CN109022558A - 基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组snp分子标记方法 - Google Patents

基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组snp分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，包括许氏平鲉基因组DNA提取、Adapter接头设计、许氏平鲉基因组DNA酶切、连接Adapter、混合样品和PCR扩增、回收序列片段和高通量测序、数据分析开发SNP位点，其中Adapter接头的设计与MseI和NlaIII的酶切末端和后续Illumina Hiseq测序平台要求的引物序列一致。有益效果为：本发明分子标记方法技术稳定、重复性高、能够在降低成本的情况下大量开发基因组分子标记。

Description

基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子 标记方法
技术领域
本发明涉及许氏平鲉基因组分子标记开发技术领域，尤其是涉及基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法。
技术背景
分子标记是能区分生物种间、种内群体间及群体内个体间遗传差异的DNA序列片段。利用分子标记能够开展物种鉴别、遗传多样性评估、遗传分化监测和个体分类聚群等科学研究。目前使用较为广泛的分子标记有线粒体DNA（mitochondrial DNA）、微卫星标记（simple sequence repeat, SSR）、单核苷酸多态位点（single nucleotidepolymorphism, SNP）等。随着高通量测序技术和生物信息学分析方法的发展，分子遗传学研究要求分子标记需具有成本低、遗传信息量大、基因分型效率高等特点。因而SNP标记越来越成为重要的分子标记。相对于线粒体DNA和SSR标记而言，SNP标记具有数据量大、覆盖度高、分型效率高等特点。SNP广泛分布在基因组编码区和非编码区，借助高通量测序技术能够在低成本的情况下开发得到数以万计的标记位点。随着测序技术的发展和测序成本的降低，SNP标记已经成为群体遗传、基因分型和物种鉴定的主要标记方法。基因分型测序技术（genotyping-by-sequencing, GBS）是一种低成本的简化基因组测序技术（reduced-representation sequencing），能够在基因组范围内开发大量SNP标记用于基因分型。由于不依赖参考基因组、测序流程简单、测序成本低等特点，GBS技术已广泛应用于非模式生物分子标记开发、遗传图谱绘制、关联分析和群体基因组学等研究。许氏平鲉是一种广泛分布于西北太平洋海域的岩礁性卵胎生鱼类，具有重要的经济价值和生态价值。目前许氏平鲉的分子标记仅局限于线粒体DNA和微卫星标记，分子标记的局限性严重影响了许氏平鲉群体遗传多样性和遗传结构的监测，导致划分渔业管理单元和制定管理策略出现偏差，最终影响许氏平鲉渔业资源的合理开发利用。基于上述原因，有必要提供一种新的开发许氏平鲉基因组SNP位点的分析方法，在降低成本的前提下开发大量分子标记，为后续基因分型和遗传学研究提供便利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种技术稳定、重复性高、能够在降低成本的情况下大量开发许氏平鲉基因组分子标记的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，包括许氏平鲉基因组DNA提取、Adapter接头设计、许氏平鲉基因组DNA酶切、连接Adapter、混合样品和PCR扩增、回收序列片段和高通量测序、数据分析开发SNP位点，具体包括如下步骤为：
许氏平鲉基因组DNA提取：（a）将肌肉样品中加入600-700μl消化缓冲液和18-22μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于50-60℃下消化4-6h；
（b）将步骤a消化好的溶液冷却至室温后，加入等体积的平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，离心，然后重复上述步骤2-3次；
