CN110172520B - 一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物、鉴别方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物、鉴别方法及其应用，属于海洋经济鱼类遗传育种技术领域，所述特异分子标记引物能够对平鲉鱼类进行雌雄鉴别，仅在雄性个体中扩增出特异性片段，片段大小为558bp。本发明引物和方法可以用于许氏平鲉、铠平鲉、厚头平鲉等所有平鲉鱼类的遗传性别鉴定。所述方法不需要解剖活体就能检测雌雄性别，降低了鉴定成本，为在生产上实现平鲉鱼类的性别控制育种具有重要的研究意义。

Description

一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物、鉴别方法及其应用

技术领域

本发明属于海洋经济鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物、鉴别方法及其应用。

背景技术

许氏平鲉，Sebastes schlegelii(Hilgendorf,1880)、厚头平鲉、铠平鲉等平鲉鱼类，属鲉形目平鲉科平鲉属的一种暖温性底层鱼类，分布于西北太平洋近岸的温水性鱼种，卵胎生。许氏平鲉雌雄个体在早期胚胎发育和幼鱼阶段并没有表现出形态学上的差异，从体型大小和生殖器的特征无法对其雌雄进行性别鉴定，对性别的鉴定只能通过麻醉后解剖。

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提供一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物、鉴别方法及其应用，所述方法运用PCR扩增技术在雌雄个体的基因组DNA中扩增特异的片段，从而达到区分许氏平鲉雌雄性别的目的。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物，所述的引物序列如下所示：Tag-fw 5′-primer：5′-GTAAACCAAGAACTGAGGAGGAG-3′，Tag-rv 3′-primer：5′-GAGAAAAGCAGAAGTGGAATCA-3′。

本发明还提供一种利用所述引物进行许氏平鲉雌雄鉴别的方法，所述方法运用PCR扩增技术在雌雄个体的基因组DNA中扩增特异的片段；

所述PCR反应体系如下：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taq buffer2.5μL，浓度2.5mMdNTP2.0μL，10mM Fw/Rv引物各0.5μL，5U/μL Taq酶0.25μL，dd H₂O补齐25.0μL

所述PCR反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，循环30次，72℃延伸10min；待PCR反应结束后琼脂糖凝胶进行电泳，特异性片段大小为558bp，仅在雄性个体中有扩增。

本发明还提供利用所述引物和方法在平鲉鱼类雌雄鉴别中的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明方法不需要解剖活体就能检测雌雄性别，降低鉴定成本，为在生产上实现平鲉鱼类的性别控制育种具有重要的研究意义。

附图说明

图1为许氏平鲉10个雄性和10雌性个体DNA检测电泳图；

图2为许氏平鲉雄性特异分子标记在雌雄个体中的验证的电泳图。

图3为铠平鲉雄性特异分子标记在雌雄个体中的验证的电泳图；

图4为厚头平鲉雄性特异分子标记在雌雄个体中的验证的电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

本实施例的实施对象是许氏平鲉幼鱼，事先通过解剖方法鉴别了雌雄性别，然后取10个雌性和10个雄性用来验证本发明技术方案。

1、DNA的提取

1)裂解

本实验提取DNA所用的方法是机械剪碎法，将保存在-80℃的肌肉组织取出，用干净的剪刀和镊子剪黄豆粒大小的肌肉组织，放入1.5mL的EP管中，加入550μL的TNES溶液(预先在60℃的水浴锅中加热溶解)，8μL的蛋白酶K并在56℃水浴30min，用剪刀将组织块剪碎，再56℃放置4-5h。

2)抽提蛋白

在肌肉裂解液中加入平衡酚/氯仿/异戊醇300μL，轻轻晃动20min，13000rpm离心20min；吸取上清液放入新的EP管中，加入TE溶液补足到600μL。再加入氯仿/异戊醇(24：1)600μL，将EP管放在板架上，轻轻晃动20min，13000rpm离心20min。重复一次，去除肌肉DNA中的残留酚。

3)沉淀DNA

吸取上清，加入-20℃预冷的异丙醇700μL，饱和的3M NaAc 50μL，置于-20℃3h或过夜，4℃13000rpm/min离心10min。取上清，加入2倍体积的预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀，再4℃，13000rpm离心10min。留沉淀，加入预冷的无水乙醇，4℃，13000rpm/min离心10min。

4)溶解DNA

去掉上清液，在超净工作台干燥沉淀，直至无水乙醇全部挥发完全，最后加入20μL1×TE缓冲液(预先按浓度要求加入RNaseA)来溶解DNA沉淀。

2、许氏平鲉DNA质量检测

1)DNA浓度检测

使用Nanodrop对提取的DNA样品进行浓度检测，吸取1μL的TE溶液进行调零测试，再吸取1μL的待测DNA样品进行浓度检测，并读取A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀的OD值，OD260/OD280≈1.8>1.9，表明有RNA污染；OD<1.6，表明有蛋白质、酚等污染)。

2)电泳检测DNA完整性

1×TAE中溶解琼脂糖凝胶，取30mL的琼脂糖凝胶并加入Gelred染液混匀，倒入预先洗干净的胶槽中，插上梳子，待胶凝固后吸取DNA溶液1μL，加入2μL的loadingbuffer，3μL的ddH₂O，180v电泳20min。结果如图1所示。

3、许氏平鲉性别特异标记的扩增

以Tag-fw5′-primer和Tag-fw3′-primer为引物，以提取的群体的许氏平鲉DNA为模板，模板终浓度是20ng/μL，用普通的Taq酶对筛选出的Tag片段进行扩增验证，PCR的反应体系如表1所示；

