu Asn Ile Arg Gly Ala

380 385 390 395

Ser Ala Phe Thr Gly Thr Leu Arg His Leu Ser Gly Thr Leu Thr Val

400 405 410

Ala Ser Gln Ile Gly Thr Gly Gly Thr Leu Val Val Glu Ser Thr Gly

415 420 425

Ala Val Lys Leu Asp His Pro Gly Phe Phe Thr Gly Val Thr Val Ala

430 435 440

Gly Thr Pro Leu Ala Pro Gly Tyr His Thr Tyr Ala Ala Leu Lys Ala

445 450 455

Ala His Pro Ala Arg Phe Pro Thr Gly Ser Thr Asn Ala Phe Leu Ala

460 465 470 475

Val Tyr Pro Pro Asp Thr Thr Gly Pro Ala His Met Phe Gly Val Asn

480 485 490

Leu Ala Gly Gly Glu Phe Gly Thr Pro Met Pro Gly Val Tyr Gly Thr

495 500 505

Asp Tyr Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Tyr His Gly Lys

510 515 520

Gly Leu Lys Leu Ile Arg Leu Pro Phe Lys Trp Glu Arg Leu Gln His

525 530 535

Thr Leu Asn Ala Pro Leu Asn Ala Ala Glu Leu Ala Arg Ile Asp Thr

540 545 550 555

Val Val Gly Tyr Ala Ser Ala Arg Gly Met Lys Val Val Leu Asp Met

560 565 570

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575 580 585

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590 595 600

Ala Asp His Tyr Lys Gly Asn Pro Ala Ile Tyr Gly Tyr Gly Ile Met

605 610 615

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Ala Val Asn Ala Ile Arg Thr Val Asp Leu Thr Thr His Val Ile Val

640 645 650

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Asn Leu Asp Thr Gln Asp Pro Val Gly Arg Leu Ile Tyr Glu Ala His

670 675 680

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Val Glu Trp Leu Gln Glu Thr Gly Asn Lys Gly Phe Ile Gly Glu Tyr

720 725 730

Gly Val Pro Gly Asn Asp Pro Arg Trp Leu Val Val Leu Asp Asn Phe

735 740 745

Leu Ala Tyr Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Thr Tyr Trp Ala Gly

750 755 760

Gly Pro Trp Trp Gly Asn Tyr Pro Leu Ser Cys Glu Pro Thr Ser Asn

765 770 775

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780 785 790

<210> 5

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<212> DNA

<213> 未知的

<220>

<223> 环境样品

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2505)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(105)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (106)..(2505)

<400> 5

atg aaa cac cac cac acc aca cca cac acc ccg cgt cgg acc ctg ctc 48

Met Lys His His His Thr Thr Pro His Thr Pro Arg Arg Thr Leu Leu

-35 -30 -25 -20

cgc tcg ctt gcc ggc ctg ctg gct ctc gcc acc ggc ctc gcc tcc acc 96

Arg Ser Leu Ala Gly Leu Leu Ala Leu Ala Thr Gly Leu Ala Ser Thr

-15 -10 -5

gcc cac gcc gcc gac tac tac ctc aaa gtc aac caa ccc cac ccc aac 144

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agc tgg gcc tca ccc gtc acc gat tgg gcc gcc aac ccc gac ggc acc 192

Ser Trp Ala Ser Pro Val Thr Asp Trp Ala Ala Asn Pro Asp Gly Thr

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Gly Ala Ala Pro Ala Ala Ile Ala Ala Pro Asp Thr Phe Tyr Thr Asn

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Asn Arg Thr Leu Arg Thr Pro Ala Val Gly Val Asn Ala Thr Phe Pro

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ggc ggc gtc ctc ggc cta aac ggc ggc gtc atc ggc ata aaa acc ggc 336

Gly Gly Val Leu Gly Leu Asn Gly Gly Val Ile Gly Ile Lys Thr Gly

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Pro Ser Ala Phe Ser Ile Ala Pro Lys Leu Val Ser Thr Ala Gly Ala

