CN103215366A - 基于核酸酶和发夹dna探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法。本发明所述的检测方法是基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增，并利用免疫胶体金作为放大显色系统，以及利用核酸纳米金生物传感器作为核酸量的检测系统，从而实现多重基因分型的目的。与传统的基于PCR技术的核酸分析方法相比，本发明所述的检测方法不需要热循环仪，反应速度快，灵敏度高，检测成本低，而且操作简单，既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测的灵敏度。

Description

基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法。

背景技术

据联合国世界卫生组织统计，全球死亡患者中，三分之一是死于不合理用药，而非死于自然疾病本身。在我国，每年的住院病人约有5000多万，其中至少250万与药物不良反应有关，有约20万人因此而死亡。个人基因不同，会导致机体对特定药物的代谢能力不同，从而直接关系到药物疗效和毒副作用的强弱——若药物在体内代谢较慢，代谢产物不易排出体外，容易积聚而引起药物性肝炎，严重者则引起药物中毒；若药物在体内代谢过快，就会导致常规剂量疗效降低或者无效，延误病情。生物医学研究成果表明，人体对药物处置及效应是存在个体差异的，绝大部分的药物反应个体差异是由遗传因素造成的。基因不同直接关系到药物疗效和毒副作用的强弱。因此，根据病人基因结构信息，尤其是发生变异的基因结构，有针对性地选择药物，并确定最适合病人的用药剂量，将成为未来理想的治病新模式。

基因导向个性化用药的技术研究可以应用于对人体血液中药物代谢基因型（药物代谢酶、转运体和受体基因）的检测，对药物使用进行个性化评估，从而根据每个人基因的不同，使用不同的药和药量。

细胞色素CYP2D6是重要药物代谢酶，代谢的药物占总CYP450代谢药物的20％。CYP2D6基因位于第22号染色体（22q13.1），已经发现有78种等位基因。CYP2D6基因多态性使药物代谢在不同种族之间，甚至在同种族不同人群中产生较大的差异，从而影响药物的疗效。快速分析CYP2D6基因的多态性，对指导临床合理用药和调整用药方案具有重大意义。

基于聚合酶链式反应（PCR）技术的分子诊断技术，如限制性内切酶酶切分型、引物特异性聚合酶链式扩增、实时定量PCR、测序技术，是目前广泛使用的基因分型工具，它们的灵敏度可以达到几个拷贝。然而这些技术需要复杂昂贵的热循环仪和专业操作人员，无法满足发展中国家以及缺乏先进医疗资源的边远地区的需求，更无法满足现场快速诊断的要求。

为了解决基于PCR技术的诊断方法都需要依赖热循环仪这一问题，目前也发明出一些基于等温核酸扩增的技术，例如核酸序列依赖性扩增技术（Nucleic-acid sequence based amplification，NASBA）、环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、解旋酶依赖性DNA扩增技术（Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HAD）等。等温核酸扩增技术能够在恒定温度下扩增核酸，缩短了诊断时间、降低了对仪器设备的要求。然而，这些技术也涉及到一些急需解决的问题，如NASBA仅仅适用于RNA分析并且涉及多个酶反应步骤，LAMP需要复杂的引物设计而且无法依据产物大小分析扩增产物，HDA所需有的解旋酶容易受到样本的抑制，这些问题都影响到了检测方案的稳定性和应用的广泛性，削弱了等温扩增技术在分子诊断上的优势。

自21世纪以来，纳米金层析技术在现场快速测定中的应用不断扩大，它可以检测多种分析物，而且简单快速，因而对众多行业产生了巨大影响。在实际的检测中，通常仅仅需要一滴血液尿液或者唾液，即可得到准确的结果，进而立即展开治疗。兽医、食品储藏及环境检测也经常使用层析检测，无需特别的仪器或者培训。

发明内容本发明所述为一种基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法。与传统的基于PCR技术的核酸分析方法相比，本发明所述的检测方法不需要热循环仪，反应速度快，灵敏度高，检测成本低，而且操作简单，既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测的灵敏度。