（c）将步骤b得离心上清液体中加入等体积-20℃预冷酒精，振动至DNA沉淀下来，离心，离心沉淀用250-350μl浓度为70-80%酒精溶液漂洗两次，离心后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，待用，本发明利用苯酚/氯仿/异戊醇方法提取许氏平鲉基因组DNA，对许氏平鲉基因组DNA的损伤比较小，容易获得完整性相对更好的许氏平鲉基因组DNA，同时可在加异丙醇后冰浴10-20分钟后离心，效果更佳；
Adapter接头设计：Adapter接头的设计与MseI和NlaIII的酶切末端和后续IlluminaHiseq测序平台要求的引物序列一致，采用MseI和NlaIII酶切组合酶的酶切位点分布广泛且均匀，对许氏平鲉基因组DNA进行酶切，产生的酶切标签具有较高的多样性，可满足筛查SNP以进行遗传作图的要求；
许氏平鲉基因组DNA酶切：取0.1-1μg许氏平鲉基因组DNA，用MseI和NlaIII酶切组合进行酶切，以得到适合的标记密度；
连接Adapter：Adapter接头连接与许氏平鲉基因组DNA酶切在同一试管中进行，接头通过连接酶与DNA酶切末端相连接；
混合样品和PCR扩增：将连接Adapter接头的不同样品DNA片段等量混合，加入PCR引物序列和DNA合成酶进行PCR扩增；
回收序列片段和高通量测序：电泳回收步骤（4）中扩增的产物，利用IlluminaHiseq2000测序平台进行测序，高通量SNP开发方法简单易行、清晰准确、假阳性低并且试验成本低，扩增区内已知和未知SNP都能检测；灵敏度和精确度达到近100%；
数据分析开发SNP位点：测序得到的原始数据按照样品标签序列进行分选聚类，按样品个体进行数据质控并删除Adapter接头序列，利用短序列比对软件BWA将序列比对到参考基因组上，使用SAMtools软件提取SNP位点，使用VCFtools软件筛选用于群体遗传结构分析的SNP位点。
作为优选，许氏平鲉基因组DNA提取步骤用平衡酚中含有0.4-0.45%十六烷基三甲基溴化铵和0.052-0.57%正戊醇，十六烷基三甲基溴化铵和正戊醇的特殊存在能够和平衡酚发挥增益作用，一方面能够溶解未被破坏的细胞膜，同时结合多糖和蛋白质等物质，提高苯酚溶解蛋白质的量，使得在较少平衡酚的情况下也能有效地变性蛋白质，进而有效抑制DNAse的降解作用，同时能够降低DNA在异戊醇中的溶解量，使得本实施例3改进的DNA提取方法DNA得率和纯度的高，简便快速，成本低廉，且能够在后续过程中清除干净，对最终得到的DNA溶液无影响。
作为优选，Adapter接头序列由Illumina测序平台接头序列、样品标签序列两部分组成。
进一步优选，样品标签序列设计原则如下：
（a）样品标签序列为6碱基序列且不能含有连续两个相同的碱基；
（b）样品标签序列间必须有至少两个差异碱基；
（c）样品标签不能与酶切位点相同或相近。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明分子标记方法可以在许氏平鲉基因组水平上开发SNP分子标记，SNP覆盖基因组编码区和非编码区，基因分型测序技术是一种低成本的简化基因组测序技术，能够在基因组范围内开发大量SNP标记用于基因分型，而使用MseI和NlaIII的基因分型测序技术大大降低了分子标记开发的成本，开发得到的SNP位点可应用于许氏平鲉的种质资源评估、遗传多样性和遗传结构监测等研究，该SNP分子标记方法技术稳定，重复性高。
附图说明
图1：本发明实例例3中利用开发的许氏平鲉基因组SNP位点进行群体遗传结构分析。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，包括许氏平鲉基因组DNA提取、Adapter接头设计、许氏平鲉基因组DNA酶切、连接Adapter、混合样品和PCR扩增、回收序列片段和高通量测序、数据分析开发SNP位点，具体包括如下步骤为：
1）许氏平鲉基因组DNA提取：（a）将肌肉样品去除酒精后置于1.5ml离心管中，加入600μl消化缓冲液和18μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于50℃烘箱内消化4h，每30min摇晃一次；
（b）将步骤a消化好的溶液冷却至室温后，于离心管中加入等体积的平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，在10000rpm条件下离心10min，然后重复上述步骤2次；