80 85 90

atc gag tcc tgg ggc aca ccc caa aac ttc cgc gcc gac gac tgg gag 432

Ile Glu Ser Trp Gly Thr Pro Gln Asn Phe Arg Ala Asp Asp Trp Glu

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cat acg ctc aag gtc tcc gtc ggc aaa ctc tcc ggc acc ggc gaa atc 528

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Arg Val His Gly Gly Gly Thr Val Leu Leu Asp Val Thr Asp Ala Glu

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aac tac ctc ggc acc ctc tgc gtc gcc tcc ggc gcg ttg aac ttc gac 624

Asn Tyr Leu Gly Thr Leu Cys Val Ala Ser Gly Ala Leu Asn Phe Asp

160 165 170

aac gcc gtc ttc tcc tcc ggc ccc ctc gac atc aag acc ggc gcc acc 672

Asn Ala Val Phe Ser Ser Gly Pro Leu Asp Ile Lys Thr Gly Ala Thr

175 180 185

gtc gtc ctc gac cag gcc gtc tcc ttc gcc ggc ctc gcc gtc gga gcc 720

Val Val Leu Asp Gln Ala Val Ser Phe Ala Gly Leu Ala Val Gly Ala

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acc gag tat cca ccc ggc aac tac acc ctc gcc gcc ctg caa gcc gcc 768

Thr Glu Tyr Pro Pro Gly Asn Tyr Thr Leu Ala Ala Leu Gln Ala Ala

210 215 220

cac ccg ggc gtc ttc acc ggc acc gcc gcc ggc tcc atc acc gtc cgc 816

His Pro Gly Val Phe Thr Gly Thr Ala Ala Gly Ser Ile Thr Val Arg

225 230 235

gcc ccg cgc acc tgg tat ctc acc gtc agc cag ggc tcc cag aac tgg 864

Ala Pro Arg Thr Trp Tyr Leu Thr Val Ser Gln Gly Ser Gln Asn Trp

240 245 250

acc gag gcc ttc ctc tcc aac tgg aac tcc gcc gcc aac ggc tcc ggc 912

Thr Glu Ala Phe Leu Ser Asn Trp Asn Ser Ala Ala Asn Gly Ser Gly

255 260 265

gtc gcc ccg aac tac atc aac ggc cac gac atc tac ctc aac cag gtg 960

Val Ala Pro Asn Tyr Ile Asn Gly His Asp Ile Tyr Leu Asn Gln Val

270 275 280 285

aac aac cgc gag ctc cgc acg ccc tac acc gcc agc acc ttc acc ggc 1008

Asn Asn Arg Glu Leu Arg Thr Pro Tyr Thr Ala Ser Thr Phe Thr Gly

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ggc acc ctc gcc ctc acc ttc ggc tcg aag ctc gtc gtc aag acc tca 1056

Gly Thr Leu Ala Leu Thr Phe Gly Ser Lys Leu Val Val Lys Thr Ser

305 310 315

ccc aac ctc gtc agc acc atc ccc gcc ctc gtc acc tcc ggc acc ccg 1104

Pro Asn Leu Val Ser Thr Ile Pro Ala Leu Val Thr Ser Gly Thr Pro

320 325 330

cag ttc gcc aac ggc agc ggc agc cgc caa aac ctc gcc atc ggc gac 1152

Gln Phe Ala Asn Gly Ser Gly Ser Arg Gln Asn Leu Ala Ile Gly Asp

335 340 345

tgg gac atc atc tcc ggc acc agc cgc ctc gtc gcc ggc tcc acc cgg 1200

Trp Asp Ile Ile Ser Gly Thr Ser Arg Leu Val Ala Gly Ser Thr Arg

350 355 360 365

tcc ctc ggc ttc gac atc ggc tgg ctc acc ggc gcg ggc aac ctc cag 1248

Ser Leu Gly Phe Asp Ile Gly Trp Leu Thr Gly Ala Gly Asn Leu Gln

370 375 380

acc gaa ggc ggc ggc tcg ttc ttc ctc cgc ctc atc gac ggc tcc ggc 1296

Thr Glu Gly Gly Gly Ser Phe Phe Leu Arg Leu Ile Asp Gly Ser Gly

385 390 395

tac acc ggc gcc atc aac cac aac tcc ggc gcc ctc cgc ttc gag tcc 1344

Tyr Thr Gly Ala Ile Asn His Asn Ser Gly Ala Leu Arg Phe Glu Ser

400 405 410

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Val Phe Ser Thr Ala Gly Ala Leu Asn Ile Gly Ala Ser Ala Thr Val

