CN101550183A - 一种抗菌肽及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子微生物学领域，具体地说是一种抗菌肽及其构建和应用。抗菌肽的核苷酸序列由序列表SEQ No.1所示。其构建以中国名对虾肝胰腺cDNA为模板，再以中国名对虾中的血蓝蛋白设计的引物xueNF和xueXR进行PCR扩增，所得产物即为列表SEQ No.1中核苷酸序列。其应用所述抗菌肽经重组表达后纯化的重组表达抗菌肽对多种微生物具有拮抗活性作用；同时所述抗菌肽的核苷酸序列导入水稻基因组，其对水稻纹枯病和稻瘟病具有抗性，并且转基因水稻的秸秆和稻糠可用于饲料中。本发明提供的抗菌肽具有较高的抗菌活性，可以应用在食品工业、饲料工业、养殖业、生物制药、作物育种等领域，具有广泛的应用前景和经济意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种抗菌肽及其构建和应用。
背景技术
血蓝蛋白(hemocyanin)是位于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色。
一般认为，血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的输氧有关，它与血红蛋白(hemoglobins)和蚯蚓血红蛋白(hemerythreins)并称为动物界3种呼吸蛋白。近年来研究表明，血蓝蛋白不仅具有输氧功能，而且还与能量的贮存、渗透压的维持、蜕皮过程的调节、表皮的固化以及黑色素的合成有关。特别引起学术界重视的是，血蓝蛋白及其降解片段还具有酚氧化物酶活性、抗病毒和抗菌等多种免疫学功能，被认为是一种具有多种非特异性免疫活性的多功能蛋白。
血蓝蛋白是一种多功能蛋白，它不仅具有输氧功能，而且还具有免疫防御功能。血蓝蛋白具有细菌凝集活性；血蓝蛋白可部分降解产生具有抗菌功能的抗菌蛋白和抗菌肽；血蓝蛋白具有非特异性抗病毒作用；血蓝蛋白在一些化学试剂，生物防御分子，以及血细胞组成成分的作用下可表现出类似于酚氧化酶的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌肽及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
抗菌肽的序列由序列表SEQ No.1中核苷酸所示。所述抗菌肽所编码基因由序列表SEQ No.2中氨基酸所示。
抗菌肽的构建方法：以中国名对虾肝胰腺cDNA为模板，再以中国名对虾中的血蓝蛋白基因为模板设计的引物xueNF和xueXR进行PCR扩增，所得产物即为由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的序列；
引物序列为：xueNF：5’ATGACGCCATGTTTGAAGTCCTTCCCAAC3’，xueXR：5’TTCTACTCGAGTATGGTGATGGATATGTTC 3’。
所述得到中国名对虾肝胰腺cDNA时所获得的中国明对虾肝胰腺总RNA需将加入RNase-free水后于室温放置0.5-1h使RNA充分溶解。
所述中国名对虾中的血蓝蛋白，以肝胰腺cDNA作为模板，用引物Xues1和Xuea1进行PCR扩增，即得到血蓝蛋白部分cDNA片段；而后根据产物的序列再设计正向引物XueRace3-1和XueRace3-2引物，反向引物XueRace5-1和XueRace5-2引物，而后利用四条引物并以肝胰腺cDNA作为模板进行RACE扩增，将扩增产物序列进行拼接，即得到血蓝蛋白cDNA全长序列；
引物序列为：Xues1为5’CCTCGGTGTTTGTGATGG3’；Xuea1为5’ATTTCAACGGGCGGTCTG 3’，XueRace3-1为5’GTCAGTTCCCCTCTCGTCCAGATAATG3’；XueRace3-2为5’AGGATGTGGATGGTGTTGCTCG 3’；XueRace5-1为5’ATGCGAGCAACACCATCCACATCCT3’；XueRace5-2为5’CATTATCTGGACGAGAGGGGAACTGAC 3’。
抗菌肽的应用：所述由序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽经重组表达后纯化的重组表达抗菌肽对多种病原微生物具有拮抗活性作用；同时所述由序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽的导入水稻基因组，其对水稻纹枯病和稻瘟病具有抗性，并且转基因水稻的秸秆和稻糠可用于饲料中。
