CN101659958B - 一种多效价活疫苗、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组质粒、多效价活疫苗及其制备方法和应用。本发明提供的重组质粒包含鳗弧菌金属蛋白酶的信号肽和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因序列；制备方法包括A)构建信号肽-3-磷酸甘油脱氢酶融合基因；B)酶切融合基因和载体；C)连接酶切的融合基因和载体。多效价活疫苗由重组质粒转化鳗弧菌减毒株获得；其制备方法包括：A)构建包含鳗弧菌金属蛋白酶的信号肽和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因的重组质粒；B)将步骤A)获得的重组质粒转化鳗弧菌减毒株；其应用为用于预防鳗弧菌和嗜水气单胞菌导致的鱼类疾病。使用本发明提供的减毒疫苗，具有明显的多效价免疫保护力，可作为鳗弧菌和嗜水气单胞菌的活疫苗，并具有良好的应用前景。

Description

一种多效价活疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于水产养殖动物病害防治技术，具体地说，涉及一种多效价活疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

目前，规模化、集约化、高密度养殖模式逐渐成为我国海水鱼类养殖业的发展主流。然而随着海水养殖业的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖的产量及成长造成严重影响，例如，在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、暴发性疾病频繁发生，海水养殖平均死亡损失率在30％以上，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。

疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点，因此，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。

由于水产养殖业的产业特点，要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，适用于水产养殖业的疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。其中，减毒活菌疫苗因具有给药方便、免疫效价高、成本低廉、可开发广谱疫苗的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。

近年来，随着对病原基因背景的深入了解以及重组DNA技术的不断发展，将编码某一特定病原体蛋白的外源基因插入无毒力病毒或细菌疫苗株的基因组的某一部位，使其高效表达，但不影响该疫苗株的正常生长与繁殖。用这种重组体作为活疫苗进行接种时，病毒或细菌能产生特定的外源蛋白，并诱发机体产生特异性免疫应答。目前，这种能针对多种病毒病害的多效价疫苗也已成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。其中，利用高效信号肽分泌表达外源病原蛋白已成为多效价疫苗开发中的一种重要技术手段，并且该技术已在大肠杆菌及沙门氏菌的疫苗开发中得到了成功应用(Gentschev I，et al.The E.coliα-hemolysin secretion system and its use in vaccine development.Trends Microbiol，2002(10)：39-45及Russmann H，et al.Delivery of epitopes by the Salmonella type III secretion system forvaccine development.Science，1998(281)：565-568)，但在鳗弧菌疫苗的研制中还未见相关技术应用的报道。

弧菌是导致海水养殖鱼类细菌性疾病的一种最为常见的病原体，可导致鱼类弧菌病(Vibriosis)，其发生温度范围大，季节长，地域广，危害的种类多，有鲈科、鲻科以及鲆、鲽类等大多数海水鱼类，其中，鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等严重危害我国水产养殖鱼类中牙鲆、大菱鲆、真鲷和鲈鱼等名贵经济鱼种。同时，这些病原菌普遍存在于淡水、污水、淤泥和土壤中，对水产动物、畜禽和人类均有致病性，可引起多种水产动物的出血性败血症和人类腹泻，给养殖业造成巨大经济损失，也给人类健康带来威胁。

由于养殖鱼类多同时遭受多种弧菌病原体的侵害，所以，弧菌病疫苗多以几种弧菌病病原体的灭活联苗产品居多。但尚未见以鳗弧菌和嗜水气单胞菌为主要防治对象的商品化的多效价弧菌病活菌疫苗。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种重组质粒。

本发明还有一个目的在于，提供该重组质粒的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种多效价活疫苗。

本发明还有一个目的在于，提供该多效价活疫苗的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供该多效价活疫苗的应用。

本发明提供的重组质粒包含鳗弧菌金属蛋白酶的信号肽和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因序列，其中，鳗弧菌金属蛋白酶信号肽介导3-磷酸甘油脱氢酶的分泌。

本发明提供的重组质粒的制备方法包括：A)构建信号肽-3-磷酸甘油脱氢酶融合基因；B)酶切融合基因和载体；C)将酶切的融合基因和酶切的载体进行连接。

本发明提供的多效价活疫苗由本发明提供的重组质粒转化鳗弧菌减毒株获得。

本发明提供的多效价活疫苗的制备方法包括：A)构建包含鳗弧菌金属蛋白酶的信号肽和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因的重组质粒；B)将步骤A)获得的重组质粒转化鳗弧菌减毒株。