415 420 425

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430 435 440 445

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Ala Lys Pro Ala Gly Ile His Thr Tyr Ala Ser Leu Asn Ala Ala His

450 455 460

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Pro Ala Gln Phe Asn Ala Gly Ala Ala Pro Gly Leu Val Ala Val Tyr

465 470 475

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Thr Pro Asn Thr Ala Ala Pro Val Arg Met Asn Gly Val Asn Leu Ser

480 485 490

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Gly Pro Glu Ser Val Gly Gly Ala Gly Thr Pro Phe Pro Gly Thr Tyr

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Gly Phe Gln Trp Ile Tyr Pro Thr Val Ala Asp Tyr Asp Tyr Tyr Ala

510 515 520 525

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Ala Lys Gly Leu Asn Leu Ile Arg Ile Pro Phe Arg Trp Glu Arg Met

530 535 540

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Gln Gly Thr Leu Asn Gly Pro Leu Ile Ala Ala Glu Leu Ala Arg Met

545 550 555

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Asp Asn Ala Ile Ala Leu Ala Ser Ala Arg Gly Met Lys Val Ile Leu

560 565 570

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Asp Met His Asn Tyr Ala Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Ala Ser Tyr Val

575 580 585

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Phe Gly Asp Ala Gln Leu Pro Ala Ser Ala Phe Ala Asp Val Trp Arg

590 595 600 605

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Lys Leu Ala Asp His Tyr Lys Asn Glu Pro Ala Ile Tyr Gly Phe Asp

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640 645 650

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Trp Ile Ile Val Glu Gly Glu Thr Tyr Ala Asn Ser Trp Lys Phe Gly

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Asn Ala Val Phe Ser Ser Gly Pro Leu Asp Ile Lys Thr Gly Ala Thr

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415 420 425

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430 435 440 445

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<220>

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<220>

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<220>

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-1 1 5 10

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480 485 490

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Gly Glu Tyr Ala Met Ser Leu Asp Val Ser Ser Gly Lys His Arg Pro

625 630 635

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<213> 施氏假单胞菌

<400> 8

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-20 -15 -10 -5

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-1 1 5 10

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240 245 250

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255 260 265

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655

<210> 9

<211> 2409

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 密码子优化的

<400> 9

gcagactatt atctgaaagc atcacaaggc gcatcaaatc attggtcatc acatctgaca 60

gattggacag caaatgcaga tggcacaggc gcaaatccga cagttattgg cctggcagat 120

acatttgata caaataatcg cacactgaga acaccggcag ttaatgcaac aacaacatat 180

cctggcggag ttctgagact gtcaggcgga gcaggcgtta ttggcatgaa aacaggcgga 240

acagcagttg caattgttcc gaaactggtt tcaacagcag gcacagttga tgcatggcat 300

acaggcacac agtattttag agcagatgat tgggaaaatc ttgcatcagg cacaggcttt 360

acagcactga aagcagtcgc aggcagaaca cttaaagttt cagttggcaa actgacaggc 420

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gtttcaggac cgctggttat tgaaacaggc gctacagttg ttctggatca agcagtttca 600

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acatatctga gcaattggaa ttcagcagca aatggatcag gcgttgcacc gacatcaatt 840

aatggctatg acttttatat cgatcaggtc agcaatcgcg aaattagaac accgtcaaca 900

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gaagcggact ttgattatta tgcatcaaaa ggcctgaacc tgattagaat tccgtttaga 1620

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tatggctttg acattatgaa tgaaccgaat ggcctgagcg gaggcgtttg gcctgcgtat 1920

