CN110042168B - 用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents
用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对、试剂盒及方法，该引物对包括引物对1和引物对2，引物对1包括上游引物ITS‑F和下游引物ITS‑R，引物对2包括上游引物mtDNA‑F和下游引物mtDNA‑R；其中ITS‑F的序列如SEQ ID NO.1所示，ITS‑R序列如SEQ ID NO.2所示，mtDNA‑F序列如SEQ ID NO.3所示，mtDNA‑R序列如SEQ ID NO.4所示。本发明是国内外首次基于分子生物学技术原理建立的区分细鳞鲑和哲罗鲑的新方法，它利用细鳞鲑和哲罗鲑ITS基因和线粒体基因组各设计1对特异性引物，建立了一种PCR反应就可以实现鉴别细鳞鲑和哲罗鲑的新方法。本发明可以区分细鳞鲑和哲罗鲑完整个体及其加工产品，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。
Description
技术领域
本发明涉及用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对、试剂盒及方法，属于分子鉴定技术领域。
背景技术
细鳞鲑Brachymystax lenok(pallas)和哲罗鲑Hucho taimen(pallas)是我国珍稀名贵的冷水性鱼类，分属于属鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)的细鳞鱼属和哲罗鱼属。1998年细鳞鲑和哲罗鲑被列入中国濒危动物红皮书，濒危等级为易危。2004年二者被列入中国物种红色名录，近年来细鳞鲑和哲罗鲑的资源量不断下降，已经很难见到。细鳞鲑和哲罗鲑均是冷水性鱼类，生活环境相似。为了更好地保护与合理开发细鳞鲑和哲罗鲑种质资源，准确评估其资源量和分布状况，必须找到能够准确鉴别细鳞鲑与哲罗鲑的方法。同时在人工繁殖的细鳞鲑和哲罗鲑商品苗种销售、购买时，也需对其进行鉴定。但细鳞鲑和哲罗鲑属于近缘物种，成鱼根据外形易于区分，但幼鱼形态学特征不明显，很难依据形态学特征对二者鉴别，鱼卵更是专业人士也难以区分。因此急需简单快速的方法将细鳞鲑与哲罗鲑区分开。
此外，细鳞鲑、哲罗鲑肉质细嫩、味道鲜美，营养丰富，是人们喜爱的优质鱼类，为名贵的水产品。进一步加工后，失去了原有的外部形态特征，使得他们之间更加难于鉴别，因此对细鳞鲑、哲罗鲑产品的鉴别也亟不可待。
发明内容
本发明的目的在于针对现有细鳞鲑、哲罗鲑鉴别方法不足，提供一种能够把细鳞鲑和哲罗鲑区分开的引物。本发明的另一个目的在于利用上述鉴别引物建立细鳞鲑和哲罗鲑的鉴别方法、试剂盒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对，包括引物对1和引物对2，引物对1包括上游引物ITS-F和下游引物ITS-R，引物对2包括上游引物mtDNA-F和下游引物mtDNA-R；其中ITS-F的序列如SEQ ID NO.1所示，ITS-R序列如SEQ ID NO.2所示，mtDNA-F序列如SEQ ID NO.3所示，mtDNA-R序列如SEQ ID NO.4所示。
用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的试剂盒，包括上述引物对、2×Taq PCR Mix、超纯水。
区分细鳞鲑和哲罗鲑的方法，包括以下步骤：
(1)样本基因组DNA提取：采用裂解液裂解样本，粗提样本的基因组DNA；
(2)PCR扩增：以样本基因组DNA为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增；
(3)电泳检测：将PCR扩增产物进行电泳检测，再将电泳结果与标准图谱对比，如同时出现一条大小为298bp条带和一条大小为192bp条带，则该样本为哲罗鲑；如只出现一条大小为298bp条带，则该样品为细鳞鲑。
PCR扩增的反应体系为20μl，各成分为：2×Taq PCR Mix 10μl、模板2μl、10μM的4条引物各1μl，用超纯水补足20μl。
PCR扩增的PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃最后延伸5min。
裂解液的主要成分为：蛋白酶K 0.5mg/ml、Tris(pH8.0)10mM、KCl 50mM、Tween200.3％(w/v)、NP-40 0.3％(w/v)。
裂解条件为：55℃2h，98℃10min。
本发明有益效果：
本发明是国内外首次基于分子生物学技术原理建立的区分细鳞鲑和哲罗鲑的新方法，它利用细鳞鲑和哲罗鲑ITS基因和线粒体基因组各设计1对特异性引物，合计4条引物，建立了一种PCR反应就可以实现鉴别细鳞鲑和哲罗鲑的新方法。本发明无需依赖专业的分类学背景，也不需要具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验，不仅可以区分细鳞鲑和哲罗鲑完整个体，还可以鉴别其加工产品，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。且可以用于鱼卵、刚孵出苗种的鉴定，能够研究哲罗鲑的群落结构、产卵位置及扩散途径，了解早期生活史，评估细鳞鲑和哲罗鲑资源，解决商品苗种及淡水产品市场上存在的标识错误等方面的问题。