本发明提供的多效价活疫苗的应用为用于预防鳗弧菌和嗜水气单胞菌导致的鱼类疾病。

使用本发明提供的减毒疫苗，具有明显的多效价免疫保护力，可作为鳗弧菌和嗜水气单胞菌的活疫苗，并具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明制备获得的重组质粒的结构图谱，其中，图1a为pGap质粒的结构图谱，图1b为pGap-hlyA质粒的结构图谱，图1c为Gap-rtxA质粒的结构图谱，图1d为pGap-vah3质粒的结构图谱，图1e为pGap-empA质粒的结构图谱。

图2为上清组分和胞内组分的ELISA检测和Western-blot检测结果，其中，图2中的图a为胞内组分的ELISA检测结果，图b为上清组分的ELISA检测结果，图c为上清组分和胞内组分的Western-blot检测结果。

在本发明的实施例中，所使用的鳗弧菌减毒株MVAV6203已于2004年9月15日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC No：M 204066。

在本发明的实施例中，所使用的嗜水气单胞菌LSA34已于2009年6月10日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC No：M 209124。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或厂商推荐的条件进行。

发明人为获得能在鳗弧菌减毒株MVAV6203(保藏号CCTCC No：M 204066)中表达及分泌嗜水气单胞菌的3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)的多效价减毒活疫苗，首先构建了4种不同信号肽与嗜水气单胞菌(保藏号为CCTCC No：M 209124)的3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)的序列(gapA)融合表达的质粒，并将获得的不同质粒分别转化到鳗弧菌减毒株MVAV6203中分别获得重组菌株，然后将获得的重组菌株发酵培养并进行检测，确定了鳗弧菌金属蛋白酶(EmpA)信号肽能介导嗜水气单胞菌的3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)在减毒株MVAV6203中成功的表达及分泌至胞外，然后经体外免疫保护试验，确定该重组菌株对鳗弧菌和/或嗜水气单胞菌具有良好的防治效果，即该疫苗具有明显的多效价免疫保护力，从而提供了一种多效价减毒活疫苗，具体过程如实施例所示。

在本发明的下述实施例中，使用的海水生理盐水的配方为：NaCl 28g/L，KCl 0.77g/L，MgCl₂·6H₂O 4.8g/L，NaHCO₃ 0.11g/L，MgSO₄·7H₂O 3.5g/L，CaCl₂·2H₂O 1.6g/L，pH7.2。溶液配制好后，过滤除菌，获得无菌海水生理盐水。

在本发明的下述实施例中，序列片段的回收纯化采用以下方法：

将PCR扩增获得的片段或酶切后片段分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下含有目的片段的凝胶后，采用天根生化公司(TIANGEN)的凝胶回收试剂盒回收DNA，具体操作步骤参考产品说明书。

在本发明的下述实施例中，使用的生物材料来源如下：

质粒pANN-202-812：Gentschev I，et al.The E.coli α-hemolysin secretion system and itsuse in vaccine development.Trends Microbiol，2002(10)：39-45。

霍乱弧菌N16961(O1，El Tor)：购自美国典型菌种保藏中心，保藏号ATCC 39351。

鳗弧菌MVM425：Lingyun Zhou et al.， Secretory delivery of heterologous proteins inattenuated Vibrio anguillarum for potential use in vac

大肠杆菌Top10：购自英骏生物技术(Invitrogen)公司。

pUC18质粒：购自宝生物(TaKaRa)公司。

在本发明的下述实施例中，使用的高盐LB培养液为在LB培养基补加NaCl至终浓度为2.5％。

在本发明的下述实施例中，质粒DNA采用天根生化(TIANGEN)公司的细菌质粒小提试剂盒进行制备，具体操作步骤参考产品说明书。

在本发明的下述实施例中，菌株的基因组采用天根生化公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒进行制备，具体操作步骤参考产品说明书。