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catccgtaa 2409

<210> 10

<211> 2452

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 密码子优化的

<400> 10

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tatctggata aaaatcaagc aagatatgcg agctgggata cactggcaga ttggaaaccg 120

aatccggatg gctcaggctc aaatccgtca gcactgtcac cgtcagatac atatcatctg 180

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ggcagaggcc tgaatctggc aattacaaca ctggttggct caggacagtt tagattttat 480

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aatacaggcg caaaagttgc actggatcaa gcagttacgt ttacaggact gacaattgca 660

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ccggcatttg caacatcagg cagcatttca attacaaacg gctttagctc aattacacaa 1080

ccgctggtta ttggcgattg gcatcttggc gctggcacag cacaagtttc agttccgtca 1140

acatcaacag ttcaactgac agtcgataaa ctgagcggag atggcacact gcaatttcaa 1200

aatggcggta aatatacgct gaacattaga ggcgcatcag cttttacagg cacattaaga 1260

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ccggcacata tgtttggcgt taatctggct ggcggagaat ttggaacacc gatgcctggc 1560

gtttatggca cagattatat ctatccgagc gcagcagcat ttgattatta tcatggcaaa 1620

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ggcatgaaag ttgttctgga tatgcataac tatgcgcgta gaaaagaatc aggcacgaca 1800

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agcacaaata caacgtggcc tcaaatggcg caaacagcag ttaatgcaat tagaacagtt 1980

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tcaaaaaatc cgaatctgga tacacaagat ccggtcggca gactgattta tgaagcacat 2100

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catccgatga ttggcgttga tagagttaga gaatttgtcg aatggcttca agaaacaggc 2220

aacaaaggct ttattggaga atatggcgtt ccgggaaatg atccgagatg gctggttgtt 2280

cttgataatt ttctggcata tctggatgca aatggcgtta gcggaacata ttgggcaggc 2340

ggaccgtggt ggggcaatta tccgctgtca tgcgaaccga catcaaatta cacagttgat 2400

aaaccgcaaa tgagcgtcct ggaaaactac aactaaacgc gttaatcaat aa 2452

<210> 11

<211> 2403

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 密码子优化的

<400> 11

gcagattatt atctgaaagt taatcaaccg catccgaatt catgggcatc accggttaca 60

gattgggcag caaatccgga tggcacaggc gcagcaccgg cagcaattgc ggcaccggat 120

acattttata caaataatag aacacttcgc acaccggctg ttggcgttaa tgcaacattt 180

cctggcggag ttctgggcct gaatggcgga gtcattggca ttaaaacagg accgtcagca 240

ttttcaattg caccgaaact ggtttcaaca gcaggcgcaa ttgaatcatg gggcacaccg 300

cagaatttta gagcagatga ttgggaatca aatgcaccgt ttccgacatt tacaggcctg 360

agaacagcat caaatcatac acttaaagtt agcgttggca aactgagcgg aacaggcgaa 420

attagagttc atggcggagg cacagttctg ctggatgtta cagatgcaga aaattatctg 480

ggcacactgt gcgttgcatc aggcgcactg aattttgata atgcagtttt ttcatcagga 540

ccgctggata tcaaaacagg cgcaacagtt gttctggatc aagcagtttc atttgcaggc 600

cttgcagttg gagcaacaga atatccgcct ggcaattata cactggcagc actgcaagca 660

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acatggtatc tgacagtttc acaaggctca caaaattgga cagaagcatt tctgtcaaat 780

tggaattcag cagcaaatgg ctcaggcgtc gcaccgaatt atatcaatgg acatgatatc 840

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gttagcacaa ttccggcact ggttacatct ggaacaccgc aatttgcgaa tggcagcggc 1020

tcaagacaaa atctggcaat tggcgattgg gatattatct caggcacatc aagactggtt 1080

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caaacagaag gcggaggctc attttttctg agactgattg atggatcagg ctatacaggc 1200

