CN109680071A

CN109680071A - 鉴别水蛭品种的成套引物及方法

Info

Publication number: CN109680071A
Application number: CN201811449821.8A
Authority: CN
Inventors: 郑健; 刘杰; 过立农; 高妍; 昝珂; 李文静; 李丽潇; 黄涛宏
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN109680071B

Abstract

本发明公开了一种鉴别水蛭品种的成套引物及方法。采用该成套引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果，判断所述待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭、日本医蛭或菲牛蛭这些水蛭品种，有效得将其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

Description

鉴别水蛭品种的成套引物及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及鉴别水蛭品种的成套引物及方法。

背景技术

水蛭(HIRUDO)别名马蛭、麻黄蜞、马蟥，属环节动物门蛭纲医蛭形亚目医蛭科。《神农本草经》记载：“水蛭主逐恶血、瘀血，月闭、破血瘕积聚……”，作为中药,迄今已有3000多年的历史。现代中医学认为水蛭属活血化瘀药下属分类的活血调经药，可以抑制血小板的释放、降低血脂、抑制成纤维细胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌症细胞转移与增值等。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关，其中最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素(Hirudin)，它是迄今为止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制剂，与胰岛素、青蒿素被称为拯救人类疾病的“世界三素”，具有极高的药用价值。

2015版《药典》规定用于药用的水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman(即宽体金线蛭)、水蛭Hirudo nippponica whitman(即日本医蛭)或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman(即尖细金线蛭)。值得注意的是，世界上的水蛭有500多种，我国有97种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。发明人对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查发现，中药水蛭的资源极度紧缺；同时，水蛭的生产和贸易缺乏行业规范，来源混乱，存在着严重的相似品种水蛭品种混淆用药问题。不同品种、疗效有差异的水蛭品种混用影响水蛭中药材质量，也给临床用药带来极大的安全隐患。为了临床用药安全、准确和有效，针对外形相近的不同中药材品种建立一种有效准确的鉴定方法成为已经成为迫在眉睫的需求。

随着分子生物学迅速发展，DNA水平上的多样性研究取得突破性进展，用于药用的动植物的分子鉴定技术也日渐完善。肖凌等(水蛭DNA鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究，湖北中医药大学，2015年)扩增得到宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、棒纹牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8个物种的ITS2、COⅠ、12Sr RNA、16Sr RNA等基因片断的序列，比较此4个基因片断候选序列种内种间差异；得到12Sr RNA为医用蛭类较为合适的DNA条形码序列。

目前对水蛭品种的鉴定选用的主要为COI和LEP两对引物，其中引物COI在动物类品种的鉴定中比较常用，由于水蛭营寄生生活，多以吸食其他动物血液为生，因此将COI引物用于水蛭样品的鉴定时，通常测序结果会出现双峰、套峰，导致测序成功率低；引物LEP是针对水蛭类品种鉴定用的，在对水蛭品种进行鉴定时可以避免污染，但仍需要对序列结果进行比对分析。由于COI和LEP两对引物的鉴定均涉及扩增产物的测序和序列的比对分析，操作周期长，同时要求操作人具有对测序结果进行序列比对分析的能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供鉴别水蛭品种的成套引物及方法，一次性将宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

本发明首先提供鉴别水蛭品种的成套引物，包括宽体金线蛭的特异性引物对KT、菲牛蛭的特异性引物对FN、日本医蛭的特异性引物对RY中的两对引物对或者三对引物对；所述引物对KT由引物KT-5’和引物KT-3’组成，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(TATGTATTGAAAGGGTATTCAATCG)和序列2(TTAAGAATGATCATCAGTATATAGTG)，；所述引物对FN由引物FN-5’和引物FN-3’组成，所述引物FN-5’和所述引物FN-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列3(GTAATTAGAATCGTAATAGCTC)和序列4(CATAATTGAATATACATTTACAGCAGAA)；所述引物对RY由引物RY-5’和引物RY-3’组成，所述引物RY-5’和所述引物RY-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列5(CCAGCTATATCATTAAGTCAAT)和序列6(CTTAATGGAGTATTTTGAATT)。

