CN102895677B - 一种新型对虾多价载体疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型对虾多价载体疫苗，其特征在于：所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HT5303，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2012395。本发明的枯草芽孢杆菌疫苗株，形成芽孢后能够在芽孢表面展示对虾白斑综合症病毒VP281蛋白，在形成营养细胞时分泌表达穿膜肽、白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）形成的融合蛋白。本发明的多价载体疫苗相对于其它疫苗具有交叉保护和保护期长，并且该疫苗能够添加到饲料中，耐受饲料的高温定型，具有广阔的商业开发景。

Description

一种新型对虾多价载体疫苗及其应用

技术领域

本发明属于基因生物工程技术领域，涉及一种新型对虾白斑综合症病毒（WSSV）和弧菌病多价载体疫苗及其应用，具体地说是用于防治对虾白斑综合症和弧菌病的多价载体疫苗及其应用。

背景技术

对虾是主要在亚洲和拉丁美洲特别为出口目的生产的高价值水产品，目前我国主要的养殖品种为南美白对虾、斑节对虾和中国对虾。然而在过去的10多年里，对虾养殖生产中出现了相当严重的问题，其中白斑综合症病毒（White spot syndrome virus， WSSV）、桃拉病毒（Taura Syndrome Virus， TSV）和弧菌为重要病害元凶。对虾白斑综合症（white spot syndrome，WSS）是由对虾白斑综合征病毒（WSSV）引起的以感染对虾甲壳内侧出现直径为0.5～2 mm大小的白色斑点为主要特征的暴发性传染病。该病感染率和死亡率都极高，给养虾业造成了巨大的经济损失。到目前为止，在世界大部分对虾养殖区都爆发了白斑综合症，该病已成为全球对虾养殖业面临的最严重的挑战之一。除病毒病之外，弧菌病（Vibriosis）也是影响对虾养殖业最为常见、危害较重的一类疾病，它多发于6-9月间，在虾苗孵育阶段临床症状主要表现为发光，肠道破坏，病害爆发时可一夜间导致100％死亡率。白斑综合症和弧菌病已成为我国和全球对虾养殖业健康可持续发展的严重制约因素。

白斑综合症病毒（WSSV）是属于Nimaviridae科Whispovirus属的代表种，是一种无包涵体、有囊膜的杆状病毒（van Hulten，et al.2001.Virology.286（1）:1-22）。它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可以侵染淡水及海洋生态中的多种蟹类、克氏鳌虾类、端足类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产养殖造成严重的经济损失。因此世界范围内针对对虾白斑综合症病毒的防治技术开发受到广泛关注。

近年的研究表明，白斑综合症病毒（WSSV）的重组囊膜蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。WSSV的主要结构白蛋有VP28、VP19、VP24、VP26、VP15等。VP19和VP28是主要的囊膜蛋白。VP19在囊膜蛋白的成分中所占比例仅次于VP28，国内外的研究将其作为设计免疫预防性药物的靶位点（Van Hulten M.C. et al. 2001. Virology. 286: 7-22）。目前，VP19基因已在原核或真核生物表达系统内表达，并且发现表达产物具有显著的抗病毒保护效应，保护效应次于VP28囊膜蛋白。VP281是WSSV的次要结构蛋白，由ORF1050编码，VP281中存在一细胞黏附序列 （RGD三肽序列），提示此囊膜蛋白可能在介导WSSV感染时发挥重要作用（Huang C H，et al.2002. Journal of General Virology 83: 2385-2392）。

