CN107384799A - 降解羽毛菌株的筛选方法及其在降解羽毛方面的应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用微生物菌株降解羽毛废弃物的方法，属于微生物技术领域。该方法的具体步骤如下、菌株的筛选；羽毛的处理：将羽毛用清水洗干净后放入45℃‑55℃烘箱，烘干4‑5天备用、将培养基与经步骤处理后的羽毛进行高温高压灭菌后，接种微生物菌株ABTNL‑1，在37℃，160r/min条件下培养，36h降解率可达到85％，本发明所利用的微生物菌株可有效解决废弃羽毛的再生利用，得到可利用的氨基酸和多肤，减少环境污染。此外，微生物法降解羽毛，与物理化学法相比，无需提供设备，使能耗大大降低，同时，其降解效率高，发酵周期短，避免了大部分氨基酸的损失，提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

Description

降解羽毛菌株的筛选方法及其在降解羽毛方面的应用方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地说，涉及一种高效降解羽毛菌株的筛选及其在降解废弃羽毛的方法。

背景技术

数据显示，在全球范围内，羽毛年产量约为85亿t，在中国，羽毛年产量可高达1100万t；而废弃羽毛的年产量可高达10万t；羽毛属于天然角蛋白质，羽毛中角蛋白的含量高达90％左右，而角蛋白属于硬蛋白，很难被胃肠道内的消化酶消化，因此长期以来并未被高效利用，从而造成可利用资源的浪费。

近年来，随着养殖业规模化，集约化的飞速发展，每年可产生万余吨羽毛等羽毛废弃物。且数量还在持续增长。这些羽毛废弃物主要的处理方法为填埋、焚烧，给生态环境带来严重的挑战。

国内外很早就开展了羽毛废弃物的资源化利用，但采用的方法主要是物理法—高温高压、膨化，化学法—酸碱水解。这些方法在加工过程中存在很大的缺点，如：投资成本大，耗能大，污染环境，所得的羽毛粉的营养价值有不同程度的破坏，导致角蛋白利用率低。这些严重制约了技术的应用与普及。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种高效降解羽毛废弃物的方法，降低生产成本、降低能耗、避免环境污染。

为了达到上述目的，本发明提供了一种高效降解羽毛菌株的筛选方法，具体步骤为：

1、从废弃羽毛堆积点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于20ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；

2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的20-30ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

所述富集培养基的组成成分为：每1000ml的蒸馏水中加入：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，pH 7.4-7.6

3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

所述液体筛选培养基的配比为每1000ml水中加入氯化钠0.5-0.8g，磷酸氢二钾0.3-0.6g，磷酸二氢钾0.3-0.7g，羽毛粉8.0-20.0g，pH 8.0-8.5；

4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，稀释至10^-4-10^-8倍，将稀释液涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；

所述复筛过程采用的固体筛选培养基的配比为：每1000ml水中加入氯化钠0.5-0.8g，磷酸氢二钾0.3-0.6g，磷酸二氢钾0.3-0.7g，羽毛粉8.0-20.0g，琼脂粉10.0-20.0g，pH 8.0-8.5；

5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取单菌落进行平板划线；划线培养所得菌落即为高效降解羽毛菌株ABTNL-1；

6、菌种保藏：从步骤5划线平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取菌液与已灭菌的50％的甘油以1:1的比例混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

优选方式下，步骤4复筛中稀释过程，稀释到10^-5、10^-6或10^-7倍。

本发明还提供了一种上述高效降解羽毛菌株在降解羽毛方面的应用方法，以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述培养基中加入所述高效降解羽毛菌株ABTNL-1，37℃培养，即可实现羽毛降解。

优选方式下，上述高效降解羽毛菌株在降解羽毛方面的应用方法，具体操作为，取所述高效降解羽毛菌株ABTNL-1置于含有羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，即可实现羽毛降解；

所述高效降解羽毛菌株ABTNL-1的菌株浓度为1×10⁸～5×10⁹CFU/ml；

所述发酵培养基的配比为每1000ml水中加入硫酸镁0.05-0.3g，氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.2-0.5g，磷酸二氢钾0.4-0.9g，氯化钙0.01-0.1g，羽毛粉8.0g-20.0g，调节pH至8.0～8.5。