本发明所述的基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

针对靶标DNA的多态性位点的两种等位基因，配备用于在一次反应中同时分析两种等位基因等温信号扩增反应体系，该体系含有两种发夹DNA探针和相应引物，它们分别对应于各自的靶标等位基因，反应体系为100μl，包含：

反应条件为：37℃恒温反应60分钟；

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述野生型基因发夹DNA探针包括：针对野生型靶标基因设计的识别序列，该识别序列由发夹DNA探针的环序列上游15bp和与此相连的5’端茎序列的8bp构成（5’端上游3bp序列为随机序列5’-TAC-3’），总长度23bp；在所述识别序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列5’-GCTGAGG-3’；在切刻酶识别序列的下游是长12bp的茎序列，其中11bp与5’端形成茎状结构，在序列最后加入一个任意碱基，以抑制引物与探针结合后聚合酶延长探针3’端；所述发夹DNA探针的5’端用生物素修饰。

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述突变型基因发夹DNA探针包括：针对突变型靶标等位基因设计的识别序列，该识别序列由发夹DNA探针的环序列上游15bp和与此相连的5’端茎序列的8bp构成（5’端上游3bp序列为随机序列5’-TAC-3’），总长度23bp；在所述识别序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列5’-GCTGAGG-3’；在切刻酶识别序列的下游是长12bp的茎序列，其中11bp与5’端形成茎状结构，在序列最后加入一个任意碱基，以抑制引物与探针结合后聚合酶延长探针3’端；所述发夹DNA探针的5’端用生物素修饰。

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述野生型基因引物由两部分构成，下游8bp部分是所述野生型基因探针的3’端茎序列中的识别序列的互补序列，下游是10bp的标签DNA序列5’-GTTAGGTAGA-3’。

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述突变型基因引物由两部分构成，下游8bp部分是所述突变型基因探针的3’端茎序列中的识别序列的互补序列，下游是10bp的标签DNA序列5’-CTATTGCTTG-3’。

将等温扩增产物与胶体金-链酶亲和素混合均匀，静置5分钟后，取混合液滴于核酸纳米金生物传感器的样品垫进行检测；

所述的核酸纳米金生物传感器包括：从左至右固定于胶板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；硝酸纤维素膜上靠近样品垫一端的地方固定有用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针，形成野生型等位基因检测线；在该野生型等位基因检测线后，固定有用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针，形成突变型等位基因检测线；硝酸纤维素膜靠近吸水纸一端的地方固定有抗链酶亲和素抗体，形成质控线。

所述用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针序列是所述野生型引物的标签DNA的互补序列，在该序列的3’加入10个A碱基作为间臂以弱化空间位阻效应。

所述用于检测突变型等位基因的寡核苷酸探针序列是所述突变型引物的标签DNA的互补序列，在该序列的3’加入10个A碱基作为间臂以弱化空间位阻效应。

结果判定标准是：如果质控线出现红色，而两条检测线任意一条都未出现红色，表明被检样品为阴性，说明核酸提取失败或者扩增反应失败；如果两条检测线或者其中一条和质控线同时出现红色，表明被检样品为阳性；在这种情况下，如果检测线T1出现红色，表明被检样品为野生型纯合子，如果检测线T2出现红色，表明被检样品为突变型纯合子，如果两条检测线出现红色，表明被检样品为杂合子；

利用试纸条检测仪器读出检测线和质控线的信号峰面积，对靶标DNA做定量分析。

根据本发明所述的检测方法的进一步特征，所述的核酸纳米金生物传感器中，所述试纸条的宽度为4mm；所述质控线与检测线相距8-10mm；样品垫与硝酸纤维素膜的相邻部分彼此重叠0.5-1mm，硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠0.5-1mm。

根据本发明所述的检测方法的进一步特征，所述样品垫是预先用样品垫处理液浸泡后37℃烘干备用的，所述样品垫处理液包括：2%Triton X-100，1%BSA，20mM Tris-HCl(pH8.0)。