gctattaacc ataattctgg cgctctgaga tttgaaagcg tttttagcac agctggcgca 1260

cttaatattg gcgcatcagc aacagttcat cttgataaac cggtctatgt ttcaggcctt 1320

agcgttgcag gcgttgcgaa accggcaggc attcatacat atgcatcact taatgcagcg 1380

catccggcac aatttaatgc aggcgctgct ccgggacttg ttgcagttta tacaccgaac 1440

acagcagctc cggttagaat gaatggcgtc aatctgtcag gaccggaatc agttggcgga 1500

gcaggtacac cttttccggg aacatatggc tttcaatgga tttatccgac agtcgcggat 1560

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atgcaaggca cactgaatgg accgctgatt gcagcggaac tggcaagaat ggataatgca 1680

attgcgctgg catcagcgag aggcatgaaa gttattctgg atatgcataa ctatgcacgc 1740

tatagaacac cgacagcatc atatgttttt ggagatgcgc aacttccggc atcagcattt 1800

gcagatgttt ggagaaaact ggcggatcac tataaaaacg aaccggcaat ttatggcttt 1860

gacattatga atgaaccgca ttcaatgccg acaccgacaa cgtggccgac atatgcacaa 1920

gcagcagttc atgcaattag agaagtcaat ctggatacat ggattatcgt tgaaggcgaa 1980

acatatgcga actcatggaa atttggcgaa aaaaatccgc atctgcataa tgttagagat 2040

ccggttggca gactgatgtt ttcagcacat tcatattggt gcaaaaatgg cgacgatcgc 2100

tatggcacgt atgatgcgga aaatggccat ccgcaaatgg gcgttgattc actgaaacat 2160

tttgttgatt ggctgcgcaa acataatgca catggctttg ttggcgaata tggcgttccg 2220

aataatgatc cgagatggct ggaagttctg gaaaatgcac tgatttatct ggcgaacgaa 2280

aacattagcg gcacatattg ggcaggcgga gcatggctgg caggctcaca tatttcatgc 2340

catccgtcat ctaactatac agttgatcgt ccggttatga gcgtcctgca aaattatccg 2400

taa 2403

<210> 12

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 密码子优化的

<400> 12

tcatcagttg cagcagtttc agtttcagca aaaatcaatg cgtttacgaa tagcgattgg 60

ctgaatggca tttggagaac aggcgcaggc ttttcaattc cggcaacatc agcaaataga 120

gcagcatttg ttgcaggcgc atcagttaga ctggcagatg gccaagttag aaaaattagc 180

agagcacaaa ttgtcggcag caacatgtca atttttctgg aaggcgcaaa actggatggc 240

aataaagttg gcgcaccgca agttgttaca attggctcaa cagcagttac agcaccggat 300

acatcagcac cgattacaac accgcctaca gtcacagcac attcaacatc aattaacgcc 360

tttacaaata atgactggct taacggcgtt tggcgcaaat caccgggatt tagcattccg 420

gcatctgcag cgaataaagc ggcttttaaa gttggagcaa cagcaaaact tgcggatgga 480

caggttcgca aaattacaca agttcaagtt gttggcgcta acatgagcgt ttatcttgaa 540

ggcgcagcag tcaatggctc agttgttgga gcaccgaata aactggcact ggcaacaaca 600

agcacaacat caccggcacc gacaccggct ccgtcagctc cgacaccgtc agttattgca 660

acatcaaatc tgaacaacta tacaaatgcg cagtggctga acggaatgta tagaacagca 720

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gtcagacttg ctgatggcca gacaagaaaa gttctgagag cacaactggt tggctcaaat 840

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<210> 13

<211> 811

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> HISTAG'ed

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(9)

<223> His标签

<400> 13

Met His His His His His His Pro Arg Ala Asp Tyr Tyr Leu Lys Ala

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Val Ser Ser Gly Ala Ala Asp Phe Asp Asn Asn Val Phe Val Ser Gly

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Ala Ser Gly Ala Lys Leu Thr Leu Lys Ser Ser Pro Gly Val Val Ser

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Gly Gly Ser Phe Arg Gln Ser Leu Ala Leu Gly Asp Trp Glu Ile Ala