由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的抗菌肽，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，与经过同样酶切的质粒pET-32a的DNA在T4 DNA连接酶作用下进行拼接的质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，将其在含有氨苄青霉素的LB培养基中于37℃震荡培养16h后，待菌体OD达到0.6-1.0时，加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导表达，收集菌体，用超声波破碎细胞，离心后上清为重组抗菌肽的粗产物，经过His-Tag亲和层析，即为经重组表达后纯化的重组表达序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽。
整合在原核表达载体pET-32a中的由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的抗菌肽经限制性酶切和T4 DNA连接酶连接后，将其导入植物表达载体pCAMBIA1300，构建含有植物启动子35S和终止子nosT的植物表达载体pCAM-XP，将该载体导入农杆菌EHA105，通过农杆菌EHA105的介导，将重组的序列表SEQ No.1中核苷酸序列所示的抗菌肽编码序列导入水稻基因组，获得表达序列表SEQ No.2中氨基酸序列所示的抗菌肽的转基因水稻。
本发明所具有的优点：
1.本发明通过从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中得到血蓝蛋白基因设计引物得到C末端的抗菌肽序列，通过表达该抗菌肽可以提高植物性状和开发饲料添加剂以及生物药品。
2.本发明构建得到的抗菌肽具有较强的抗真菌活性，可用于提高植物的抗病性，培育优良作物品种；同时表达的抗菌肽可用于饲料工业、食品工业、养殖业、生物制药领域。
具体实施方式
实施例1中国明对虾肝胰腺总RNA的提取
取中国明对虾的新鲜肝胰腺100mg，加入1ml Trizol(invitrogen公司)，研磨粉碎，静置5min。每1ml中加入0.2ml氯仿。盖紧管盖，用力剧烈摇动15s，在室温下放置10min。12000g 4℃离心10min。离心后，取上层水相。小心将水箱转移至一个干净的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇。肝胰腺样品在15-30℃环境下放置10min，以12000g 4℃离心15min。小心弃去上清。加入1ml体积百分比75％乙醇并颠倒混匀，7500g 4℃离心10min，而后再加入1ml体积百分比75％乙醇并颠倒混匀，7500g 4℃离心10min，小心弃去上清，干燥5-10min，并注意RNA不能过度干燥，否则RNA会变得难于溶解，降低RNA产率，干燥后加入100μl左右的RNase-free水(上海生工生物工程技术服务有限公司)。室温放置1h使RNA充分溶解，待用。
实施例2血蓝蛋白基因克隆
通过上述获得的总RNA逆转录得到肝胰腺cDNA，以肝胰腺cDNA作为模板，用引物Xues1和Xuea1进行PCR扩增血蓝蛋白片段，得到的PCR片段回收后克隆到T载体(宝生物工程(大连)有限公司)，转化E.coli TOP 10F’，挑取阳性克隆检测后进行测序。根据测序结果再设计正向XueRace3-1和XueRace3-2引物，反向XueRace5-1和XueRace5-2引物，而后利用四条引物并以肝胰腺cDNA作为模板进行RACE扩增，产物回收克隆到T载体，转化E.coli TOP 10F’，挑取阳性克隆检测后进行测序。将测序的产物和上述的PCR产物进行拼接，得到中国明对虾血蓝蛋白的全长cDNA序列，共有2161个碱基对，包含一个2034bp的开放阅读框(ORF)，编码678个氨基酸。
所用引物序列为：
Xues1(Forward) 5’CCTCGGTGTTTGTGATGG 3’
Xuea1(Reverse) 5’ATTTCAACGGGCGGTCTG 3’
XueRace3-1 5’GTCAGTTCCCCTCTCGTCCAGATAA TG 3’
XueRace3-2 5’AGGATGTGGATGGTGTTGCTCG 3’
XueRace5-1 5’ATGCGAGCAACACCATCCACATCCT 3’
XueRace5-2 5’CATTATCTGGACGAGAGGGGAACTGAC 3’
中国明对虾血蓝蛋白的全长cDNA序列如下：
ACCAACAACATGAAGGTCCTCGTAGTGCTCGCTTTTGTCGCGACTGCGGCTGCCCGGCCGAACCTCGGATTCCAGGCGGACGCTGCAGATGTGTCAGATGCCCAGAAGCAGCATGATATCAACTTCCTGCTGCACAAGATCTACGGAGAAATCCGTGATCCCAACCTAAAAGGAAAAGCTGATTCCTTTGACCCGGAGGCTGATTTATCCCATTACAGTGACAGTGGTGAGGCGGTACATAAACTCATAAGAGATCTCAAGGATCACAGACTCCTCGAACAGAACCACTGGTTCTCTCTCCTCAGCCCAAGACAGCGTCATGAAGCACTTATGCTCTTCGATGTTCTCATTCGCTGCAAGGATTGGGATACATTTGTCAGCAATGCAGCCTACTTCCGTCAGCGTATGAACGAGGGAGAGTTTGTCTACGCCTTGTATGTTGCAGTCATCCACTCTCCTCTGGCTGAACACGTTGTACTTCCTCCACTCTATGAGGTCGCTCCTCATCTCTTCACTAACAGTGAAGACATTGAAGCAGCTTATCGTGCCAAGCAGACACAGACCCCTGGTAAATTCCAGTCTTCCTTTACTGGAACAAAGAAGAACCCTGAACAAAGAGTAGCCTATTTCGGAGAGGACATTGGAATGAACACTCACCACGTTACATGGCATATGGAATTCCCATTCTGGTGGCAAGATGAATACAGTCATCATCTGGATCGCAAAGGAGAGAGCTTCTTCTGGGTACATCATCATCTTGCCGTTCGCTTTGATGCTGAACGTCTCTCCAATTATTTGGATCCCGTCGACGAACTTCACTGGGAGAAGCCCATCGTACAAGGTTTTGCTCCCCACACCACTTACAAGTATGGAGGTCAGTTCCCCTCTCGTCCAGATAATGTAAACTTCGAGGATGTGGATGGTGTTGCTCGAATTCGAGATCTGCTCATTGTTGAGAGCCGAATTCGTGATGCTATTGCCCACGGTTATATTATTGACAAACAAGGCAATCGCATTGACATCATGAATGAGCGTGGCATTGACATTCTTGGAGACATCATTGAATCCTCAATGTATAGTCCTAATGTCCAGTACTATGGGGCTTTGCATAATACTGCTCATATTGTACTCGGTCGACAGGCCGATCCACATGGAAAATACGCTCTACCACCTGGTGTACTAGAACATTTTGAAACTGCCACACGTGATCCCAGTTTCTTCAGGCTACACAAATATATGGATAATATCTTCAAAGAACATAAGGATTCTCTTCCCCCATACTCAAAGGAAGAATTAACTTTCACAGGTGTTAATGTTGAAAATCTATCCGTTGATGGTGAATTAGAGACCTTCTTTGAGGACTATGAGTACAGTCTTATTAATGCTGTTGACGACACTGAAGAAATTGCGGATGTAGAAATCTCTACGTACGTTCCTCGTCTCAACCACAAAGATTTCGCATACAACATTGAAGTTACAAACAATAACGGCAAGGAAGTTCTAACAACAGTCCGCATTTTCGCCTGGCCTCACCGTGACAACAATGGTATTGAATACACTTTCGACGAGGGTCGTTGGAATGCTATTGAACTAGACAAGTTTTGGGTTAAGTTGTCTCCCGGCTCAAACCACATTGTCCGTAAGTCATCAGAATCAGCAGTAACTGTTCCTGATGTACCAAGTTTCGATACTCTCTTCAAGAAGGCCGAAGCTGCCTTGGGTGGCGGGGATGCCGGACTTACAGAATTCGAGAGTGCGACTGGCATTCCTAACCGTTTCCTCCTCCCCAAGGGTAACGAACAGGGTCTGGAGTTCGATCTTGTCGTAGCTGTGACGGATGGTGAAGCTGACGCAGCTGTAGAGGGACTACACGATAATACTGACTTCATCCACTACGGTTCCCATGGCAAATACCCTGATAATCGCCCACATGGCTACCCCCTGGATCGTAAAGTTCCAGATGACCGCGTGTTTGAAGTCCTTCCCAACTTCAAGCACATTCAAGTAAAGGTCTTCAATCACGGTGAACATATCCATCACCATTAACTAATAGAAATCGATAAGACTTGAACAAATACCACATGTTTTATTTATCTTCCTTAAAGGATATGCGTTTTCAATAAAGTAGATTTCATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
实施例3抗菌肽序列的获得
以中国名对虾肝胰腺cDNA为模板，再以中国名对虾中的血蓝蛋白基因为模板设计的引物xueNF和xueXR进行PCR扩增，所得产物即为由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的序列；
所用引物序列为：
xueNF 5’ATGACGCCATGTTTGAAGTCCTTCCCAAC 3’
xueXR 5’TTCTACTCGAGTATGGTGATGGATATGTTC 3’
序列表SEQ ID No.1为：
TTTGAAGTCCTTCCCAACTTCAAGCACATTCAAGTAAAGGTCTTCAATCACGGTGAACATATCCATCACCAT
(a)序列特征：
●长度：72
●类型：核苷酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：基因
