CN101580807A - 一种产角蛋白酶的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产角蛋白酶的菌株及其应用，该菌株是嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ CGMCC No.2231，应用于降解软质角蛋白鸡毛、鸽子毛、牛毛、羊毛、头发和硬质角蛋白牛角、羊角、羊蹄角、指甲废弃物。与其它降解角蛋白的菌株相比，本发明的菌株发酵条件温和，应用方便，所产角蛋白酶的酶活较高，且较稳定。

Description

一种产角蛋白酶的菌株及其应用

技术领域

本发明属微生物发酵菌株领域，特别是涉及一种产角蛋白酶的新型菌株及其应用。

背景技术

角蛋白大量以脊椎动物的皮肤、毛发、羽毛、羽茎、蹄、角、爪等结构蛋白存在于自然界中，是一种抗性很强的硬性蛋白，其结构通过分子间二硫键、氢键、盐键和其它键作用后具有很高的稳定性，在一般条件下不溶解于水、盐、稀酸和稀碱，且不能被一般的蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶)水解。角蛋白酶是一类能够水解角蛋白的酶类，有些角蛋白同时对除角蛋白外的多种蛋白质有水解作用。

角蛋白酶能降解角蛋白的性质，使其在饲料工业、食品工业、皮革加工、洗涤剂行业、医药工业及环境治理等方面具有广阔的应用前景。在饲料工业中，角蛋白酶可将羽毛、猪毛等废弃物转化为高营养的饲料蛋白。羽毛中蛋白质含量超过90％，氨基酸含量在70％以上，还含有常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子，是动物饲料中的优良蛋白源，但该类蛋白中存在大量的二硫键、氢键和疏水键，交联度大，不可溶，不能被常见蛋白酶所降解，因而它在动物体内难以被消化利用。在全世界，每年家禽加工业要产生数百万吨羽毛废弃物，对环境造成了严重的污染。采用高温、高压的工艺条件将其软化，加工成动物饲料添加剂，是减少其污染环境的有效途径，但耗能大，处理过程中蛋氨酸、赖氨酸及色氨酸等必需氨基酸被破坏，消化性差，营养性不稳定。利用角蛋白酶可有效地解决这一问题，它的优点在于更为经济，提高废弃角蛋白的利用率，同时产品营养价值好，而且无污染。我国的角蛋白资源极其丰富，尤其在现代农业中，大规模的家禽养殖产生了大量的角蛋白废物，其中羽毛废弃物产量最多，年产量达70多万吨。但是大部分没有被充分利用，有的甚至造成局部的环境污染，其分泌物所含有的致病微生物也会对人类健康造成危害。随着畜牧业的不断发展，饲料资源，尤其实动物性蛋白饲料资源的缺乏逐渐明显起来，成为养殖业发展的制约因素。按照我国饲料工业的发展规划，到2010年饲料蛋白的缺口将达到800万吨，羽毛废弃物的有效开发利用对我国这种蛋白资源极度匮乏的国家有着重要的意义。角蛋白酶可应用于皮革加工，因为角蛋白酶能够有效地水解毛囊中的角质组织，使毛发得以从中拔出。在脱毛过程中，使用含角蛋白酶的生物脱毛助剂，不仅能降低脱毛废液中BOD(生物需氧量)和TDS(溶解固体总量)，而且能大幅度地减少硫化物的用量甚至将其弃用，有效减少了脱毛废液对环境的污染。角蛋白酶可应用于食品工业，如可使角蛋白降解为氨基酸和短肽，作为营养学药物；用来生产鱼露、肉胨等高营养食品，或作为肉类嫩化剂。在医药上，可利用角蛋白酶使其降解产生L-胱氨酸，具有促进伤口愈合、治疗皮肤过敏、解毒、刺激血功能、促进白血球生成、治疗肝病和放射病等医药用途。酶促降解所得的可溶性角蛋白是一种表面活性物质，具有良好的乳化性能，既可用作洗涤剂的活性物又可作为农药的乳化剂。另外，在美容保健上，角蛋白酶可溶解皮肤表层皮屑和黑斑，使皮肤柔软、光滑，并能去除头皮屑、软化头发和头发等。