附图说明
图1为细鳞鲑和哲罗鲑标准图谱。其中，1-8为哲罗鲑，9-16为细鳞鲑。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、方法建立
1、样本基因组DNA提取
采集样本鱼5-10个鳞片，加入40μl裂解液(蛋白酶K 0.5mg/ml、Tris(pH8.0)10mM、KCl 50mM、Tween 20 0.3％(w/v)、NP-40 0.3％(w/v))，55℃2h，98℃10min裂解，裂解后混匀，1000-2000rpm离心1-2min，提取上清液，即为基因组DNA粗提液。
2、引物设计
根据细鳞鲑和哲罗鲑ITS基因和线粒体基因组各设计1对特异性引物，合计4条引物，引物序列如下：
ITS-F：5’-GTGCCTAACGGGGAAAGG-3’(SEQ ID NO.1)
ITS-R：5’-AACATACAGCAAATGCCATCC-3’(SEQ ID NO.2)
mtDNA-F：5’-TAAGCAAAATGGGCAAAACC-3’(SEQ ID NO.3)
mtDNA-R：5’-GTTATTCCAAGCGCACCTTC-3’(SEQ ID NO.4)
本发明在NCBI上查找哲罗鲑ITS基因与本实验室获得哲罗鲑转录组及基因组数据对比，获得哲罗鲑的部分序列，如SEQ ID NO.5所示，该序列160bp-192bp处与细鳞鲑不同，设计ITS引物，细鳞鲑不能扩增出条带。
为了避免实验过程中PCR扩增失败，产生误判，本发明引入了线粒体rRNA做参照，在NCBI上将细鳞鲑和哲罗鲑的线粒体rRNA基因进行对比，找出序列完全相同的部分，序列如SEQ ID NO.6所示，设计引物，该引物起到参照作用，如果在加样的过程中，DNA、引物没有加进去，或者其他问题导致的PCR扩增失败，比如飞样，PCR仪某个孔头问题等，在没有这个线粒体引物参照时，没有条带，会判断为细鳞鲑，造成判断失误。当有线粒体DNA引物参照时，如果线粒体DNA引物也没扩出条带，说明PCR反应有问题；如果线粒体DNA扩增出了条带，而ITS基因没扩出条带，说明本身PCR反应无问题，条带缺失是由于是ITS引物在细鳞鲑上不匹配造成的。
哲罗鲑ITS基因：
GTGCCTAACGGGGAAAGGGGGGATGGAGCCGGTCGGGCGCAACCCAGGCGACATGGAGATGCGGGGAACCGGGCTCGGGCTGGGGCCAAAGCCACCCTCCCGGCCTAGAACCCCGCGCCGAGGGAAGGGAGAGGCGGGGGGCGTGAGCCCCCTACCCTACATAAGGGACGCGGATGGCATTTGCTGTATGTT(SEQ ID NO.5)
线粒体rRNA基因：
TAAGCAAAATGGGCAAAACCCAAAACGTCAGGTCGAGGTGTAGCGCATGGGGTGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTAAATTAGAGCACTACGAACCACGCTGTGAAACCAGCGTCCGAAGGTGGATTTAGCAGTAAACAGAAAACAGAGAGTTCTCTTGAAACTGGCTCTGAGGCGCGCACACACCGCCCGTCACTCTCCCCAAGTTCAATTTATCCTTCTAACTAAGAAGTTAACCGAACAAAGGGGAGGCAAGTCGTAACATGGTAAGTGTACCGGAAGGTGCGCTTGGAATAAC(SEQ ID NO.6)
同时对ITS基因和线粒体基因引物比例进行了优化，分别做了浓度10:1、5:1、2:1、1:1和1:0.5的优化，仅1:1时ITS基因和线粒体基因的扩增产物条带清晰。
3、PCR扩增
以DNA粗提液为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCR Mix 10μl、DNA粗提液2μl、10μM的4条引物各1μl，用超纯水补足20μl。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃最后延伸5min。
4、电泳
PCR反应结束后，取8μl PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪下观察、照相并保存。根据电泳结果与提供的细鳞鲑和哲罗鲑标准图谱(图1)对比，如同时出现一条大小为298bp条带和一条大小为192bp条带，则该样本为哲罗鲑；如只出现一条大小为298bp条带，则该样品为细鳞鲑。
实施例2、样本检测
利用实施例1的鉴别方法，采集不同流域根据形态鉴定为野生细鳞鲑和哲罗鲑的成鱼各50尾，取各尾成鱼5-10个鳞片，进行鉴定。根据电泳结果与提供的哲罗鲑和细鳞鲑标准图谱对比，发现50份根据形态学鉴定为细鳞鲑样本均出现一条大小为298bp的特异性条带，表明样本为细鳞鲑样本；50份根据形态学鉴定为哲罗鲑样本出现一条大小为298bp和一条大小为192bp的两条特异性条带，表明样本为哲罗鲑。该方法十分灵敏，鱼卵、幼鱼和成鱼均能够区分，准确率能达100％。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
<120> 用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对、试剂盒及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gtgcctaacg gggaaagg 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aacatacagc aaatgccatc c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
taagcaaaat gggcaaaacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gttattccaa gcgcaccttc 20
<210> 5
<211> 192
<212> DNA
<213> 哲罗鲑(Hucho taimen)
<400> 5
gtgcctaacg gggaaagggg ggatggagcc ggtcgggcgc aacccaggcg acatggagat 60
gcggggaacc gggctcgggc tggggccaaa gccaccctcc cggcctagaa ccccgcgccg 120
agggaaggga gaggcggggg gcgtgagccc cctaccctac ataagggacg cggatggcat 180
ttgctgtatg tt 192
<210> 6
<211> 298
<212> DNA
<213> 哲罗鲑(Hucho taimen)
<400> 6
taagcaaaat gggcaaaacc caaaacgtca ggtcgaggtg tagcgcatgg ggtgggaaga 60
aatgggctac attctctaaa ttagagcact acgaaccacg ctgtgaaacc agcgtccgaa 120
ggtggattta gcagtaaaca gaaaacagag agttctcttg aaactggctc tgaggcgcgc 180
acacaccgcc cgtcactctc cccaagttca atttatcctt ctaactaaga agttaaccga 240
acaaagggga ggcaagtcgt aacatggtaa gtgtaccgga aggtgcgctt ggaataac 298
Claims (8)
1.用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对，其特征在于，包括引物对1和引物对2，引物对1包括上游引物ITS-F和下游引物ITS-R，引物对2包括上游引物mtDNA-F和下游引物mtDNA-R；其中ITS-F的序列如SEQ ID NO.1所示，ITS-R序列如SEQ ID NO.2所示，mtDNA-F序列如SEQID NO.3所示，mtDNA-R序列如SEQ ID NO.4所示。
2.用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×Taq PCR Mix、超纯水。
4.区分细鳞鲑和哲罗鲑的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样本基因组DNA提取：采用裂解液裂解样本，粗提样本的基因组DNA；
（2）PCR扩增：以样本基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
（3）电泳检测：将PCR扩增产物进行电泳检测，再将电泳结果与标准图谱对比，如同时出现一条大小为298bp条带和一条大小为192bp条带，则该样本为哲罗鲑；如只出现一条大小为298bp条带，则该样本为细鳞鲑。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为20 μL，各成分为：2×Taq PCR Mix 10 μL、模板2 μL、10 μM的4条引物各1 μL，用超纯水补足20 μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s，32个循环；72℃最后延伸5 min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，裂解液的主要成分为：蛋白酶K 0.5 mg/mL、Tris（pH8.0）10 mM、KCl 50 mM、Tween 20 0.3%（w/v）、NP-40 0.3%（w/v）。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，裂解条件为：55℃ 2 h，98℃ 10 min。
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