CN103898235A - 一种水蛭的dna条形码分子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水蛭(宽体金线蛭)的DNA条形码分子鉴定的方法和其CO I序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出水蛭CO I基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后送至测序公司进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与公开序列进行比对，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为宽体金线蛭来源。本发明采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了宽体金线蛭品种，增强了准确性和可靠性，确保了水蛭作为药材入药的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种宽体金线蛭DNA条形码分子鉴定方法。
背景技术
宽体金线蛭(学名：Whitmania pigra)是传统的名贵中药材，是2010版《中国药典》收录的药材水蛭主要基原动物之一，具有破瘀通经，消积散结等功效，也是疏血通等众多治疗心脏血管疾病中药的主要原料。因此，对宽体金线蛭的鉴定是入药的基础。在我国的药材市场，大部分动物药都是贵重、紧缺药材，通常以粉末等形式入药，市场较为混乱，鉴别十分困难。至于水蛭，在药材市场上，来源相对清晰，但是仍有部分伪品在市场内流通。目前，传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差，可信度低，导致水蛭的鉴定存在很大困难，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。
DNA条形码技术(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。目前在动物中最常用的DNA barcode是细胞色素C氧化酶1号基因(COI)的部分序列。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。运用DNA条形码技术，可以很好的对水蛭的品种进行快速、有效的鉴定。
本发明提供一种关于宽体金线蛭DNA条形码分子鉴定的方法，有利于实现宽体金线蛭的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。
发明内容
本发明克服目前以形态学鉴定水蛭方法存在的缺陷，提高宽体金线蛭鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的鉴定方法。本发明的技术方案如下：
首先从采集的各种水蛭提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增一段COI基因片段，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立各种水蛭的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快速，准确鉴定宽体金线蛭的目的。对需要鉴定的水蛭样品，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的特异引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物结果，然后测序，根据 序列比对可以鉴定出宽体金线蛭。本发明设计的用于鉴别宽体金线蛭的分子鉴定方法，采用如下步骤：
1、提取水蛭总DNA按常规动物DNA提取方法或者血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/μl-2μg/μl。
2、扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为
LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；
HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；
扩增程序为94℃预变性1分钟，45℃退火1.5分钟，72℃延伸1.5分钟，5个循环94℃变性1分钟，50℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环72℃延伸5分钟。
3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNA marker检测PCR片段大小。
4、鉴定结果的判断：若出现明显清晰的709bp大小的条带，且无杂带，则可送生物公司测序。
5、将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为宽体金线蛭。
其中，所述的水蛭DNA条形码分子鉴定方法采用的是血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。
所述引物，正向引物为5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′反向引物为5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。
所使用的DNA聚合酶为pfu高保真酶。
所述的电泳为1％-2％的琼脂糖凝胶电泳。
所述的条带大小需要用DNA maker检测。
所述的DNA序列拼接软件包括CodonCode Aligner、Sequencher、Genious、DNA star等软件。
与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现宽体金线蛭的分子鉴定。
附图说明
附图为用COI引物扩增水蛭的电泳检测图谱，其中泳道M为DNA Marker，泳道N1为阴性对照，泳道M1～M3依次为样品M1，M2，M3。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明：
1、水蛭标本的采集与保存采集品系：W1-湖面自育幼苗养殖I期水蛭；W2-湖面自育幼苗养殖II期-水蛭；W3-随机市场收集水蛭样品。采获的标本经10％酒精麻醉处理约20分钟，再经75％酒精浸泡15分钟处死并保存。