目前，国内外在研究WSSV疫苗上取得了很大的进展。已研发的包括有核酸类疫苗（Rout N， et al. 2007.Vaccine. 25:2778-2786； Rajeshkumar S， et al. 2009. 26（3）:429-437等）和重组疫苗（Witteveldt J， et al. 2004b. J Virol.78:2057-2061； Witteveldt J， et al. 2004a. Fish Shellfish Immunol.16:571-579； Mavichak R. et al. 2010. J Fish Dis. 33:69-74等）。Witteveldt J等发现VP28的亚单位疫苗对对虾免受WSSV的感染起到重要的保护作用，其免疫保护率达到70%。宁德刚等人（D. Ning， et al. 2011 Journal of Applied Microbiology 111:1327-1336）通过枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白展示系统将VP28蛋白展示到枯草芽孢杆菌的表面，通过口服的方式免疫克氏鳌虾，21天的免疫保护率为30%。2011年美国Harris等人证明在注射的条件下VP19的免疫保护率要优于VP28（J.Dustion Loy，DVM global aquaculture advocate May/June 2011）。2007年Namita Rout等人（Namita Rout，et al.2007.Vaccine.25:2778-2786）制备的VP281的DNA疫苗使对虾免受病毒感染的保护作用达到了50天。基于上述前人的研究结果，本发明采用的WSSV的抗原蛋白是VP281和VP19。

弧菌是一类条件致病菌，分布广泛，当水体环境变化，弧菌尤其是致病性弧菌繁殖迅速，如数量超过阈值则容易引发对虾弧菌病。目前对虾弧菌病的主要病原为哈氏弧菌、副溶血弧菌和鳗弧菌等。多年来弧菌病主要采用抗生素治疗，但抗生素治疗带来一系列严重后果，主要是产生耐药菌株，造成水体污染。以抗生素为代表的化学疗法已经在水产病害防治中的成效逐渐丧失并在越来越多的国家受到限用或禁用。因此探索新的免疫和治疗途径势在必行。

3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为一个传统糖酵解蛋白基因广泛存在于几乎所有的生物体中。然而近年来的研究表明GAPDH在不同的亚细胞部位显示出和糖酵解无关的多种生物学活性（Sirove，M.A.，1997，J Cell Biochem，66（2）：133-40；Sirove，M.A.，1999，Biochim Biophys Acta，1432（2）：159-184）。在许多微生物（酵母，细菌和致病性寄生虫）的研究中发现，GAPDH不仅存在于细胞质中还定位于细胞膜上。从而GAPDH做为外膜蛋白的生物学功能受到广泛的关注。1997年Gil Navarro 等人首先在白色念珠菌中发现GAPDH具有免疫原性（Gil Navarro et al.，1997，J Bacteriol，179：4992-4999）。目前在布鲁氏菌和迟钝爱德华氏菌中已经证实，GAPDH能够激发宿主的保护性免疫反应（Kawai K. et al，2004，Vaceine，22：3411-3418；Rosinnha G.M. et al.，2002，J Med Mierobiol，51（8）：661-671）。目前的研究也表明，许多致病弧菌的GAPDH的同源性非常高，具有很高的保守性。X. Li等已证实GAPDH是重要的广谱性保护抗原，在不同的病原菌间具有显著的交叉免疫力（X.Li et al.，2012，Letters in Applied Microbiology，54（1）:1-9）。因此，以哈氏弧菌gapdh基因作为应用靶点开发成为针对多种弧菌病的疫苗具有具大的应用价值。目前尚未有利用GAPDH作为抗原开发虾类疫苗的报道。

