CN103766626B

CN103766626B - 一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法

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Publication number: CN103766626B
Application number: CN201210405508.0A
Authority: CN
Inventors: 刘梅; 刘文真; 王雷; 付亚萍; 王宝杰; 胡国成; 蒋克勇
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2012-10-22
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2032-10-22
Also published as: CN103766626A

Abstract

本发明涉及基因工程，具体的说是一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法。以感染白斑病的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）为：VP28F（NcoI）：CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT；VP28R（NheI）：GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。本发明选择水稻作为生物反应器表达WSSV囊膜蛋白基因既保证了外源基因的准确表达，又易于大规模培养和生产。

Description

一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程，具体的说是一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

对虾白斑综合症（WSS）是危害全球对虾养殖业的毁灭性病害，其病原为对虾白斑综合症病毒（WSSV），该病毒毒力极强，每年因此全球养殖对虾产量减少一半，损失几百亿人民币。到目前为止，对虾白斑病尚无有效的治疗方法。

早在1999年，王雷等人从对虾免疫基础研究的角度出发，发现热灭活的WSSV、病毒结构蛋白可以刺激中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）血清中溶菌酶活力和超氧化物歧化酶产生显著提高，可见灭活的WSSV或者其结构蛋白都可以激活对虾的免疫系统。随后，利用囊膜蛋白刺激对虾产生抗病性的研究也在不同的实验室展开，结果都显示利用WSSV特异结构蛋白作为“疫苗”防治对虾白斑病是完全可行的。其中WSSV的囊膜蛋白VP28被证明是最有效的一种结构蛋白。多数的研究均采用原核生物——细菌作为表达载体用于WSSV囊膜蛋白的表达，而采用原核生物表达外源真核生物蛋白往往不能保持其真正的构象，因此可能丧失一部分抗原活性。由此可见，获得大量能保持免疫原性的WSSV囊膜或核衣壳蛋白是解决这一问题的关键，而选择廉价且安全的生物反应器表达囊膜或核衣壳蛋白是实现产业化应用的前提条件。

发明内容

本发明目的在于提供一种预防对虾白斑病的饲料添加剂及其制备方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种预防对虾白斑病的饲料添加剂，以感染白斑病的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）为：VP28F（NcoI）：CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT；VP28R（NheI）：GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。

所述SEQ ID No.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中：采用NcoI和NheI双酶切的方法分别对SEQ ID No.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体pCAMBIA-VP28进而转入水稻中；具体为：

1）将SEQ ID No.1所示的扩增产物采用PCR产物纯化试剂盒纯化后，采用NcoI和NheI进行酶切，待用；

2）采用NcoI和NheI双酶切植物表达载体pCAMBIA1305.2，电泳分离酶切产物，采用胶回收试剂盒回收电泳大片段，即为线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；

3）采用T4连接酶，将步骤1）酶切的VP28基因连接入步骤2）酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA-VP28。

预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，所述以携带WSSV的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后通过农杆菌介导法转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）为：VP28F（NcoI）：CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT；VP28R（NheI）：GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。

所述SEQ ID No.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中：采用NcoI和NheI双酶切分别对SEQ ID No.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体pCAMBIA-VP28进而转入水稻中。

将所述制备所得添加剂即携带VP28的再生苗种植后所得米糠与饲料混配，能够预防对虾白斑病。

本发明所具有的优点：本发明选择水稻作为生物反应器表达WSSV囊膜蛋白基因既保证了外源基因的准确表达，又易于大规模培养和生产。而且植物细胞内表达的WSSV囊膜蛋白可以得到植物细胞壁的保护，使其在饲料加工过程中减少破坏，并有助于其安全到达肠道发挥免疫作用。

附图说明

图1为本发明实施例提供的含有VP28基因的植物表达载体示意图。

图2为本发明实施例提供的转基因水稻的RT-PCR检测电泳图。

具体实施方式

实施例

1)WSSV囊膜蛋白基因的克隆

根据GenBank中收录的WSSV序列（GenBank登录号：AF332093）合成下列引物VP28F（NcoI）：CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT，VP28R（NheI）：GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。

