CN109900871A - 一种脑心通制剂中水蛭药材的dna分子鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法，该方法采用蛋白酶K消化动物药组分，广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取植物药组分；基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ设计水蛭特异性引物进行PCR扩增；将产物电泳检测测序，获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST进行结果判定，以相似性最高的序列物种为待测样品最接近的物种。本水蛭特异性引物可扩增140～200bp的小片段基因，能针对脑心通胶囊中水蛭粉末进行鉴定，不受水蛭的外在形态限制，避免了DNA降解造成的影响，具有专属性强，准确通用的特点，填补了脑心通胶囊在水蛭质量控制方面的空白。
Description
技术领域
本发明涉及一种脑心通制剂中水蛭药材的鉴别方法。
背景技术
脑心通胶囊为陕西步长制药有限公司独家单一品规的中药品种(国药准字Z20025001，规格：每粒装0.4g)，是由黄芪、丹参、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花、醋乳香、醋没药、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、水蛭、全蝎等16味中药直接散粉制药而得，其功能主治益气活血，化瘀通络。用于气虚血滞、脉络痹阻所致中风，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短，脑梗塞、冠心病心绞痛的治疗。
水蛭作为脑心通胶囊的臣药之一，功能主治破血通经，逐瘀消癥。用于血瘀经闭，癥瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤。据2015年版《中国药典》(一部)记载，水蛭(Hirudo)来源为水蛭科动物蚂蝗(宽体金线蛭)Whitmania pigra Whitman、水蛭(日本医蛭)Hirudonipponica Whitman或柳叶蚂蝗(尖细金线蛭)Whitmania acranulata Whitman的干燥全体。
随着野生水蛭资源日渐萎缩，目前市场上流通的水蛭商品多以人工养殖为主，而其中宽体金线蛭和伪品菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)是主要养殖对象。因此，在现今的药材市场上，水蛭的来源相对清晰，基本上以蚂蝗(宽体金线蛭)为主，有少量的水蛭(日本医蛭)，柳叶蚂蝗(尖细金线蛭)较为罕见；伪品中则以菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis Lesson)较为常见。传统的水蛭鉴别主要以基原、性状、显微和薄层鉴别为主，专属性和特异性都不强；特别地，当药材加工切断或粉碎制成中药制剂后，性状特征消失，传统的鉴别方法难以满足实际工作需求。就脑心通胶囊而言，目前尚未有研究报道该胶囊中水蛭的有效鉴别方法，2015年版《中国药典》(一部)中也未对脑心通胶囊中水蛭的质量控制进行规定。
因此，在尚不能明确其他蛭类物种能否应用于临床的情况下，急需建立准确、方便、通用的鉴定方法来确保水蛭药材的正品基原，加强对脑心通胶囊的监管与质量控制，以保证临床用药安全。
随着分子生物学领域的迅速发展，DNA条形码分子鉴定技术应运而生，被广泛应用于市售中药材的鉴定。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，在动物类中药材中采用线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为主体序列，ITS2为辅助序列。近年来，国内许多研究者探讨了应用COⅠ、ITS、ITS2、12S rRNA和16S rRNA等基因序列对蛭类动物进行分类鉴别的可能性，结果表明上述基因可以在不同程度上有效鉴定蛭类动物，以判定水蛭药材的正伪。
但上述研究多以通用引物对药材DNA进行PCR，扩增的目的产物片段大小在350～700bp左右。然而，就脑心通胶囊而言，在水蛭药材的制作(晒干)、加工(粉碎)和保存过程中不免发生DNA的降解，基因裂解为小片段，不能被上述通用引物扩增出来；此外，除水蛭外，脑心通胶囊中还含有地龙和全蝎两种动物药，也可以被上述通用引物扩增出与水蛭相似大小的基因片段。因此，设计能扩增出小片段基因的水蛭特异性引物，对于脑心通胶囊中基原正品的鉴定显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对在中药制剂脑心通制剂中水蛭形态特征缺失，缺乏科学鉴定手段的现状，提供一种科学、准确、有效的分子生物学鉴定方法，该方法包括以下步骤：
1、脑心通制剂总DNA的提取：先用蛋白酶K消化动物组分，再按照广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物药组分，得总DNA提取物；
2、PCR扩增：以步骤1所得总DNA提取物作为模板，进行PCR扩增；反应体系为15μL，其中总DNA模板0.5μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl2溶液1.5μL，2.5mM dNTPs 1.2μL，特异性引物为10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH2O 8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述特异性引物包括3个引物对，序列如下：