但目前已有的研究工作也存在着很多不足之处：1）给药不方便，主要以注射的方式给药，难以进行生产性养殖应用；2）现有的疫苗免疫保护期难以超越28天，无法满足对虾生产养殖中对免疫保护期的实际需要（40天以上），故没有生产应用价值和开发前景。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 作为一种好氧性的革兰氏阳性细菌，是国际公认的具有良好生物安全性的非致病性宿主菌，可作为多种抗原蛋白的表达载体宿主菌。它在营养缺乏或其他胁迫条件下， 能形成具有抗逆性的休眠体芽孢，芽孢在肠道内定植后可萌发成营养体，而营养体枯草芽孢杆菌是常用的益生菌之一， 它在水产养殖中可起到净化水质的作用，同时枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌有很强的抑制作用。而芽胞良好的抗逆性使疫苗能够耐受胃液中的酸性环境，储存时间长，可顺利通过胃肠屏障，快速诱导机体产生保护性免疫反应。枯草芽孢杆菌芽孢的形成是一系列基因程序性表达的结果。这些基因包括芽孢衣壳蛋白基因以及其调控基因，如cotA、cotB、cotC、cotF、cotG和cotX等20余种。利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白的基因为分子载体，通过分子生物学技术和芽孢表面展示技术将外源目的蛋白展示于重组枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建具有生物活性的重组芽孢备受关注。2001年Isticato R等人第一次利用CotB作为芽孢表面展示外源抗原的融合载体蛋白， 成功地在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示了破伤风毒素（TTFC）C末端的片段。宁德刚等人（D. Ning， et al. 2011 Journal of Applied Microbiology 111:1327-1336）通过基于CotB和CotC衣壳蛋白基因展示系统将VP28蛋白展示到枯草芽孢杆菌的表面，通过口服的方式免疫克氏鳌虾，7天的免疫保护率为77%，21天的免疫保护率为30%。

蛋白质转导结构域（protein transduction domain，PTD）或称细胞穿膜肽是一条以肽为载体的有效运输各物质进入细胞及细胞核的系统。通过PTD携带的物质有全产蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸等。现在研究最多的、应用范围最广的蛋白转导结构域来源于人免疫缺陷病毒I型的转录激活因子（trans-activating transcriptional activator， TAT）TAT蛋白。早在1994 年，Fawell等就已证实，TAT 蛋白来源的多肽能够携带外源分子转导进入细胞，但是到目前为止，关于TAT蛋白转导结构域进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻，但是TAT已经广泛应用于药物的研究（L. Crombez，et al.2009，Mol. Ther.， 17 ：95–103；S.C. Pero，et al. Cancer 96：1520-1525）和疫苗的开发（Zhang Y et al，2012，Journal of virological methods 181 （ 1 ）: 59-67）。2012年孟小林等人（Yi Z，et al.2012.Journal of Virological Method 181:59-67）将TAT-VP28制备成亚单位疫苗免疫克氏鳌虾，发现14天的免疫保护率提高了14%，达到67.8%。因此，TAT在疫苗方面有着潜在的应用价值，但是将TAT蛋白应用于水产载体疫苗的开发目前还处于空白。

虽然目前已有将VP28展示于枯草芽孢杆菌表面制备成载体疫苗的研究，也有将TAT-VP28融合蛋白制备成亚单位疫苗的研究，但是其免疫保护期相对较短，在大规模的水产养殖应用上存在诸多弊端。目前国际上只有2007年Namita Rout等人（Namita Rout，et al.2007.Vaccine.2778-2786）将对虾疫苗的免疫保护期提高到50天。作者将VP281和VP28制备成DNA疫苗以注射的方式免疫黑虎虾，结果发现，随着检测免疫保护期的延长VP281的保护效果要优于VP28（25天时VP28免疫保护率是53%，VP281的免疫保护率是50%；50天时VP28免疫保护率是30%，VP281的免疫保护率是35%）。

综上所述，本发明的目的在于提供一种可口服并且具有较长免疫保护期的抗对虾白斑综合症和弧菌病的多价载体疫苗，该载体疫苗由枯草芽孢杆菌经基因工程改造而获得，在该重组枯草芽孢杆菌形成芽孢时，芽孢表面展示有对虾白斑综合症病毒VP281蛋白，在该重组枯草芽孢杆菌形成营养体细胞时，胞外分泌表达穿膜肽TAT、白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌GAPDH构建的融合蛋白。在本发明作出以前，这样的载体疫苗迄今尚未见于任何类似的报道或发明专利。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种可口服并且具有较长免疫保护期的抗对虾白斑综合症和弧菌病的多价载体疫苗，该疫苗是以枯草芽孢杆菌重组菌株作为核心制备而成的一种新型的口服剂型多价载体疫苗，该疫苗在营养细胞状态时可以分泌穿膜肽、白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）形成的融合蛋白，而在诱导形成芽孢后可产生表面展示对虾白斑综合症病毒VP281蛋白的芽孢。