取携带白斑病毒的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）作为材料，采用CTAB法提取对虾肝胰腺组织的DNA。以肝胰腺组织DNA为模板，用VP28F（NcoI）和VP28R（NheI）进行PCR扩增获得VP28基因的DNA序列，扩增程序为：94℃变性2min；94℃变性30s，45℃退火45s，72℃延伸45s，5个循环；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司）进行纯化，在T4连接酶的作用下连接入pMD 18-T载体（宝生物工程（大连）有限公司），连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。采用引物VP28F（NcoI）和VP28R（NheI）对大肠杆菌进行菌落PCR鉴定，选取阳性大肠杆菌克隆进行序列测定。获得VP28的基因序列，测序后序列与GenBank中收录的WSSV序列（AF332093）相似性为98％。SEQ ID No.1序列如下，其中下划线部分为有效的编码序列，根据DNA序列推测的蛋白序列包含204个氨基酸。CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGGTCGTGTCGGCCATCCTCGCCACCACTGCTGTGA TTGCTGTATTTATTGTGATTTTTAGGTATCACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCCACAC AGACAATATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGGATCA GGCTACTTCAAGATGACTGATGTGTCCTTTGACAGCGACACCTTGGGCAAAATCAAGATCCGCA ATGGAAAGTCTGATGCACAGATGAAGGAAGAAGATGCGGATCTTGTCATCACTCCCGTGGAGGG CCGAGCACTCGAAGTGACTGTGGGACAGAATCTCACCTTTGAGGGAACATTCAAGGTGTGGAAC AACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTGCCAAAGATTAACCCATCAAAGG CCTTTGTCGGTAGCTCCAACACCTCCTCCTTCACCCCCGTCTCTATTGATGAGGATGAAGTTGG CACCTTTGTGTGTGGTACCACCTTTGGCGCACCAATTGCACGTACCGCCGGTGGAAATCTTTTC GACATGTACGTGCACGTCACCTACTCTGGCACTGAGACCGAGTAAATAAATCGTGCTTTTTTATATAGATAGGGAATTTTAATATTACAACAATAAGAAAATAAAACAATTGAGGAAATTTATACCATATTTTATTGACCTACTTAACCTTCTTGCTATACAATGAATGTTTAGGTGACTGGAAAAGTTTAGCAATATTATCCTTGAACGGGAAACATGCTAGCAATC

（a）序列特征：

●长度：804bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：双链DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：感染WSSV的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）

（f）特异性名称：VP28

根据上述DNA序列编码的蛋白序列包含204个氨基酸。该蛋白序列为：MDLSFTLSVVSAILATTAVIAVFIVIFRYHNTVTKTIETHTDNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKIKIRNGKSDAQMKEEDADLVITPVEGRALEVTVGQNLTFEGTFKVWNNTSRKINITGMQMVPKINPSKAFVGSSNTSSFTPVSIDEDEVGTFVCGTTFGAPIARTAGGNLFDMYVHVTYSGTETE

分子量：22.2KD

等电点：4.66

2）携带VP28基因的植物表达载体的构建

用VP28F（NcoI）和VP28R（NheI）引物进行PCR扩增获得VP28基因PCR产物，如SEQ ID No.1序列所示，该产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司）进行纯化后，采用NcoI和NheI进行双酶切，得到带有NcoI和NheI粘性末端的VP28基因片段。用NcoI和NheI双酶切植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到带有NcoI和NheI粘性末端的植物表达载体。然后在T4连接酶的作用下将酶切所得的VP28基因（其两端分别为NcoI和NheI内切酶的粘性末端）和线性化植物表达载体pCAMBIA1305.2（其两端分别为NcoI和NheI内切酶的粘性末端）连接在一起，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。采用引物VP28F（NcoI）和VP28R（NheI）对大肠杆菌进行菌落PCR鉴定，选取阳性大肠杆菌克隆进行序列测定；获得pCAMBIA-VP28载体，该载体可用于植物遗传转化。