（c）将步骤b得离心上清液体中加入等体积-20℃预冷酒精，振动至DNA沉淀下来，然后在2℃、10000rpm条件下离心5min后，离心沉淀用250μl浓度为70%酒精溶液漂洗两次，然后在10000rpm条件下离心5min后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，最后将提取的DNA溶液置于4℃冰箱保存，待用，本发明利用苯酚/氯仿/异戊醇方法提取许氏平鲉基因组DNA，对许氏平鲉基因组DNA的损伤比较小，容易获得完整性相对更好的许氏平鲉基因组DNA，同时可在加异丙醇后冰浴10-20分钟后离心，效果更佳；
2）Adapter接头设计：Adapter接头的设计与MseI和NlaIII的酶切末端和后续IlluminaHiseq测序平台要求的引物序列一致，采用MseI和NlaIII酶切组合酶的酶切位点分布广泛且均匀，对许氏平鲉基因组DNA进行酶切，产生的酶切标签具有较高的多样性，可满足筛查SNP以进行遗传作图的要求；
3）许氏平鲉基因组DNA酶切：取0.1μg许氏平鲉基因组DNA，用MseI和NlaIII酶切组合进行酶切，以得到适合的标记密度；
4）连接Adapter：Adapter接头连接与许氏平鲉基因组DNA酶切在同一试管中进行，接头通过连接酶与DNA酶切末端相连接；
5）混合样品和PCR扩增：将连接Adapter接头的不同样品DNA片段等量混合，加入PCR引物序列和DNA合成酶进行PCR扩增；
6）回收序列片段和高通量测序：电泳回收步骤（4）中扩增的产物，利用IlluminaHiseq2000测序平台进行测序，高通量SNP开发方法简单易行、清晰准确、假阳性低并且试验成本低，扩增区内已知和未知SNP都能检测；灵敏度和精确度达到近100%；
7）数据分析开发SNP位点：测序得到的原始数据按照样品标签序列进行分选聚类，按样品个体进行数据质控并删除Adapter接头序列，利用短序列比对软件BWA将序列比对到参考基因组上，使用SAMtools软件提取SNP位点，使用VCFtools软件筛选用于群体遗传结构分析的SNP位点。
上述许氏平鲉基因组DNA提取步骤用平衡酚中含有0.4%十六烷基三甲基溴化铵和0.052%正戊醇，十六烷基三甲基溴化铵和正戊醇的特殊存在能够和平衡酚发挥增益作用，一方面能够溶解未被破坏的细胞膜，同时结合多糖和蛋白质等物质，提高苯酚溶解蛋白质的量，使得在较少平衡酚的情况下也能有效地变性蛋白质，进而有效抑制DNAse的降解作用，同时能够降低DNA在异戊醇中的溶解量，使得本实施例3改进的DNA提取方法DNA得率和纯度的高，简便快速，成本低廉，且能够在后续过程中清除干净，对最终得到的DNA溶液无影响。
上述Adapter接头序列由Illumina测序平台接头序列、样品标签序列两部分组成。
其中，样品标签序列设计原则如下：
（a）样品标签序列为6碱基序列且不能含有连续两个相同的碱基；
（b）样品标签序列间必须有至少两个差异碱基；
（c）样品标签不能与酶切位点相同或相近。
实施例2：
基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，包括许氏平鲉基因组DNA提取、Adapter接头设计、许氏平鲉基因组DNA酶切、连接Adapter、混合样品和PCR扩增、回收序列片段和高通量测序、数据分析开发SNP位点，具体包括如下步骤为：
1）许氏平鲉基因组DNA提取：（a）将肌肉样品去除酒精后置于1.5ml离心管中，加入700μl消化缓冲液和22μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于60℃烘箱内消化6h，每30min摇晃一次；
（b）将步骤a消化好的溶液冷却至室温后，于离心管中加入等体积的平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，在15000rpm条件下离心15min，然后重复上述步骤3次；
（c）将步骤b得离心上清液体中加入等体积-20℃预冷酒精，振动至DNA沉淀下来，然后在5℃、15000rpm条件下离心10min后，离心沉淀用350μl浓度为80%酒精溶液漂洗两次，然后在15000rpm条件下离心10min后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，最后将提取的DNA溶液置于4℃冰箱保存，待用；
2）Adapter接头设计：Adapter接头的设计与MseI和NlaIII的酶切末端和后续IlluminaHiseq测序平台要求的引物序列一致；
3）许氏平鲉基因组DNA酶切：取1μg许氏平鲉基因组DNA，用MseI和NlaIII酶切组合进行酶切，以得到适合的标记密度；