按照本发明提供的技术方案：一种新型对虾载体疫苗，其特征在于：所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HT5303，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M 2012395。

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株在营养细胞状态时能够分泌白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）形成的融合蛋白。

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组整合有由枯草芽孢杆菌分泌信号肽sacB基因、人工合成tat基因、白斑综合症病毒VP19基因和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因形成的相融合所获得的sacB-tat-vp19-gapdh融合基因序列（SEQ ID NO: 1），该枯草芽孢杆菌重组菌株在营养细胞时能够胞外分泌表达穿膜肽、白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）形成的融合蛋白。

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株在芽孢状态时能够在芽孢表面展示对虾白斑综合症病毒VP281蛋白。

作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上重组整合有以枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与对虾白斑综合症病毒VP281蛋白相融合的融合基因片段（SEQ ID NO: 2），通过诱导该枯草芽孢杆菌重组菌株形成芽孢后，可产生表面展示对虾白斑综合症病毒VP281蛋白。

本发明还提供了所述新型对虾多价载体疫苗在对虾养殖中防治白斑综合症病和弧菌病的应用。

作为所述应用的进一步改进，所述新型对虾多价载体疫苗是以枯草芽孢杆菌芽孢形式添加到对虾饲料及饲料添加剂中，以口服方式免疫。

生物材料样品保藏：枯草芽孢杆菌HT5303（Bacillus subtilis）HT5303，于2012年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏号CCTCCNo：M 2012395。

本发明与现有技术相比，优点在于：本发明的枯草芽孢杆菌疫苗株，形成芽孢后能够在芽孢表面展示对虾白斑综合症病毒VP281蛋白，在形成营养细胞时分泌表达白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）形成的融合蛋白。本发明利用芽孢所具有的独特抗逆性，将该枯草芽孢杆菌多价载体疫苗以芽孢形式添加到对虾饲料中口服免疫。本发明构建的多价载体疫苗，相对于其它疫苗具有多价交叉保护和保护期长（35天以上），并且该疫苗能够添加到饲料中，耐受饲料的高温定型，具有实际的生产应用开发价值。

附图说明

图1是口服免疫接种多价载体疫苗的南美白对虾在停止免疫一段时间时，攻对虾白斑综合症病毒后的各实验组的累计死亡率统计曲线图。

图2是口服免疫接种多价载体疫苗的中国对虾在停止免疫一段时间时，攻对虾白斑综合症病毒后的各实验组的累计死亡率统计曲线图。

图3是口服免疫接种多价载体疫苗的南美白对虾和中国对虾在停止免疫28天时，攻弧菌病原菌后的各实验组的累计死亡率统计曲线图。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明做进一步描述。

实施例1：抗对虾白斑综合症和弧菌病多价载体疫苗的制备

1、培养基配制

（1）DSM液体培养基：细菌营养肉汤（Difco）8g，10%（w/v）KCl 10ml，1.2%（w/v） MgSO₄·7H₂O 10ml，1M NaOH 1.5ml，调pH至7.6，ddH₂O定容至1000ml。高压灭菌后，冷却至50℃，在使用前分别加入已灭菌的1M Ca（NO₃）₂、0.01MMnCl₂、1mMFeSO₄各1ml。

（2）PBS缓冲液：Na₂HPO₄·2H₂O 2.74g/L，NaH₂PO₄·H₂O 0.63g/L， 将所述成份溶解于1000ml 蒸馏水，于121℃灭菌20分钟。