本发明所用的微生物菌株ABTNL-1是在羽毛堆积点的土壤中分离得到的，经过16SrRNA，BLAST，clustalx-2分析以及系统发育树的构建及形态学、生理生化鉴定结果，将该菌株定命名为Bacillus licheniformis ABTNL-1，该菌经发明人检测在培养36h后对羽毛的降解率高达85％。

相比于现有技术，本发明的优势在于：

1、本发明采用的微生物菌株ABTNL-1，该菌株可以从羽毛堆积点土壤中筛选获得，培养原料简单易得、来源广泛。

2、本发明菌株筛选过程中提供了多种培养基，使菌株的筛选过程更加高效准确，各筛选步骤得到的菌株纯度高，应用效果好。

3、本发明所涉及的Bacillus licheniformis ABTNL-1，可应用于降解羽毛，36h降解率可达到85％。同时，利用现代生物技术——基因工程、代谢组学、生物系统学等高科技技术，还可进一步提高该菌株的羽毛角蛋白降解效率，并通过降解产物而获得高附加值的营养成分，使该菌株的工业生产前景更加广阔。

4、本发明采用的微生物菌株ABTNL-1，该菌株不但能快速地降解羽毛，而且对角蛋白的降解效率高，可有效解决废弃羽毛的再生利用，得到可利用的氨基酸和多肽，减少环境污染；同时由于降解产物中所含附加营养成分较高，因而满足了工业化生产。

5、本发明微生物法降解羽毛，与物理化学法相比，无需提供设备，使能耗大大降低，同时，其降解效率高，发酵周期短，避免了大部分氨基酸的损失，提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

附图说明：

图1为微生物菌株Bacillus licheniformis ABTNL-1的扫描电镜照片；

图2为ABTNL-1的系统发育树；

图3为实施例4中在微生物菌株Bacillus licheniformis ABTNL-1的作用下36h羽毛的降解情况。

保藏信息

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ABTNL-1，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.10037。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

以下具体实施方式为对本发明的上述内容做进-步的详细说明，但并不意味着本发明上述主体的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：羽毛降解菌种的筛选1

从旅顺某屠宰场采集废弃羽毛及羽毛堆积点土壤。

通过富集培养和初筛、复筛、进一步分离纯化得ABTNL-1菌株。

试验装置与羽毛处理

粉碎羽毛的实验装置：220V，3.6KW的高速多功能粉碎机。

羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，55℃烘干5-7天，备用。羽毛经粉碎机粉碎，过100目筛子，供固体培养使用。

富集培养基的配制：分别称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，加入到含有1000ml蒸馏水的锥形瓶中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，溶解后用2mol/L的NaOH溶液调节pH为7.4-7.6。加盖密封，121℃，高温湿热灭菌20min。

培养基的分装：取已灭菌的富集培养基20ml置于已灭菌的50ml的离心管中备用。

筛选培养基的配制：以羽毛作为唯一的碳源氮源，只有可以利用羽毛的微生物菌株才能在该培养基上生长。根据液体筛选培养基的配方所需，称取氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.3g，磷酸二氢钾0.4g，溶解后，再加水至1L。pH 8.0-8.5取100ml于250ml的锥形瓶中，再加入羽毛1g。以此逐个分装。121℃，高温湿热灭菌20min。

固体筛选培养基的配制：在以上液体筛选培养基的基础上再加入琼脂粉20.0g即可。然后置于灭菌锅中，121℃，高温湿热灭菌20min。

具体的筛选步骤如下：

1、从旅顺某屠宰场废弃羽毛堆积点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于20ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；

2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的25ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，然后选取10^-5，涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；

5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取了单菌落进行平板划线；

6、菌种保藏：从固体平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取500μl于500μl已灭菌的50％的甘油混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

