CN105543415A - 一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种适用于牡蛎疱疹病毒(Ostreid？herpesvirus-1,OsHV-1)不同变异株检测的巢式PCR方法。该检测方法以牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因功能结构域核苷酸序列为模板，设计两对嵌套式引物，并以此为主题设计巢式PCR检测方法。由于DNA聚合酶基因在疱疹病毒种内阶元上高度保守，本发明采用的两对嵌套式引物，可以与目前已知的所有OsHV-1变异株基因组相结合，对这些变异株的特异性DNA核酸片段进行定性检测，灵敏度高，特异性好。利用该检测方法可以克服现有分子检测方法，仅能对OsHV-1部分变异株进行检测的严重缺陷。该检测方法可用于贝类各时期养殖过程中的牡蛎疱疹病毒的跟踪检测，具有很高的使用价值。有望替代牡蛎疱疹病毒之前的相关分子检测方法。

Description

一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法
技术领域
本发明属于贝类病原检测技术领域，具体涉及一种通过巢式聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)检测牡蛎疱疹病毒(Ostreidherpesvirus1,OsHV-1)的方法。
背景技术
自20世纪90年代末以来，OsHV-1引起包括我国在内的全球11个国家和地区海水养殖双壳贝类的大规模死亡。目前已知受影响的宿主物种包括牡蛎(6种)，扇贝(2种)，蛤类(2种)和魁蚶在内的11个物种；其中受影响最严重的是我国养殖的栉孔扇贝(Chlamysfarreri)和欧洲养殖的长牡蛎(Crassostreagigas)。建立准确、灵敏和快速的检测方法是及早发现病害病原并采取相应防控措施前提和基础。
目前对于OsHV-1的检测，最常用的方法是聚合酶链式反应(PCR)技术；PCR所采用的引物多是基于病毒基因组C区设计的，其中基于C2和C6位点设计的一对引物，被OIE推荐为该病毒的PCR检测的通用方法，该方法已被多个国家和地区广泛采用。然而最新的比较基因组学分析结果表明，C区是牡蛎疱疹病毒基因组中序列变异最大的几个基因片段之一。同时近年来OsHV-1分子流行病学监测数据和研究结果表明，该病毒2008年以来发生了较强的株系分化；因基因组C区碱基组成或排列顺序发生变异而产生的新变异株不断出现，从而导致基于该区核苷酸序列设计的OsHV-1检测引物无法与目标位点结合；最终导致基于C区建立的多种普通和巢式PCR检测方法，不能准确检出部分OsHV-1变异株感染的存在。
发明内容
本发明的目的是提供一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法，可以弥补现有检测技术只能对部分病毒变异株进行检测的不足，使牡蛎疱疹病毒的检测更准确和灵敏；可用于双壳贝类各时期养殖过程中牡蛎疱疹病毒的跟踪检测。
本发明首先提供一种检测牡蛎疱疹病毒的巢式PCR检测引物，
Pol-F：5＇-GATTTCAACTCGCAATACC-3＇(SEQIDNO:1)、
Pol-R：5＇-GGCAGACACAGATTCCACA-3＇(SEQIDNO:2)、
nPol-F：5＇-GTGTTTCTACATTGCTGG-3＇(SEQIDNO:3)、
nPol-R：5＇-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3＇(SEQIDNO:4)；
本发明另一个方面提供一种牡蛎疱疹病毒的巢式PCR检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制巢式PCR反应体系，然后通过巢式PCR反应程序对反应模板进行扩增，最后根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳是否产生目的条带对检测结果进行判断，如果显示目的条带则表示该样品的牡蛎疱疹病毒检测结果为阳性；
具体包括如下的步骤：
步骤1)基因组DNA提取：采用普通动物组织的DNA提取方法，从约30mg的贝类样本外套膜组织中提取DNA；
步骤2)第一轮PCR扩增：以步骤1)中得到的样本DNA2.0μL为模板，采用Pol-F/Pol-R引物，经PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物。
步骤3)第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物10倍稀释物2.0μL为模板，采用nPol-F/nPol-R引物，经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物。
步骤4)PCR扩增产物检测：取4.5μL第二轮PCR扩增产物，加入1.5μL的上样缓冲液(GeneFinder与6×loadingbuffer按1∶9体积混合)混合后，在浓度为1％的琼脂糖凝胶中，110伏电压下电泳30min；凝胶成像系统观察并拍照，存在约386bp的特异性条带，则确定所检测的样本被OsHV-1所感染。
其中步骤2)所用PCR反应体系为：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL，Mg2+(25mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L)各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超纯水30.6μL补齐到50μL的反应体系。
步骤2)所用PCR反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，53℃变性30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
步骤3)所用PCR反应体系为：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)3.0μL，Mg2+(25.0mmol/L)3.0μL，上下游引物(10.0μmol/L)各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超纯水32.6μL补齐到50μL的反应体系。
步骤3)所用PCR反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，51℃变性30s，72℃延伸45s，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
本发明是以牡蛎疱疹病毒种内严格保守的基因序列为模板设计的两对嵌套式引物。这些引物可以特异性地与所有牡蛎疱疹病毒变异株基因组相结合，并被经过优化的PCR反应体系和程序所扩增，完成对不同变异株的检测，克服了之前检测方法只能检测到部分变异株的严重缺陷。