（3）LB培养基：胰蛋白胨（Tryptone） 10g/L，酵母提取物（Yeast extract） 5g/L，氯化钠（NaCl） 10g/L，调pH至7.0。

2、平板培养基复苏：取-80℃保存的保藏号为CCTCCNo：M 2012395的枯草芽孢杆菌重组菌株种子划线接种于LB固体平板上，在37℃培养过夜，使枯草芽孢杆菌重组菌株复壮，形成单菌落。

3、种子的制备：挑取单菌落接种于100ml DSM液体培养基中，37℃培养18h，OD600至2.0，作为种子液。

4、发酵液的制备：制备的种子液按照1%的接种量接种到5L生物反应器中，采用DSM液体培养基，培养温度37℃，通气量2L/分钟，pH7.5，培养25-30h，至芽孢形成率90%以上，终止发酵，得发酵液。

5、枯草芽孢杆菌芽孢菌粉的制备：将上述发酵液于室温以5000g离心10分钟，收集菌泥，向菌泥中加入15%重量百分比的淀粉，喷雾干燥，得到水分重量百分含量<5%的枯草芽孢杆菌芽孢菌粉，该枯草芽孢杆菌芽孢菌粉即为所述的枯草芽孢杆菌多价载体疫苗。

6、疫苗饲料的制备：将上述的枯草芽孢杆菌芽孢菌粉与对虾饲料原料混合制粒，包被大约1×10¹⁰个芽孢／g饲料，饲料经微粉碎后过40目筛，混合均匀后用小型颗粒饲料机加工成直径1.5mm的颗粒饲料备用，饲料加工过程中温度65-70℃持续时间约10min。

 实施例2：口服免疫接种南美白对虾对白斑综合症的免疫保护力评价

南美白对虾的饲养：购置的试验用虾（南美白对虾）经无WSSV携带检测后暂养于3000L养殖水槽内，配以过滤的新鲜海水（海水盐度为25g/L），养殖水温维持26±2℃，暂养1周后，剔除不健康个体。继续养殖一周后（平均体重10±1.2g/尾）后，随机分组，每组30尾，每组平行3水槽（100L/槽）。

WSSV病毒悬浮液制备：解剖病虾的鳃和胰腺，称量1g，剪碎后在液氮下研磨，按1/10（w/V）的比例，加入TN缓冲液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH 7.6，0.4 mol/ L NaCl），用玻璃匀浆器在冰浴下匀浆，匀浆液经4℃，7000 g离心20 min，弃沉淀；上清经0.45μm微孔滤膜过滤后，4℃，20000 g离心50 min，沉淀用TN缓冲液悬浮至终浓度为1×10⁶IU/ml，实验室保存备用。

免疫效力评价：上述已分组水族箱分别设置空白对照组、口服对照组A、口服对照组B、免疫对照组A、免疫对照组B、免疫组A、免疫组B。其中空白对照组、口服对照组A和口服对照组B饲喂正常基础饲料，免疫对照组A和免疫对照组B饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组A和免疫组B饲喂用实施例1制备的疫苗饲料，每组设置3个平行。

将上述各组南美白对虾连续饲喂免疫1周，每尾虾每天免疫1g饲料，免疫1周后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，其中口服对照组A、免疫对照组A和免疫组A停止免疫28天后攻毒；口服对照组B、免疫对照组B和免疫组B停止免疫35天后攻毒，攻毒的方式为每尾虾肌肉注射实验室储存的病毒悬液100μl。在以后的每天中，观察并记录各组对虾的死亡情况，20天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组对虾的累计死亡率，统计结果如图1所示。