表1 PCR的反应体系

反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃；30s，30cycles；72℃，5min，12℃∞。待PCR反应结束后琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图2所示。558bp和393bp片段序列如下：

558bp

GTAAACCAAGAACTGAGGAGGAGAATAATTCCAATTTTATGATCATGGTGATCAATGAGACAGGCAGAGTGTTATTATAATATAACCTATGATTCTATTTTTCACTTTTAGATGGTTAAATTATGTTAGAAATAGGCCTACCAGTGGGCTGCAGTTTATTTTTTGGCCTTTTCAAACATGACAATGTCATTTAAAAGATATATATCAGCTGTTACTGGTGCATTCTGGTCAGATTTAATACTTTTTTTCTGGTCTTATAATCAAGATCAATATGGTAGCTTTATTATAAGCAGGTTAAGAGGCTACACATCCTGTATGCACAAAAATAACACTGAGAACCTCCCGGCAGGTCACGCTGTGCAAAGAGAGGTGGAGGGGCACCAGCTAAAATCTTGCCTAGGGCACCAAATAGGTCAGGGCTGACAATGAAGATAGAATTTCTTGTTTCGTGTGCACTCTTCTCACATTTCCTCTCTTTGCAGACCAAAACCTAAAAGATATCCTTGTTGGCAGAAAAACAGGAAGTAACATCAGCATGATTCCACTTCTGCTTTTCTC

339bp

GTAAACCAAGAACTGAGGAGGAGAATAATTCCAATTTCAAGATCATGGTGATCAATGAGACAGGCAGAGTCTTATTAAAATATAACCTATGGTTCTATTTTTCACTTTTAGATGGTTAAATTATGTTAGAAATAGGCCTACCATTAGGCTGCAGTTTATTTTTTGGGCCTTTTCAAACATGACAATGTCATTTAAAAGCTATATATCAGCTGTAACTGGTGCATTCTGGTCAGATTTGACCAAATAGGTCAGGGCCGACAATGAAGATAGAATTTCTTGTTTCGTGTGCACTCTCCTCACATTTCCTCTCTTTGCAGACCAAAACCTAAAAGACATCCTTGTTGGCGGAAAATCAGGAAGTAACATCAGCATGATTCCACTTCTGCTTTTCTC

实施例2

本实施例的实施对象为铠平鲉，其它方法步骤如实施例1，验证结果如图3。从图3可以看出在本发明引物和方法能够鉴别铠平鲉的雌雄个体。

实施例3

本实施例的实施对象为厚头平鲉，其它方法步骤如实施例1，验证结果如图4。从图4可以看出在本发明引物和方法能够鉴别厚头平鲉的雌雄个体。

本发明的雌雄性别鉴定引物和方法同样适用于其它平鲉鱼类。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物、鉴别方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaaaccaag aactgaggag gag 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagaaaagca gaagtggaat ca 22

<210> 3

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaaaccaag aactgaggag gagaataatt ccaattttat gatcatggtg atcaatgaga 60

caggcagagt gttattataa tataacctat gattctattt ttcactttta gatggttaaa 120

ttatgttaga aataggccta ccagtgggct gcagtttatt ttttggcctt ttcaaacatg 180

acaatgtcat ttaaaagata tatatcagct gttactggtg cattctggtc agatttaata 240

ctttttttct ggtcttataa tcaagatcaa tatggtagct ttattataag caggttaaga 300

ggctacacat cctgtatgca caaaaataac actgagaacc tcccggcagg tcacgctgtg 360

caaagagagg tggaggggca ccagctaaaa tcttgcctag ggcaccaaat aggtcagggc 420

tgacaatgaa gatagaattt cttgtttcgt gtgcactctt ctcacatttc ctctctttgc 480

agaccaaaac ctaaaagata tccttgttgg cagaaaaaca ggaagtaaca tcagcatgat 540

tccacttctg cttttctc 558

<210> 4

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaaaccaag aactgaggag gagaataatt ccaatttcaa gatcatggtg atcaatgaga 60

caggcagagt cttattaaaa tataacctat ggttctattt ttcactttta gatggttaaa 120

ttatgttaga aataggccta ccattaggct gcagtttatt ttttgggcct tttcaaacat 180

gacaatgtca tttaaaagct atatatcagc tgtaactggt gcattctggt cagatttgac 240

caaataggtc agggccgaca atgaagatag aatttcttgt ttcgtgtgca ctctcctcac 300

atttcctctc tttgcagacc aaaacctaaa agacatcctt gttggcggaa aatcaggaag 360

taacatcagc atgattccac ttctgctttt ctc 393

Claims (3)

1.一种平鲉鱼类性别特异分子标记引物，其特征在于所述的引物序列如下所示：Tag-fw5′-primer：5′-GTAAACCAAGAACTGAGGAGGAG-3′，Tag-rv3′-primer：5′-GAGAAAAGCAGAAGTGGAATCA-3′。

2.一种利用权利要求1所述引物进行许氏平鲉雌雄鉴别的方法，所述方法运用PCR扩增技术在雌雄个体的基因组DNA中扩增出特异性片段；

所述PCR反应体系如下：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taq buffer2.5μL，浓度2.5mMdNTP2.0μL，10mM Fw/Rv引物各0.5μL，5 U/μL Taq酶0.25μL，dd H₂O补齐25.0μL；

所述PCR反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，循环30次，72℃延伸10min；待PCR反应结束后琼脂糖凝胶进行电泳，特异性片段大小为558bp，仅在雄性个体中有扩增。

3.权利要求2所述方法在平鲉鱼类雌雄鉴别中的应用。

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