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：中国名对虾
序列表SEQ ID No.2为：
Phe Glu Val Leu Pro Asn Phe Lys His Ile Gln Val Lys Val Phe Asn HisGly Glu His Ile His His His
(a)序列特征：
●长度：24
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：基因
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：中国名对虾
实施例4抗菌肽的应用
由引物xueNF和xueXR对中国明对虾肝胰腺cDNA进行PCR扩增，所获得的PCR产物，即序列表SEQ No.1中所示的核苷酸序列，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，与经过同样酶切的质粒pET-32a(Novagen公司)的DNA在T4 DNA连接酶的作用下进行拼接，得到重组质粒pET-XP，用重组的质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21。获得表达序列表SEQ No.2中氨基酸序列所示的抗菌肽的大肠杆菌工程菌。工程菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中于37℃震荡培养16h后，转接发酵罐，当菌体OD达到0.6-1.0时，加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导表达。收集菌体，用超声波破碎细胞，离心后上清为重组抗菌肽的粗产物，经过His-Tag亲和层析，分离纯化重组表达抗菌肽，纯化的重组表达抗菌肽对多种微生物具有拮抗活性作用。
将上述纯化的重组表达抗菌肽对真菌菌种进行最小抑菌浓度测定(MIC)(参见表1)，其实验操作参见(顾真荣，程洪斌，魏春妹，马承铸.枯草芽孢杆菌G3抗真菌物质最低抑菌浓度和有效抑菌中浓度测定方法.《植物病理学报》，2006，36(3)：279-280)。
表1
| 真菌种类 | 最小抑菌浓度MIC(μM |
| 芸苔生链格孢(Afternaria brassicola) | 7.5 |
| 尖孢镰孢(Fusarium oxysporum) | 8 |
| 红球丛赤壳菌(Nectria haematococca | 7.5 |
| 粗糙脉孢菌Neurospora crassa | 60 |
| 绿色木霉(Trichoderma.viride) | 5.5 |
实施例5抗菌肽的应用
由引物xueNF和xueXR对中国明对虾肝胰腺cDNA进行PCR扩增，所获得的PCR产物即序列表1中所示的核苷酸序列用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，与经过同样酶切的质粒pET-32a的DNA在T4 DNA连接酶的作用下进行拼接，得到重组质粒pET-XP，将pET-XP中的由序列表SEQ No.1中核苷酸序列导入植物表达载体pCAMBIA1300，构建含有植物启动子35S和终止子nosT的植物表达载体pCAM-XP，将该载体导入农杆菌EHA105，通过农杆菌EHA105的介导，将由序列表SEQ No.1中核苷酸序列所示的抗菌肽序列导入水稻基因组，获得表达由序列表SEQ No.2中氨基酸序列所示的抗菌肽的转基因水稻。该转基因水稻对水稻纹枯病和稻瘟病的具有抗性，而且转基因水稻的秸秆和稻糠添加到饲料当中，对饲料中的污染菌有显著抑制作用，摄食该饲料的动物，其患病比例降低。
将上述表达抗菌肽的水稻秸秆和无抗菌肽的水稻秸秆粉碎，分别添加到大菱鲆人工配合饲料中，添加量均为总饲料质量的1％，将饲料密封置于30℃放置2个月，添加表达抗菌肽秸秆的饲料抑菌活性明显高于不含有抗菌肽秸秆的饲料，其中添加抗菌肽秸秆的饲料霉菌总数为2.78万个/g，而添加非抗菌肽秸秆的饲料霉菌总数为8.45万个/g。
序列表.txt
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种抗菌肽及其构建和应用
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>72
<212>DNA
<213>中国名对虾
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(72)
<223>
<400>1
ttt gaa gtc ctt ccc aac ttc aag cac att caa gta aag gtc ttc aat 48
Phe Glu Val Leu Pro Asn Phe Lys His Ile Gln Val Lys Val Phe Asn
1 5 10 15
cac ggt gaa cat atc cat cac cat 72
His Gly Glu His Ile His His His
20
<210>2
<211>24