按下述公式计算免疫保护率：

免疫保护率%＝（对照组死亡率-试验组死亡率）/对照组死亡率×100%

经计算，对于停止免疫28天后的南美白对虾来说，实施例1制备的多价载体疫苗对白斑综合症病毒的免疫保护率是70%，仅饲喂枯草芽孢杆菌也有一定的免疫保护作用，其免疫保护率大约是20%；对于停止免疫35天后的南美白对虾来说，实施例1制备的多价载体疫苗对白斑综合症病毒的免疫保护率是50%，仅饲喂枯草芽孢杆菌的免疫保护率大约是17%。从此结果可看出本发明的多价载体疫苗对对虾白斑综合症具有很好的免疫防治效果，可大大降低南美白对虾的死亡率。同时本发明提供的疫苗将免疫保护期延长了一个星期，具有更大的应用价值。从以上结果还可看出，枯草芽孢杆菌作为益生菌，可以提高南美白对虾的免疫力，抵抗外界病原体的侵染。

 实施例3：口服免疫接种中国对虾对白斑综合症的免疫保护力评价

中国对虾的饲养：从天津购置的试验用虾（中国对虾）经无WSSV携带检测后暂养于3000L养殖水槽内，配以过滤的新鲜海水（海水盐度为35g/L），养殖水温维持25±2℃，暂养1周后，剔除不健康个体。继续养殖一周后（平均体重10g±0.9g/尾）后，随机分组于100L水槽内，每组30尾，每组平行3水槽（100L/槽）。

WSSV病毒悬浮液制备：解剖病虾的鳃和胰腺，称量1g，剪碎后在液氮下研磨，按1/10（w/V）的比例，加入TN缓冲液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH 7.6，0.4 mol/ L NaCl），用玻璃匀浆器在冰浴下匀浆，匀浆液经4℃，7000 g离心20 min，弃沉淀；上清经0.45 μm微孔滤膜过滤后，4℃，20000 g离心50 min，沉淀用用TN缓冲液悬浮至终浓度为1×10⁶IU/ml，实验室保存备用。

免疫效力评价：上述已分组水族箱分别设置空白对照组、口服对照组A、口服对照组B、免疫对照组A、免疫对照组B、免疫组A、免疫组B。其中空白对照组、口服对照组A和口服对照组B饲喂正常基础饲料，免疫对照组A和免疫对照组B饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组A和免疫组B饲喂用实施例1制备的疫苗饲料。每组设置3个平行。

将上述各组中国对虾连续饲喂免疫1周，每尾虾每天免疫1g饲料，免疫1周后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，其中口服对照组A、免疫对照组A和免疫组A停止免疫28天后攻毒；口服对照组B、免疫对照组B和免疫组B停止免疫35天后攻毒，攻毒的方式为每尾虾肌肉注射实验室储存的病毒悬液100μl。在以后的每天中，观察并记录各组对虾的死亡情况，20天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组对虾的累计死亡率，统计结果如图2所示。

按下述公式计算免疫保护率：

免疫保护率%＝（对照组死亡率-试验组死亡率）/对照组死亡率×100%

经计算，对于停止免疫28天后的中国对虾来说，实施例1制备的多价载体疫苗对白斑综合症病毒的免疫保护率是69%；对于停止免疫35天后的中国对虾来说，实施例1制备的多价载体疫苗对白斑综合症病毒的免疫保护率是41%。从此结果可看出本发明的多价疫苗对对虾白斑综合症具有很好的免疫防治效果，可大大降低中国对虾的死亡率。同时本发明提供的疫苗将免疫保护期延长了一个星期，具有更大的应用价值。从以上结果还可看出，枯草芽孢杆菌作为益生菌，可以提高中国对虾的免疫力，抵抗外界病原体的侵染。

实施例4：口服免疫接种南美白对虾和中国对虾对弧菌病的免疫保护评价

南美白对虾的饲养：购置的试验用虾（南美白对虾）经无WSSV携带检测后暂养于3000L养殖水槽内，配以过滤的新鲜海水（海水的含盐量为25g/L），养殖水温维持26±2℃，暂养1周后，剔除不健康个体。继续养殖一周后（平均体重10±1.2g/尾）后，随机分组，每组30尾，每组平行3水槽（100L/槽）。