COI WP F1/R2序列：COI WP F1：5’-TTGGTGGGTTTGGTAATTGAC-3’，COI WP R2：5’-GATGGGCCTGAATGAGATACG-3’，扩增片段长度为202bp；
COI WP F2/R2序列：COI WP F2：5’-TGGGTTTGGTAATTGACTC-3’，COI WP R2：5’-GATGGGCCTGAATGAGATACG-3’，扩增片段长度为198bp；
COI HN F1/R2序列：COI HN F1：5’-GCCATTAATAGTTGGAGCAG-3’，COI HN R2：5’-CGGATATAATGTTCATCCAGC-3’，扩增片段长度为142bp；
3、琼脂糖凝胶电泳检测及测序：取5μL步骤2所得的PCR产物与1μL 6×RNA/DNALoading buffer混合，于1.5％琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳20-30min后，得到单一明亮条带，切胶纯化后测序；
4、鉴定：步骤3中测得的序列去引物和除低质量区域后，将获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行对比，相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种；
步骤1中蛋白酶K消化动物组分的操作步骤具体可为：取约50mg脑心通制剂内容物细粉，加入400μL缓冲液AP1和浓度为20mg/mL的20μL蛋白酶K，涡旋振荡，充分混匀后置55℃水浴过夜。
所述步骤1中的10×PCR缓冲液的组成包括：PH值为8.8，750mM Tris；200mM(NH4)2SO4；15mM MgCl2；0.1％(v/v)Tween 20。
所述步骤2中DNA的浓度优选为50.00±0.50ng/μL。
所述步骤3中，COI WP F1/R2和COI WP F2/R2引物对是针对水蛭Haemopidae科设计的特异性引物，包括蚂蝗Whitmania pigra Whitman和柳叶蚂蝗Whitmania acranulataWhitman；COI HN F1/R2引物对是针对水蛭Hirudinidae科设计的特异性引物，包括水蛭Hirudo nipponica Whitman。
所述步骤4的鉴定具体方法为：对于同一待鉴定样品，同时满足以下2个条件才可鉴定为含有水蛭正品；
(1)在琼脂糖凝胶检测时，待测样品出现与3对水蛭特异性引物对中任意一对的目的条带大小一致的条带；
(2)该条带纯化测序后进行BLAST，与其相似性最高的序列对应的物种需与将其扩增出条带的引物对对应的物种一致。
本发明所述脑心通制剂是指以脑心通胶囊处方为基础，按中医理论加减所得处方而制成的任何适用于临床应用的剂型。
本发明所述脑心通制剂优选胶囊剂。
本发明所使用的水蛭特异性引物可扩增140～200bp的小片段基因，能针对经粉碎制成的含水蛭中药制剂，特别是脑心通胶囊进行鉴定，不受水蛭的外在形态限制，避免了DNA降解造成的影响，具有专属性强，准确通用的特点。本发明在脑心通胶囊中的应用，填补了该胶囊在水蛭的质量控制方面的空白，进一步提高了该胶囊的质量控制水平，保证临床用药安全。
附图说明
图1是引物COI WP F1/R2对水蛭药材进行PCR的产物电泳检测图。
图2是引物COI WP F2/R2对水蛭药材进行PCR的产物电泳检测图。
图3是引物COI HN F1/R2对水蛭药材进行PCR的产物电泳检测图。
图4是引物COI WP F1/R2对脑心通胶囊进行PCR的产物电泳检测图。
图5是引物COI WP F2/R2对脑心通胶囊进行PCR的产物电泳检测图。
图6是引物COI HN F1/R2对脑心通胶囊进行PCR的产物电泳检测图。
图7是引物COI WP F1/R2所扩增的脑心通胶囊序列对比图(图中WP为宽体金线蛭Whitmania pigra)。
图8是引物COI WP F2/R2所扩增的脑心通胶囊序列对比图(图中WP为宽体金线蛭Whitmania pigra)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1一种水蛭药材的DNA分子鉴别方法
1.实验样品
实施例中所用水蛭实验样品如表1所示，表中各样品的鉴定是通过使用COⅠ通用引物HCO2198/LCO1490(HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)进行PCR扩增、测序后，进行BLAST，与待测序列相似性最高的序列对应的物种即为待测样品最接近的物种。
表1市售水蛭商品来源表
2.待鉴别水蛭的总DNA提取
取水蛭药材20～50mg于灭菌后的1.5mL离心管中，用消毒后的小剪刀将水蛭组织剪碎，使用组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒(Biomed,Beijing,China)提取总DNA，具体操作参见试剂盒说明书。按此方法提取获得22批水蛭药材的总DNA，存于-20℃。
3.水蛭特异性引物的设计
在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GenBank数据库中下载水蛭正品所属的2个科(Haemopidae科和Hirudinidae科)下各物种的COⅠ片段，其中Haemopidae科共计17条，Hirudinidae科共计47条，登录号见表2、3。运用BioEdit v7.0.4软件对这些序列进行排序、比对、分析后，基于水蛭正品与伪品之间的种间差异，分别设计了针对Haemopidae科和Hirudinidae科的水蛭特异性引物，其序列如表4所示。由北京六合华大基因科技有限公司(广州分公司)合成。