4）连接Adapter：Adapter接头连接与许氏平鲉基因组DNA酶切在同一试管中进行，接头通过连接酶与DNA酶切末端相连接；
5）混合样品和PCR扩增：将连接Adapter接头的不同样品DNA片段等量混合，加入PCR引物序列和DNA合成酶进行PCR扩增；
6）回收序列片段和高通量测序：电泳回收步骤（4）中扩增的产物，利用IlluminaHiseq2000测序平台进行测序；
7）数据分析开发SNP位点：测序得到的原始数据按照样品标签序列进行分选聚类，按样品个体进行数据质控并删除Adapter接头序列，利用短序列比对软件BWA将序列比对到参考基因组上，使用SAMtools软件提取SNP位点，使用VCFtools软件筛选用于群体遗传结构分析的SNP位点。
上述许氏平鲉基因组DNA提取步骤用平衡酚中含有0.45%十六烷基三甲基溴化铵和0.57%正戊醇。
上述Adapter接头序列由Illumina测序平台接头序列、样品标签序列两部分组成。
其中，样品标签序列设计原则如下：
（a）样品标签序列为6碱基序列且不能含有连续两个相同的碱基；
（b）样品标签序列间必须有至少两个差异碱基；
（c）样品标签不能与酶切位点相同或相近。
实施例3：
一种基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，包括以下步骤：
（1）实验材料
本实验样品于2016年春季采自大连、舟山和珠海近海海域，每个群体20尾许氏平鲉样品，共计60尾样品，样品采集时间相近，体长大小相似。所有样品取肌肉样品，置于95%酒精溶液中-20℃冷冻保存；
（2）许氏平鲉基因组DNA提取
（a）将肌肉样品去除酒精后置于1.5ml离心管中，加入650μl消化缓冲液和20μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于56℃烘箱内消化5h，每30min摇晃一次；
（b）待溶液冷却至室温后，于离心管中加入650μl平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，在10000rpm条件下离心10min，用1000μl移液枪吸出上层液体；
（c）加入600μl（相同体积）苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）按照步骤（b）再次提取两次，将上层液体转移到新的1.5ml离心管中，加入1ml -20℃预冷酒精，轻轻振动离心管，可以观察到DNA沉淀下来，在10000rpm条件下离心10min后，用300μl 75%酒精溶液漂洗两次，在10000rpm条件下离心10min后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，提取的DNA溶液置于4℃冰箱保存待用；
（3）Adapter接头序列
合成一对通用接头序列，60对样品标签序列和一对PCR引物序列；
（4）许氏平鲉基因组DNA酶切
使用MseI和NlaIII酶切组合对许氏平鲉许氏平鲉基因组DNA进行酶切，反应体系为20μl，包括15μl去离子水，2μl 10×CutSmart Buffer，0.5μl MseI，0.5μl NlaIII，200ng样品DNA，反应条件为37℃ 2h。之后将反应体系置于65℃下30min变性内切酶，抑制其活性；
（5）酶切产物与Adapter接头连接
酶切结束后连接Adapter接头，接头连接与酶切反应在同一试管中进行。加入NEBBuffer 4缓冲液和ATP、正反向接头各100μmol，反应结束后再加入NEB Buffer 4缓冲液、ATP和200U的T4连接酶。整个反应体系保持在22℃下持续2h，之后反应体系置于65℃下20min；
（6）样品混合和PCR扩增
连接产物通过Qbit定量后，按照样品等量混入PCR试管中。经过18次重复循环（98℃30s，65℃ 30s，72℃ 30s）后得到待测序文库；
（7）高通量测序和基因组SNP开发
按照Illumina建库和测序流程对步骤（6）中获得的序列在Illumina Hiseq2000测序平台上进行高通量测序，测序使用双末端150 bp测序模式，共得到测序数据约60G。
按照样品标签对测序数据进行聚类，分别得到60个许氏平鲉样品的原始测序数据。对原始数据进行质量控制并去除Adapter接头序列后，使用BWA软件的BWA-mem算法比对到许氏平鲉参考基因组序列上，得到bam文件。使用SAMtools软件对bam文件进行分析，提取SNP标记，得到sam文件。使用VCFtools软件筛选SNP标记，得到用于许氏平鲉群体遗传学分析的SNP标记。