本发明的技术原理是：本发明所述的用于多重基因分型的核酸纳米金生物传感器基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增方法，这是一种探针信号扩增技术。在此技术中，高特异性的发夹DNA探针用于检测样品中靶标核酸，探针识别靶标核酸并与之杂交。该杂交反应激活一个级联的、依赖于聚合酶和切刻酶的信号扩增反应系统。该系统可循环生成一种两端被标记的双链DNA产物，这种双链DNA一端由生物素标记，另一端由标签DNA标记。于是这种信号扩增反应系统便通过循环生成两端被标记的双链DNA产物将探针检测靶标的杂交信号不断放大。此外，切刻酶的使用可使该信号扩增系统进一步合成更多的靶标分子；这些新生成的分子将靶标浓度维持在一个更好的水平，从而提高信号扩增效率和检测技术的灵敏度。整个信号扩增反应时间为1小时，反应温度为37℃。此外，本发明所述的用于多重基因分型的核酸纳米金生物传感器基于纳米金层析技术，具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高等特点。本发明所述的核酸纳米金生物传感器上固定的探针可以通过与引物的标签DNA发生杂交反应而捕获本发明所述的等温信号扩增产物，并通过探针序列5’标记的生物素和链酶亲和素的亲和作用将捕获信号可视化地显示出来。而定量分析可通过分析颜色的强度来实现。因此，标签DNA和链酶亲和素修饰的胶体金的结合使该技术成为一个通用型的分析平台，用于分析本发明所述的探针信号扩增反应系统的扩增产物。

本发明所述的基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法，在基因分型中可以达到快速、灵敏、特异的遗传学分析的目标。在本发明的实施例中，对于人类细胞色素P4502D6酶基因CYP2D6*4的多态性位点的多重基因分型，整个分析过程为15分钟，灵敏度为100aM，线性范围为10fM到10nM。整个检测过程只需要一台简单的恒温装置，如普通的水浴锅、金属浴，而且操作简单，对操作人员的技能要求不高，绝大多数人通过简单培训或自学都可掌握，这些特点和优势使其可用于医院的床边诊断，快速分析药物代谢基因，对药物进行个性化评估，从而个性化选择药物种类和用药剂量，进行个性化指导治疗。

附图说明

图1为本发明所述的基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增方法的原理图。

图2为本发明所述的基于等温信号扩增的多重基因分型的核酸纳米金生物传感器的结构示意图。

图3是本发明所述的核酸纳米金生物传感器的特异性试验结果图。

图4是本发明所述的核酸纳米金生物传感器的灵敏性试验结果图。

具体实施方式

本发明所述的基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法，包括基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增过程，其工作原理如图1所示。

本发明所述的基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增方法涉及一段5’端由生物素修饰的发夹DNA探针，该探针近3’端的环区域包含一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列；此外，该方法还包括在5’端标记有一段标签DNA的引物；以及Klenow fragment exo^-聚合酶和Nt.BbvCⅠ切刻酶。发夹DNA探针的单链环区域被设计为识别靶标核酸的区域，发夹DNA探针的双链茎区域的3’部分序列与引物互补。如图1所示，在第一步中，靶标与探针杂交导致发夹DNA探针构象变化，由此茎区域成为单链；在第二步中，引物退火到茎上，Klenow fragment exo^-聚合酶以探针为模板延伸引物，合成互补的DNA；第三步中，互补DNA合成完毕，同时靶标DNA被聚合酶置换下来，并且被另一个探针识别，由此，靶标DNA激活了新一轮聚合反应；在第四步中，由第二步反应生成的双链DNA被Nt.BbvCⅠ切刻酶识别并在新合成的互补DNA链上切断一个磷酸二酯键，形成一个切口；在第五步中，聚合酶识别新形成的切口，并延伸切口的3’端，合成一段新的互补DNA。在这个聚合过程中，之前的互补DNA被置换下来。第五步不断生成游离的单链互补DNA，这些互补DNA在第六步中再次引起更多的探针的构象变化，从而导致整个系统不断合成一种由生物素和标签DNA双标记的双链DNA分子。

