KR20170001379A - 조피볼락의 비정형 에어로모나스 살모니시다의 불활화 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)의 조피볼락(Sebastes schlegeli) 유래주의 불활화 균체를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 제공하며, 국내 양식장의 Aeromonas 감염증에 걸린 조피볼락에서 분리한 Aeromonas salmonicida의 아종 subsp. salmonicida, subsp. achromogenes, subsp. masoucida, subsp. smithia, 또는 subsp. pectinolytica의 균주 중 어느 하나를 포르말린으로 불활화시킨 어류의 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 제공함으로써, 최근 국내 양식장에서 그 발생빈도가 증가하고 있는 절창병을 예방하고 양식어민의 소득 증대에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 조피볼락의 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)의 불활화 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)의 조피볼락(Sebastes schlegeli) 유래주를 포르말린 불활화시킨 균체를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물에 관한 것이다.
조피볼락(Sebastes schlegeli)은 우리나라 연안, 일본 북해도 이남, 중국 북부 연안에서 발견되는 쏨뱅이목 양복락과의 어류로, '우럭'이라고도 불리며 주로 연안 얕은 곳의 암초 지대에서 서식한다. 몸길이가 30cm가량으로 볼락류 중에서 가장 큰 종으로, 몸길이가 60cm 이상 되는 개체도 많다. 볼락과 비슷하며, 위턱의 상부를 덮는 3개의 날카로운 가시가 있고, 눈 아래에는 2개의 줄무늬가 있다. 몸은 회갈색 바탕에 검은 점이 흩어져 있다. 조피볼락은 새끼를 낳는 난태성 어종으로서 출산시기는 4~6월, 수온이 섭씨 15~16도 정도 되는 4~6월경에 연안의 암초 지대에서 7mm 정도 길이의 새끼를 낳는다. 주로 어류를 잡아먹는 육식성으로, 새우, 게 같은 갑각류와 오징어류 등도 먹으며 1년에 10cm 정도 자란다.
우리나라에서 광어와 함께 횟감으로 가장 많이 애용되는 어종으로 인기높은 조피볼락은 국내 양식 산업에서 중요한 부분을 차지하고 있는 어종이다. 양식 조피볼락은 1987년 양식법이 도입되면서부터 급격하게 생산량이 증가되어 2009년에는 33,020 톤에 달하였으며, 이는 국내 어류양식 생산량의 30.2%에 달하는 양이다. 이러한 조피볼락에 발병하는 질병으로는 Microcotye sp.와 Caligus sp. 등에 의한 기생충성 질병, Vbrio sp.와 Streptococcus sp.에 등에 의한 세균성 질병 등이 알려져 있다.
그러나 최근에는 연어, 송어 등의 연어류에 주로 발병하는 절창병 또는 부스럼병(furunculosis)의 원인병원체인 Aeromonas salmonicida로 인해 우리나라의 조피볼락 양식장에서 질병이 발병한다는 보고가 증가하고 있다. 절창병은 주로 양어지에서 어류의 배설물 또는 사료 찌꺼기 등이 배출되지 못하고 누적되거나 오염수가 유입되어 수질 환경이 나빠질 때 자주 발견되며, 양식어가 먹이를 먹지 못하거나 쇠약하여 기생충 등에 감염되었을 때, 선도가 좋지 못하고 영양가가 낮은 사료를 주거나, 다른 양식장에서 들어오는 종묘 또는 양식어에 병원균이 감염되어 들어와 번식될 때 발병하는 것으로 알려져 있다.
절창병에 걸린 병어는 외부에서 보기에 체표에 1개 또는 수개소의 팽융된 환부가 형성되며, 궤양은 외부손상에 의한 것이 아니고, 모세 혈관 내에서 병원균이 증식해서 혈관 벽과 근육을 붕괴시켜 피와 농이 나오고 조직이 괴사되며 일반적으로 고령어에서 많이 보고되고 있으나, 당년생이나 성어에서도 볼 수 있다.