表2 GenBank中水蛭Haemopidae科下各物种的COI序列列表
表3 GenBank中水蛭Hirudinidae科下各物种的COI序列列表
表4水蛭Haemopidae科和Hirudinidae科的特异性引物
4.PCR扩增
以待测样品的基因组DNA作为模板，采用步骤3设计合成的三对水蛭特异性引物对按照如下分别进行PCR扩增：
反应体系为15μL，其中0.5μL待鉴定的DNA模板，1.5μL 10×PCR缓冲液(750mMTris(pH 8.8)，200mM(NH4)2SO4，15mM MgCl2，0.1％(v/v)Tween 20)，1.5μL 25mM MgCl2溶液，1.2μL 2.5mM dNTPs(Biomed,Beijing,China)，10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH2O 8.7μL；同时设置以ddH2O为模板作为阴性对照。PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min。
5.琼脂糖凝胶检测与测序
以琼脂糖制备凝胶，并加入SYBRTM Safe DNA gel stain(ThermoFisherScientific,US)染色。取5μL步骤4所得的PCR产物与1μL 6×RNA/DNA Loading buffer(Biomed,Beijing,China)混合，于1.5％琼脂糖凝胶上进行点样，DNA Marker为GeneRuler100bp DNA Ladder(ThermoFisher Scientific,US)。120V条件下电泳20～30min后，置凝胶成像系统观察，结果如图1～3所示，图1～3中，“M”为DNA Marker(GeneRuler 100bp DNALadder)；“H1～H22”为22批水蛭药材；“N”为空白对照。得到的单一明亮条带，切胶后经多功能DNA纯化回收试剂盒(Biomed,Beijing,China)纯化后送北京六合华大基因科技有限公司(广州分公司)测序。
6.鉴定及结果
步骤5中测得的序列去除低质量区域后，将获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。
结果显示，(1)引物COI WP F1/R2和COI WP F2/R2可以特异性地扩增Haemopidae科的水蛭正品蚂蝗(宽体金线蛭)的基因，而不能将Hirudinidae科的水蛭正品以及伪品进行扩增；(2)引物COI HN F1/R2可以特异性地扩增Hirudinidae科的水蛭正品水蛭(日本医蛭)，而不能将Haemopidae科的水蛭正品以及伪品进行扩增。
实施例2一种脑心通胶囊中水蛭药材的DNA分子鉴别方法
1.实验样品
脑心通胶囊9批(批号：171275、171278、1712103、1712104、1712105、180478、180585、180655、180721)，均来自于陕西步长制药有限公司，分别编号NXT-1～9。
2.待鉴别脑心通胶囊的总DNA提取方法
采用广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(Biomed,Beijing,China)提取胶囊中的植物药组分，并在过程中加入蛋白酶K用来消化胶囊中的动物药组分。具体步骤为：取约50mg脑心通胶囊细粉到一个1.5mL灭菌离心管，加入400μL缓冲液AP1和20μL蛋白酶K(20mg/mL,Biomed,China)，涡旋振荡，充分混匀后置55℃水浴过夜；接下来的步骤与试剂盒说明书步骤一致。
取9批脑心通胶囊及缺水蛭的脑心通胶囊阴性对照(编号T4841)按上述方法提取总DNA，用超微量紫外/可见光分光光度计NanoDrop 2000c(Thermo Scientific,US)测得核酸浓度，保存于-20℃。
3.PCR扩增、产物检测与测序
将上述9批脑心通胶囊及缺水蛭的脑心通胶囊阴性对照(编号T4841)的DNA稀释到浓度为49.50～50.50ng/μL，以此为DNA模板，根据实施例1所述水蛭药材的DNA分子鉴别方法步骤4～5进行PCR扩增、产物琼脂糖凝胶检测、测序，以ddH2O为模板的作为空白对照。获得3对水蛭特异性引物对9批脑心通胶囊进行扩增的产物琼脂糖凝胶图，如图4～6所示，图4～6中，“M”为DNA Marker(GeneRuler 100bp DNA Ladder)；“N1～N9”为9批脑心通胶囊；“N”为空白对照；“T41”为缺水蛭的脑心通胶囊阴性对照。
4.鉴定及结果
根据实施例1中步骤6所述鉴定方法对上述9批脑心通胶囊中是否存在水蛭正品进行判定，得到水蛭特异性引物对脑心通胶囊进行扩增的产物序列对比如图7、8所示。
从图4～8可知，仅引物COI WP F1/R2和COI WP F2/R2可以在9批脑心通胶囊中扩增出条带，且测序结果经BLAST后显示这9批胶囊中所含水蛭与水蛭正品蚂蝗(宽体金线蛭)Whitmania pigra Whitman(GenBank登录号EU304459.1)相似度达98％以上，可判定这9批胶囊中含有水蛭正品蚂蝗(宽体金线蛭)；而引物COI HN F1/R2没有扩增出条带，说明这9批胶囊中不含水蛭正品日本医蛭。
序列表中序列编号与序列名称对应如下表5所示：
表5
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种脑心通胶囊中水蛭药材的DNA分子鉴别方法
<130> 2019