附图说明
图1：PCR反应退火温度的优化图，其中(a)第一轮PCR反应；M：DL2000TMDNAmarker；1～6泳道分别为51、53、55、57、59和61℃；(b)第二轮PCR反应；M：DL2000TMDNAmarker；1～6泳道分别为47、49、51、53、55和57℃；
图2：PCR反应灵敏度的测试图，(a)第一轮PCR反应，(b)第二轮PCR反应M：DL2000TMDNAmarker；1～8泳道分别为108、107、106、105、104、103、102和101拷贝/μL；
图3：PCR反应特异性检测图；(a)第一轮PCR反应，(b)第二轮PCR反应；M：DL2000TMDNAmarker；1.牡蛎疱疹病毒；2.副溶血弧菌；3.对虾肝肠孢虫；4.白斑综合征；5.派琴虫；6.阴性对照。
图4：不同变异株检测特异性测试图；(a)本发明所述巢式PCR检测方法，(b)基于OsHV-1基因组C区建立的巢式PCR检测方法；M：DL2000TMDNAmarker；1.阳性对照；2.阴性对照；3.栉孔扇贝病料(代表变异株1)；4.长牡蛎病料(代表变异株2)；5.魁蚶病料(代表变异株3)。
图5：本发明所述巢式PCR检测方法检测不同贝类OsHV-1感染电泳图；M：DL2000TMDNAmarker；1.阳性对照；2-6.2001～2005年采集栉孔扇贝病料；7-11.2013年采集长牡蛎病料；12-16.2012～2015年采集魁蚶病料；17.阴性对照。
具体实施方式
申请人在对DNA聚合酶进行分析后发现其在鲍疱疹病毒(Haliotidherpesvirus1)、鲤疱疹病毒(Cyprinidherpesvirμs3)等多种疱疹病毒分子中有相对保守的序列。对OsHV-1三个变异株DNA聚合酶核苷酸序列进行比对，通过基因同源性分析，确定保守性强(核苷酸组成完全相同)的关键功能结构域，从而建立适用于OsHV-1不同变异株检测方法的基础。
以下通过附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：PCR引物设计
利用Primer5.0引物设计软件，以DNA聚合酶基因关键功能结构域核苷酸序列为基础，设计出巢式PCR检测引物：外引物上游序列，Pol-F：5＇-GATTTCAACTCGCAATACC-3＇，外引物下游序列，Pol-R：5＇-GGCAGACACAGATTCCACA-3＇，扩增片段大小为573bp；内引物上游序列，nPol-F：5＇-GTGTTTCTACATTGCTGG-3＇，内引物下游序列nPol-R：5＇-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3＇，扩增片段大小为386bp。
第一轮PCR反应体系及扩增程序的优化：以已知感染OsHV-1的栉孔扇贝样本DNA2μL作为阳性模板，DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL，Mg2+(25.0mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L)各2.0μL，其余加超纯水补齐50μL反应体系；扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度设置梯度分别为51、53、55、57、59和61℃30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验结果(如图1)，选取最适退火温度。利用摸索好的退火温度依次对反应体系中的dNTPs终浓度(0.05、0.1、0.15、0.20、0.25和0.30mmol/L)，Mg2+终浓度(0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mmol/L)进行优化。
第二轮PCR反应体系及扩增程序的优化：以2μL第一轮反应产物的10倍稀释液为模板，反应体系同第一轮反应；扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度设置梯度分别为47、49、51、53、55和57℃30s，72℃延伸45s，25个循环；72℃延伸10min。将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验结果，选取最适退火温度。利用摸索好的退火温度依次对反应体系中的dNTPs终浓度(0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/L)，Mg2+终浓度(0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mmol/L)进行优化。
检测方法灵敏度测试：用优化好的反应条件，用浓度为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL病毒质粒DNA为模板，各浓度反应分别做10组平行对照，以加等量超纯水作为模板的反应作为阴性对照，进行巢式PCR扩增反应，进行灵敏度的测定，发现本发明所述检测方法可以稳定重复检测到102拷贝/μL的病毒质粒(结果如图2)。
检测方法特异性测试：以实验室保存的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、虾肝肠孢虫(enterocytozoonhepatopenaei，EHP)、白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus，WSSV)和派琴虫(Perkinsusspp.)核酸为模板，以OsHV-1呈阳性的栉孔扇贝核酸为阳性对照，OsHV-1呈阴性的栉孔扇贝核酸作为阴性对照。采用优化好的巢式PCR反应程序和体系进行扩增反应，检验该检测方法的特异性(结果如图3)。
不同变异株检测特异性测试：以已知感染三种不同OsHV-1变异株的阳性样本为模板，以OsHV-1呈阳性的栉孔扇贝核酸为阳性对照，OsHV-1呈阴性的栉孔扇贝核酸作为阴性对照。同时采用本发明所述的巢式PCR检测方法，以及基于OsHV-1基因组C区设计的巢式PCR引物和优化好的反应程序和体系，进行扩增反应。结果发现本发明所述的巢式PCR检测方法可以成功检测所有三个变异株(结果如图4a)，而之前基于基因组C区设计的巢式PCR检测方法仅能检测到两种变异株(结果如图4b)。