3）水稻转基因及检测

将上述载体导入根癌农杆菌EHA105用于植物遗传转化，通过根癌农杆菌与水稻幼胚愈伤组织的共培养，在根癌农杆菌的介导下，将上述WSSV囊膜蛋白VP28基因转入水稻并且通过潮霉素的筛选，获得携带VP28基因的转基因再生苗。

具体步骤如下：取授粉后12～15天的水稻未成熟种子，在70％（体积浓度）乙醇中浸0.5～1min后，放入1.25％（体积浓度）次氯酸钠溶液中（1.25％次氯酸钠溶液中加2～3滴吐温-200）灭菌90分钟，用无菌水冲冼4～5次。挤出幼胚并培养于诱导培养基（见表1）上（培养条件为26℃，避光）诱导愈伤组织。约5～6天后剥下由盾片处诱导出的愈伤组织，转入新的诱导培养基相同条件下继代培养3～5天。将经继代培养3～5天的愈伤组织转移到一无菌三角瓶中，然后将适量农杆菌（携带植物表达载体p726S-VP28）悬浮液倒入三角瓶中，使悬浮液至少浸没愈伤组织，室温下放置10～20分钟，并不时晃动。取出愈伤组织，在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基（见表1）上于26℃暗培养3天。将共培养后的愈伤组织转入含潮霉素的选择培养基上（见表1），于26℃暗培养。10d后转到另一新鲜选择培养基SM上继续筛选10d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基（见表1）上，于26℃，12h光照:12h黑暗条件下培养。待再生小苗长成约2.5cm高时，将其移到壮苗培养基（见表1）上，26℃，12h光照:12h黑暗条件下培养约2～3周后，将小苗移入网室或温室。

表1 植物转基因过程中所用各类培养基组份

注：表中各类母液的成分为：20×N6大量元素母液：KNO₃ 56.6g/L，(NH₄)₂SO₄ 9.26g/L，KH₂PO₄ 8g/L，MgSO₄ 3.7g/L，CaCl₂.2H₂O 3.32g/L；100×B5有机母液：Inositol（肌醇）10g/L，Nicotinic Acid（VB5）100mg/L，Pyridoxine（VB6）100mg/L，Thiamine（VB1）1g/L；100×B5微量元素母液：H₃BO₃ 3mg/L，MnSO₄.H₂O 10mg/L，CoCl₂.6H₂O0.025mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L，ZnSO₄.7H₂O 2mg/L，Na₂MoO₄.H₂O 0.25mg/L，KI 0.75mg/L；100×MS Fe盐溶液：FeSO₄.7H2O 2.78g/L，Na₂.EDTA 3.75g/L。

转基因再生植株经过PCR鉴定和测序验证，对虾白斑病毒VP28基因已经整合到植物基因组中。PCR检测所用引物序列为：VP28F2：GCCATCCTCGCCACCACTG，VP28R2：TGCCAACTTCATCCTCATCAATAG，该引物特异性扩增VP28基因产生一条475bp的条带。2009年经过对自交T1代植株的选育，获得了携带VP28基因的转基因纯合株系。2010-2011年继续验证了VP28基因在转基因水稻中的遗传稳定性。对500多株转基因水稻后代进行了PCR验证，证明90％的VP28基因能够在水稻中稳定遗传。通过采用引物VP28F2：GCCATCCTCGCCACCACTG和VP28R2：TGCCAACTTCATCCTCATCAATAG对转基因后代进行RT-PCR分析表明对虾素已经在水稻中表达（参见图2）。

4）VP28转基因米糠对对虾白斑病的防治效果

特异饲料的制备：原始对虾饲料（购自烟台大乐饲料有限公司生产的“大乐”对虾二号料），主要成分为优质纯鱼粉、乌贼粉、虾糠、豆粕、高筋面粉、酵母粉、有机矿物质、微量元素、维生素、促脱壳生长剂等。