角蛋白酶的研究工作已有几十年的历史，自然界中许多的微生物均能分泌角蛋白酶，能特异性地分解角蛋白。在众多微生物中，最早发现能降解角蛋白的就是真菌。早在1899年Ward就发现马爪甲团囊菌(Onygena equina)。到目前为止，发现具有降解角蛋白能力的真菌有18个属(Chrysosporium，Aspergillus，Alternaria，Trichuru，urvularia，Cladosporium，Fusarium，Geomyces，Gleomasti，Monodictys，Myrothecium，Paecilomyces，Stachybotrys，Urocladium，Scopulariopsis，Sepedonium，Penicillium，Doratomyces)。尽管种类很多，但由于这些真菌大多属于皮肤真菌，存在致病性，而没有太多的经济价值。许多放线菌也能降解角蛋白，但多为链霉菌属(Streptomyces)，如弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)，密旋链霉菌(Streptomyces pactum)，微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)，热紫链霉菌SD8(Streptomyces thermoviolaceus SD8)和禾生链霉菌(Streptomyces graminofacients)。可降解羽毛角蛋白的细菌包括芽孢杆菌(Bacillus)，溶杆菌(Lysobacter)和细杆菌(Microbacterium)等。角蛋白降解的特性广泛存在于微生物世界中。但是只有少数几种达到研究开发的经济要求。芽孢杆菌(Bacillus)特别是地衣芽孢杆菌(Baccillus lincheniformis)和枯草芽孢杆菌(Baccillus subtilis)产生的角蛋白酶由于其高效降解羽毛的特性而被广泛地研究。1992年Lin等(Appl Environ Microbiol，58：3271-3275)从地衣芽孢杆菌PWD-1菌株降解羽毛的培养液中提取到角蛋白酶，并对其理化性质进行了详细的研究，该酶的分子量约为33kD，酶在pH5-12范围都很稳定，反应最适温度为50℃，比活性为5990U/mg酶蛋白，但该角蛋白酶不能降解未高温蒸煮过的羽毛，耐热性差，且会自我催化裂解。江西农业大学【江西农业大学学报，19(4)：60-65，1997】对弗氏链霉菌S-221进行了一系列的研究，他们用自行设计并改良的C₂液体发酵培养基，发酵液的最后酶活达66.2ug/mL，该酶有效作用pH为7-10，在70℃下处理0.5小时，其酶活维持在70％左右。角蛋白的微生物降解与利用的重大意义，越来越引起了人们的广泛兴趣。国外一些学者的研究工作，已涉及角蛋白酶高级结构、活性表达分子基础以及酶工程等分子生物学上的研究，主要集中在地衣芽孢杆菌的角蛋白酶基因，已测出其编码序列而且已成功地克隆和表达。而国内对角蛋白酶的研究还大多停留在产角蛋白酶菌的分离、筛选、角蛋白酶的分离纯化及理化性质的研究，以及角蛋白酶的作用机理的初步研究。而且，研究的对象也及其有限，主要集中于弗氏链霉菌的研究，对于细菌发酵产生角蛋白酶的研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种产生角蛋白酶的新型细菌及其应用，来源于含角蛋白的羽毛为原料的筛选，与其它降解角蛋白的菌株相比，本发明的菌株不仅可用于羽毛角蛋白的降解，还可应用于其它多种角蛋白废弃物的降解，菌株的发酵条件温和，应用方便，且该菌所产角蛋白酶的酶活较高，并较稳定。

根据Blast及聚类结果(图3)，该菌与Stenotrophomonas maltophilia(嗜麦芽糖寡养单胞菌)具有最大同源性，相似性为98％，因此命名为嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ。

本发明的嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ，已于2007年10月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2231，其16S rRNA序列见表1。

表1嗜麦芽糖寡养单胞菌DHHJ的16S rRNA序列

本发明提供的产角蛋白酶的嗜麦芽糖寡养单胞菌DHHJ的形态特征如下：

该菌菌落圆形，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，呈淡黄色半透明状；呼吸类型为好氧呼吸，在有氧的条件下生长良好，不运动，革兰氏染色呈阴性，电镜观察菌体无鞭毛，杆状，无其它特殊结构，为无芽孢的短杆菌，菌体大小为0.3～0.6×0.8～1.5μm(见图1)。提取菌株的DNA然后进行PCR扩增，扩增结果见图2，之后的测序工作由上海申能博彩生物技术有限公司完成。测定菌株的16S rRNA全序列，进行系统发育学分析(菌株的16SrRNA全序列见表1)。根据该菌株的16S rRNA序列与GenBank数据库中相似性高的已知菌株的16S rRNA基因序列进行比对，用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(version 3)进行分析，得到图3所示的种系进化树。

