CN104017791A - 一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。通过来自同一菌株的同源性较高的两种不同角蛋白酶的N端或者C端互换，提高角蛋白酶的热稳定性和底物专一性。该角蛋白酶及其突变体能够有效水解羽毛，羊毛等非水溶性角蛋白底物，可用于皮革纺织工业和饲料工业。

Description

一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。
背景技术
角蛋白酶(Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白(Prion)的降解。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌中筛选出的角蛋白酶热稳定性差，底物专一性不高，大大降低了角蛋白酶的开发和运用。目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。本专利介绍一种由本实验室自主筛选获得的具有高效降解羽毛能力的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1，并将角蛋白酶KerSMD进行分子改造，提高其热稳定性和底物专一性，为角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种角蛋白酶突变体，热稳定性和酶活得到提高，是将嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1中角蛋白酶KerSMD的C端前导肽和/或N端前导肽替换为嗜麦芽窄食单胞菌BBE11-1中角蛋白酶KerSMF中的相应的前导肽序列。
所述角蛋白酶KerSMD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，角蛋白酶KerSMF的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述角蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.3所示突变体(P2C2T1)是从氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD出发，将其C端前导肽结构域(Cys486-Gln590)的105个氨基酸替换成氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶KerSMF的C端前导肽结构域(Pro445-Tyr548)的104个氨基酸，获得新的角蛋白酶突变体P2C2T1。
SEQ ID NO.4所示突变体(P1C2T2)是从氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD出发，将其N端前导肽123个氨基酸(Ala1-Ala123)替换成氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的角蛋白酶KerSMF的N端前104个氨基酸(Gly1-Thr104)，获得新的角蛋白酶突变体P1C2T2。
SEQ ID NO.5所示突变体(P1C2T1)，是从氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD出发，将其N端前导肽123个氨基酸替换成氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶KerSMF的N端前104个氨基酸，并且将其C端前导肽结构域(Cys486-Gln590)的105个氨基酸替换成角蛋白酶KerSMF的C端前导肽结构域(Pro445-Tyr548)的104个氨基酸，获得新的角蛋白酶突变体P1C2T1。
本发明要解决的第二个技术问题是提供获得所述角蛋白酶突变体的方法，具体步骤如下：
(1)根据从嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1中获得编码角蛋白酶KerSMD、KerSMF的基因，克隆到pET22b(+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD和pET22b+kerSMF；
(2)采用融合PCR的方法，设计含首尾重叠片段的引物，PCR扩增得到编码三种角蛋白酶突变体的基因序列，连接表达载体pET22b(+)获得含有突变体序列的重组载体；
(3)将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突变体粗酶液。
所述方法还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude1ml的镍柱对角蛋白酶进行纯化。
将所述方法中步骤(3)获得的优质基因工程菌在含有100μg/l的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/l的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。
通过对N端和/或C端序列的替换，本发明所得角蛋白酶突变体热稳定性显著提高，对比原始角蛋白酶，三个突变体P1C2T2、P2C2T1和P1C2T1在60℃下孵育90min酶活损失不到15％，而原始角蛋白酶酶活损失达到50％；半衰期提高2倍左右。此外，本发明提供的角蛋白酶突变体对酪蛋白底物的酶活有明显提高，P2C2T1对于不可溶性底物的酶活也有一定的提高，在40-70℃、pH9.0下与不溶性角蛋白底物反应，能够很好的水解羽毛粉、羊毛，在洗涤、纺织、饲料消化、医药等领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1角蛋白酶KerSMF和KerSMD及其突变体的一级结构和同源性结构预测示意图；P1和P2为N端前导肽，C1和C2为活性区域，T1和T2为C端结构，H为6个组氨酸的标签。