实施例2：羽毛降解菌种的筛选2

从旅顺某屠宰场采集废弃羽毛及羽毛堆积点土壤。

通过富集培养和初筛、复筛、进一步分离纯化得ABTNL-1菌株。

试验装置与羽毛处理

粉碎羽毛的实验装置：220V，3.6KW的高速多功能粉碎机。

羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，55℃烘干5-7天，备用。羽毛经粉碎机粉碎，过100目筛子，供固体培养使用。

富集培养基的配制：分别称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾1.0g，加入到含有1000ml蒸馏水的锥形瓶中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，溶解后用2mol/L的NaOH溶液调节pH为7.4-7.6。加盖密封，121℃，高温湿热灭菌20min。

培养基的分装：取已灭菌的富集培养基25ml置于已灭菌的50ml的离心管中备用。

筛选培养基的配制：以羽毛作为唯一的碳源氮源，只有可以利用羽毛的微生物菌株才能在该培养基上生长。根据液体筛选培养基的配方所需，称取氯化钠0.6g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.4g，溶解后，再加水至1L。pH 8.0-8.5取100ml于250ml的锥形瓶中，再加入羽毛1.5g。以此逐个分装。121℃，高温湿热灭菌20min。

固体筛选培养基的配制：在以上液体筛选培养基的基础上再加入琼脂粉20.0g即可。然后置于灭菌锅中，121℃，高温湿热灭菌20min。

具体的筛选步骤如下：

1、从旅顺某屠宰场废弃羽毛堆积点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于20ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；

2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的25ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，然后选取10^-7，涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；

5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取了单菌落进行平板划线；

6、菌种保藏：从固体平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取500μl于500μl已灭菌的50％的甘油混匀于1.5ml的离心管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

实施例3：菌种鉴定

本发明上述高效降解羽毛菌株鉴定过程具体为：

菌种鉴定：采用16SrRNA法对微生物菌株进行鉴定

菌种鉴定结果：PCR扩增、测序：该菌株以肉汤培养基为底物培养至指数生长期，离心收集菌体，用PCR仪进行煮沸获取总DNA，16S rRNA PCR反应体系所用引物为通用引物(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)。

PCR反应体系

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min；第2步循环29次；72℃10min，电泳观察。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

根据上海生工生物工程技术服务有限公司的测序结果，进入NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)进行BLAST比对，然后进行clustalx-2.0，MEGA5.0构建系统发育树，结果如图2所示。

经测定，本发明所述的菌株具有以下微生物学特性：

形态学的特性：微生物菌株在肉汤固体培养基培养过夜，菌落呈现为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落之间大小约为3mm

扫描电镜观察：取对数生长期菌液，离心收集菌体，以PBS缓冲液(pH7.2)冲洗，样品送大连海洋大学做喷金处理，处理后的样品送大连交通大学进行扫描电镜观察并拍照。如图1所示

培养学特性：以1％的羽毛粉作为唯一的碳源和氮源，再选取基本培养基进行好氧培养。

综上所述各项指标可得知所筛到的高效降解羽毛的菌株为Bacilluslicheniformis，并命名为Bacillus licheniformis ABTNL-1。

实施例4：微生物菌株ABTNL-1的应用1

菌种的复苏：从-80℃的冰箱中取出已冻存的菌种，待其慢慢融化，取100μl于25ml已灭菌的基础培养基中，37℃，160r/min的摇床中培养过夜。

从培养过夜的NB培养基中取出100μl于100ml含有1g羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，实时观察检测羽毛粉的降解情况。培养过夜的微生物菌株ABTNL-1的菌株浓度达到10⁸-5×10⁹CFU/ml。

发酵培养基的具体成分为：硫酸镁0.1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.3g，磷酸二氢钾0.4g，氯化钙0.01g，羽毛粉10.0g，蒸馏水1000ml，pH 8.0-8.5。

实验结果：微生物菌株ABTNL-1在37℃，160r/min的条件下培养，经过36h，羽毛粉的降解率可高达85％，巯基含量可高达1.48mmol/L。从本实施例的结果可以看出微生物菌株ABTNL-1可高效率的降解废弃羽毛。