本发明的菌种的保存用牛肉膏蛋白胨培养基(w/v％)：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g(pH7.4-7.6)，40℃130rpm培养过夜，添加冻存缓冲液(磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬酸钠0.0588g，七水合硫酸镁0.02645g，甘油10mL，加水定容至100mL)；发酵培养基(w/v％)：葡萄糖1g，羽毛粉2.5g，干酪素0.2g，KCl 0.0373g，NaCl0.0294g，磷酸氢二钠∶磷酸二氢钾0.4∶0.03，吐温800.4g(pH 7.5)。

将该菌接种于发酵培养基中，测得其角蛋白酶的最高酶活为最大值达49.3U/mL，其粗酶液酶反应的最适作用pH为7.5，最适作用温度为40℃，装液量25mL/250mL，发酵时间72h，在pH 6.5-8.0，40℃以下酶活较稳定。

角蛋白酶的酶活测定方法如下：

参考Gradisar(Gradisar H.，Kern S.，Friedrich J.，Keratinase of Doratomycemicrosporus.Appl.Microbio.Biotech.，2000，53(2)：196-200)，并在此基础上稍作修改。将发酵液过滤离心，取1mL上清液，加入2.0mL0.05mol/LTris-HCl(pH＝7.8)缓冲溶液，然后加入10mg羽毛粉，在40℃恒温水浴锅中反应1h后(定时取出用力振荡)，加入2.0mL10％三氯乙酸TCA终止反应。4℃9000rpm离心15min，取上清液于280nm波长处测定其吸光度。反应前即加TCA处理用作对照。

本发明的菌株可应用于降解多种角蛋白废弃物，对不同角蛋白底物进行的实验发现，嗜麦芽糖寡养单胞菌DHHJ产生的酶可同时降解α角蛋白(牛角、羊角、指甲、羊蹄角)和β角蛋白(鸡毛、鸽毛、牛毛、羊毛、头发)这两种角蛋白(图4)，降解范围广泛，且几乎对实验选用的底物都有很高的降解作用，除了羊毛的酶活值稍低些，其余的底物材料降解效果都较好(羊角的酶活和鸡毛、鸽毛的几乎相等，其次是牛角和牛毛，然后是指甲和羊蹄角)，这在国内外已经发现的可以降解角蛋白的各种菌株是少见的。

本发明的有益效果：

(1)为多种含角蛋白的废弃物的降解提供了一种优良菌种，扩展了角蛋白废弃物的生物降解范围；

(2)此菌的降解条件温和(温度条件和pH比较适中)，所产角蛋白酶活性高，稳定性也较好。

附图说明

图1是菌株的透射电镜形态特征(×5000)；

图2是菌株16S rRNA基因组PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱；

图3是菌株16S rRNA序列系统发育树；

图4是不同角蛋白作底物时的酶活。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将从市场收集的大量羽毛埋于室外较湿润的土壤中富集培养，直至羽毛有明显的降解，期间保持充足的水分。取上述腐烂鸡毛1g于富集培养基1(牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，pH7.4-7.6，100mL)中，于28℃、120转/min恒温培养48h。再取其培养液2mL转入富集培养基2(可溶性淀粉2g，羽毛粉a 2g，氯化钠0.5g，pH7.4-7.6，100mL)中，28℃，120r/min进一步富集培养48h。取终富集液100μL涂布于磷酸消解蛋白培养基(可溶性淀粉2g，磷酸消化蛋白2.5g，琼脂粉2g，氯化钠0.5g，pH7.4-7.6，100mL)平板，筛选出生长的单菌落，以牛肉膏蛋白胨培养基(完全培养基)作为对照。将初筛得到的菌种分别点接于磷酸消解蛋白培养基平板和羽毛粉平板培养基(可溶性淀粉2g，羽毛粉b2g，琼脂粉2g，氯化钠0.5g，pH 7.4-7.6，100mL)平板，于33℃下恒温培养48h，对照观察两平板上的菌种生长，选定有效菌株。再将这些有效菌株涂布于磷酸消解蛋白培养基平板，重复几次做进一步的分离纯化。