本实施例按照上述流程共得到9624个SNP标记。使用上述获得的基因组SNP标记对3个许氏平鲉群体进行群体遗传结构分析，结果发现相同群体内个体均呈现明显的聚类关系，显示群体内个体间遗传关系较近，而不同群体间呈现一定的遗传分化，如附图1所示。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，包括许氏平鲉基因组DNA提取、Adapter接头设计、许氏平鲉基因组DNA酶切、连接Adapter、混合样品和PCR扩增、回收序列片段和高通量测序、数据分析开发SNP位点，其特征在于：所述Adapter接头的设计与MseI和NlaIII的酶切末端和后续Illumina Hiseq测序平台要求的引物序列一致。
2.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述Adapter接头序列由Illumina测序平台接头序列、样品标签序列两部分组成。
3.根据权利要求2所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述样品标签序列设计原则如下：
（a）样品标签序列为6碱基序列且不能含有连续两个相同的碱基；
（b）样品标签序列间必须有至少两个差异碱基；
（c）样品标签不能与酶切位点相同或相近。
4.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述许氏平鲉基因组DNA提取步骤为：
（a）将肌肉样品中加入600-700μl消化缓冲液和18-22μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于50-60℃下消化4-6h；
（b）将步骤a消化好的溶液冷却至室温后，加入等体积的平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，离心，然后重复上述步骤2-3次；
（c）将步骤b得离心上清液体中加入等体积-20℃预冷酒精，振动至DNA沉淀下来，离心，离心沉淀用250-350μl浓度为70-80%酒精溶液漂洗两次，离心后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，待用。
5.根据权利要求4所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述平衡酚中含有0.4-0.45%十六烷基三甲基溴化铵和0.052-0.57%正戊醇。
6.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述许氏平鲉基因组DNA酶切步骤为：取0.1-1μg许氏平鲉基因组DNA，用MseI和NlaIII酶切组合进行酶切，以得到适合的标记密度。
7.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述连接Adapter步骤为：Adapter接头连接与许氏平鲉基因组DNA酶切在同一试管中进行，接头通过连接酶与DNA酶切末端相连接。
8.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述混合样品和PCR扩增步骤为：将连接Adapter接头的不同样品DNA片段等量混合，加入PCR引物序列和DNA合成酶进行PCR扩增。
9. 根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述回收序列片段和高通量测序步骤为：电泳回收步骤（4）中扩增的产物，利用Illumina Hiseq2000测序平台进行测序。
10.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的许氏平鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述数据分析开发SNP位点步骤为：测序得到的原始数据按照样品标签序列进行分选聚类，按样品个体进行数据质控并删除Adapter接头序列，利用短序列比对软件BWA将序列比对到参考基因组上，使用SAMtools软件提取SNP位点，使用VCFtools软件筛选用于群体遗传结构分析的SNP位点。
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