降解效果如图3所示。

实施例5：微生物菌株ABTNL-1的应用2

菌种的复苏：从-80℃的冰箱中取出已冻存的菌种，待其慢慢融化，取100μl于25ml已灭菌的基础培养基中，37℃，160r/min的摇床中培养过夜。

从培养过夜的NB培养基中取出100μl于100ml含有1.5g羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，实时观察检测羽毛粉的降解情况。培养过夜的微生物菌株ABTNL-1的菌株浓度达到10⁸-5×10⁹CFU/ml。

发酵培养基的具体成分为：硫酸镁0.1g，氯化钠0.45g，磷酸氢二钾0.35g，磷酸二氢钾0.43g，氯化钙0.02g，羽毛粉15.0g，蒸馏水1000ml，pH 8.0-8.5

实验结果：微生物菌株ABTNL-1在37℃，160r/min的条件下培养，经过36h，羽毛粉的降解率可高达83.8％，巯基含量可高达1.38mmol/L。

从实施例4和实施例5的实验结果可以看出微生物菌株ABTNL-1可高效降解废弃羽毛，减少环境污染的同时，也实现资源的再利用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种高效降解羽毛菌株的筛选方法，其特征在于，具体步骤为：

S1、从废弃羽毛堆积点取土壤样品若干，称取样品1g，溶于20ml已灭菌的PBS缓冲液中，置于摇床中20min摇匀；

S2、富集：取1ml摇匀的样品液于分装好的20-30ml的富集培养基中，37℃，160r/min的条件下培养过夜；

所述富集培养基中各组成物质及浓度为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6

S3、初筛：从培养过夜的富集培养基中取出1ml培养液于液体筛选培养基中在37℃，160r/min条件下进行初步筛选；

所述液体筛选培养基的配比为每1000ml水中加入氯化钠0.5-0.8g，磷酸氢二钾0.3-0.6g，磷酸二氢钾0.3-0.7g，羽毛粉8.0-20.0g，pH8.0-8.5；

S4、复筛：待羽毛开始降解，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中进行梯度稀释，稀释至10^-4-10^-8倍，将稀释液涂布于固体筛选平板上于37度恒温培养箱中培养；

所述复筛过程采用的固体筛选培养基的配比为：每1000ml水中加入氯化钠0.5-0.8g，磷酸氢二钾0.3-0.6g，磷酸二氢钾0.3-0.7g，羽毛粉8.0-20.0g，琼脂粉10.0-20.0g，pH8.0-8.5；

S5、分离纯化：观察固体筛选平板上微生物菌株的生长情况，选出生长最好的优势菌株，挑取单菌落进行平板划线；划线培养所得菌落即为高效降解羽毛菌株ABTNL-1；

S6、菌种保藏：从步骤S5划线平板上挑取单菌落于NB培养基中培养过夜，取菌液与已灭菌的50％的甘油以1:1的比例混匀于冻存管中，冻存于-80℃的冰箱中以备用。

2.根据权利要求1所述高效降解羽毛菌株的筛选方法，其特征在于，步骤S4复筛中稀释过程，稀释到10^-5、10^-6或10^-7倍。

3.权利要求1所述高效降解羽毛菌株在降解羽毛方面的应用方法，其特征在于，以羽毛粉为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述培养基中加入高效降解羽毛菌株ABTNL-1，37℃培养，即可实现羽毛降解。

4.根据权利要求3所述高效降解羽毛菌株在降解羽毛方面的应用方法，其特征在于，具体操作为，取所述高效降解羽毛菌株ABTNL-1置于含有羽毛粉的发酵培养基中，于37℃，160r/min的摇床中培养，即可实现羽毛降解；

所述高效降解羽毛菌株ABTNL-1的菌株浓度为1×10⁸～5×10⁹CFU/ml；

所述发酵培养基的配比为每1000ml水中加入硫酸镁0.05-0.3g，氯化钠0.4-0.9g，磷酸氢二钾0.2-0.5g，磷酸二氢钾0.4-0.9g，氯化钙0.01-0.1g，羽毛粉8.0g-20.0g，调节pH至8.0～8.5。