上述用于鉴别水蛭品种的成套引物中，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’的摩尔比可为1:1；所述引物FN-5’和所述引物FN-3’的摩尔比可为1:1；所述引物RY-5’和所述引物RY-3’的摩尔比可为1:1。

上述用于鉴别水蛭品种的成套引物的应用，为如下a)-f)中任一种：

a)制备用于检测或辅助检测水蛭品种的试剂盒；

b)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有对应的水蛭品种；

c)制备用于鉴定或辅助鉴定水蛭品种的试剂盒；

d)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为对应的水蛭品种；

e)制备用于鉴定或辅助鉴定市售水蛭品种的真伪性的试剂盒；

f)鉴定或辅助鉴定市售水蛭品种的真伪性。

本发明还提供了用于鉴定水蛭品种的试剂盒。本发明所提供的用于鉴定水蛭品种的试剂盒含有本发明所述用于鉴别水蛭品种的成套引物。其中，它还包括Taq DNA聚合酶、dNTP\反应缓冲液或水等。

上述用于鉴定水蛭品种的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。上述用于鉴定水蛭品种的试剂盒的应用可为如下b1)或b2)或b3)：

b1)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有对应的水蛭品种；

b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为对应的水蛭品种；

b3)鉴定或辅助鉴定市售水蛭品种的真伪性。

本发明还提供了一种检测待测样品是否含有或候选含有对应的水蛭品种的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的总DNA作为模板，采用上述用于鉴定水蛭品种的成套引物(或试剂盒)进行PCR扩增，根据是否实现有效扩增以及扩增产物中的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有对应的水蛭品种。

本发明还提供了一种鉴定待测样品是否为或候选为对应的水蛭品种的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用上述用于鉴定水蛭品种的成套引物(或试剂盒)进行PCR扩增，根据是否实现有效扩增以及扩增产物中的DNA片段，则所述待测样品中是否候选为对应的水蛭品种。

本发明还提供了一种鉴定市售水蛭品种的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市售水蛭的基因组DNA作为模板，采用上述用于鉴定水蛭品种的成套引物(或试剂盒)进行PCR扩增，根据是否实现有效扩增以及扩增产物中的DNA片段，判断则所述市售水蛭品种的真伪性。

上述任一所述方法中，所述扩增产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭；所述扩增产物中含有100-200bp的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有菲牛蛭；所述扩增产物中含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有日本医蛭。

上述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度具体可为55℃。

上述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35～38个循环；72℃延伸5min。

上述方法中，进行所述PCR扩增时，所述PCR扩增的体系可为：总体积为20μl时，SYBR Premix Ex Taq II 10μl，各引物用量均为0.4μl(其中，引物对KT浓度为0.2μM，引物对RY浓度为0.2μM，引物对FN浓度为0.4μM)，模板1μl(10-30ng)，灭菌蒸馏水补齐20μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

首先，本发明涉及三对新的引物对，所述引物对特异性良好，可以用于快速、准确的鉴别水蛭品种真伪。每对引物都是针对目标物种响应而不对其它品种产生非特异性反应。例如，本发明所述的引物KT-5’和KT-3’，特别是所述上游引物3’端的第1个碱基g和第2碱基c，该碱基的引入避免了假阳性检测结果的出现，增加了引物的特异性，同时提高了所述引物的检测准确度；所述的引物RY-5’与RY-3’均选择了两位连续突变的位点作为特异性引物的3’端产生连续两位错配，极大程度的减弱了特异性引物潜在非特异性的可能；所述的引物FN-5’与FN-3’针对菲牛蛭与宽体金线蛭、日本医蛭的SNP位点进行设计，是菲牛蛭的专属特异性引物，不能与宽体金线蛭、日本医蛭的DNA模板产生非特异性扩增。