实施例1、重组质粒构建

1.1、引物设计

设计引物hlyASP-F、hlyASP-R、rtxASP-F、rtxASP-R、vah3SP-F、vah3SP-R、empASP-F、empASP-R、gapA-F1/2、gapA-R1、gapA-R2、gapA-F3、gapA-F4和gapA-R3/4，上述引物的序列及酶切位点如下所示：

hlyASP-F：5′-CACTCAGCAGGACAAAGCACGAAAGATGCAT-3′；

hlyASP-R：5′-CGCGGATCCTTATGCTGATGTGGTC-3′；

BamHI位点

rtxASP-F：5′-GATTACTTTAATGGTAACCGCGCTCAAGTG-3′；

rtxASP-R：5′-TGCATGCATTTACACCATCAATCCTTTTTTGTG-3′；

NsiI位点

vah3SP-F：5′-CCGGAATTCGATGACTTCTTCTAAATTTTCG-3′；

EcoRI位点

vah3SP-R：5′-AGACCACTTTAATTGGGTGTTTATCTCACTAGGG-3′；

empASP-F：5′-CCGGAATTCGATGAAAAAAGTACAACGTC-3′；

EcoR I位点

empASP-R：5′-AGCTTGTTCTAGTAGACTTGGATCA-3′。

gapA-F1/2：5′-TAGGAGAATTCGATGACTATCAAAGTAGG-3′；

EcoR I位点

gapA-R1：5′-CGTGCTTTGTCCTGCTGAGTGCTTAGAGATGTGAGCGAT-3′

gapA-R2：5′-ACCATTAAAGTAATCCTTAGAGATGTGAGCGAT-3′；

gapA-F3：5′-CAATTAAAGTGGTCTATGACTATCAAAGTAGGT-3′；

gapA-F4：5′-CTACTAGAACAAGCTATGACTATCAAAGTAGGTATTAAC-3′；

gapA-R3/4：5′-CCAATGCATTTACTTAGAGATGTGAGCGA-3′。

NsiI位点

1.2、常规PCR扩增

使用上述引物进行PCR扩增，以制备目标片段，其中具体使用的模板和引物对及制备的目标片段如下所示：

以质粒pANN-202-812为模板，以引物hlyASP-F和hlyASP-R为引物对，扩增HlyAC端信号肽的编码序列hlyASP；

以霍乱弧菌N16961(O1，El Tor)基因组为模板，rtxASP-F和rtxASP-R为引物对，扩增RtxA C端信号肽的编码序列rtxASP；

以鳗弧菌MVM425基因组为模板，分别以vah3SP-F和vah3SP-R为引物对扩增Vah3N端信号肽的编码序列vah3SP，以empASP-F和empASP-R为引物对，用于扩增EmpA N端信号肽的编码序列empASP；

以嗜水气单胞菌LSA34基因组为模板，分别以gapA-F1/2和gapA-R1为引物对扩增gapA1序列，以gapA-F1/2和gapA-R2为引物对扩增gapA2序列，以gapA-F3和gapA-R3/4为引物对扩增gapA3序列，以gapA-F4和gapA-R3/4为引物对扩增gapA4序列，以gapA-F1/2和gapA-R3/4为引物对扩增gapA序列，即3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列。

将扩增获得的上述序列片段分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，其中，扩增获得的各序列片段的大小分别如下：hlyASP为240bp；rtxASP为240bp；vah3SP为120bp；empASP为120bp；gapA及gapA1-4均为996bp。

1.3、重叠PCR扩增

以hlyASP和gapA1基因片段为模板，gapA-F1/2和hlyASP-R为引物对，采用重叠PCR扩增得到融合基因gap-hlyA；

以rtxASP和gapA2基因片段为模板，gapA-F1/2和rtxASP-R为引物对，采用重叠PCR扩增得到融合基因gap-rtxA；

以vah3SP和gapA3基因片段为模板，vah3SP-F和gapA-R3/4为引物对，采用重叠PCR扩增得到融合基因gap-vah3；

以empASP和gapA4基因片段为模板，empASP-F和gapA-R3/4为引物对，采用重叠PCR扩增得到融合基因gap-empA。

将扩增获得的上述序列片段分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，扩增获得的各序列片段大小如下：gap-hlyA及gap-rtxA约为1.2kb；gap-yah3及gap-empA约为1.1kb。

1.4、重组质粒构建

使用双酶EcoRI和BamHI酶切gap-hlyA片段，使用双酶EcoRI和NsiI酶切gap-rtxA，gap-yah3，gap-empA及gapA片段，将酶切后的片段分别回收纯化，获得酶切片段。