中国对虾的饲养：购置的试验用虾（中国对虾）暂养于3000L养殖水槽内，配以过滤的新鲜海水（海水的含盐量为35g/L），养殖水温维持25±2℃，暂养1周后，剔除不健康个体。继续养殖一周后（平均体重10±0.9g/尾）后，随机分组，每组30尾，每组平行3水槽（100L/槽）。

病原菌悬浮液的制备：在TSB（2% NaCl）液体培养基中培养哈氏弧菌至OD600为0.6，然后于室温以5000rpm离心10分钟，收集沉淀菌体，用PBS缓冲液悬浮至终浓度为1×10⁷cfu/ml，实验室保存备用。

免疫效力评价：上述南美白对虾已分组水族箱分别设置空白对照组A、口服对照组A、免疫对照组A、免疫组A；将中国对虾已分组水族箱分别设置空白对照组B、口服对照组B、免疫对照组B、免疫组B。其中空白对照组A、空白对照组B、口服对照组A和口服对照组B饲喂正常基础饲料，免疫对照组A和免疫对照组B饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组A和免疫组B饲喂用实施例1制备的载体疫苗。每组设置3个平行。

将上述各组对虾连续饲喂免疫1周，每尾虾每天免疫1g饲料，免疫1周后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，停止免疫28天后，对除空白对照组外的各组南美白对虾分别攻毒，攻毒的方式为注射实验室保存的哈氏弧菌病原菌悬浮液，每尾虾的注射剂量为100μl。在以后的15天中，每天观察并记录各组对虾的死亡情况，15天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组对虾的累计死亡率，统计结果如图3所示。

按下述公式计算免疫保护率：

免疫保护率%＝（对照组死亡率-试验组死亡率%）/对照组死亡率×100%

经计算，对于停止免疫28天后的南美白对虾来说，实施例1制备的多价载体疫苗对弧菌病的免疫保护率是80%；对于停止免疫28天后的中国对虾来说，实施例1制备的多价载体疫苗对弧菌病的免疫保护率是74%。从此结果可看出本发明的多价疫苗对弧菌病具有很好的免疫防治效果，可大大降低对虾的死亡率。并且枯草芽孢杆菌作为益生菌，可以提高对虾的免疫力，抵抗外界病原体的侵染。

<110>无锡海健生物科技有限公司

<120>一种新型对虾多价载体疫苗及其应用

<160> 2

<210> 1

<211>1865

<212> DNA

<213>人工序列

<400>1

acggattagg ccgtttgtcc tcatggaccc gtataaaaag aatgatattg agcgttttga     60

ccgtgagccg gatgtgatct gcgagtatat taaaaaccgt tcacaatacc tcaaagatca    120

tttaagtatt ttatgaatgc gtgaaaatgg gtattcgcgg aaaaagcgac aattaggcta    180

ttgaattagt tcaacaaata aatgtgacac gtatatatgc agtatgttta tcatctatgt    240

ataagtgact aggaggaatt tgaatgagca agaggagaat gaaatatcat tcaaataatg    300

aaatatcgta ttataacttt ttgcactcaa tgaaagataa aattgttact gtatatcgtg    360

gaggtccgga atctaaaaaa ggaaaattaa cagctgtaaa atcagattat atagctttac    420

aagctgaaaa aaaaataatt tattatcagt tggagcatgt gaaaagtatt actgaggata    480

ccaataatag caccacaaca attgagactg aggaaatgct cgatgctgat gattttcata    540

gcttaatcgg acatttaata aaccaatcag ttcaatttaa ccaagggggt ccggaatcta    600

aaaaaggaag attggtctgg ctgggagatg attacgctgc gttaaacaca aatgaggatg    660

gggtagtgta ttttaatatc catcacatca aaagtataag taaacacgag cctgatttga    720

aaatagaaga gcagacgcca gttggagttt tggaagctga tgatttaagc gaggttttta    780

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tctatccttt tcacataaaa agcatcagct taggtccaaa agggtcgtac aaaaaagagg    960