第二，本发明涉及一种一次性鉴别多种水蛭品种的方法，所述方法利用成套引物进行三重PCR，用于三重PCR的引物之间不相互结合，也不与目标以外的DNA片段产生非特异性反应，并且不同物种扩增得到的PCR产物可以明显区分。本发明针对市场上的主流品种宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭分别设计特异性引物，并建立能够一次性鉴定宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭三个水蛭品种的多重PCR方法，且只需要对扩增产物进行电泳检测，不需要对扩增产物进行测序及后续的数据分析，缩短操作周期，降低判定难度，实验结果重现性强，应用性强。

再者，本发明还涉及一种高分辨的DNA检测方法，结合微芯片电泳(岛津公司，MultiNA)进行直接检测，实现了对水蛭药材的快速检测。相比药典中规定的对PCR扩增产物进行检测的琼脂糖凝胶电泳方法，此方灵敏度好、分辨率高、分析成本低、操作简便，可快速实现中药材品种的鉴别。

附图说明

图1多重PCR体系下的成套引物考察凝胶图；左侧：DNA Marker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-水，空白对照；2-宽体+日医；3-宽体+菲牛；4-菲牛+日医；5-宽体+菲牛+日医；引物：本发明所述用于鉴别水蛭品种的成套引物，包括宽体金线蛭的特异性引物对KT、菲牛蛭的特异性引物对FN、日本医蛭的特异性引物对RY。

图2(a)-(d)为图1对应的电泳图。模板：宽体金线蛭与日本医蛭混合模板(a)、菲牛蛭与日本医蛭混合模板(b)、宽体金线蛭与菲牛蛭混合模板(c)、三种水蛭混合模板(d)，引物：本发明所述用于鉴别水蛭品种的成套引物，包括宽体金线蛭的特异性引物对KT、菲牛蛭的特异性引物对FN、日本医蛭的特异性引物对RY。

图3为不同批次水蛭多重PCR鉴别电泳图；左侧L：DNA Marker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-8为不同批次的水蛭样品，详见表1；引物：本发明所述用于鉴别水蛭品种的成套引物，包括宽体金线蛭的特异性引物对KT、菲牛蛭的特异性引物对FN、日本医蛭的特异性引物对RY。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，所涉及主要仪器和试剂如下：微芯片电泳(岛津公司MultiNNAMCE-202)，PCR仪(岛津公司)，紫外-分光光度仪(岛津公司Biospec-nano)，高速离心机(Eppendort 5418)；DAN聚合酶(SYBR Premix Ex Taq II，宝生物RR820)，DNA染料(Gold Nucleic Acid Gel Stain，美国英杰生命技术有限公司S-11494)，微芯片电泳试剂盒(DNA-500Reagent Kit for MultiNA，岛津公司292-27910-91)，DNA分子量标准(25bp DNALadder，美国英杰生命技术有限公司10597-011)，基因组DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit，QIAGEN 69504)。

下述实施例中，所涉及药材样品包括日本医蛭、宽体金线蛭、菲牛蛭以及市面上八种不同批次的水蛭药材。

下述实施例中，日本医蛭、宽体金线蛭、菲牛蛭可分别简称为日医、宽体、菲牛。

实施例1

用于鉴别水蛭品种的成套引物，包括宽体金线蛭的特异性引物对KT、菲牛蛭的特异性引物对FN、日本医蛭的特异性引物对RY，共三对引物对；所述引物对KT由引物KT-5’和引物KT-3’组成，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(TATGTATTGAAAGGGTATTCAATCG)和序列2(TTAAGAATGATCATCAGTATATAGTG)，；所述引物对FN由引物FN-5’和引物FN-3’组成，所述引物FN-5’和所述引物FN-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列3(GTAATTAGAATCGTAATAGCTC)和序列4(CATAATTGAATATACATTTACAGCAGAA)；所述引物对RY由引物RY-5’和引物RY-3’组成，所述引物RY-5’和所述引物RY-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列5(CCAGCTATATCATTAAGTCAAT)和序列6(CTTAATGGAGTATTTTGAATT)。

