CN102154144A - 高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，经16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F4为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4，保藏于：中国微生物菌种保藏中心保藏日期为：2010年10月22日保藏编号为：CGMCC NO.4229，其筛选方法为：经过初筛、分离、富集、复筛后的到高效降解羽毛角蛋白菌株。本发明在筛选Bacillus licheniformis F4菌株以碳源和氮源作为初步筛选条件，以降解完整羽毛和角蛋白酶活测定作为复筛条件，经这两步骤条件的严格限制筛选获得高效降解羽毛角蛋白菌株。将菌株接入含有完整羽毛的发酵培养中，发酵培养60h，羽毛的小羽枝全部脱去，剩余的羽梗和脱去的羽枝大部分被降解，菌株脱毛及降解羽毛角蛋白效果明显。

Description

高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，涉及微生物菌种的筛选，尤其是一种高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法。

背景技术

大规模畜禽养殖产生的大量畜禽场废弃物，其中羽毛废弃物最多，其产量巨大，全球每年可达几百万吨。禽类羽毛主要由角蛋白组成，角蛋白是一种具有极强抗性、难降解的硬性蛋白，具有很高的结构稳定性，其强度与尼龙相当，角蛋白在一般条件下不溶解，且不能被胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶降解，具有能抵抗特异性蛋白酶活性的长聚合链。

羽毛通过生物转化可获得羽毛粉，羽毛粉可以替代豆粕、鱼粉添加到饲料中去，是一种新型优质的蛋白源，各国都开展了利用羽毛作饲料的研究，对利用羽毛粉的研究和应用从20世纪70年代就已经开始，并取得一定进展，例如美国，已经进行了50多年研究开发，并可应用于产业，目前羽毛粉年产量37万吨。我国羽毛资源非常丰富，是羽毛产量第一大国，目前羽毛年产60多万吨，数量十分庞大，家禽中羽毛成分占5％-7％，但其中大部分被用来生产羽绒制品，下脚料羽梗经过简单的加工后制成羽毛粉添加到饲料中，以提高饲料粗蛋白的含量，从中看出羽毛粉产量很低，绝大部分羽毛没有得到充分利用，这既浪费资源又污染环境，若能够将这些废弃羽毛合理利用，可变废为宝，提供大量蛋白饲料资源。

传统的处理羽毛的方法主要是物理高温高压法和化学酸碱法，与常规物理和化学加工方法相比，微生物角蛋白酶降解法有两个突优点，一是水解以及干燥温度较低，节省能源并减少了蛋白质变性与氨基酸的损失；二是提高了羽毛粉中氨基酸的消化率，增加了可消化氨基酸，改善了必需氨基酸的平衡性，降低了氮排除量，减少了氮污染，保护环境，因此微生物角蛋白酶降解法使羽毛粉的营养价值显著提高，所获得的经济收益显然要比常规方法加工的羽毛粉高的多。

角蛋白酶(keratinase)是具有降解角蛋白活性的一类酶的总称，角蛋白酶属于诱导型酶，需要外源诱导物诱导而生，具有专一降解天然角蛋白的功能，目前普遍认为微生物降解角蛋白的过程可分为变性作用、水解作用和转氨基作用3个步骤，不同微生物降解方式存在差异，而蛋白质的变性是关键步骤，伴随着二硫键的断裂、含硫化合物的逐步氧化，角蛋白在蛋白酶作用下逐渐水解为氨基酸，降解机理还需进一步探讨。角蛋白酶除了应用于降解羽毛生产饲料外，还具有广泛的用途，可用作毛发和胶原蛋白等物质的降解，具有高效的脱毛性；角蛋白酶可用于制备有机肥料，增进植物增长；角蛋白酶可以制成皮肤真菌病疫苗，去痤疮、粉刺、牛皮癣，也可以出去结痂；角蛋白酶能够破坏阮病毒，使其丧失传染能力，在肉骨粉中添加角蛋白酶，可以确保饲料安全性；角蛋白酶还应用于食品加工，清洁剂生产，皮革脱毛鞣制，浴皂、洗发膏、润肤露、防晒油和脱毛膏等美容产品等。