图2构建重组角蛋白酶P2C2T1的重叠PCR基因操作步骤，其中Primer1、2、3、4、5和6分别是F-PD、R-PD、F-CDF、R-PF、F-NcoI-kersmd、R-XhoI-kersmf。
图3构建重组角蛋白酶P2C2T1的质粒示意图。
图4角蛋白酶KerSMD及其突变体的SDS-PAGE电泳图；M，蛋白分子量(kDa)；1，P2C2T2；2，P2C2T1；3，P1C2T2；4，P1C2T1；所有蛋白的分子大小接近46kDa。
图5角蛋白酶突变体在60℃下孵育不同时间后的残余酶活。
具体实施方式
角蛋白酶酶活测定原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，释放出酪氨酸，通过酪氨酸与福林酚显色，在660nm下测定吸光度值。吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。
角蛋白酶酶活测定步骤：0.1mL经适当稀释的酶液，加入0.1mL的1％(w/v)羽毛粉不可溶性角蛋白底物(使用前和0.1mol/L的pH9.0的Gly-NaOH缓冲液混合)，在50℃反应20min，每个反应样品中加入0.2mLTCA反应终止蛋白沉淀剂，摇匀后10,000r/min离心5min，取0.2mL上清液加入1mL的4％(w/v)Na2CO3，再加入0.2mL上海生工公司购买的福林酚试剂(预先稀释3倍)在50℃下反应15分钟。使用0.5cm的石英比色杯测定清液在660nm处的吸光值。空白对照是在加入底物之前已经加入同等体积的TCA终止酶活，其他步骤相同。酶活定义为每毫升酶液每分钟释放出多少微克酪氨酸。
实施例1 角蛋白酶突变体P2C2T1基因的构建
(1)先使用两对引物F-NcoI-kersmf和R-XhoI-kersmf，F-NcoI-kersmd和R-XhoI-kersmd，以嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1(于2011年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2011193)基因组为模版，PCR扩增角蛋白酶基因kerSMF和kerSMD。反应条件为：95℃预变性5min后进入一下循环：98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min50S，30个循环；72℃延伸10min。使用的DNA扩增酶为TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方参照产品说明书。
利用NCBI的蛋白数据库，通过Blast功能的氨基酸序列比对，推测角蛋白酶KerSMD和KerSMF分为三段结构域如图1，分别为：N端前导肽(N-propeptide)，活性区域(catalyticdomain)，C端结构域(C-terminus)。相应的结构域相似度在50～80％之间。将扩增得到的kerSMD片段作为模板，使用引物F-NcoI-kersmd和R-PD再次进行PCR，得到片段P2C2(角蛋白酶KerSMD的N端前导肽及活性区域)；另外的kerSMF片段也同样作为模板，使用引物F-CDF和R-XhoI-kersmf，得到片段T1(角蛋白酶KerSMF的C端结构区域)。步骤示意图见图2。
(2)此时，DNA片段P2C2和T1含有相同的重叠区域，进行融合PCR，使两个片段连接到一起。反应条件为：95℃预变性5min后进入一下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min50S，12个循环；72℃延伸10min。使用的DNA扩增酶为TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方参照说明书。步骤示意图见图2。
(3)至此，使用含有酶切位点的引物再次扩增步骤2得到的融合PCR产物，得到突变体P2C2T1的基因片段。经过NcoI和XhoI内切酶的双酶切，得到和已经双酶切处理的质粒pET22b(+)具有相同的粘性末端的基因片段。按照配比：目的DNA片断4.5μl，质粒1.5μl，T4DNA连接酶5μl，在16℃下连接过夜，得到含有突变体P2C2T1的重组质粒pET22b+p2c2t1。步骤示意图见图3。
(4)连接产物转化大肠杆菌BL21，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃培养过夜，挑取单菌落，接入LB液体培养基，8h后提取质粒。将此质粒进行序列测定。选择正确的测序结果即为我们所需要的重组质粒。
表1 角蛋白酶突变体的重叠PCR引物序列
注：斜体字母为酶切为点序列。
实施例2 培养重组菌发酵生产角蛋白酶
将参照实施例1的方法构建的分别携带编码突变体P1C2T2、P2C2T1、P1C2T1的基因的重组表达载体转化E.coli BL21获得表达角蛋白酶的基因工程菌；将所得基因工程菌在含有100μg/l的氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有100μg/l的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD600＝0.6，降温至20℃培养，加入最终浓度0.1mM的诱导剂IPTG诱导培养，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。
实施例3 角蛋白酶突变体的纯化及热稳定性测定
(1)含有突变体基因的质粒的重组大肠杆菌在20℃下诱导培养3天后获得粗酶液。
(2)使用AKTA蛋白纯化仪(美国GE公司)和HisTrap FF crude1ml的镍柱，从粗酶液中纯化出纯度90％以上的角蛋白酶KerSMD及其各种突变体。角蛋白酶的SDS-PAGE见图4，每个蛋白分子量大小都接近46kDa.