절창병(부스럼병)은 Aeromonas salmonicida의 감염에 의하여 발병되는 것으로 알려졌다. Aeromonas salmonicida는 1894년, Emmerich와 Weibel에 의하여 독일의 송어 치어에서 처음 보고된 이후, 높은 밀도로 양식되는 연어류에서만 발병되는 것으로 생각되었다. 그러나 이후의 연구에서 연어류에서 절창병을 일으키는 A. salmonicida는 다섯 가지의 아종 중, subsp. salmonicida의 정형(typical type)으로, 주로 연어류에서 절창병을 일으키며, 다른 네 가지 아종 subsp. achromogenes, subsp. masoucida, subsp. smithia, subsp. pectinolytica의 비정형(atypical type)은 50여종이 넘는 어류에서 질병을 일으킨다고 보고되었다. 또한 초기에 비정형 A. salmonicida는 주로 소하성 어류에서 발견되는 것으로 알려졌었으나, 최근에는 뱀장어, shotted halibut, 터봇, common wolffish, 넙치, 늑대고기 등 다양한 담수어류와 해산어류에 질병을 일으키고 있다.
넓은 범위의 어종에서 감염증을 발생시키는 비정형 A. salmonicida는 정형 A. salmonicida와 같이 비운동성, 통기 혐기성의 간균으로, 22~25℃에서 최적으로 자라는 그람음성균이다. 그러나 비정형 A. salmonicida는 정형 A. salmonicida와 비교하여 성장이 느리고, 갈색색소를 형성하지 않는 아종도 존재한다.
절창병의 치료는 주로양어장의 사육수를 교체하며 소독을 강화하고 클로람페니콜계나 페니실린계의 항생제를 사용하여 수행되어 왔다.
본 발명자들은 2008년 12월에서 2009년 5월 사이와 2010년 2월에서 11월 사이, 국내의 조피볼락 양식장에서 궤양병변을 나타내고 체표에 출혈증상을 나타내는 병어를 분석하여 이 질병의 병인학적 요인이 A. salmonicida라는 것을 확인한 바 있다. 또한 이들 균주의 분리 배양시 콜로니에서 갈색 색소가 형성되지 않았으며 느리게 자라는 특성 및 매우 다양한 표현형을 나타낸다는 점에서 넓은 범위의 어종에서 발병하는 비정형 A. salmonicida인 것을 확인하였다.
이에 본 발명은 국내 조피볼락 양식장에서 발병되는 질병의 원인균을 확보함으로서 양식어가 비정형 A. salmonicida에 대한 특이적인 면역을 갖출 수 있는 백신을 제공하여 질병의 치료와 예방에 기여하고자 한다.
최근 연어, 송어 등의 연어류 양식장에 주로 발병하여 큰 피해를 주어 왔던 절창병 또는 부스럼병(furunculosis)의 원인병원체인 Aeromonas salmonicida로 인해 우리나라의 조피볼락 양식장에서 질병이 발병한다는 보고가 증가하고 있다. 절창병은 연어류 양식에서 사육수의 수질 악화에 기인하는 경우가 많으며, 연어류를 제외한 다른 어종에서는 그 보고가 많지 않았다. 그러나 최근 연어류 이외의 어종에서 Aeromonas salmonicida에 의한 질병 발생 사례가 증가하고 있으며, 국내 양식 산업의 주요 어종인 조피볼락에서도 질병 발생이 보고되고 있어 이에 대한 연구과 대책이 시급한 실정이다. 본 발명은 국내 조피볼락 양식장에서 발병되는 질병의 원인균을 찾고 양식어가 원인균에 대한 특이적인 면역을 갖출 수 있는 백신을 제공하는 데에 목적이 있다.
상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)의 조피볼락(Sebastes schlegeli) 유래주의 불활화 균체를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 제공하며, 국내 양식장의 병든 조피볼락에서 분리한 Aeromonas salmonicida의 아종 subsp. salmonicida, subsp. achromogenes, subsp. masoucida, subsp. smithia, 또는 subsp. pectinolytica의 균주 중 어느 하나를 포르말린으로 불활화시킨 어류의 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 제공한다.
어류의 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물은 조피볼락(Sebastes schlegeli) 유래 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 수탁번호 KCTC12849BP를 포르말린 최종 농도 1 %(v/v)를 처리하여 불활화 균체 현탁액 50 %(v/v), 배지 24 %(w/v), glycerol 20%(v/v), squalene 5%(v/v), aluminum hydroxide 0.5%(v/v), Tween 80 0.5%(v/v)로 구성되며, 주사제 또는 경구 투여제의 형태로 제조된 것을 특징으로 한다.