<212>PRT
<213>中国名对虾
<400>2
Phe Glu Val Leu Pro Asn Phe Lys His Ile Gln Val Lys Val Phe Asn
1 5 10 15
His Gly Glu His Ile His His His
20
<210>3
<211>24
<212>PRT
<213>中国名对虾
<220>
<221>PRT
<222>(1)..(24)
<223>
<400>3
Phe Glu Val Leu Pro Asn Phe Lys His Ile Gln Val Lys Val Phe Asn
1 5 10 15
His Gly Glu His Ile His His His
20
Claims (8)
1.一种抗菌肽，其特征在于：抗菌肽的序列由序列表SEQ No.1中核苷酸所示。
2.一种按权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽所编码基因由序列表SEQ No.2中氨基酸所示。
3.一种按权利要求1所述的抗菌肽的构建方法，其特征在于：以中国名对虾肝胰腺cDNA为模板，再以中国名对虾中的血蓝蛋白基因为模板设计的引物xueNF和xueXR进行PCR扩增，所得产物即为由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的序列；
引物序列为：xueNF：5’ATGACGCCATGTTTGAAGTCCTTCCCAAC 3’，xueXR：5’TTCTACTCGAGTATGGTGATGGATATGTTC 3’。
4.按权利要求1所述的抗菌肽的构建方法，其特征在于：所述得到中国名对虾肝胰腺cDNA时所获得的中国明对虾肝胰腺总RNA需将加入RNase-free水后于室温放置0.5-1h使RNA充分溶解。
5.按权利要求1所述的抗菌肽的构建方法，其特征在于：所述中国名对虾中的血蓝蛋白，以肝胰腺cDNA作为模板，用引物Xues1和Xuea1进行PCR扩增，即得到血蓝蛋白部分cDNA片段；而后根据产物的序列再设计正向引物XueRace3-1和XueRace3-2引物，反向引物XueRace5-1和XueRace5-2引物，而后利用四条引物并以肝胰腺cDNA作为模板进行RACE扩增，将扩增产物序列进行拼接，即得到血蓝蛋白cDNA全长序列；
引物序列为：Xues1为5’CCTCGGTGTTTGTGATGG3’；Xuea1为5’ATTTCAACGGGCGGTCTG 3’，XueRace 3-1为5’GTCAGTTCCCCTCTCGTCCAGATAATG3’；XueRace3-2为5’AGGATGTGGATGGTGTTGCTCG 3’；XueRace5-1为5’ATGCGAGCAACACCATCCACATCCT3’；XueRace5-2为5’CATTATCTGGACGAGAGGGGAACTGAC 3’。
6.一种按权利要求1所述的抗菌肽的应用，其特征在于：所述由序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽经重组表达后纯化的重组表达抗菌肽对多种病原微生物具有拮抗活性作用；同时所述由序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽的导入水稻基因组，其对水稻纹枯病和稻瘟病具有抗性，并且转基因水稻的秸秆和稻糠可用于饲料中。
7.按权利要求6所述的抗菌肽的应用，其特征在于：由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的抗菌肽，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切，与经过同样酶切的质粒pET-32a的DNA在T4 DNA连接酶作用下进行拼接的质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，将其在含有氨苄青霉素的LB培养基中于37℃震荡培养16h后，待菌体OD达到0.6-1.0时，加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导表达，收集菌体，用超声波破碎细胞，离心后上清为重组抗菌肽的粗产物，经过His-Tag亲和层析，即为经重组表达后纯化的重组表达序列表SEQ No.1中氨基酸序列所示的抗菌肽。
8.按权利要求6或7所述的抗菌肽的应用，其特征在于：整合在原核表达载体pET-32a中的由序列表SEQ No.1中核苷酸所示的抗菌肽经限制性酶切和T4 DNA连接酶连接后，将其导入植物表达载体pCAMBIA1300，构建含有植物启动子35S和终止子nosT的植物表达载体pCAM-XP，将该载体导入农杆菌EHA105，通过农杆菌EHA105的介导，将重组的序列表SEQ No.1中核苷酸序列所示的抗菌肽编码序列导入水稻基因组，获得表达序列表SEQNo.2中氨基酸序列所示的抗菌肽的转基因水稻。
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