CN102329751A

CN102329751A - 一种产角蛋白酶的单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN102329751A
Application number: CN201110281656A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 刘柏宏; 张娟; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: JIANGSU XINHANLING BIO-ENGINEERING CO., LTD.
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2031-09-21
Also published as: CN102329751B

Abstract

本发明公开了一种产角蛋白酶的单胞菌及其应用，所筛产角蛋白酶菌株可以在24h以内高效降解羽毛，经发酵初步优化后角蛋白酶活力可以达到150U/mL。对所降解羽毛经过氨基酸分析后发现可产多种氨基酸，可以代替大豆等粮食作物作为饲料的主要氮源。同时，该菌发酵酶液对羊毛也具有较好的处理效果。本发明筛选的产角蛋白酶单胞菌在饲料及纺织行业均具有良好的应用前景。

Description

一种产角蛋白酶的单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产角蛋白酶的单胞菌及其应用，尤其是一种产角蛋白酶的的单胞菌的筛选和应用。

背景技术

角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，可以由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。常见的角蛋白为动物的毛发，如牛毛、羊毛和人发等，羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物每年产量巨大，且蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源。在传统利用羽毛过程中主要采用酸碱水解。热降解等方法，前者存在污染环境问题，后者对能源消耗比较大，且可以破坏部分氨基酸，降低了产品的营养价值。羽毛的合理利用一方面可以减少废弃物对环境的污染，同时可以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养。

在纺织工业中，羊毛有时候会发生毡缩现象。目前处理羊毛鳞片多采用氯化法等化学方法，或采用双氧水进行预处理，对环境造成了污染。而在应用生物处理法时采用蛋白酶进行单一处理对羊毛质地损害较大。采用角蛋白酶和蛋白酶共同处理可以达到既可以减少羊毛鳞片又可以不损害羊毛自身质地的效果。

此外，角蛋白酶可“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白，从而可应用于医疗和实验仪器的净化；它还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产角蛋白酶的单胞菌，该菌株为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1，于2011年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2011193，以其16SrDNA全序列为基础的系统发育树如说明书附图1所示。

所述嗜麦芽寡养单胞菌发酵用培养基组成如下：葡萄糖10gL^- ¹，酵母粉5gL^-1，羽毛5gL^-1，磷酸二氢钾1gL^-1，磷酸氢二钾3gL^-1pH 9；发酵条件为：

发酵条件优选为：pH 9、培养温度25℃。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明提供的菌株，具有在24h内高效降解羽毛的优点，优于国内外所报道的可以降解羽毛角蛋白的菌株；

2)采用本发明所筛选的菌株对单一羽毛培养基进行降解，经分析后可以产生17种氨基酸，并含有动物自身不能合成的稀有氨基酸，可以代替大豆满足家禽所用饲料。

3)采用本发明筛选的菌株所产角蛋白酶的粗酶液，与蛋白酶共同处理，在蛋白酶浓度一定的情况下增加角蛋白酶粗酶液的浓度可以对羊毛鳞片得到较好的处理，可应用于纺织行业。

附图说明

图1：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1的系统发育树

图2：采用所筛菌株对单一羽毛培养基进行降解24h的效果

培养基为羽毛含量为20gL^-1的单一羽毛无机盐培养基，

A三角瓶为未处理羽毛，B三角瓶为单胞菌处理24h的效果。

图3：嗜麦芽寡养单胞菌发酵上清液对羊毛去鳞的处理效果

A：未处理羊毛纤维

B：蛋白酶用量2％owf，角蛋白酶用量10％owf

C：蛋白酶用量2％owf，角蛋白酶用量30％owf

D：蛋白酶用量2％owf，角蛋白酶用量80％owf

具体实施方式

实施例1产角蛋白酶菌株的筛选方法

1.采样地点为当地家禽饲养场，将采样所得土壤或污泥样品，分别加入到盛有20mL灭菌水和玻璃珠的三角瓶中，置37℃摇床混匀、打碎做成菌悬液；

2.将菌悬液加入到初筛培养基中，37℃200转，直至羽毛降解为止，传代三次。

初筛培养基：羽毛10，K₂HPO₄，1.4，KH₂PO₄ 0.7，NaCL0.5，MgSO₄·7H₂O 0.1，pH7.0-7.2。(g/l)