또한, 조피볼락(Sebastes schlegeli) 유래 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 수탁번호 KCTC12849BP를 포르말린 최종 농도 1 %(v/v)를 처리하여 불활화 균체를 만드는 단계(A); (A)단계의 불활화 균체 현탁액 50 %(v/v), 배지 24 %(w/v), glycerol 20%(v/v), squalene 5%(v/v), aluminum hydroxide 0.5%(v/v), Tween 80 0.5%(v/v)이며 불활화 균체의 최종 농도는 20 mg/ml이 되도록 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신을 제조하는 단계(B);로 이루어지는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 제조방법을 제공하며 또한 상기 (B)단계의 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신을 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 균체 농도 1 mg/fish가 되도록 어류에 접종하는 단계(C)를 포함하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida에 의한 질병 치료방법을 제공한다.
본원발명의 또 다른 실시예로서 양식어장에서 병든 조피볼락을 입수하여 병어의 신장, 비장 및 간으로부터 BHIA 배지를 사용하여 세균을 분리ㅇ배양하는 단계; 배양된 균주를 이하의 16S rRNA gene 과 virulence array protein gene A을 증폭시키는 primer set를 이용하여 동정하여 비정형 Aeromonas salmonicida에 의한 감염을 확인하는 단계; 양식어장의 조피볼락에게 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신을 이용한 질병 치료방법을 실시하는 단계로 이루어지는 질병 예방방법을 제공한다.
본 발명에 따른 어류의 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물은 국내 양식장에서 양식 중인 조피볼락 등의 양식어에 비정형 Aeromonas salmonicida에 특이적인 면역을 획득하게 함으로써 최근 그 발생이 증가하고 있는 질병의 원인균인 비정형 Aeromonas salmonicida에 의한 감염을 예방하여 국내 양식어의 Aeromonas 감염증으로 인한 손실을 예방하여 안정된 양식을 수행할 수 있도록 한다.
도 1은 여수의 조피볼락 양식장에서 비정형 Aeromonas 감염증이 발병한 조피볼락의 병어(위) 및 BHIA 배지에서 분리된 세균(아래)의 사진이다.
도 2는 분리된 비정형 Aeromonas salmonicida의 16S rRNA의 염기서열(1261bp) 및 A-protein을 coding하는 유전자의 염기서열(1369bp)을 나타낸다.
도 3은 분리 균주의 LD50값을 결정하기 위하여 여수에서 분리한 비정형 Aeromonas salmonicida를 농도별로 복강주사한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 48일째 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 58일째 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 66일째 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본원 발명에서 분리 동정된 비정형 A. salmonicida 균주, 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)(RF15), 기탁번호 : KCTC12849BP의 기탁증을 나타낸다.
도 2는 분리된 비정형 Aeromonas salmonicida의 16S rRNA의 염기서열(1261bp) 및 A-protein을 coding하는 유전자의 염기서열(1369bp)을 나타낸다.
도 3은 분리 균주의 LD50값을 결정하기 위하여 여수에서 분리한 비정형 Aeromonas salmonicida를 농도별로 복강주사한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 48일째 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 58일째 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 66일째 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본원 발명에서 분리 동정된 비정형 A. salmonicida 균주, 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)(RF15), 기탁번호 : KCTC12849BP의 기탁증을 나타낸다.
본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물은 최근 국내 조피볼락 양식장에서 발병률이 증가하고 있는 Aeromonas 감염증의 예방을 위하여 국내 양식 조피볼락의 병어에서 분리한 비정형 Aeromonas salmonicida를 불활화시킨 백신 조성물을 제공함으로써 국내 양식산업에서 중요한 어종인 조피볼락의 안정된 양식을 도모하기 위한 것이다. 이하 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 자세히 설명한다. 하기에서 본 발명을 설명함에 있어서, 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하였다.
A. 조피볼락의 비정형
Aeromonas
salmonicida
사전 분리 실험
A. 1. 조피볼락 병어의 입수
2015년 1월 여수에 위치한 조피볼락 양식장에서 Aeromonas 감염증에 의해 이상 유영을 보이는 병어를 채취하였다. 병어의 외부 및 내부 증상을 관찰하고 신장, 비장 및 간으로부터 BHIA 배지를 사용하여 세균을 분리, 배양 하였다.
도 1은 여수의 조피볼락 양식장에서 Aeromonas 감염증이 발병한 조피볼락의 병어(위) 및 brain heart infusion agar (BHIA; Difco) 배지에서 분리된 세균(아래)의 사진이다. 병어의 조사 결과, 감염어 (체중 200-300g)는 두부의 출혈과 체표 궤양이 관찰되었으며, 아가미 뚜껑 및 장관 출혈, 신장과 비장의 비대 병변도 관찰되었다. 이상의 증상은 비정형 Aeromonas salmonicida에 의한 감염의 전형적인 특성을 나타내었다. 또한, 병어의 신장, 비장 및 간 조직에서는 다수의 동일한 형태의 세균이 분리되었다.