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Gly Ser Tyr Phe Leu Ser Leu Asp Asp Gly Ser Gly Tyr Thr Gly Thr

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530 535 540

Arg Ile Pro Phe Arg Trp Glu Arg Met Gln His Gly Leu Asn Val Pro

545 550 555 560

Leu Asn Thr Ala Gln Leu Gly Tyr Met Asp Thr Ala Val Ala Arg Ala

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Ser Ala Arg Gly Met Lys Val Ile Leu Asp Met His Asn Tyr Ala Arg

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Cys Lys Val Gly Gly Val Thr Tyr Lys Phe Gly Asp Ala Gln Leu Pro

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Trp Ala Asn Ala Trp Gly Phe Glu Thr Lys Asn Pro Tyr Leu His Asn

675 680 685

Val Arg Asp Pro Val Gly Arg Leu Met Phe Ser Ala His Ser Tyr Trp

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Ser Asp Ala Gly Thr Asp Val Tyr Lys Thr Tyr Asp Glu Glu Gly Ala

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Tyr Pro Glu Met Gly Val Asn Asn Val Lys Pro Phe Ile Asp Trp Leu

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Lys Lys His Asp Ala Lys Gly Phe Val Gly Glu Tyr Gly Val Pro Asn

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Asn Asp Pro Arg Trp Leu Val Val Leu Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Leu

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<210> 14

<211> 803

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> His tag'ed

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(9)

<223> His标签

<400> 14

Met His His His His His His Pro Arg Ala Asp Trp Tyr Leu Asp Lys

1 5 10 15

Asn Gln Ala Arg Tyr Ala Ser Trp Asp Thr Leu Ala Asp Trp Lys Pro

20 25 30

Asn Pro Asp Gly Ser Gly Ser Asn Pro Ser Ala Leu Ser Pro Ser Asp

35 40 45

Thr Tyr His Leu Asn Gly Phe Met Leu Arg Thr Pro Glu Gly Gly Ser

50 55 60

Thr Tyr Thr Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Asn Ala Asp

65 70 75 80

Asn Phe Ala Leu Lys Thr Thr Gly Ser Gly Val Ser Ile Ile Pro Ala

85 90 95

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130 135 140

Gly Ser Gly Gln Phe Arg Phe Tyr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Leu Ser

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Leu Ala Asn Ser Pro Thr Tyr Asp Gly Asp Ile Tyr Val Gln Ser Gly

165 170 175

Thr Ile Asp Phe Asn Asn Asp Leu Ala Thr Ala Gly Thr Leu Thr Val

180 185 190

Asn Thr Gly Ala Lys Val Ala Leu Asp Gln Ala Val Thr Phe Thr Gly

195 200 205

Leu Thr Ile Ala Gly Thr Ala Tyr Pro Val Gly Asn Tyr Ser Tyr Ala

210 215 220

Ala Leu Gln Ala Ala His Pro Ala Val Phe Val Ser Gly Thr Ser Gly

225 230 235 240

Gly Ala Ile Asn Val Arg Ala Pro Arg Asn Trp Tyr Leu Ser Thr His

245 250 255

Gln Pro Val Gly Ala Ser Trp Asn Thr Leu Ala His Trp Arg Ala Asn

260 265 270

Pro Asp Gly Thr Gly Ala Thr Ala Asp Ser Ile Asn Ser Phe Asp Asn

275 280 285

Tyr Ile Asn Gln Val Ser Gly Arg Thr Leu Arg Thr Pro Glu Thr Thr

290 295 300

Ala Thr Phe Ala Gly Gly Ser Leu Val Leu Ala Asp Gly Gly Asn Leu

305 310 315 320

Ser Leu Lys Ala Pro Ala Gly His Ser Ser Thr Ile Pro Ala Phe Ala

325 330 335

Thr Ser Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asn Gly Phe Ser Ser Ile Thr Gln