同时，使用双酶EcoRI和BamHI或双酶EcoRI和PstI酶切pUC18质粒，将酶切后的质粒分别回收纯化，获得酶切质粒。

将上述酶切片段分别与酶切质粒用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，分别得到重组质粒pGap-hlyA，pGap-rtxA，pGap-vah3，pGap-empA及pGap，获得的上述重组质粒结构如图1所示，其中，ori-为复制起始区，Plac-为lac启动子，LacZ alpha-为α-半乳糖苷酶基因，Ampicillin-为氨苄青霉素抗性基因，EcoRI、BamHI、Pst I-为对应的酶切位点。

将上述重组质粒分别用CaCl₂转化法转化大肠杆菌Top10，得到大肠杆菌重组菌株Top10(pGap-hlyA)，Top10(pGap-rtxA)，Top10(pGap-vah3)，Top10(pGap-empA)及Top10(pGap)。

实施例2、鳗弧菌重组菌株构建

将鳗弧菌MVAV6203接种于50ml高盐LB培养液中，于30℃振摇培养过夜后，再以1∶100(v/v)转接于100ml新鲜高盐LB培养液中，在30℃下以200rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.6时，离心收集菌体，将菌体在冰浴中放置20-30min后，用272mM的蔗糖缓冲液洗涤菌体三次，再用蔗糖缓冲液悬浮菌体，使菌液终浓度为1×10⁹cfu/ml，得到鳗弧菌MVAV6203的电转化感受态细胞。

分别将重组菌株Top10(pGap-hlyA)，Top10(pGap-rtxA)，Top10(pGap-vah3)，Top10(pGap-empA)及Top10(pGap)进行扩增培养，收集菌体并制备获得相应的重组质粒pGap-hlyA，pGap-rtxA，pGap-vah3，pGap-empA及pGap。

利用鳗弧菌MVAV6203的电转化感受态细胞和重组质粒pGap-hlyA，pGap-rtxA，pGap-vah3，pGap-empA及pGap分别制备相应的重组菌株，具体过程如下：

分别取100μl感受态菌悬液于一个0.2cm的电转化杯(Bio-Rad，USA)中，分别加入重组质粒DNA10μl，混匀后在冰浴上放置10min，用电脉冲仪(Bio-Rad MicroPluser，USA)进行电脉冲，其中，脉冲场强V＝2kV/cm，脉冲时间t＝3ms。

电脉冲完毕后，菌悬液转入1.5ml的离心管，并加入800μl高盐LB培养液，在30℃，200rpm恢复培养3h后，涂布于高盐LB抗性平板(氨苄青霉素浓度200μg/ml)，30℃静置培养16-20h，筛选阳性克隆，得到重组菌株AV(pGap-hlyA)，AV(pGap-rtxA)，AV(pGap-vah3)，AV(pGap-empA)及AV(pGap)。

实施例3、多效价减毒活疫苗筛选

分别将在实施例2的步骤中获得的重组菌株接种于含200μg/ml氨苄青霉素的LB高盐液体培养基，200rpm，30℃培养过夜，次日按1∶100(v/v)接种于100ml LB高盐(Amp)培养基，30℃，200rpm培养9h，收获培养液。

将1ml收获的培养液于10000g离心10min，收集上清液，作为“上清组分”。

同时，将菌体沉淀经PBS(pH7.0)洗涤三次后，再用1ml PBS重悬。并将重悬液在冰浴中超声破菌5min至菌体完全破碎，然后将得到的菌体裂解液在4℃，10000g离心5min，收集上清部分作为“胞内组分”。

分别将获得的“上清组分”和“胞内组分”进行ELISA检测和Western-blot检测，其中，以AV(pGap)为阴性对照，结果如图2所示。

图2的结果显示，候选株AV(pGap-hlyA)，AV(pGap-rtxA)及AV(pGap-vah3)未能有效的合成并分泌GAPDH融合蛋白；而候选株AV(pGap-empA)不但能正确表达GAPDH融合蛋白，其培养液的上清组分中也能检测到GAPDH蛋白。