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttggtgggtt tggtaattga c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgggcctg aatgagatac g 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgggtttggt aattgactc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccattaata gttggagcag 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggatataat gttcatccag c 21
<210> 6
<211> 202
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 6
ttggtgggtt tggtaattga ctcctaccat taatggtagg ggccgtagat atatcgtttc 60
ctcgtctgaa taacttaaga ttttggttac tacccccttc aataatcata ttgcttaggt 120
catccttaat tgagggtggt gtaggtgcag ggtgaaccct ttatcctcca ctatcagact 180
ccgtatctca ttcaggccca tc 202
<210> 7
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 7
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcccccac tatcagactc 160
<210> 8
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 8
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcccccac tatcagactc 160
<210> 9
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 9
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcccccac tatcagactc 160
<210> 10
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 10
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcctccac tatcagactc 160
<210> 11
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 11
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcctccac tatcagactc 160
<210> 12
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 12
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcccccac tatcagactc 160
<210> 13
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 13
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcctccac tatcagactc 160
<210> 14
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 14
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcctccac tatcagactc 160
<210> 15
<211> 160
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 15
tcctaccatt aatggtaggg gccgtagata tatcatttcc tcgtctgaat aatttaagat 60
tttggttact acccccttca ataatcatat tgcttaggtc atccttaatt gagggtggtg 120
taggtgcagg gtgaaccctt tatcctccac tatcagactc 160
<210> 16
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 16
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 17
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 17
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 18
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 18
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 19
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 19
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 20
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 20
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 21