A. 2. 병원 균주 배양 및 표현형적 특성
분리 배양을 위한 배지는 tryptic soy agar (TSA; Difco)에 1% NaCl을 첨가한 TNA, thiosulfate citrate bile salts sucrose agar (TCBS; Difco), salmonella-shigella agar (SS; Difco)를 이용하였다.
병어의 신장에서 순수분리된 Aeromonas salmonicida를 실험에 사용하였다. 균주는 25℃에서 TSA, TNA, TSB (Tryptic soy broth, Difco) 및 TNB (TSB+1% NaCl)에 48시간 배양하여 실험에 사용하였다.
조피볼락에서 분리된 균주의 콜로니는 TNA에서 갈색색소를 형성하지 않았고, 뚜렷한 세균 집락 형성을 위하여 최소 48시간 이상이 요구되어, 비정형 A. salmonicida의 특성을 가지고 있었다.
A. 3. 병원 균주의 동정 및 유전적 특성
분리된 균주의 동정 및 유전적 특성을 알아보기 위하여 Genomic DNA extraction kit(Bionner, Daejeon, Korea)를 이용하여 제공되는 방법에 따라 세균의 genomic DNA를 분리하여 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 분리된 DNA는 MyGenie 96 Thermal Block (Bioneer)을 이용하여 PCR법으로 실험하였으며, PCR 조건은 95℃에서 5분, 30 cycles (95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 90초), 72℃에서 7분 반응하였다.
균주의 동정을 위해 2종의 16S rRNA gene 프라이머 set를 사용하였다;
서열 01, 63F: 5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3'
서열 02, 1406R: 5'-ACGGG CGGTGTGTRC-3'
A-protein을 coding 하는 유전자인 virulence array protein gene A, 즉 vapA gene을 증폭시키는 primer set를 사용하였다.
서열 03, F-1: 5'-TCAACGGATAGGTTCAACCC-3',
서열 04, R-1: 5'-CAGAGTGAAATCTACCAGCGGTGC-3'
이후 1% agarose gel에서 band의 유무와 크기를 확인한 다음 Bioneer (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
도 2는 분리된 균주의 16S rRNA의 염기서열(1226bp) 서열 05, 및 A-protein을 coding하는 유전자의 염기서열(1369bp) 서열 06이다.
이에 본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 본 발명의 균주, 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)(RF15)를 2015년 6월 18일자로 한국생명공학연구원(KRIBB)에 기탁하여 기탁번호 KCTC12849BP를 부여받았다.
A. 4. 분리 균주의 감염 실험
분리된 세균의 조피볼락에 대한 병원성 확인을 위하여 반수치사농도 (Median lethal dose; LD50)를 측정하였다. 실험에 사용한 조피볼락은 평균 체중이 20 g이었으며, 실험 수온은 12-15℃로 유지하였고 매 24시간 마다 50%씩 환수하였다. 비정형 A. salmonicida를 BHIA에 25℃에서 24시간 배양한 다음 생리식염수(0.85% saline)에 현탁하여 최종 접종 농도가 4x106, 4x105, 4x104 colony forming unit (CFU)/100 ㎕/fish가 되도록 각 구 당 10미의 조피볼락에 복강주사 하였다. 대조구는 생리식염수를 10미의 조피볼락에 100 ㎕씩 복강주사 하였다. 14일간 누적 폐사율을 조사하였으며, 폐사어의 경우, 해부하여 신장과 비장을 BHIA에 배양하여 세균의 재분리를 시도하였다.
도 3은 분리 균주의 LD50값을 결정하기 위하여 여수에서 분리한 비정형 Aeromonas salmonicida를 농도별로 복강주사한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다. 실험 결과, 조피볼락에서 분리한 비정형 A. salmonicida 분리 균주의 LD50값은 4x105 cfu/fish 로 나타났다.
따라서 조피볼락 양식장에서 분리된 Aeromonas 감염증의 병인균주는 Aeromonas salmonicida이며, 비정형 아종인 것을 확인하였다. 비정형 A. salmonicida에 의한 비연어류 감염은 국내에서 전무한 실정이어서, 이에 대한 예방과 치료를 위한 연구를 지속하면서 본 발명을 완성하였다.