本发明所述的等温信号扩增过程的具体步骤如下：

1、设置恒温装置温度为37℃。

2、配置检测溶液；样本组设置为三个重复；以本次检测用水做阴性对照，设置为三个重复。

3、将检测溶液至于恒温装置中，反应60分钟。

本发明所述的等温信号扩增体系的组成和含量，具体为：

反应体系为100μl，包含：

本发明所述的基于等温信号扩增的多重基因分型的核酸纳米金生物传感器的结构如图2所示。所述的核酸纳米金生物传感器包括：从左至右固定于胶板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；硝酸纤维素膜上靠近样品垫一端的地方固定有两种寡核苷酸探针，形成用于检测野生型等位基因的第一检测线以及用于检测突变型等位基因的第二检测线；硝酸纤维素膜靠近吸水纸一端的地方固定有抗链酶亲和素抗体，形成质控线。

在本实施例中，所述试纸条的宽度为4mm；所述质控线与检测线相距8-10mm；样品垫与硝酸纤维素膜的相邻部分彼此重叠0.5-1mm，硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠0.5-1mm。

根据本发明所述的基于等温信号扩增的多重基因分型的核酸纳米金生物传感器，其制作涉及到链霉素标记胶体金的方法，该生物传感器的样品垫处理液和处理方法，以及用寡聚核苷酸标记硝酸纤维膜的方法。

本发明所述的基于等温信号扩增的多重基因分型的核酸纳米金生物传感器的检测方法，包括以下步骤：

（1）执行本发明所述的一种基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增方法扩增检测核酸样本。

（2）将扩增反应液与5ul胶体金-链酶亲和素偶联物混合均匀，静置5分钟。

（3）取所得液体滴至样品垫上，15min后观察结果。

（4）本发明所述的基于等温信号扩增的多重基因分型的核酸纳米金生物传感器的结果分析：质控线出现红色，而两条检测线任意一条都未出现红色，表明被检样品为阴性，说明核酸提取失败或者扩增反应失败。两条检测线或者其中一条和质控线同时出现红色，表明被检样品为阳性；在这种情况下，如果检测线T1出现红色，表明被检样品为野生型纯合子，如果检测线T2出现红色，表明被检样品为突变型纯合子，如果两条检测线出现红色，表明被检样品为杂合子。

（5）利用试纸条检测仪器读出信号峰面积，做定量分析。

以下将以对于人类细胞色素P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点的分型为例来详细描述本发明的具体实施方案。

（一）针对人类细胞色素P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点设计特异性野生型探针和突变型探针。

在NCBI中下载跨度P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点上下游100bp的基因序列；针对这段序列设计探针的靶标识别序列；在识别序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列5’-GCTGAGG-3’；在其下游设计茎序列，茎长12bp；3’茎序列后加入一个碱基，抑制引物与探针结合后，聚合酶延长探针3’端。设计结果为：

P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点的野生型等位基因探针HP1：

SEQ ID NO:1    5’-生物素

-TACCCCACCCCCAGGACGCCCCTTTCGCTGAGGAGGGGTGGGGTAA-3’

P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点的突变型等位基因探针HP2：

SEQ ID NO:2    5’-生物素

-CAACCCACCCCCAAGACGCCCCTTTCGCTGAGGAGGGGTGGGTTGA-3’