通过生物途径来解决角蛋白降解的问题一直以来都倍受世界关注，早在十九世纪初期， 就发现了一些生物能分解角蛋白，如衣蛾、苍蝇和兀鹰以及一些放线菌，后来又发现一些细菌、真菌也能在含有角蛋白的基质上生长繁殖，1963年Nickerson等首次提出将具有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶(Keratinase)，迄今已分离到30余种能降解角蛋白微生物，分别属于细菌、放线菌和真菌属，近十年来，随着分子生物学技术的发展，角蛋白酶再次成为研究的热点，并取得了显著的进展。目前国内对微生物降解角蛋白的研究主要集中在菌种分离和酶的提取纯化，虽然取得了一定的进展，但是均不能实现工业化生产，不能满足工业上对其降解的需要，大部分微生物降解羽毛尚需要一定的前处理，因此需要进一步分离优良的羽毛角蛋白降解菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，本发明筛选得到菌株降解羽毛角蛋白效果好且发酵得到的角蛋白酶活高，能满足工业需要。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高效降解羽毛角蛋白的菌株，经16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F4为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4，保藏于：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所保藏日期为：2010年10月19日保藏编号为：CGMCC NO.4229。

一种高效降解羽毛角蛋白的菌株的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

(1)初步筛选

将鸡粪样品溶解于的蒸馏水中，稀释后涂布于初筛培养基，分别在30-60℃条件下培养20-30h，筛选长有菌落的平板，30-60℃培养条件下，取菌体生长较快，菌落较大的菌落；

(2)富集培养

在无菌条件下，用无菌水冲洗步骤(1)温度下的初筛培养基上的菌落，接入富集培养基，在步骤(1)温度下，100-150rpm/min条件下富集培养40-60h；

(3)分离培养

将40-60h富集培养后的菌液稀释后，涂布于LA平板在步骤(1)温度下培养20-30h，挑取了不同形态单菌落LA平板划线保存；

(4)复筛

经分离纯化后的单菌落接种到含有筛选培养基的摇瓶发酵，观察培养液中完整羽毛的降解程度，将振荡培养的发酵液过滤，测定角蛋白酶活和甲醛滴定法测定滤液内氨基氮含量，发酵培养55-75h后，完全脱去了羽毛中的小羽枝，且羽梗和羽枝被完全被降解；

所述：初筛培养基(g/ml)的成分为：2％羽毛粉、2％琼脂粉，其余为水；

富集培养基(g/ml)：2％羽毛粉、1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％NaCl，其余为水；

筛选培养基(g/ml)：2％羽毛粉，0.1％K2HPO4，KH2PO4 0.04％、NaCl 0.04％，灭菌后的完整羽毛，其余为水；

LA平板(g/ml)：1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％NaCl、2％琼脂，其余为水。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明在筛选Bacillus licheniformis F4菌株以碳源和氮源作为初步筛选条件，以降解完整羽毛和角蛋白酶活测定作为复筛条件，经这两步骤条件的严格限制筛选获得高效降解羽毛角蛋白菌株，将菌株接入含有完整羽毛的发酵培养中。

2、本发明中的Bacillus licheniformis F4菌株在50℃，pH7.8条件下测定发酵液的角蛋白酶活为23U/mL，氨基氮增加量为0.7090mg/mL，本优良羽毛角蛋白降解菌为角蛋白酶的生产及应用于工业生产奠定了基础。

3、本发明筛选的F4菌株是一种快速、直接利用天然羽毛的微生物菌株，不仅能以羽毛角蛋白作为唯一碳源和氮源，还能够降解完整的天然羽毛，仅发酵24h即可见完整羽毛的羽枝有明显脱落，发酵60h后羽枝完全脱落，羽枝和羽梗大部分被降解，菌株脱毛及降解羽毛角蛋白效果明显。

附图说明

图1为本发明菌株Bacillus licheniformis F4的菌落形态图；

图2为本发明菌株Bacillus licheniformis F4的革兰氏染色电子显微镜图；

图3为本发明菌株Bacillus licheniformis F4的Biolog鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本筛选方法的主要步骤为：菌株是以鸡粪作为筛选来源，经过以羽毛角蛋白作为唯一碳源和氮源的初步筛选条件，以降解完整羽毛和角蛋白酶活测定作为复筛条件筛选获得，该菌株具有发酵培养60h能够将完整羽毛降解掉的特征，该菌株经过16srDNA序列分析方法和Biolog系统鉴定是地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4。

一种高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，步骤如下：

1、实验说明

(1)筛选样品来源于天津养鸡场，实验用羽毛来源于天津大成屠宰场。

(2)羽毛预处理

培养基用羽毛粉：用洗涤剂将羽毛清洗干净，蒸煮一个小时后，清水冲洗。在60℃烘箱中放置烘干，用万能粉碎机连续粉碎三次，每次持续时间为五分钟。

测定角蛋白酶活的羽毛粉：用洗涤剂将羽毛清洗干净，去离子水冲洗，在含有0.2％NaOH的去离子水中煮30分钟，去离子水冲洗羽毛至中性，在60℃烘箱中放置烘干，用万能粉碎机连续粉碎三次，每次持续时间为五分钟，过20目筛子，取筛下部分作为酶活测定的底物。