B. 비정형
Aeromonas
salmonicda
백신 제조를 위한 균주의 분리 및 백신의 제조
B. 1. 비정형
Aeromonas salmonicda
균주 분리
2015년 1월 여수에 위치한 조피볼락 양식장에서 분리된 비정형 A. salmonicida 균주를 백신제조에 사용하였다. 순수 분리된 세균 집락은 NaCl이 1% 함유된 BHIA에 접종하여 15℃에서 3일간 배양하였다.
B. 2. 시험어 준비
시험어는 비정형 A. salmonicida의 감염이력이 없는 건강한 조피볼락 (평균 체중: 20.3 g, 평균 길이: 10.9 cm)을 선정하여 실험에 사용하였다. 시험용 수조는 약 600 L 순환 수조를 사용하여 시험구당 100미씩 수용하여 관리하였다. 수온은 15±1℃로 유지하고, 시판용 EP사료를 3일에 1회 공급하였다.
B. 3. 백신의 제조
본원 발명에서 분리 동정된 비정형 A. salmonicida 균주, 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)(RF15), 기탁번호 : KCTC12849BP는 NaCl이 1% 함유된 BHIA에 접종하여 15℃에서 3일간 배양하였으며, 멸균생리식염수에 세균 집락을 현탁한 후에 포르말린 (37% formaldehyde)을 최종적으로 1% 농도가 되도록 처리하여 실온에서 2시간 반응시킨 후, 4℃에서 24시간 동안 두어 불활화시켰다.
불활화된 세균은 원심분리를 통해 (12,000 rpm, 10분) 멸균생리심역수를 이용하여 3회 세척 한 후 균체를 수거하여 10 mg/ml 농도로 현탁하여 백신으로 사용하였다. 추가적으로 보조제를 섞은 백신을 제조하기 위해, 200 ml 기준으로 Dulbecco minimum essential medium (DMEM) 48 ml (24%), glycerol 40 ml (20%), squalene 10 ml (5%), aluminum hydroxide 1 ml (0.5%), Tween 80 1 ml (0.5%), 백신 100 ml (농도: 20 mg/ml) (50%) 비율로 합성하여 보조제를 첨가한 백신을 제조하였다.
C. 비정형
Aeromonas
salmonicda
백신의 효능 검증
C. 1. 비정형
Aeromonas salmonicda
백신 접종
백신 접종은 실험용 수조에 사육중인 조피볼락 6 그룹에 각각 포르말린 사균 백신(2 그룹), 보조제가 첨가된 백신(2 그룹) 및 멸균생리식염수(대조구, 2 그룹)를 투여하였다. 실험 백신을 어체당 0.1 ml씩 근육(포르말린 사균 백신) 및 복강(보조제가 첨가된 백신)에 주사하였으며 최종 농도가 1 mg/fish가 되도록 하였다.
C. 2. 백신의 방어 효과 검증 실험 I
백신의 방어 효과를 조사하기 위하여 백신 접종 후 48일째 공격 실험을 실시하였다. 공격실험은 BHIA에서 배양한 비정형 A. salmonicida를 5x104 colony forming unit (CFU)/ml 농도로 조정하여 2개의 백신처리구와 대조구의 조피볼락에 각각 0.1 ml 씩 복강 주사하였다. 인위 감염 후 2주 동안 누적폐사율을 조사하였다. 또한 빈사어 및 폐사어의 경우, BHIA 배지를 사용하여 세균 재분리를 실시하여 병원균을 재동정하였다.
도 4는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 48일째 비정형 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다. 백신미처리구(대조구)에서는 3일째부터 폐사어가 관찰되기 시작하였고 감염실험 후 7일째 100%의 누적폐사율을 나타내었다.
포르말린 사균 백신처리구 (Vac)의 경우, 4일째부터 폐사어가 관찰되었고, 실험 종료일인 14일째 까지 30%의 누적폐사율을 보였다. 보조제가 첨가된 백신처리구 (Vac+Adj)에서는 4일째 10%가 폐사된 후, 14일째까지 20%의 누적폐사율을 나타내었다. 비정형 A. salmonicida를 접종하지 않은 백신처리구와 대조구에서는 폐사어가 관찰되지 않았다. 폐사어는 공통적으로 두부출혈, 아가미 및 내장기관 출혈의 증상을 나타내었고, 신장, 비장 및 간 조직에서 다수의 비정형 A. salmonicida가 분리되었다.