2、试验样品的前处理：取出保存于75％酒精中的水蛭标本，去内脏，避免内脏内容物的污染，剩余部分用蒸馏水浸泡清洗3次，洗去酒精，取尾部大约20mg解剖剪置入2ml EP管，加入磁珠，震荡粉碎。蛋白酶K56℃温浴1小时，至组织完全溶解。加入350μl氯仿：异戊醇(24∶1)混匀，10,000×g室温离心5分钟，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。
3、DNA模板制备：采用天根生物公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DNA进行提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.5μg/μl。
4、引物合成：本实施例所用引物如下：
正向引物5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；
反向引物5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。
5、PCR扩增本实施例的PCR反应体系如下：
PCR反应体系为25μl：ddH2O8.5uL，2×Taq PCR Master Mix12.5uL，正向引物/反向引物(2.5umol)各1uL，DNA模板2uL2×Taq PCR Master Mix包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2×，且不含染料；扩增程序：反应条件为94℃预变性1分钟，45℃退火1.5分钟，72℃延伸1.5分钟，5个循环94℃变性1分钟，50℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环72℃延伸5分钟。
6、琼脂糖电泳验证PCR结果琼脂糖电泳显示W1，W2，W3样品扩增良好，条带清晰无杂质，可直接送测序公司进行测序。
7、测序结果序列拼接将测序结果用CodonCode Aligner生物软件，将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后跟SEQ ID NO.1进行比对，W1，W2与跟SEQ ID NO.1同源率100％，为宽体金线蛭。W3序列与SEQ ID NO.1差异显著，与药用植物研究所构建的中药材DNA鉴定网站进行(网址www.tcmbarcode.cn)为日本水蛭。
本发明所阐述的实施例并不是对本发明的限定，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化和改进，均落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种水蛭的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于采用DNA条形码鉴定的水蛭为蚂蝗Whitmania pigra Whitman，亦称宽体金线蛭。
2.根据权利要求1所述的DNA条形码分子鉴定方法，其步骤主要包括：
(1)从待测的水蛭组织中分离提取总DNA；
(2)以该DNA为模板用一对引物，通过聚合酶链式反应扩增出水蛭COI基因；
(3)然后取适量步骤(2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因产物用琼脂糖电泳分离鉴定扩增产物大小，送生物公司测序；
(4)根据测序结果，进行分析比对，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为宽体金线蛭来源。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于引物DNA的序列为：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
4.根据权利要求2所述聚合酶链式反应，其特征在于扩增条件为94℃预变性1分钟，45℃退火1.5分钟，72℃延伸1.5分钟，5个循环；94℃变性1分钟，50℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。
5.根据权利要求2所述扩增产物，其特征在于扩增片段为709bp，用1％-2％琼脂糖电泳检测。
6.根据权利要求2所述的一种水蛭的DNA条形码标准检测基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为CO I基因，具有如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：
AAATAAATGTTGAAACAAAATAGGATCCC CC CCTCCTATAGGGTCAAAGAAAGTAGTATTTAAATTTCGATCTGTAAGTAATATTGTAATAGCTGCTGCTAAAACTGGTAATGATAACAATAATAAAATAGTAGTAATAACAACTGACCAAACAAATAATGGTACTCGTTCAGTTGTTATTCCTTTAGTTCGTATATTTATAATAGTCGAAATAAAATTTAATGACCCTAAAATAGATGAGGCACCAGCTATATGTAATGAAAAGATGGCTATGTCAACGGATGGGCCTGAATGAGATACGGAGTCTGATAGTGGAGGATAAAGGGTTCACCCTGCACCTACACCACCCTCAATTAAGGATGACCTAAGCAATATGATTATTGAAGGGGGTAGTAACCAAAATCTTAAGTTATTCAGACGAGGAAACGATATATCTACGGCCCCTACCATTAATGGTAGGAGTCAATTACCAAACCCACCAATTAGAATTGGTATAACTATAAAGAAGATTATAACCAACCCATGAGCCGTTACTAGTGAATTATACAATTGGTCGTCTCCAAGGAATCTTCCTGGCTGTGCTAATTCAATTCGAATAATTGATCTTATAGAAGAGCCTAACATAGCTGATCACGTTCCTAAAATAAAGTATAAAGTA。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 157013 Heilongjiang province Mudanjiang City Yangming District Yumin Road No. 288 Applicant after: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 157013 Heilongjiang province Mudanjiang City Yangming District Yumin Road No. 288 Applicant before: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |