CN1904032A

CN1904032A - 一种黄原胶降解菌及其发酵方法和应用

Info

Publication number: CN1904032A
Application number: CN 200510046945
Authority: CN
Inventors: 杜昱光; 刘晗; 黄成栋; 白雪芳
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2005-07-28
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2007-01-31

Abstract

本发明涉及一种新鞘氨醇单胞菌属的细菌，特别是一种黄原胶降解菌及其发酵方法和应用，其命名为黄原胶降解菌XT－11，即Sphingomonas sp.XT－11，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏中心，保藏日期：2005年7月25日，其保藏编号为CGMCC NO.1421。本发明已针对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定生产具有降解黄原胶能力的酶。

Description

一种黄原胶降解菌及其发酵方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新鞘氨醇单胞菌属的细菌，特别是一种黄原胶降解菌及其分离培养方法和发酵方法与应用。

背景技术

黄原胶是一种由野油菜黄单孢菌分泌的中性水溶性多糖，又称汉生胶。其结构由五糖单位重复构成，主链与纤维素相同即由β-1，4糖苷键相连的葡萄糖构成，三个相连的单糖组成其侧链：甘露糖→葡萄糖→甘露糖。黄原胶由于其独特的剪切稀释性质，良好的增稠性，理想的乳化稳定性，对酸、碱、热、反复冻融的高度稳定性，以及对人体的完全无毒害等许多优良的特性，因而在食品、石油、医药、日用化工等十几个领域有着极其广泛的应用，其商品化程度之高，应用范围之广，令其他任何一种微生物多糖都望尘莫及。但同时也引起了一些应用问题。采油过程中黄原胶的使用可提高采油率，但也增加了原油的粘度，使后续工艺如油料运输及产品纯化的成本增高，为此需要能方便降解黄原胶的方法。同时，由于寡糖具有抗病毒、抑菌、植物诱抗、提高免疫力等功能，由植物致病菌分泌的黄原胶降解得到的寡糖是否也拥有某种生物活性也激起了人们强烈的兴趣。

目前降解黄原胶的方法有物理法、化学法、酶解法。其中酶解法以其降解过程容易控制、反应条件温和以及对环境没有污染等优点成为黄原胶降解的首选途径。随着市场需要的增加，寻找具有能分泌降解黄原胶能力酶的菌种是十分需要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在发酵过程中分泌黄原胶降解酶的新菌种，并提供该新菌种的分离培养方法和发酵工艺。

本发明所述的黄原胶降解菌(Sphingomonas sp.XT-11)菌株(CGMCCNO.1421)是从土壤中分离到的一株细菌，经分子鉴定表明它属于与鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)相似但又有区别的类群，定名为黄原胶降解菌XT-11(Sphingomonas sp.XT-11)。该菌分类位置比较独立，申请人已针对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定生产具有降级黄原胶能力的酶。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏中心，其简称为CGMCC，保藏日期：2005年7月25日，其保藏编号为CGMCC NO.1421。

所述黄原胶降解菌菌株的生物生化学特性为：

菌落形态特征：黄原胶固体培养基上生长良好，菌落呈圆形，凸起，较光滑，乳白色，湿润，不透明，边缘完整；

菌体形态特征：菌株在幼龄时期为杆菌，大小约为0.4~0.6×1.0~2.0μm，呈直杆形或稍弯曲，但在一周以上的培养物中，只存在0.5×0.5μm左右的类球状细胞；不运动，不形成芽孢，电镜照片显示有鞭毛；革兰氏染色阴性，抗酸性染色阴性；

主要生理生化特征：在黄原胶液体培养基中可产生黄原胶降解酶；可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊糖、纤维二糖、D-岩藻糖。但是不产酸不产气；该菌的氧化酶反应为阴性，而过氧化氢酶反应为阳性；不呈现卵磷脂酶和脲酶活性；该菌不能水解淀粉、纤维素、七叶苷、酪素、明胶和油脂等，但能够分解果胶；甲基红试验阳性，石蕊牛奶反应为暗红色产酸；能够由色氨酸生成吲哚并且能够产生硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；对半乳糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化发酵实验检测发现，该菌对上述各种糖均属发酵型代谢。该菌不能利用柠檬酸盐，在以葡萄糖为唯一碳源和氮源的培养基上也不能生长。

遗传学特征：

所述黄原胶降解菌XT-11菌株的16S rRNA全基因具有序列表SEQ IDNO：1中的碱基序列。菌株16S rRNA全基因序列(1362bp)(Genbank登录号为DQ 115797)为：

CATGCAAGTCGAACGAAGGCTTCGGCCTTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTG

GGAATCTGCCCCTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGGATG

ATGACGTAAGTCCAAAGATTTATCGCCGAGGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGGTA

GTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGCCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATG

ATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG

GGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAA

GGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGA

ATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCTAGCG

TTATTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTAAGAGGT

GAAAGCCGAGAGCTCAACTCTGGAATTGCCTTTTAGACTGCATCGCTTGAATCATG

GAGAGGTCAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAA

CACCAGTGGCGAAGGCGGCTGACTGGACATGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCG

TGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAAC

TAGCTGTCCGGACACTTGGTGTTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCG

CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCTGCAC

AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTT

TGACATGGCAGGACGACTTCCAGAGATGGATTTCTTCCCTTCGGGGACCTGCACA

CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG

CAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTTTAAAGGA

ACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCT

TACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAAGCACG

CGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTC

GAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATA

CGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACCCGA

AGGCGTTGCGCTAACTCGCAAGAGAGGCAGGCGACCACG

根据《Bergey’s Manual of Deteminative Bacteriology(Ninth Edition)》(JohnG.Holt et al.1994)，以及形态和生理生化特征，本发明菌株与鞘氨醇单胞菌有相似性，用Phylip软件包对其16S rRNA序列进行系统学分析，并应用邻接法(Neigbor-Joining)构建的系统树表明本菌株与鞘氨醇单胞菌属于同一类群，关系最紧密。16S rRNA序列分析表明，与Genbank国际基因序列数据库中记录的最相似的菌株Sphingomonas sp.J05(AJ 864842)的相似性达到99.78％。

所述黄原胶降解菌的发酵方法，

1)将黄原胶降解菌菌种接种于黄原胶固体培养基上，在28-32℃培养1-2天；

2)将固体培养基种子接于盛有种子培养基的培养瓶内，培养瓶内按1/5～1.5/5体积比加入种子培养基，于28-32℃下以190-210rpm转速振荡培养1-2天，成为二级种子液；

3)搅拌式发酵罐内按2.5/5～3.5/5体积比加入发酵培养基，0.02％消泡剂，常规蒸汽灭菌20-30分钟冷却至28-32℃，按1％接入二级种子液，培养2-5天，获得发酵物。

所述的黄原胶固体培养基为：琼脂粉：2％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，黄原胶：0.1-0.5％，葡萄糖：0.1-0.5％，水：97.3％；

所述种子培养基为：牛肉浸膏0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，蒸馏水1000ml，PH 6.8～7.0；

所述发酵培养基为：黄原胶：0.45％，葡萄糖：0.08％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，水：99.27％，pH7.0左右。

所述黄原胶降解菌XT-11可用于发酵生产具有降解黄原胶能力的酶。

本发明所述的黄原胶降解菌(Sphingomonas sp.XT-11)CGMCC NO.1421用于发酵，具有生产降解黄原胶能力的酶的用途。该菌能稳定地产生含量较高的黄原胶降解酶。而在此之前没有报道过利用生物酶解法降解黄原胶的方法，该菌还可以进一步遗传选育或改良得到更优良的工业生产用菌；对目前黄原胶降解酶日益增加的需求，本发明为之找到了一条新的生产途径。

具体实施方式

实施例1

一种黄原胶降解菌(Sphingomonas sp.XT-11)CGMCC NO.1421的发酵工艺：

1)将黄原胶降解菌纯菌种接种于黄原胶固体培养基上，在28℃培养2天；

2)将固体培养基种子接于盛于250ml三角瓶的50ml种子培养基中，于28℃以190rpm转速振荡培养48小时，即成为二级种子液；

3)于50升搅拌式发酵罐内加入30升发酵培养基，常规蒸汽灭菌30分钟冷却至30℃，按体积比1％接入二级种子液，培养3天，获得发酵产物。

黄原胶固体培养基组成为：琼脂粉：2％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，黄原胶：0.1％，葡萄糖：0.1％，水：97.3％；

种子培养基组成为：牛肉浸膏0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，蒸馏水1000ml，PH 6.8～7.0；

发酵培养基组成为：黄原胶：0.45％，葡萄糖：0.08％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，水：99.27％，pH6.8。

实施例2

一种黄原胶降解菌(Sphingomonas sp.XT-11)CGMCC NO.1421的发酵工艺：

1)将黄原胶降解菌纯菌种接种于黄原胶固体培养基上，在30℃培养1天；

2)将固体培养基种子接于盛于500ml三角瓶的150ml种子培养基中，于30℃以200rpm转速振荡培养24小时，即成为二级种子液；

3)于100升搅拌式发酵罐内加入50升发酵培养基，常规蒸汽灭菌30分钟冷却至30℃，按体积比1％接入二级种子液，培养3天，获得发酵产物。

黄原胶固体培养基组成为：琼脂粉：2％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，黄原胶：0.3％，葡萄糖：0.2％，水：97.3％；

发酵培养基组成为：黄原胶：0.45％，葡萄糖：0.08％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，水：99.27％，pH7.0。

实施例3

一种黄原胶降解菌(Sphingomonas sp.XT-11)CGMCC NO.1421的发酵工艺：

1)将黄原胶降解菌纯菌种接种于黄原胶固体培养基上，在32℃培养1天；

2)将固体培养基种子接于盛于500ml三角瓶的150ml种子培养基中，于32℃以210rpm转速振荡培养30小时，即成为二级种子液；

3)于100升搅拌式发酵罐内加入50升发酵培养基，常规蒸汽灭菌30分钟冷却至28℃，按体积比1％接入二级种子液，培养5天，获得发酵产物。

黄原胶固体培养基组成为：琼脂粉：2％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，黄原胶：0.5％，葡萄糖：0.5％，水：97.3％；

发酵培养基组成为：黄原胶：0.45％，葡萄糖：0.08％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，水：99.27％，pH7.2。

实施例4

按照常规方法进行黄原胶酶的制备，制备过程参考文献《黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究》，其发表在2005年微生物学通报第二期中，作者黄成栋、白雪芳等人。

黄原胶降解菌(Sphingomonas sp.XT-11)CGMCC NO.1421在实施例1-3的基础上制备黄原胶酶的方法：

1)将培养4-5天的发酵液(以培养液的粘度大幅度降低为根据)在9000rpm，4℃条件下离心15分钟以除去菌体，留上清液备用；

2)向上清液中分别加入35％饱和度的(NH₄)₂SO₄，静置40min，然后在9000rpm，4℃下离心20分钟，除去杂蛋白，留上清备用；

3)向上清液中分别加入65％饱和度的(NH₄)₂SO₄，静置40min，然后在9000rpm，4℃下离心20分钟，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀；

4)盐析后将之冷冻干燥即可得到黄原胶降解酶。

黄原胶

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院大连化学物理研究所

<120>一种黄原胶降解菌及其发酵方法和应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1362

<212>DNA

<213>黄原胶降解菌XT-11

<220>

<221>rRNA

<222>(1)..(1362)

<223>

<400>1

catgcaagtc gaacgaaggc ttcggcctta gtggcgcacg ggtgcgtaac gcgtgggaat 60

ctgccccttg gttcggaata acagttggaa acgactgcta ataccggatg atgacgtaag 120

tccaaagatt tatcgccgag ggatgagccc gcgtaggatt aggtagttgg tgtggtaaag 180

gcgcaccaag ccgacgatcc ttagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctgggactga 240

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc 300

ctgatccagc aatgccgcgt gagtgatgaa ggccttaggg ttgtaaagct cttttacccg 360

ggatgataat gacagtaccg ggagaataag ctccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg 420

taatacggag ggagctagcg ttattcggaa ttactgggcg taaagcgcac gtaggcggct 480

ttgtaagtaa gaggtgaaag cccagagctc aactctggaa ttgcctttta gactgcatcg 540

cttgaatcat ggagaggtca gtggaattcc gagtgtagag gtgaaattcg tagatattcg 600

gaagaacacc agtggcgaag gcggctgact ggacatgtat tgacgctgag gtgcgaaagc 660

gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gataactagc 720

tgtccggaca cttggtgttt gggtggcgca gctaacgcat taagttatcc gcctggggag 780

tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ctgcacaagc ggtggagcat 840

gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagcgt ttgacatggc aggacgactt 900

ccagagatgg atttcttccc ttcggggacc tgcacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 960

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgc ctttagttgc 1020

黄原胶

catcatttag ttgggcactt taaaggaacc gccggtgata agccggagga aggtggggat 1080

gacgtcaagt cctcatggcc cttacgcgct gggctacaca cgtgctacaa tggcggtgac 1140

agtgggcagc aagcacgcga gtgtgagcta atctccaaaa gccgtctcag ttcggattgt 1200

tctctgcaac tcgagagcat gaaggcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1260

gtgaatacgt tcccaggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt tggattcacc 1320

cgaaggcgtt gcgctaactc gcaagagagg caggcgacca cg 1362

Claims

1.一种黄原胶降解菌，其特征在于：命名为黄原胶降解菌XT-11，即Sphingomonas sp.XT-11，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏中心，保藏日期：2005年7月25日，其保藏编号为CGMCC NO.1421。

2.按照权利要求1所述黄原胶降解菌，其是从土壤中分离的一个新的鞘氨醇单胞菌属的细菌，其特征在于：

菌落形态特征为：黄原胶固体培养基上生长良好，菌落呈圆形，凸起，较光滑，乳白色，湿润，不透明，边缘完整；

菌体形态特征为：菌株在幼龄时期为杆菌，大小约为0.4~0.6×1.0~2.0μm，呈直杆形或稍弯曲，但在一周以上的培养物中，只存在0.5×0.5μm左右的类球状细胞；不运动，不形成芽孢，电镜照片显示有鞭毛；革兰氏染色阴性，抗酸性染色阴性；

主要生理生化特征：

在黄原胶液体培养基中可产生黄原胶降解酶；可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、D-棉子糖、菊糖、纤维二糖、D-岩藻糖。但是不产酸不产气；该菌的氧化酶反应为阴性，而过氧化氢酶反应为阳性；不呈现卵磷脂酶和脲酶活性；该菌不能水解淀粉、纤维素、七叶苷、酪素、明胶和油脂等，但能够分解果胶；甲基红试验阳性，石蕊牛奶反应为暗红色产酸；能够由色氨酸生成吲哚并且能够产生硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；对半乳糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化发酵实验检测发现，该菌对上述各种糖均属发酵型代谢。该菌不能利用柠檬酸盐，在以葡萄糖为唯一碳源和氮源的培养基上也不能生长。

3.按照权利要求1所述黄原胶降解菌，其特征在于：所述黄原胶降解菌XT-11菌株的16S rRNA全基因具有序列表SEQ ID NO：1中的碱基序列。

4.一种权利要求1所述黄原胶降解菌的发酵方法，其特征在于：

3)发酵罐内按2.5/5～3.5/5体积比加入发酵培养基，常规蒸汽灭菌20-30分钟冷却至28-32℃，按1％接入二级种子液，培养2-5天，获得发酵物。

5.按照权利要求4所述黄原胶降解菌的发酵方法，其特征在于：

所述黄原胶固体培养基为：琼脂粉：2％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，黄原胶：0.1-0.5％，葡萄糖：0.1-0.5％，水：97.3％。

6.按照权利要求4所述黄原胶降解菌的发酵方法，其特征在于：

所述发酵培养基为：黄原胶：0.45％，葡萄糖：0.08％，蛋白胨：0.1％，酵母浸出粉：0.1％，水：99.27％，pH 6.8～7.2。

7.一种权利要求1所述黄原胶降解菌的应用，其特征在于：黄原胶降解菌XT-11用于发酵生产具有降解黄原胶能力的酶。