3.吸取上清液进行梯度稀释，取10^-4、10^-6、10^-6 3个稀释度涂布脱脂牛奶平板。涂布后37℃倒置培养48h；

4.选取透明圈较大的点种于脱脂牛奶培养基中。

从形态上分辨及透明圈大小可以筛选出6株菌。

5.将以上牛奶平板中透明圈较大的在LB培养基上划线纯化并保藏于甘油管中。

6.将以上菌株接种到含有完整羽毛的三角瓶中进行进一步筛选。选出降解较强时间较快的菌株，后进行菌种鉴定。

将以上6株菌分别接种于羽毛无机盐培养基中观察羽毛降解情况，其中有两株菌可以降解羽毛，但有一株菌降解速度较慢。另一株菌在24小时内可以对羽毛实现大部分降解，确定此株菌为最终筛选菌株，并测序鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。

实施例2产角蛋白酶菌株的初步发酵条件确定

选取不同的温度、pH、氮源、碳源和无机盐，对所筛菌发酵条件进行初步确定，发酵时间定为40h，结果见表1。

酶活测定：吸取1mL适当稀释的酶液，加入1mL 0.05mol/LTtis-Hcl缓冲液(pH7.5)及底物(羽毛粉)5mg，40℃培养60min，加入2mL 4M TCA溶液以终止反应，放置20min后过滤掉不溶物。离心5min，吸取0.5mL上清液移入到新的试管中，后依此加入0.5mL福林酚试剂和2mL 0.5M Na₂CO₃后40℃显色20min，在660nm处检测吸光值，吸光值每增加0.01定义为一个酶活单位。

表1产角蛋白酶菌株的初步发酵条件确定

注：试验碳源浓度为：10g/L、氮源浓度为5g/L、MgSO₄和CaCl₂浓度为0.1g/L、NaCL为1g/L。

经过试验发现，选取温度25℃、pH为9、葡萄糖和酵母粉为培养条件时酶活可以达到最高150U/mL。

实施例3：产角蛋白酶单胞菌应用于饲料加工

将所筛菌株接种于羽毛含量为20g/L的单一羽毛无机盐培养基中，发酵48小时后取发酵上清检测游离氨基酸种类和含量(表2)，发酵结果见图2。

表2产角蛋白酶菌株的初步发酵条件确定

经氨基酸分析后可以检测出17种氨基酸，并含有动物自身不能合成的稀有氨基酸，将发酵产物添加如家禽饲料中，可以代替大豆满足家禽所用饲料。

实施例4：产角蛋白酶单胞菌应用于纺织原料加工

试验采用二浴法：先用角蛋白酶预处理(pH 7.5，40℃，1h)，再用蛋白酶处理(pH 8.5，55℃，1h)。

注：Owf：对织物重量。如纤维用量1g，100％owf指酶用量1ml。蛋白酶为诺维信公司商品化酶Savinase^TM

结果表明(图3)：当蛋白酶用量保持为2％owf不变时，随着角蛋白酶用量的增加去除羊毛鳞片的效果越好。说明采用本发明筛选的菌株所产角蛋白酶的粗酶液，与蛋白酶共同处理可以对羊毛鳞片得到较好的处理，为其应用于纺织行业提供可能性。

实施例5：产角蛋白酶单胞菌应用于皮革鞣制

皮革鞣制加工指动物生皮经脱毛、鞣制等物理和化学方法加工，再经涂饰和整理，制成具有不易腐烂、柔韧、透气等性能的皮革生产活动。一般普遍采用传统的化学鞣剂金属铬，减少金属铬的使用可以减少环境的污染。采用本发明的产角蛋白酶单胞菌的初酶液进行第一步处理动物生皮后，再经原所需添加量一半的鞣剂金属铬对动物生皮进行进一步处理后，基本可以达到采用全部金属铬处理时可以达到的效果。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种产角蛋白酶的单胞菌，为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1，于2011年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2011193。

2.权利要求1所述的单胞菌应用于纺织原料加工。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于所述嗜麦芽寡养单胞菌发酵上清粗酶液与羊毛进行反应处理。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述嗜麦芽寡养单胞菌发酵用培养基组成如下：葡萄糖10gL^-1，酵母粉5gL^-1，羽毛5gL^-1，磷酸二氢钾1gL^-1，磷酸氢二钾3gL^-1pH 9。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于发酵条件优选为：pH9、培养温度25℃。

6.权利要求1所述的单胞菌应用于饲料添加剂制备。