(3)将纯化好的角蛋白酶突变体加入到50mM的Gly-NaOH缓冲液(pH9.0)中，置于60℃下孵育不同时间后，测定酶活。以最初的没有加热过的角蛋白酶为100％的残余酶活，之后测定的酶活对比最初酶活的百分比值作为残余酶活。
(4)由图5可知，原始序列的角蛋白酶P2C2T2热稳定性最差，90min的孵育后，酶活损失可达50％。而进行N端或者C端互换的突变体，90min的孵育后，酶活损失不到15％。表2显示角蛋白酶突变体及对照组的Tm值。其中P1C2T1的Tm值最高，增加了8.6℃，也就是热稳定提高最多。来自角蛋白酶KerSMF的C端前导肽结构可能和KerSMD的活性区域结构形成盐桥或者二硫键来增加突变体的热稳定性。而来自角蛋白酶KerSMF的N端前导肽可能重新折叠角蛋白酶KerSMD，减少原始KerSMD结构上的不稳定结构例如loop环等来增加酶的稳定性。因此，本实验使用的分子改造技术的确能在一定程度上改善角蛋白酶热稳定性。
表2 不同角蛋白酶的Tm值
实施例4 角蛋白酶突变体的底物专一性
参照实施例1的方法构建多个角蛋白酶突变体，并测定这些突变体对不同底物的酶活情况。如表3所示，相比出发酶，角蛋白酶突变体底物专一性显著改变，尤其是对酪蛋白底物的酶活有明显提高，P2C2T1对于不可溶性底物的酶活也有一定的提高。N端前导肽在蛋白酶折叠成熟过程中具有着决定性的作用，来自不同角蛋白酶的N端前导肽具有不同的折叠功能。对酪蛋白底物具有较高酶活的角蛋白酶KerSMF提供的前导肽P1的确能够增加角蛋白酶KerSMD的酪蛋白酶活性。而特殊结构C端前导肽也有可能在决定角蛋白酶底物结合能力的作用中起着重要作用。
表3 角蛋白酶突变体对于不同底物的酶活
注：角蛋白酶P2C2T2的氨基酸序列和KerSMD相同。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，是将嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)BBE11-1中角蛋白酶KerSMD的C端前导肽和/或N端前导肽替换为嗜麦芽窄食单胞菌BBE11-1中角蛋白酶KerSMF的相应的前导肽序列。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述角蛋白酶KerSMD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述角蛋白酶KerSMF的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
5.编码权利要求1-4任一所述突变体的基因。
6.携带权利要求5所述基因的载体、重组细胞或基因工程菌。
7.一种获得权利要求1所述角蛋白酶突变体的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的角蛋白酶KerSMD的C端前导肽结构域的105个氨基酸和/或N端前导肽123个氨基酸替换成氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶KerSMF中相应的前导肽序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述角蛋白酶KerSMF的C端前导肽结构域是从Pro445至Tyr548的104个氨基酸，N端是从Gly1至Thr104的104个氨基酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)从嗜麦芽窄食单胞菌BBE11-1中获得编码角蛋白酶KerSMD、KerSMF的基因，克隆到pET22b(+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD和pET22b+kerSMF；
(2)采用融合PCR的方法，设计含首尾重叠片段的引物，PCR扩增得到编码三种角蛋白酶突变体的基因序列，连接表达载体pET22b(+)获得含有突变体序列的重组载体；
(3)将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突变体粗酶液。
10.权利要求1-4任一所述角蛋白酶突变体在洗涤、纺织、饲料消化、医药领域的应用。
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CN104017791B (zh) 2017-02-15

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