（二）针对探针序列设计探针引物。

根据上述探针的茎的3’部分设计引物，长度为8个核苷酸长度。在引物的5’端加上一段10个核苷酸长度的DNA标签序列。

P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点的野生型等位基因探针的引物Primer1：

5’-GTTAGGTAGATACCCCAC-3’    SEQ ID NO.3

P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点的突变型等位基因探针的引物Primer2：

5’-CTATTGCTTGCAACCCAC-3’    SEQ ID NO.4

（三）设计核酸纳米金生物传感器的检测线探针

依据引物5’端的标签序列的互补序列作为探针序列，每种探针序列的修饰端加入10个A碱基作为间臂以弱化空间位阻效应。

用于识别野生型探针扩增反应产物的探针序列CP1：

5’-TCTACCTAACAAAAAAAAAA-生物素-3’    SEQ ID NO.5

用于识别突变型探针扩增反应产物的探针序列CP2：

5’-CAAGCAATAGAAAAAAAAAA-生物素-3’    SEQ ID NO.6

（四）核酸纳米金生物传感器的制备：

1.纳米金的制备：

在500ML的圆底烧瓶中加入100ml0.01%的HAuCl4溶液，边搅拌边加热至沸腾；向上述溶液中加入4ml1%柠檬酸三钠，溶液20s内变为蓝色，60s后变为酒红色，继续煮沸10min，停止加热继续搅拌15min；分析纳米金溶液的最大吸光度，该值为519nm为佳。纳米金溶液4℃避光保存。

2.生物素标记探针与链霉亲和素的偶联及偶联物的固定

链霉亲和素可以与生物素通过亲水键和范德华力相结合并形成稳定的难断裂的键，因此本发明采用生物素标记的DNA探针与链霉亲和素混合反应，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜上。

例如，用10μl去离子水溶解1OD生物素标记的寡聚核苷酸探针CP1，加入20μl（1mg/ml）链霉亲和素，室温下反应2小时后，采用划膜喷金仪（划膜速度为1μL/cm）涂于硝酸纤维素膜质控线上。37℃干燥两个小时。

寡聚核苷酸探针CP2采用同样方法固定于检测线上。

抗链酶亲和素抗体（1mg/ml）采用同样方法固定于质控线上。

3.链酶亲和素标记的胶体金的制备

取4ml胶体金溶液，加入32μl浓度为100mM的K₂CO₃，摇匀静置；然后加入40μl的链酶亲和素和牛血清白蛋白混合液，两者的浓度都是5g/l，摇匀静置半小时。12000转/分钟离心30分钟，弃上清，所得纳米金沉淀用1000μl重悬液重新悬浮，4℃保存备用。胶体金重悬液包括：2%Tween20，2%BSA，20mM Tris-Hcl(pH8.0)。

4.样品垫的处理

玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中4个小时后，37℃烘干备用。样品垫处理液包括：2%Triton X-100，1%BSA，20mM Tris-Hcl(pH8.0)。

5.核酸纳米金生物传感器的组装

将由寡聚核苷酸探针CP1和寡聚核苷酸探针CP2功能化的硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠0.5-1mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。

（五）人类细胞色素P4502D6酶CYP2D6*4多态性位点基因型的分析。

1、按下列组份配制等温扩增反应液（反应液配制应在冰上进行）：

反应体系为100uL；缓冲溶液为50mM Tris-Hcl(pH=7.90)，Na⁺浓度为200mM，Mg²⁺浓度为5mM，dNTPs（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）浓度为100μM，发夹DNA探针浓度为50nM，引物浓度为50nM，Klenow fragment exo^-聚合酶(购自New England Biolabs,Inc)为2.5U，Nt.BbvCⅠ切刻酶(购自New EnglandBiolabs,Inc)为5U；DNA样本溶液1μl，不足体积用水补足。

2、待水浴锅温度升至37℃，将反应容器放置在水浴锅中孵育60分钟。

3、将反应液滴加在纳米金核酸生物传感器的样品垫上，15分钟后分析结果。

4、利用试纸条检测仪器读出信号峰面积，做定量分析。

（六）本发明所述的检测方法的特异性试验。

分别配置含有1nM野生型靶标DNA和1nM突变型靶标DNA的混合溶液A1+A2，1nM野生型靶标DNA的溶液A1，和1nM突变型靶标DNA的溶液A2。检测上述DNA样品，以实验用水为阴性对照。检测结果图3所示：

当两种等位基因都存在时，两条检测线显现；当只有一种等位基因存在时，只有相应的检测线显现。此结果说明该探针特异性良好，可以区分一个碱基的差异。

（七）本发明所述的检测方法的灵敏度试验。

配置一系列浓度梯度的野生型靶标DNA溶液，检测这些DNA样本，试验结果图4所示。

依据该实验结果，本检测方法的最低检测限为100aM，线性范围为10fM-100nM，相关系数为0.9859。因此，本检测方法具有良好的线性范围和较高的灵敏度。

Claims (3)