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cagggtttga catgagacgt caagttgaag ctgcattata tgaagcaata tccaaaaaga    1200

aagaaaaggc cataaaggca ttcgatgagc tcatacaaga aagaggtgat gaaattacac   1260

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aaactgcaac agtcatagtt aaggcagatt gtgaaacggg ggatatcgat gaagtgtata    1500

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cggaattgga taatgtcgca gattctttcc atatttataa aatttctgca acagatagcg    1620

acagtggcaa tactaaaaaa ttgttgtatg ggttaaggaa taaaaaagca ggttatacgt    1680

gtttgtgtag aatttttgca gaaattgaat cagatgggat tatggccaat acaaatatcg    1740

gtgtcgctga aaacaacaga gatgaaattg atgaaaacga agaaggtaaa tatggttttt    1800

taatacccaa acaaccagct ggtgctaaat tgatcatcta cttcttttta aattgttgga    1860

cataa                                                      1865

 

 

<210> 2

<211> 1482

<212> DNA

<213>人工序列

<400>2

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg     60

gcaggaggcg caactcaagc ttttgcctac ggccgtaaaa aacgtcgtca acgtcgtcgt    120

atggccacca cgactaacac tcttcctttc ggcaggaccg gagcccaggc cgctggccct    180

tcttacacca tggaagatct tgaaggctcc atgtctatgg ctcgcatggg cctctttttg    240

atcgttgcta tctcaattgg tatcctcgtc ctggccgtca tgaatgtatg gatgggacca    300

aagaaggaca gcgattctga cactgataag gacaccgatg atgatgacga cactgccaac    360

gataacgatg atgaggacaa atataagaac aggaccaggg atatgatgct tctggctggg    420

tccgctcttc tgttcctcgt ttccgccgcc accgttttta tgtcttaccc caagaggagg    480

cagtaaatga ctatcaaagt aggtattaac ggttttggcc gtatcggtcg tttcgtattc    540

cgtgcagcgc aagagcgcaa cgacatcgaa gttgtaggta ttaacgacct tatcgacgta    600

gattacatgg catacatgct taagtacgac tcaactcacg gccgtttcaa cggtactgtt    660

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ctaactggtc cttcaaaaga cgctactcca atgttcgtaa tgggcgttaa ccacgctact    900

tacgctggtc aagacatcgt ttctaacgct tcttgtacta ctaactgtct agcgcctatcv    960

gctaaagttc ttaacgacaa gttcggtatc gaatctggtc ttatgactac agttcacgct    1020

actacagcaa ctcaaaaaac tgtagacggt ccttctgcta aagactggcg cggtggtcgt   1080

ggtgcttctc aaaacatcat cccatcatca actggtgctg ctaaagctgt aggcgttgtt   1140

cttccagaac taaacggcaa actaactggt atggctttcc gcgtaccaac agctaacgtt   1200

tctgtagttg acctaacagt taacctaaaa gaaggcgcat cttacgaagc tatctgtgca   1260

gcaatgaaag aagcttctga aggcgaacta gctggcgtac taggctacac tgaagaccaa   1320

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tcaaacaaag ttctagacct aatcgctcac atctctaagt aa                    1482

 

Claims (1)

1. 一种对虾多价载体疫苗，其特征在于：所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HT5303，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC  No：M 2012395；

所述枯草芽孢杆菌重组菌株在营养细胞状态时能够分泌白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）形成的融合蛋白；

所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上有由枯草芽孢杆菌sacB基因、人工合成tat基因和白斑综合症病毒VP19基因和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因相融合所获得的如SEQ ID NO: 1所述的sacB-tat-vp19-gapdh融合基因序列；

所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成芽孢后能够在芽孢表面展示对虾白斑综合症病毒VP281蛋白；

所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上整合有以枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与对虾白斑综合症病毒VP281基因相融合的如SEQ ID NO: 2所述的融合基因片段。

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