完整羽毛：洗涤剂将羽毛清洗干净，清水冲洗。在60℃烘箱中烘干，121℃灭菌20分钟。

(3)培养基组成

初筛培养基(g/ml)：2％羽毛粉、2％琼脂粉。

富集培养基(g/ml)：2％羽毛粉、1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％NaCl。

筛选培养基(g/ml)：2％羽毛粉，0.1％K2HPO4，KH2PO4 0.04％、NaCl 0.04％，灭菌后的完整羽毛。

LA平板(g/ml)：1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％NaCl、2％琼脂。

(4)羽毛角蛋白酶活力测定

取发酵液过滤离心后的上清液lmL，加入2mL 50mM Tris-HCI(pH7.8)，然后加入10mg羽毛粉底物，混匀；置于50℃水浴保温反应lh(不断振摇)，而后加入2mL TCA(三氯乙酸)终止反应，沉降30min后离心取上清，于280nm处比色测定OD值，以先加入TCA终止液作为对照。

酶活力单位定义：50℃水浴保温反应lh反应条件下，OD值每增加0.01为lu，重复3次，取平均值。

(5)甲醛滴定法测定氨基氮含量

发酵液过滤离心，取上清液稀释十倍，取2mL的稀释上清液于25mL三角瓶中，加入5mL去离子水，滴入五滴酚酞试剂，加入2mL甲醛溶液，用0.02mol/L的NaOH滴定至微红。以去离子水代替上清液作为空白对照。

试中：V(mL)-滴定样品消耗NaOH的体积

V0(mL)-滴定空白消耗NaOH的体积

N(mol/L)-标准NaOH的摩尔浓度

14.008(g/mol)-氮的摩尔质量

二、高效降解羽毛角蛋白的菌株的筛选方法

1、筛选步骤

(1)初步筛选

以羽毛角蛋白作为菌体生长的唯一碳源和氮源作为初步筛选条件即采用初筛培养基，将5g鸡粪样品溶解于50mL的蒸馏水中，系列稀释后涂布于初筛培养基，分别在50℃条件下培养24h，筛选长有菌落的平板，50℃培养条件下，菌体生长较快，菌落较大，说明50℃条件生长的菌体易于分解利用羽毛角蛋白。

(2)富集培养

由于羽毛角蛋白较难利用，在羽毛角蛋白初筛平板上能够生长的菌株较少，并且菌株生长的比较弱，在补加碳源和氮源的条件下，富集培养增加菌体量。在无菌条件下，用5mL无菌水冲洗50℃初筛培养基上的菌落，接入富集培养基，在50℃，120rpm/min条件下富集培养48h。

(3)分离培养

将富集培养后的菌液系列稀释后，涂布于LA平板50℃下培养24h，共挑取了18个形态不同的单菌落LA平板划线保存。

(4)复筛

经分离纯化后的18株菌接种到含完整羽毛的筛选培养基摇瓶发酵，观察培养液中完整羽毛的降解程度(如下表1)，将振荡培养的发酵液过滤，测定角蛋白酶活和甲醛滴定法测定滤液内氨基氮含量(如表2)。菌株F4发酵培养60h后，完全脱去了羽毛中的小羽枝，且羽梗和羽枝几乎被完全降解，角蛋白酶活测定为23U/mL，氨基氮增加量为0.7090mg/mL。

表1角蛋白降解菌株的筛选结果

注：“+”表示完整羽毛的降解程度，“-”表示羽毛没有被降解。

表2角蛋白降解菌株的酶活及氨基氮含量的测定

注：“+”表示完整羽毛的降解程度

2、菌种鉴定

(1)菌落及菌体形态观察

将从土壤中分离纯化的菌株F4在LA平板上进行划线分离，于50℃下恒温培养12小时，肉眼观察菌落呈乳白色，圆形凸起，表面湿润光滑，边缘刺状，无光泽，不透明。

挑单菌落制片，革兰氏染色后，在带拍摄装置的光学显微镜下放大100倍观察菌体革兰 氏染色为阳性，菌体呈直杆状，芽孢中生，少有两端生。

(2)16srDNA菌种鉴定

PCR扩增

上游引物：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

下游引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’