上述含有VP28的转基因水稻米糠：收获上述转基因水稻种子以后，先去壳成为糙米，然后糙米加工成精米，精米加工过程中除精米的部分为米糠，其主要成份为糊粉层和胚

非转基因水稻米糠：收获增长水稻种子以后，先去壳成为糙米，然后糙米加工成精米，精米加工过程中除精米的部分为米糠，其主要成份为糊粉层和胚。

将购买的饲料粉碎而后添加粉碎的饲料质量20％的米糠，其中米糠由转基因水稻米糠和非转基因水稻米糠组成，米糠中含有VP28的转基因米糠占饲料质量的10-20％。

对虾的养殖：试验用凡纳滨对虾取自滨州对虾养殖基地，平均体长5-6cm。经过检测尚未感染对虾白斑病毒。将对虾分组置于120×80×80cm的水族箱中。每缸放置30尾，每组设置3个平行，每天分两次投喂饲料，实验水温为28±2℃。

其中第一组投喂市场购得的“大乐”二号饲料；第二组投喂“大乐”二号饲料中添加饲料质量20％非转基因米糠；第三组投喂“大乐”二号饲料中添加分别占饲料质量10％非转基因米糠和占饲料质量10％转基因米糠；第四组投喂“大乐”二号饲料中添加占饲料质量5％的非转基因米糠和占饲料质量15％的转基因米糠；第五组投喂“大乐”二号饲料中添加饲料质量20％转基因米糠。

攻毒：取养殖场已发生严重白斑病的对虾，取其血淋巴，采用蔗糖密度梯度离心法提取WSSV用于感染实验对虾。各组对虾在投喂特异饲料15天后，分别置于稀释的WSSV感染液中浸浴7小时，去掉多余的感染液后，分置于各缸观察发病和死亡情况。

防治效果：浸浴实验2天以后，对虾开始出现发病死亡。在实验的15天周期内，对照组平均死亡率为87.2％，实验组死亡率分别为（91.3％，85.3％，60.7％和42.3％），可见含有VP28的转基因米糠饲料对凡纳滨对虾的WSSV感染起到了防治作用。在转基因米糠在饲料中的添加量应达到15％以上，防治效果显著。

表2 凡纳滨对虾进行WSSV攻毒后15天的累积死亡数

注：每组设置3个重复，每重复养殖30只对虾。第一组为市售大乐对虾饲料，不添加米糠，第二组添加20％非转基因米糠，第三组添加10％转基因米糠+10％非转基因米糠，第四组添加15％转基因米糠+5％非转基因米糠，第五组添加20％转基因米糠。

Claims

1.一种预防对虾白斑病的饲料添加剂，其特征在于：以感染白斑病的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）为：VP28F（NcoI）：CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT；VP28R（NheI）：GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。

2.按权利要求1所述的预防对虾白斑病的饲料添加剂，其特征在于：所述SEQ ID No.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中：采用NcoI和NheI双酶切的方法分别对SEQ ID No.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体pCAMBIA-VP28进而转入水稻中。

3.一种权利要求1所述的预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，其特征在于：所述以携带WSSV的凡纳滨对虾肝胰腺组织DNA为模板，采用引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后通过农杆菌介导法转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠，即为预防对虾白斑病的饲料添加剂；其中引物VP28F（NcoI）与VP28R（NheI）为：VP28F（NcoI）：CTCGCCATGGATCTTTCTTTCACTCTTT；VP28R（NheI）：GATTGCTAGCATGTTTCCCGTTCAA。

4.按权利要求3预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，其特征在于：所述SEQ ID No.1所示的扩增产物经如下修饰后再转入水稻中：采用NcoI和NheI双酶切的方法分别对SEQ ID No.1所示的扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1305.2进行处理，而后通过T4连接酶连接即得到植物表达载体pCAMBIA-VP28进而转入水稻中。

5.按权利要求3预防对虾白斑病的饲料添加剂的制备，其特征在于：将所述携带VP28的再生苗种植后所得米糠与饲料混配，能够预防对虾白斑病。