이상의 결과, 대조구보다 백신처리구에서 비정형 A. salmonicida에 의한 폐사율이 낮게 나타나는 것으로 보아 (백신 미처리구 (대조구): 100%, 포르말린 사균백신: 30%, 보조제가 첨가된 백신: 20%), 본 연구에서 제작된 백신은 비정형 A. salmonicida에 대한 방어 효능이 있는 것으로 확인되었다.
C. 3. 백신의 방어 효과 검증 실험 II
백신의 방어 효과를 조사하기 위하여 백신 접종 후 58일째 공격 실험을 실시하였다. 공격실험은 BHIA에서 배양한 비정형 A. salmonicida를 각각 6.5x104 colony forming unit (CFU)/ml 농도로 조정하여 2개의 백신처리구와 대조구의 조피볼락에 각각 0.1 ml 씩 복강 주사하였다. 인위 감염 후 2주 동안 누적폐사율을 조사하였다. 또한 빈사어 및 폐사어의 경우, BHIA 배지를 사용하여 세균 재분리를 실시하여 병원균을 재동정하였다.
도 5는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 58일째 비정형 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다. 백신미처리구(대조구)에서는 3일째부터 폐사어가 관찰되기 시작하였고 감염실험 후 5일째 100%의 누적폐사율을 나타내었다. 포르말린 사균 백신처리구 (Vac)의 경우, 3일째부터 폐사어가 관찰되었고, 실험 종료일인 14일째 까지 40%의 누적폐사율을 보였다.
보조제가 첨가된 백신처리구 (Vac+Adj)에서는 백신처리구와 마찬가지로 14일째까지 40%의 누적폐사율을 나타내었다. 비정형 A. salmonicida를 접종하지 않은 백신처리구와 대조구에서는 폐사어가 관찰되지 않았다. 폐사어는 공통적으로 두부출혈, 아가미 및 내장기관 출혈의 증상을 나타내었고, 신장, 비장 및 간 조직에서 다수의 A. salmonicida가 분리되었다.
이상의 결과, 대조구보다 백신처리구에서 비정형 A. salmonicida에 의한 폐사율이 낮게 나타나는 것으로 보아 (백신 미처리구 (대조구): 100%, 포르말린 사균백신: 40%, 보조제가 첨가된 백신: 40%), 본 연구에서 제작된 백신은 비정형 A. salmonicida에 대한 방어 효능이 있는 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물은 근육 주사 또는 복강 주사로 1 mg/fish가 되도록 접종하였으며, 접종 편의성을 위하여 경구투여도 가능하다.
C. 4. 백신의 방어 효과 검증 실험 III
백신의 방어 효과를 조사하기 위하여 백신 접종 후 66일째 공격 실험을 실시하였다. 공격실험은 BHIA에서 배양한 비정형 A. salmonicida를 각각 6.5x103 CFU/ml 농도로 조정하여 2개의 백신처리구와 대조구의 조피볼락에 각각 0.1 ml 씩 복강 주사하였다. 인위 감염 후 2주 동안 누적폐사율을 조사하였다. 또한 빈사어 및 폐사어의 경우, BHIA 배지를 사용하여 세균 재분리를 실시하여 병원균을 재동정하였다.
도 6는 본 발명에 따른 조피볼락의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물을 접종한 후 66일째 비정형 A. salmonicida로 인위 감염을 실시한 후, 누적 폐사율을 나타낸 그래프이다. 백신미처리구(대조구)에서는 3일째부터 폐사어가 관찰되기 시작하였고 감염실험 후 7일째 50%의 누적폐사율을 나타내었다. 포르말린 사균 백신처리구 (Vac)의 경우, 5일째부터 폐사어가 관찰되었고, 실험 종료일인 14일째 까지 60%의 누적폐사율을 보였다. 보조제가 첨가된 백신처리구 (Vac+Adj)에서는 14일째까지 10%의 누적폐사율을 나타내었다. 비정형 A. salmonicida를 접종하지 않은 백신처리구와 대조구에서는 폐사어가 관찰되지 않았다. 폐사어는 공통적으로 두부출혈, 아가미 및 내장기관 출혈의 증상을 나타내었고, 신장, 비장 및 간 조직에서 다수의 A. salmonicida가 분리되었다.