根据图2的结果，候选株AV(pGap-empA)能成功地将GAPDH蛋白分泌至胞外，因此，具有多效价减毒活疫苗的应用前景。

实施例4、多效价减毒活疫苗对大菱鲆(Turbot)的免疫保护试验

为确定候选株AV(pGap-empA)能否作为多效价减毒活疫苗应用，发明人随后又使用AV(pGap-empA)对大菱鲆(Turbot)进行了免疫保护试验，具体过程如下：

4.1、疫苗制备

取AV(pGap-empA)接种于50ml高盐LB液体培养基(Amp)中，于30℃，200rpm培养12h。然后，取5ml生长旺盛的菌液接种于100ml新鲜高盐LB液体培养基(Amp)中，30℃振荡培养12h。离心收获菌体(5000g，15min，室温)，以无菌海水生理盐水洗涤三次，菌体用海水生理盐水稀释成1×10⁶cfu/ml的菌悬液。

4.2、免疫保护试验

试验用鱼为体重7-14g，体长8-10cm的大菱鲆，实验前先置于水槽内适应养殖2周，以剔除不正常个体。试验水槽每天使用海水水体替换2/3体积养殖水，水温18±2℃。

采用改良寇式法设计实验，测得MVM425及LSA34的半数致死量LD₅₀分别为1.66×10⁶cfu/尾和1.58×10⁶cfu/尾。

将试验用鱼随机分为4大组，每组设3个平行小组，按表2分组设置对大菱鲆进行腹腔注射免疫，其中以C组海水生理盐水注射组作为对照组，D组GAPDH蛋白溶液与弗氏完全佐剂按1∶1(v/v)混匀后进行注射。

免疫4周后，各组免疫大菱鲆用鳗弧菌野生毒株MVM425、嗜水气单胞菌LSA34及联合感染三种方式进行腹腔注射攻毒，感染实验分组及攻毒剂量如表2所示，其中，联合感染时每种菌的实际攻毒剂量为各自单独攻毒时的一半。

表2、鳗弧菌减毒疫苗对大菱鲆的免疫保护试验

在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，计算每组的免疫保护率(Relative percentsurvival，RPS)，结果如表3所示，其中，免疫保护率按下列公式计算：

免疫保护率RPS％＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。

表3、鳗弧菌减毒疫苗注射免疫大菱鲆4周后攻毒的免疫保护力

根据表3的结果，减毒疫苗AV(pGap-empA)具有良好的鳗弧菌野生毒株感染防治效果，其RPS为83.6％，接近减毒株MVAV6203的保护力(RPS＝89.1％)。同时，该减毒株对嗜水气单胞菌也显示具有很好的交叉保护性，其RPS达到70％以上，接近纯蛋白GAPDH免疫达到的保护效果(RPS＝78.5％)。实验表明该疫苗保持了减毒株MVAV6203及GAPDH的免疫抗原性，具有明显的多效价免疫保护力，拥有良好的商业价值和应用前景。

综上所述，本发明提供的减毒疫苗AV(pGap-empA)，具有明显的多效价免疫保护力，可作为鳗弧菌和嗜水气单胞菌的活疫苗，并具有良好的应用前景。

Claims (7)

1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含鳗弧菌(Vibio anguillarum)金属蛋白酶信号肽和3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因序列和载体序列，其中所述鳗弧菌金属蛋白酶信号肽介导所述3-磷酸甘油脱氢酶的分泌；所述3-磷酸甘油脱氢酶来源于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；所述嗜水气单胞菌保藏号为CCTCC No：M 209124。

2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为pUC18质粒。

3.如权利要求1或2所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

A)构建鳗弧菌金属蛋白酶信号肽和3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因；

B)酶切融合基因和载体；

C)将酶切的融合基因和酶切的载体进行连接。

4.一种多效价活疫苗，其特征在于，所述多效价活疫苗由权利要求1或2所述的重组质粒转化鳗弧菌减毒株获得；所述鳗弧菌减毒株为保藏号为CCTCC M204066的菌株。

5.如权利要求4所述的多效价活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

A)构建如权利要求1或2所述的重组质粒；

B)将步骤A)获得的重组质粒转化鳗弧菌减毒株。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤B后进行阳性克隆株筛选的步骤。

7.如权利要求4所述的多效价活疫苗在制备预防鳗弧菌和嗜水气单胞菌导致的鱼类疾病的药物中的应用。

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