340 345 350

Pro Leu Val Ile Gly Asp Trp His Leu Gly Ala Gly Thr Ala Gln Val

355 360 365

Ser Val Pro Ser Thr Ser Thr Val Gln Leu Thr Val Asp Lys Leu Ser

370 375 380

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<210> 22

<211> 1073

<212> PRT

<213> 类芽孢杆菌属物种

<220>

<221> 成熟肽

<222> (28)..(1973)

<400> 22

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-10 -5 -1 1 5

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25 30 35

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170 175 180

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185 190 195

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Leu Ser Met Phe Ser Ser Arg Ile Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala

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Glu Asn Asn Lys Gly Trp His Thr Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr

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585 590 595

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<210> 23

<211> 1078

<212> PRT

<213> 类芽孢杆菌属物种

<220>

<221> 成熟肽

<222> (28)..(1078)

<400> 23

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

-25 -20 -15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala His His His His His

-10 -5 -1 1 5

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170 175 180

Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala Leu Ala Gly Ile Asn Gly Lys

185 190 195

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<210> 24

<211> 968

<212> PRT

<213> 类芽孢杆菌属物种

<220>

<221> 成熟肽

<222> (28)..(968)

<400> 24

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

-25 -20 -15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala His His His His His

-10 -5 -1 1 5

His Pro Arg Gly Gly Glu Ala Ser Gly Ser Ala Asp Asp Ala Ala Glu

10 15 20

Thr Ala Glu Ala Ala Glu Gly Glu Asn Ile Glu Asp Lys Met Val Ser

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Met Ala Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Ser Pro Leu His Ser Asn Ala

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Leu Met Tyr Asp Ser Leu Thr Pro Ala Gln Ile Ala Asn Tyr Met Asn

185 190 195

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Ser Trp Lys Ala Ile Val Val Ala Val Arg Gly Ile Leu Val Lys Asp

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330 335 340

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345 350 355

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585 590 595

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935 940

Claims (24)

1.一种具有黄原胶降解活性的糖基水解酶家族5的多肽，

其中所述多肽由SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 6的成熟多肽组成。

2.一种编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。

3.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。

4.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列，其中所述重组宿主细胞不是植物细胞。

5.一种产生具有对黄原胶的活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求4所述的宿主细胞。

6.一种产生具有对黄原胶的活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，其中所述转基因植物或植物细胞用编码权利要求1的多肽的多核苷酸转化。

7.如权利要求6所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

8.一种包含如权利要求1所述的多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。

9.一种包含如权利要求1所述的多肽的组合物。

10.如权利要求9所述的组合物，该组合物进一步包含具有黄原胶裂解酶活性的多肽。

11.如权利要求10所述的组合物，其中具有黄原胶裂解酶活性的多肽是由SEQ ID NO:21、22、23或24中任一项的氨基酸序列组成的多肽。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的组合物用于降解黄原胶的用途。

13.如权利要求12所述的用途，用于控制钻井液的粘度。

14.一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括向黄原胶施用根据权利要求9至11中任一项所述的组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中该黄原胶在纺织品或硬表面的表面上。

16.如权利要求14所述的方法，其中该黄原胶在由钻井孔穿透的地下地层的压裂中使用。

17.如权利要求14所述的方法，其中该黄原胶是钻孔滤饼中的组分。

18.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括：用根据权利要求9至11中任一项所述的组合物和选自纤维素酶和半纤维素酶的至少一种酶处理纤维素材料，或在如权利要求1所述的多肽和选自纤维素酶和半纤维素酶的至少一种酶的存在下处理纤维素材料。

19.如权利要求18所述的方法，其中该纤维素材料是经预处理的。

20.如权利要求19所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

21.如权利要求20所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收降解的纤维素材料。

23.如权利要求22所述的方法，其中该降解的纤维素材料是糖，该糖选自下组，该组由以下组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。

24.一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括：

(a)在权利要求1的多肽和选自纤维素酶和半纤维素酶的至少一种酶的存在下，或在根据权利要求9至11中任一项所述的组合物和选自纤维素酶和半纤维素酶的至少一种酶的存在下使纤维素材料糖化；

(b)用一种或多种发酵微生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且

(c)从发酵中回收该发酵产物。