포르말린 사균 백신처리구에서는 대조구와 유사한 누적폐사율을 보였으나 (백신 미처리구 (대조구): 50%, 포르말린 사균백신: 60%), 보조제가 첨가된 백신에서는 폐사율이 거의 나타나지 않았다 (10%). 이상의 연구 결과, 포르말린 사균 백신처리후 66일이 경과할 경우, 백신의 효능이 없는 것으로 나타났다. 그러나 보조제가 첨가된 백신의 경우는 백신처리후 약 2달이 지나도 백신의 효능이 뚜렷히 나타나는 것으로 확인되었다. 따라서 백신의 효능을 장기간으로 유지하기 위해서는 보조제가 첨가된 백신의 투여가 요구되는 것으로 확인되었다.
본 발명은 최근 조피볼락 양식장에서 발생되는 사례가 증가하고 있는Aeromonas 감염증의 원인균인 비정형 Aeromonas salmonicida의 불활화 백신을 제공함으로써 비정형 Aeromonas 감염증에 의한 폐사와 손실을 예방하여 안정된 조피볼락 양식을 수행하는 데에 도움이 되어 양식어민의 소득 증대에 기여할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.
[수탁기관]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12849BP
수탁일자 : 20150618
<110> Chonnam National University
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salmonicida in rockfish
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<400> 1
caggcctaac acatgcaagt c 21
<210> 2
<211> 15
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<223> Artificial Sequence
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acgggcggtg tgtrc 15
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<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
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acgggcggtg tgtrc 15
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<211> 1226
<212> RNA
<213> Aeromonas salmonicida
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(1226)
<400> 5
gggtgagtaa tgcctgggga tctgcccagt cgagggggat aacagttgga aacgactgct 60
aataccgcat acgccctacg ggggaaagga ggggaccttc gggcctttcg cgattggatg 120
aacccaggtg ggattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcgac gatccctagc 180
tggtctgaga ggatgatcag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag 240
gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg 300
aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc agcgaggagg aaaggttggc gcctaatacg 360
tgtcaactgt gacgttactc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg 420
taatacggag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt 480
ggataagtta gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ttgcatttaa aactgtccag 540
ctagagtctt gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg 600
gaggaatacc ggtggcgaag gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc 660
gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgatttgg 720
aggctgtgtc cttgagacgt ggcttccgga gctaacgcgt taaatcgacc gcctggggag 780
tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 840
gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatgtc tggaatcctg 900
cagagatgcg ggagtgcctt cgggaatcag aacacaggtg ctgcatggcn gtcgtcagct 960
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctgtcc tttgttgcca 1020
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agagggctgc aagctagcga tagtgagcga atcccaaaaa gcgcgtcgta gtccggatcg 1200
gagtctgcaa ctcgactccg tgaagt 1226
<210> 6
<211> 1369
<212> DNA
<213> Aeromonas salmonicida
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1369)
<400> 6
cccgaacgac aacactttcg ttactacctc cctcgcatct gtaactaagc agccggtact 60
ggacttctcc actgctcaac aaaacctgac ccttaacttc agtgaagttg gtgaccttaa 120
gaacaacggt ttcattgtgt tggaaatcca aggtgaaggc caattcaacg acgcggaaat 180
ccgtcagtgg ctgtccaacc gtttctggcg tgagccgttt accgctctgc tggttagccc 240
gaatgatcat ggtaatggtg tcaatagcgg tgaagttgct gacgttcggc agttctttaa 300
gattatttcc gacggtaccc agcagaccat cgatcacact atcgacaaca atggcaagcg 360
tctgcgtctt gctcttgctt ctgatgtaga gactaccgct tcaagggctg gtgcaaaggt 420
tgagctgaag ctgaacttag ctaaccaagc ctttaagctg acctccggtt ctcaaggtac 480
agtagctctg accgcaggag ctctgtggaa cgcttcttac actgctgatc cggttgctac 540
caagccgctg ttcaaactgg gtaagctgtt ccagttgagt ttgactaacg ctggtaaagc 600
taccgctctg gtttccgaag gtttcttgaa acttgatatc ggtgatgcgg atatttctgc 660
tactgatttc gcgattacca acgttactac taaccagacc atccaacgtg acaaggttaa 720
cctgaccctg actggtgatg tttctgcctt caagaaagat gccaacggta acttggtaaa 780
caaagctggt gttagcatcg gttggaaagc tgctgctgat ggtcaatctg ctacagctgt 840
cttgggtgct ggcaagatgg ccggtggggt tcaagatgct ctggctgctt ttggtacact 900
gtacgttgct gcagataaca ctgttccggt tcctgttgtt aacttcaatg ttaaggctga 960
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tgaagttgaa accaatcagg gtgaagtagc tgttaagaaa tccaatgct 1369
Claims (12)
- 조피볼락(Sebastes schlegeli)에서 분리한 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida) 균주로, 수탁번호 KCTC12849BP인 균주.