扩增体系(50μL)：

ddH2O 37μL

10×buffer 5μL

dNTPs(2.5mmol/L each)2μL，

上游引物(20μmol/L)2μL

下游引物(20μmol/L)2μL

DNA模板1μL

TaqDNA聚合酶1μL

扩增程序：95℃5min

PCR扩增产物大概1500bp，使用NCBI的BLAST进行16S rDNA的相似性比对，结果显示与Bacillus licheniformis strain MML2501地衣芽孢杆菌等菌株的相似性为99％。

(3)Biolog菌种鉴定

制备BUG+M培养基

①称取17.1g BUG琼脂，加入297mL蒸馏水；

②煮沸溶解；

③冷却至25℃调整PH至7.3±0.1；

④121℃灭菌15min；

⑤冷却至45-50℃；

⑥加3mL已灭菌的麦芽糖(质量浓度25％)，混匀；

⑦倒平板；

接种BUG+M平板进行纯培养，用木制接种棒挑取分离良好的单菌落，在BUG+M琼脂平板上划十字接种；在50℃培养箱中培养12～18h。

干管分散制备菌悬液：用接种棒挑取十字形菌线每条边外半部分的菌落于20×150mm干管内进行分散，将接种棒沿试管内壁旋转几圈，将菌落转至试管内壁，然后用接种棒上下划动，并转动试管，将菌落均匀分散；移取5mLGP-IF接种液，其成分为0.4％NaCl、0.03％聚醚F-68、0.02％Gellan Gum，洗下干管壁上的菌体，加入剩余14mLGP-IF接种液，混合均 匀并调整浊度为(GP-Rod SB标准浊度液做空白调整)28％T±3％，制成菌悬液。

接种至鉴定板：向96孔鉴定板的每个孔中加150uL菌悬液，盖上盖子，放置在30度的培养箱中培养(可垫湿毛巾保湿)；培养时间为4～6h或16～24h。

读取结果及分析：培养后的鉴定板放入读数仪的托架上，取下盖子读数，分析鉴定结果与数据库的匹配度。待测菌株F4测试结果与Bacillus licheniformis标准菌株相应数据较为匹配，F4的Biolog评价参数SIM≥0.5，鉴定为地衣芽孢杆菌。

结合16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F4为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4。

实施例2：

一种上述高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，改变初步筛选、富集培养、分离培养和复筛温度为37℃。筛选出菌株F3，结合16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F3为芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp.F3。该菌株具有发酵培养120h将完整羽毛降解掉的特征。

实施例3：

一种上述高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，改变初步筛选、富集培养、分离培养和复筛温度为60℃。筛选出菌株F2，结合16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F2为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F2。该菌株具有发酵培养72h将完整羽毛降解掉的特征。

Claims (2)

1.一种高效降解羽毛角蛋白的菌株，其特征在于：经16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F4为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4，保藏于：中国微生物菌种保藏中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所保藏日期为：2010年10月22日保藏编号为：CGMCC NO.4229。

2.一种高效降解羽毛角蛋白的菌株的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

(1)初步筛选

将鸡粪样品溶解于的蒸馏水中，稀释后涂布于初筛培养基，分别在30-60℃条件下培养20-30h，筛选长有菌落的平板，30-60℃培养条件下，取菌体生长较快，菌落较大的菌落；

(2)富集培养

在无菌条件下，用无菌水冲洗步骤(1)温度下的初筛培养基上的菌落，接入富集培养基，在步骤(1)温度下，100-150rpm/min条件下富集培养40-60h；

(3)分离培养

将40-60h富集培养后的菌液稀释后，涂布于LA平板在步骤(1)温度下培养20-30h，挑取了不同形态单菌落LA平板划线保存；

(4)复筛

经分离纯化后的单菌落接种到含有筛选培养基的摇瓶发酵，观察培养液中完整羽毛的降解程度，将振荡培养的发酵液过滤，测定角蛋白酶活和甲醛滴定法测定滤液内氨基氮含量，发酵培养55-75h后，完全脱去了羽毛中的小羽枝，且羽梗和羽枝被完全被降解；

所述：初筛培养基(g/ml)的成分为：2％羽毛粉、2％琼脂粉，其余为水；

富集培养基(g/ml)：2％羽毛粉、1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％NaCl，其余为水；

筛选培养基(g/ml)：2％羽毛粉，0.1％K2HPO4，KH2PO4 0.04％、NaCl 0.04％，灭菌后的完整羽毛，其余为水；

LA平板(g/ml)：1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％NaCl、2％琼脂，其余为水。

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