1.一种基于核酸酶和发夹DNA探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

针对靶标DNA的多态性位点的两种等位基因，配备用于在一次反应中同时分析两种等位基因等温信号扩增反应体系，该体系含有两种发夹DNA探针和相应引物，它们分别对应于各自的靶标等位基因，反应体系为100μl，包含：

反应条件为：37℃恒温反应60分钟；

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述野生型基因发夹DNA探针包括：针对野生型靶标基因设计的识别序列，该识别序列由发夹DNA探针的环序列上游15bp和与此相连的5’端茎序列的8bp构成，总长度23bp，其中5’端上游3bp序列为随机序列5’-TAC-3’；在所述识别序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列5’-GCTGAGG-3’；在切刻酶识别序列的下游是长12bp的茎序列，其中11bp与5’端形成茎状结构，在序列最后加入一个任意碱基，以抑制引物与探针结合后聚合酶延长探针3’端；所述发夹DNA探针的5’端用生物素修饰；

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述突变型基因发夹DNA探针包括：针对突变型靶标等位基因设计的识别序列，该识别序列由发夹DNA探针的环序列上游15bp和与此相连的5’端茎序列的8bp构成，总长度23bp，其中5’端上游3bp序列为随机序列5’-TAC-3’；在所述识别序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶识别序列5’-GCTGAGG-3’；在切刻酶识别序列的下游是长12bp的茎序列，其中11bp与5’端形成茎状结构，在序列最后加入一个任意碱基，以抑制引物与探针结合后聚合酶延长探针3’端；所述发夹DNA探针的5’端用生物素修饰；

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述野生型基因引物由两部分构成，下游8bp部分是所述野生型基因探针的3’端茎序列中的识别序列的互补序列，下游是10bp的标签DNA序列5’-GTTAGGTAGA-3’；

在所述的等温信号扩增反应体系中，所述突变型基因引物由两部分构成，下游8bp部分是所述突变型基因探针的3’端茎序列中的识别序列的互补序列，下游是10bp的标签DNA序列5’-CTATTGCTTG-3’；

将等温扩增产物与胶体金-链酶亲和素混合均匀，静置5分钟后，取混合液滴于核酸纳米金生物传感器的样品垫进行检测；

所述的核酸纳米金生物传感器包括：从左至右固定于胶板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；硝酸纤维素膜上靠近样品垫一端的地方固定有用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针，形成野生型等位基因检测线；在该野生型等位基因检测线后，固定有用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针，形成突变型等位基因检测线；硝酸纤维素膜靠近吸水纸一端的地方固定有抗链酶亲和素抗体，形成质控线；

所述用于检测野生型等位基因的寡核苷酸探针序列是所述野生型引物的标签DNA的互补序列，在该序列的3’加入10个A碱基作为间臂以弱化空间位阻效应；

所述用于检测突变型等位基因的寡核苷酸探针序列是所述突变型引物的标签DNA的互补序列，在该序列的3’加入10个A碱基作为间臂以弱化空间位阻效应；

结果判定标准是：如果质控线出现红色，而两条检测线任意一条都未出现红色，表明被检样品为阴性，说明核酸提取失败或者扩增反应失败；如果两条检测线或者其中一条和质控线同时出现红色，表明被检样品为阳性；在这种情况下，如果检测线T1出现红色，表明被检样品为野生型纯合子，如果检测线T2出现红色，表明被检样品为突变型纯合子，如果两条检测线出现红色，表明被检样品为杂合子；

利用试纸条检测仪器读出检测线和质控线的信号峰面积，对靶标DNA做定量分析。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的核酸纳米金生物传感器中，所述试纸条的宽度为4mm；所述质控线与检测线相距8-10mm；样品垫与硝酸纤维素膜的相邻部分彼此重叠0.5-1mm，硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠0.5-1mm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品垫是预先用样品垫处理液浸泡后37℃烘干备用的，所述样品垫处理液包括：2%Triton X-100，1%BSA，20mM Tris-Hcl(pH8.0)。

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