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 21
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 22
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 22
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 23
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 23
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
<210> 24
<211> 158
<212> DNA
<213> 宽体金线蛭（Whitmania pigra）
<400> 24
ctaccattaa tggtaggggc cgtagatata tcatttcctc gtctgaataa tttaagattt 60
tggttactac ccccttcaat aatcatattg cttaggtcat ccttaattga gggtggtgta 120
ggtgcagggt gaacccttta tcctccacta tcagactc 158
Claims (7)
1.一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)脑心通制剂总DNA的提取：先用蛋白酶K消化动物组分，再按照广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分，得总DNA提取物；
(2)PCR扩增：以步骤(1)所得总DNA提取物作为模板，进行PCR扩增；反应体系为15μL，其中总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl2溶液1.5μL，2.5mM dNTPs1.2μL，特异性引物为10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH2O8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述特异性引物包括3个引物对，序列如下：
COI WP F1/R2序列：COI WP F1：5’-TTGGTGGGTTTGGTAATTGAC-3’，COI WP R2：5’-GATGGGCCTGAATGAGATACG-3’，扩增片段长度为202bp；
COI WP F2/R2序列：COI WP F2：5’-TGGGTTTGGTAATTGACTC-3’，COI WP R2：5’-GATGGGCCTGAATGAGATACG-3’，扩增片段长度为198bp；
COI HN F1/R2序列：COI HN F1：5’-GCCATTAATAGTTGGAGCAG-3’，COI HN R2：5’-CGGATATAATGTTCATCCAGC-3’，扩增片段长度为142bp；
(3)电泳检测及测序：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳20-30min后，得单一明亮条带，纯化后测序；
(4)鉴定：步骤(3)中测得序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行对比，相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中蛋白酶K消化动物组分的步骤为：取脑心通制剂细粉，加缓冲液AP1和蛋白酶K，涡旋振荡，充分混匀后置55℃水浴过夜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的10×PCR缓冲液的组成包括：750mM Tris，PH值为8.8；200mM(NH4)2SO4；15mM MgCl2；0.1％(v/v)Tween20。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，COI WP F1/R2和COI WPF2/R2引物对是针对水蛭Haemopidae科设计的特异性引物，包括蚂蝗Whitmania pigraWhitman和柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman；COI HN F1/R2引物对是针对水蛭Hirudinidae科设计的特异性引物，包括水蛭Hirudo nipponica Whitman。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)的鉴定具体方法为：对于同一待鉴定样品，同时满足以下2个条件才可鉴定为含有水蛭正品；
(1)在电泳检测时，待测样品出现与3对水蛭特异性引物对中任意一对的目的条带大小一致的条带；
(2)测序后进行BLAST，与其相似性最高的序列对应的物种需与将其扩增出条带的引物对对应的物种一致。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于：所述水蛭为2015年《中国药典》(一部)收载的蚂蝗Whitmania pigra Whitman；或柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman；或水蛭Hirudo nipponica Whitman。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的脑心通制剂为脑心通胶囊。
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