上述基于OsHV-1基因组C区构建巢式PCR检测方法的引物序列为：外引物上游序列，CFor：5＇-ATTACCCAGATTCCCCTC-3＇，外引物下游序列，CRev：5＇-CCACGAATGTAAACTGTGAC-3＇，扩增片段大小为1200bp左右；内引物上游序列，C2：5＇-CTCTTTACCATGAAGATACCCACC-3＇，内引物下游序列C6：5＇-GTGCACGGCTTACCATTTTT-3＇，扩增片段大小为700bp左右。反应体系同本发明所述检测方法的反应体系。第一轮PCR反应测序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52℃变性30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。第二轮PCR反应测序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，50℃变性30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
实施例：巢式PCR检测方法检测不同贝类OsHV-1感染情况
(1)DNA提取：取实验室保存不同年代采集的不同物种贝类病料的外套膜组织约30mg，使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋动物组织基因组试剂盒，按照试剂盒说明书提供的步骤进行样本DNA的提取，并作为巢式PCR检测的模板。以OsHV-1呈阳性的栉孔扇贝核酸为阳性对照，OsHV-1呈阴性的栉孔扇贝核酸作为阴性对照。
(2)第一轮PCR反应：使用宝生物工程(大连)有限公司TaKaRaEx50μL的PCR反应体系，分别加入以下试剂：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL，Mg2+(25.0mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L)各2.0μL，以2μL上一步提取的DNA为模板，超纯水30.6μL。PCR反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，53℃变性30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
(3)第二轮PCR反应：使用宝生物工程(大连)有限公司TaKaRaEx50μL的PCR反应体系，分别加入以下试剂：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)3.0μL，Mg2+(25.0mmol/L)3.0μL，上下游引物(10.0μmol/L)各2.0μL，以2μL第一轮反应产物的10倍稀释液为模板，超纯水32.6μL。PCR反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，51℃变性30s，72℃延伸45s，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
(4)PCR扩增结果检测：取4.5μL第二轮PCR扩增产物，加入1.5μL的上样缓冲液(GeneFinder与6×loadingbuffer按1∶9体积混合)，浓度为1％的琼脂糖凝胶中，110伏电压下电泳30min；使用FujiFilm(LAS3000)凝胶成像系统观察并拍照(结果如图5)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种检测牡蛎疱疹病毒的巢式PCR引物组，其特征在于，所述的引物组的信息如下：
Pol-F：5＇-GATTTCAACTCGCAATACC-3＇、
Pol-R：5＇-GGCAGACACAGATTCCACA-3＇、
nPol-F：5＇-GTGTTTCTACATTGCTGG-3＇、
nPol-R：5＇-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3＇。
2.权利要求1所述的巢式PCR引物组在制备检测牡蛎疱疹病毒的制品中的应用。
3.一种检测牡蛎疱疹病毒的方法，其特征在于，所述的方法使用权利要求1所述的巢式PCR引物组。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法首先从待检测样品中制备反应模板，并配制巢式PCR反应体系，然后通过巢式PCR反应程序对反应模板进行扩增，最后根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳是否产生目的条带对检测结果进行判断，如果显示目的条带则表示该样品的牡蛎疱疹病毒检测结果为阳性。
5.如权利要求4所述的方法，包含有如下的步骤：
1)基因组DNA提取：采用普通动物组织的DNA提取方法，从待检测的样品中提取DNA；
2)第一轮PCR扩增：
以步骤1)中得到的样本DNA为模板，采用Pol-F/Pol-R引物，经PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；
3)第二轮PCR扩增：
以第一轮PCR扩增产物10倍稀释物为模板，采用nPol-F/nPol-R引物，经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；
4)PCR扩增产物检测：
取第二轮PCR扩增产物进行电泳，如存在386bp的特异性条带，则确定所检测的样本被OsHV-1所感染。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)所用PCR反应体系为：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL，Mg2+(25mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L)各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超纯水30.6μL补齐到50μL的反应体系。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)所用PCR反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，53℃变性30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)所用PCR反应体系为：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)3.0μL，Mg2+(25.0mmol/L)3.0μL，上下游引物(10.0μmol/L)各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超纯水32.6μL补齐到50μL的反应体系。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)所用PCR反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，51℃变性30s，72℃延伸45s，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
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