其中，羽毛粉的处理方法：羽毛粉a用洗涤剂清洗鸡毛，清水洗净后，分别以0.05％氢氧化钠溶液和0.05％盐酸溶液煮沸30分钟，再以清水充分洗净，于80℃烘干48h，用粉碎机将其分别粉碎后，过60目筛；羽毛粉b用洗涤剂清洗鸡毛，清水洗净后于灭菌锅内高压蒸煮1h，再以清水充分洗净，于80℃烘干48h，用粉碎机将其分别粉碎后，过100目筛。

(2)该菌株接种于含灭菌处理过的完整羽毛的基础培养基(氯化钠0.4g，磷酸氢二钠∶磷酸二氢钾0.4∶0.03，pH7.5，100mL)中，40℃、120r/min进行摇床发酵培养，2天后即可见羽毛有明显脱落，发酵5天后羽毛已完全脱落，羽梗也有一定程度的降解。经6天发酵后降解率可达86.6％，发酵液蛋白质含量最大也可达23.88mg/mL。这表明此菌株具有较强降解羽毛角蛋白的能力。

(3)16S rRNA测定

首先按下列方法提取菌株K1的DNA：

a)取1mL细菌过夜培养液移至1.5mL的Eppendorf管中，5000r/min离心10分钟，去上清液；

b)立即加入600μL预热的提取缓冲液，混匀后，65℃温浴1h；

c)冰浴冷却(5分钟)，加入600μL酚/氯仿(1∶1)溶液，颠倒混匀后，静置10min，然后12000r/min离心6min；

d)上清转移至另一个Eppendorf管中，加入等体积氯仿，静置5min，12000r/min离心5min；

e)取上清液，加入等体积异丙醇，沉淀DNA；

f)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于500μLTE或重蒸水中，-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀；然后进行PCR扩增，PCR的反应引物为BSF8/20(5`-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3`)和BSR1541/20(5`-AAG GAG GTG ATC CAG CCG-3`)。在冰上建立反应体系，加入10×扩增缓冲液10μL，物各50pmol，4种dNTP混合物各200μmol/L，模板DNA 0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5U，Mg²⁺1.5mmol/L，加双或三蒸水至100μL。94℃预变性5min；94℃变性60sec；55℃复性30sec；72℃延伸90sec；32个循环，72℃下延伸为双链10min。最后将系统稳定在4℃。取3μL的PCR产物，在1％的琼脂糖凝胶100V下电泳30min，电极缓冲液为0.5×TAE，然后用溴化乙锭(EB)染色检验扩增产物(结果见图2)。

序列的常规分析使用DNAMAN、DNASTAR等软件进行。序列同源性搜索使用Blast在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行。并应用Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis(version 3)对其进行进化树的构建，GenBank中的相近序列用clustal W程序进行多序列匹配排列(multiple alignments)分析，最后形成一个多重序列匹配排列阵，用Neighbor-Joining法构建系统进化树，使用Kimura 2-parameter法，系统树各分枝的置信度经重抽样法(Bootstrap)1000次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值，Cardiobacterium valvarum做为外群，得到图3所示的种系进化树。

(4)头发、羊毛、牛毛与羽毛粉b同样处理；牛角、羊角、羊蹄角和人指甲先用洗涤剂清洗，然后烘干至恒重，用刀切成屑，再用粉碎机粉碎，过100目筛。将经过72小时培养的发酵培养基在40℃下，9000r/min离心15min，取上清，即粗酶液，以不同来源角蛋白粉做底物测定发酵液上清中的酶活力，酶活结果见图4。

本发明所述嗜麦芽糖寡养单胞菌DHHJ的16S rRNA序列见表1。

Claims (3)

1.一种产角蛋白酶的菌株，其特征在于，该菌株是嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)DHHJ CGMCC No.2231，其16S rRNA序列为：

2.一种产角蛋白酶的嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ应用于降解软质角蛋白鸡毛、鸽子毛、牛毛、羊毛、头发和硬质角蛋白牛角、羊角、羊蹄角、指甲废弃物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述角蛋白酶的酶活测定方法是将发酵液过滤离心，取1mL上清液，加入2.0mL0.05mol/LTris-HCl pH＝7.8缓冲溶液，然后加入10mg羽毛粉，在40℃恒温水浴锅中反应1h并定时取出用力振荡后，加入2.0mL10％三氯乙酸TCA终止反应，4℃9000rpm离心15min，取上清液于280nm波长处测定其吸光度，反应前即加TCA处理用作对照。

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