CN110863057B

CN110863057B - 一种引物对及其在鉴定宽体金线蛭中的应用

Info

Publication number: CN110863057B
Application number: CN201911220903.XA
Authority: CN
Inventors: 李振国; 田晓轩; 王文秀; 张环宇; 倪开岭; 郝明; 张孝晨; 张立强; 贾力夫; 王丹丹; 何子龙
Original assignee: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd; Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd; Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: CN110863057A

Abstract

本发明实施例提供了一种引物对，使用所述引物对鉴定宽体金线蛭的方法，以及用于鉴定宽体金线蛭的试剂盒。采用本发明实施例提供的引物对及方法，能够特异性扩增宽体金线蛭中的DNA片段，从而能够用于准确鉴别宽体金线蛭。

Description

一种引物对及其在鉴定宽体金线蛭中的应用

技术领域

本发明涉及宽体金线蛭鉴定技术领域，特别是涉及一种引物对及其在鉴定宽体金线蛭中的应用。

背景技术

水蛭包括蚂蟥Whitmania Pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳叶蚂蟥Whitmania acranutata Whitman。水蛭是一种常用的中药材，近年来，水蛭作为原料药被大量用于中药制剂的开发，导致水蛭中药材价格上涨。目前市场中主要流通品种为蚂蟥，又名宽体金线蛭，为药用优良品种，为减少水蛭中药材的掺假销售，亟需一种能够快速准确鉴定宽体金线蛭的方法。

发明内容

本发明的实施例提供了一种引物对，采用所述引物对，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增，通过检测扩增结果可实现对宽体金线蛭的准确鉴定。具体技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明第二方面提供了本发明第一方面的引物对在鉴定宽体金线蛭中的用途。

本发明第三方面提供了一种利用PCR扩增技术鉴定宽体金线蛭的方法，采用本发明第一方面所提供的引物对。

在本发明第三方面的一些实施方式中，利用PCR扩增技术鉴定宽体金线蛭的方法包括以下步骤：

1)分别提取待测样品的总DNA；

2)采用所述引物对，分别以各待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；扩增结果为阳性的待测样品为宽体金线蛭。

在本发明第三方面的一些实施方式中，每25μL PCR扩增体系中包括：

在本发明第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增的条件为：

预变性95℃5分钟；变性95℃5s，退火55℃15s，延伸68℃10s，30个循环；完成循环后继续68℃延伸10分钟。

在本发明第三方面的一些实施方式中，采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测。

本发明第四方面提供了一种用于鉴定宽体金线蛭的试剂盒，所述试剂盒中包本发明第一方面所提供的引物对。

在本发明第四方面的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、DEPC水、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。

采用本发明实施例提供的引物对，能够特异性扩增宽体金线蛭中的DNA片段，从而能够用于准确鉴别宽体金线蛭。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为采用本发明引物对，对待测样品进行PCR扩增的凝胶电泳结果图；

图2为采用本发明引物对,以不同浓度的总DNA为模板进行PCR扩增的凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明第一方面提供了一种引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物的序列为5’-TGGAGACGACCAATTG-3’(SEQ ID NO:1)，反向引物的序列为5’-CAGACGAGGAAACGAT-3’(SEQ ID NO:2)。

其中，正向引物命名为sz97F，反向引物命名为sz244R；本发明的引物对是一种利用宽体金线蛭的SNP位点设计的特异性引物对，采用所述引物对，利用PCR技术，可以特异性地扩增在所述SNP位点具有某种特异性点突变的DNA片段。

本发明第二方面提供了本发明第一方面的引物对在鉴定宽体金线蛭中的用途。由于所述引物对能够特异性扩增含有宽体金线蛭特有的点突变的DNA片段，因此可用于特异性鉴定宽体金线蛭。

1)分别提取待测样品的总DNA；

所述待测样品可以理解为有待鉴定的水蛭组织样品，例如水蛭的肌肉组织，在本发明第四方面的一些实施方式中，提取待测样品的总DNA后，对总DNA的浓度进行测定，例如采用Nanodrop2000微量核酸定量分析仪对总DNA浓度进行测定，并根据吸光度A260/A280，A260/A230的值判断其DNA纯度，此为本领域常用技术手段，本发明在此不做限定。

所述“阳性”结果可以理解为扩增结果可检测到，例如采用琼脂糖凝胶电泳检测，可观察的到条带，无条带即为阴性结果；采用核酸荧光染料染色，在紫外光下可观察到荧光即为阳性结果。在本发明第三方面的一些实施方式中，采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测。采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测具有很高的灵敏度，因此对引物的特异性具有很高的要求，否则可能会出现假阳性结果；正是由于本申请的引物对对宽体金线蛭具有高度特异性，因此结合核酸荧光染料检测能够快速准确地鉴定宽体金线蛭。所述核酸荧光染料为本领域常用试剂，例如SYBR Green I核酸染料，阳性结果在紫外光下呈绿色，阴性结果为橙色；本领域技术人员也可根据实际情况选择其他核酸荧光染料，本发明在此不做限定。