- 제1항의 균주를 항원으로 포함하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염 예방용 불활화 백신 조성물.
- 제2항에 있어서, 약학적으로 허용되는 어주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염예방용 불활화 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)는 subsp. salmonicida, subsp. achromogenes, subsp. masoucida, subsp. smithia, 또는 subsp. pectinolytica의 균주 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 어류의 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물.
- 제2항에 있어서 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물은 수탁번호 KCTC12849BP 균주를 포르말린 최종 농도 1 %(v/v)를 처리하여 불활화 균체 현탁액 50 %(v/v), 배지 24 %(w/v), glycerol 20%(v/v), squalene 5%(v/v), aluminum hydroxide 0.5%(v/v), Tween 80 0.5%(v/v)로 구성된 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염예방용 불활화 백신 조성물.
- 제2항 또는 제5항의 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염예방용 불활화 백신 조성물은 주사제 또는 경구 투여제의 형태로 제조된 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염예방용 불활화 백신 조성물.
- 수탁번호 KCTC12849BP 균주를 포르말린 최종 농도 1 %(v/v)를 처리하여 불활화 균체를 만드는 단계(A);
상기 (A)단계의 불활화 균체 현탁액 50 %(v/v), 배지 24 %(w/v), glycerol 20%(v/v), squalene 5%(v/v), aluminum hydroxide 0.5%(v/v), Tween 80 0.5%(v/v)이며, 불활화 균체의 최종 농도는 20 mg/ml이 되도록 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신을 제조하는 단계(B);로 이루어진 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염예방용 불활화 백신의 제조방법.
- 수탁번호 KCTC12849BP 균주를 포르말린 최종 농도 1 %(v/v)를 처리하여 불활화 균체를 만드는 단계(A);
상기 (A)단계의 불활화 균체 현탁액 50 %(v/v), 배지 24 %(w/v), glycerol 20%(v/v), squalene 5%(v/v), aluminum hydroxide 0.5%(v/v), Tween 80 0.5%(v/v)이며, 불활화 균체의 최종 농도는 20 mg/ml이 되도록 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신을 제조하는 단계(B);
상기 (B)단계의 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 백신을 비정형 Aeromonas salmonicida 불활화 균체 농도 1 mg/fish가 되도록 어류에 투여하는 단계(C);를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염에 의한 질병 예방방법.
- 양식어장에서 병든 조피볼락을 입수하여 병어의 신장, 비장 및 간으로부터 BHIA 배지를 사용하여 세균을 분리,배양하는 단계(가);
배양된 균주를 이하의 16S rRNA gene 과 virulence array protein gene A을 증폭시키는 primer set를 이용하여 동정하여 비정형 Aeromonas salmonicida에 의한 감염을 확인하는 단계(나);
양식어장의 조피볼락에게 청구항 8항의 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염에 의한 질병 예방방법을 실시하는 단계(다);로 이루어진 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염에 의한 질병 예방방법.
- 제7항에 있어서, 16S rRNA gene primer set는 서열 01과 서열 02를 갖는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염에 의한 질병 예방방법.
- 제8항에 있어서, virulence array protein gene A을 증폭시키는 primer set는 서열 03과 서열 04를 갖는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염에 의한 질병 예방방법.
- 제7항에 있어서, 비정형 Aeromonas salmonicida는 서열 05와 서열 06을 갖는 것을 특징으로 하는 어류의 비정형 Aeromonas salmonicida 감염에 의한 질병 예방방법.
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| KR1020150091296A KR20170001379A (ko) | 2015-06-26 | 2015-06-26 | 조피볼락의 비정형 에어로모나스 살모니시다의 불활화 백신 조성물 |
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| KR (1) | KR20170001379A (ko) |
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| 그러나 상기 발명들은 본 발명의 비정형 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)의 조피볼락(Sebastes schlegeli) 유래주의 불활화 균체를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 Aeromonas salmonicida 불활화 백신 조성물과는 그 구성 및 효과에서 차이를 보인다. |
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