采用上述成套引物对鉴别水蛭品种的方法，步骤如下：

(1)基因组DNA提取：水蛭待测样品取30mg，用动物DNA提取试剂盒提取总DNA。按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，-4℃保存；DNA提取物取1μL，采用紫外-分光光度仪验证DNA质量，OD_260/280大于1.6且小于1.8，OD_260/230大于2.0；

本步骤中待测样品(模板)为来源清晰并经过传统方法验证过品种的宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭标准品的混合物，以验证本发明所述成套引物的特异性；其中，待测样品分别以1：水，2：宽体标准品+日医标准品，3：宽体标准品+菲牛标准品，4：菲牛标准品+日医标准品，5：宽体标准品+菲牛标准品+日医标准品，作为模板；

(2)PCR扩增体系的建立与反应：PCR反应体系总体积20μL，其中包括SYBR PremixEx Taq II 10μl，模板1μl(10ng)，引物对KT用量0.4μl(0.2μM)，引物对RY用量0.4μl(0.2μM)，引物对FN用量0.4μl(0.4μM)，无菌双蒸水补充体系至20μL；

PCR反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35～38个循环；72℃延伸5min；4℃保存；

(3)结果检测：PCR扩增反应结束后，取PCR反应产物1μl，微芯片电泳检测，试剂盒选用微芯片电泳500bp试剂盒(DNA-500Reagent Kit for MultiNA)，系统自动生成凝胶图与电泳图，如图1和图2。

如图1和图2所示，宽体金线蛭理论PCR产物为495bp，在凝胶图谱与电泳图谱中，在496bp处有单一条带，MultiNA检测出的片段长度和PCR目标产物基本一直。且以日本医蛭和菲牛蛭、水为模板的扩增产物中400-500bp之间没有条带，证明该成套引物可以特异性的鉴别水蛭混合样品中的宽体金线蛭。

如图1和图2所示，日本医蛭理论PCR产物为228bp，在凝胶图谱与电泳图谱中，在228bp处有单一条带，MultiNA检测出的片段长度和PCR目标产物基本一致。且以宽体金线蛭、菲牛蛭和水为模板的扩增产物中200-500bp之间没有条带，证明该成套引物可以特异性的鉴别水蛭混合样品中的日本医蛭。

如图1和图2所示，菲牛蛭理论PCR产物为333bp，在凝胶图谱与电泳图谱中，在333bp处有单一条带，MultiNA检测出的片段长度和PCR目标产物基本一直。且以日本医蛭、宽体金线蛭和水为模板的扩增产物中200-500bp之间没有条带，证明该成套引物可以特异性的鉴别水蛭混合样品中的菲牛蛭。

因此，该用于鉴别水蛭品种的成套引物可以同时进行三重PCR，而用于三重PCR的引物对之间不相互结合，也不与目标以外的DNA片段产生非特异性反应，并且不同物种扩增得到的PCR产物可以明显区分。因此，该用于鉴别水蛭品种的成套引物通过一次反应可以将混合样品中的宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭品种一次性鉴别。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：分别设置退火温度为50、55、58℃，考察不同退火温度对PCR扩增反应的影响，筛选最适退火温度。

结果显示，温度的升高可提高反应的特异性，但当退火温度高达60℃时，特异性鉴别条带亮度较弱，因此选择55℃为扩增体系的退火温度。

实施例3

采用上述实施例1的反应体系和反应参数，用8种不同批次的水蛭药材对所建立的PCR鉴别体系进行方法适用性验证，样品信息见表1，其中预期结果为经过传统方法验证过的水蛭品种，具体电泳图见图3。

表1不同批次水蛭样品信息

由图3可知，水蛭的不同样本可分别扩增出228、333和495bp的特异性片段，证明本发明成套引物特异性好，适用性强，可对水蛭不同品种进行直观、快速、准确的鉴别。

综上，本发明提供的方法，只通过一次PCR扩增即可准确、快速、可靠地鉴别日本医蛭、菲牛蛭、宽体金线蛭几种易混淆水蛭品种，本发明通过微芯片电泳检测，灵敏度好、分辨率高、分析成本低、操作简便，是中药材和食品品种鉴别有力的分析方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

＜110＞中国食品药品检定研究院

＜120＞鉴别水蛭品种的成套引物及方法

＜160＞6

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>1

tatgtattga aagggtattc aatcg 25

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>2

ttaagaatga tcatcagtat atagtg 26

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>3

gtaattagaa tcgtaatagc tc 22

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>4

cataattgaa tatacattta cagcagaa 28

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>5

ccagctatat cattaagtca at 22

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>6

cttaatggag tattttgaat t 21

Claims

1.鉴别水蛭品种的成套引物，其特征在于包括宽体金线蛭的特异性引物对KT、菲牛蛭的特异性引物对FN、日本医蛭的特异性引物对RY中的两对引物对或者三对引物对；所述引物对KT由引物KT-5’和引物KT-3’组成，所述引物KT-5’和所述引物KT-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(TATGTATTGAAAGGGTATTCAATCG)和序列2(TTAAGAATGATCATCAGTATATAGTG)，；所述引物对FN由引物FN-5’和引物FN-3’组成，所述引物FN-5’和所述引物FN-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列3(GTAATTAGAATCGTAATAGCTC)和序列4(CATAATTGAATATACATTTACAGCAGAA)；所述引物对RY由引物RY-5’和引物RY-3’组成，所述引物RY-5’和所述引物RY-3’均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列5(CCAGCTATATCATTAAGTCAAT)和序列6(CTTAATGGAGTATTTTGAATT)。

2.权利要求1所述的鉴别水蛭品种的成套引物的应用，其特征在于为如下a)-f)中任一种：

a)制备用于检测或辅助检测对应水蛭品种的试剂盒；

c)制备用于鉴定或辅助鉴定对应水蛭品种的试剂盒；

f)鉴定或辅助鉴定市售水蛭品种的真伪性。

3.含有权利要求1所述鉴别水蛭品种的成套引物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于鉴定或者辅助鉴定所述鉴别水蛭品种的成套引物对应的水蛭品种。

4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTP、水或反应缓冲液。

5.权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于为如下b1)或b2)或b3)：

b3)鉴定或辅助鉴定对应市售水蛭品种的真伪性。

6.一种权利要求1所述的鉴别水蛭品种的成套引物的应用方法，其特征在于包括如下步骤：提取待测样品的总DNA作为模板，采用权利要求1所述的鉴别水蛭品种的成套引物进行PCR扩增，根据是否实现有效扩增以及扩增产物中的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有权利要求1所述鉴别水蛭品种的成套引物对应的水蛭品种。

7.一种权利要求1所述的鉴别水蛭品种的成套引物的应用方法，其特征在于包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的鉴别水蛭品种的成套引物进行PCR扩增，根据是否实现有效扩增以及扩增产物中的DNA片段，则所述待测样品是否候选为权利要求1所述鉴别水蛭品种的成套引物对应的水蛭品种。

8.一种权利要求1所述的鉴别水蛭品种的成套引物的应用方法，其特征在于包括如下步骤：提取市售水蛭的基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的鉴别水蛭品种的成套引物进行PCR扩增，根据是否实现有效扩增以及扩增产物中的DNA片段，判断则所述对应市售水蛭品种的真伪性。

9.如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于所述扩增产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有宽体金线蛭；所述扩增产物中含有100-200bp的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有菲牛蛭；所述扩增产物中含有200-300bp的DNA片段，则所述待测样品中是否含有或候选含有日本医蛭。

10.如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35～38个循环；72℃延伸5min；所述PCR扩增的体系可为：总体积为20μl时，SYBR Premix Ex Taq II 10μl，各引物用量均为0.4μl，其中，引物对KT浓度为0.2μM，引物对RY浓度为0.2μM，引物对FN浓度为0.4μM，模板10-30ng，灭菌蒸馏水补齐20μl。