余量以DEPC水补齐，此为本领域常用技术手段，本发明在此不做赘述。

本发明中所采用的DNA聚合酶具有扩增速度快，高保真的特性，例如SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶，本领域技术人员可根据实际需要具体选择，本发明在此不做限定。

需要说明的是，本发明中所使用的特异性引物sz97F和sz244R由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR体系中除模板和引物之外的试剂以及琼脂糖凝胶电泳所需的试剂均市售可得，此为本领域常规试剂，本发明在此不做限定。

实施例

一、试剂

COⅠ通用引物LCO1490和HCO2198以及特异性引物sz97F和sz244R由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(TaKaRa，批号RR070A)；10×FastBuffer I(TaKaRa公司)；dNTP Mixture(即dNTPs)(TaKaRa公司)；DEPC水(Biosharp)；琼脂糖(Lonza)；无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)；6×Loading Buffer(TaKaRa公司)；10000×SYBR GreenI核酸染料(北京索莱宝科技有限公司)；DuRed核酸染料(北京泛博生物化学有限公司)；D2000 DNAMarker(北京天根生化科技有限公司)；TAE(50×)(合肥志宏生物技术有限公司)；Tks Gflex DNA聚合酶以及2×Gflex PCRBuffer(2×Gflex PCRBuffer中包含dNTPs)(TaKaRa)。

二待测样品物种鉴定

1、采集不同产地的水蛭样品20份(即待测样品)，如表1所示。

表1

2、待测样品肌肉组织提取

剪取各水蛭样品(待测样品)肌肉组织约30mg，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304-03)说明书提取总DNA，采用Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪测定DNA浓度约为100ng/μL，并吸光度A260/A280≥1.8，A260/A230＞2.0，-20℃保存备用。

3、待测样品COⅠDNA片段获取

采用COⅠ通用引物LCO1490和HCO2198，分别以各待测样品总DNA为模板，进行PCR扩增，其中，LCO1490核苷酸序列为5’-GGTCAACAAATCATAAAGATA TTGG-3’(SEQ ID No:3)；HCO2198核苷酸序列为5’-TAAACTTCAGGGTGACC AAAAAATCA-3’(SEQ ID No:4)。

扩增体系为：

扩增条件为：预变性98℃1分钟；变性98℃10s，退火52℃15s，延伸68℃30s，40个循环；完成循环后继续68℃延伸5分钟，获得待测样品COⅠDNA片段，产物长度658bp。

4、通过Sanger测序对待测样品进行鉴定

对引物LCO1490和HCO2198扩增后的产物，进行Sanger测序，测序工作由北京华大基因完成。测序结果在NCBI上进行Blast鉴定物种，鉴定结果见表2。

表2

5、采用本发明引物对对待测样品进行鉴定

分别以提取的待测样品总DNA片段为模板，采用本申请的引物对对其进行PCR扩增，扩增体系为：

扩增条件为：预变性95℃5分钟；变性95℃5s，退火55℃15s，延伸68℃10s，30个循环；完成循环后继续68℃延伸10分钟。

反应产物中加入6×Loading buffer 5μL(Takara公司)，混匀后于DURed核酸染料染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，经凝胶成像系统成像，结果如图1所示。图1中marker为分子量标记物，N为阴性对照(DEPC水)，其他标号与样品编号一致。标号K1、K2、AH1、AH2、AH3、HB1、HB2、K3、SD1、SD2、SD3、HN1、HN2、JS所对应的样品可观察到条带，即为阳性结果，说明这些样品编号对应的待测样品为宽体金线蛭，此结果与Sanger测序结果一致，说明本发明的引物对能够准确鉴定宽体金线蛭。

实施例三引物灵敏度考察

模板DNA的浓度是特异性PCR扩增中重要的影响因素，模板浓度低则对引物灵敏度要求高。本实施例针对待测样品K1，通过改变反应体系中DNA模板的用量，考察本发明的引物对的灵敏度。调整DNA模板用量分别为25ng，5ng，1ng，0.2ng，采用本发明的引物对及扩增体系进行PCR反应。PCR反应条件与实施例二中相同；PCR扩增结果见图2。从结果中可以看出，模板DNA用量在25-0.2ng时均能扩增出条带，证明本发明的引物对可适用于较宽范围的模板用量，0.2ng模板仍能扩增出条带，说明本发明的引物对具有较高的灵敏度。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 牡丹江友搏药业有限责任公司

天津中医药大学

<120> 一种引物对及其在鉴定宽体金线蛭中的应用

<130> PP192836

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggagacgac caattg 16

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagacgagga aacgat 16

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims

1.一种引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ IDNO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的引物对在鉴定宽体金线蛭中的用途。

3.一种利用PCR扩增技术鉴定宽体金线蛭的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物对。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别提取待测样品的总DNA；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，每25μLPCR扩增体系中包括：

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增的条件为：

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测。

8.一种用于鉴定宽体金线蛭的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1所述的引物对。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、DEPC水、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。