CN107254524A - 一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明基于荧光PCR技术对肺炎支原体及耐药突变进行快速检测。属于分子生物学领域。本发明通过针对肺炎支原体23S rRNA基因设计引物，并针对23S rRNA2063位点设计专用引物检测支原体是否存在耐药突变。具体来说检测耐药突变的上游引物3’末端设计在2063位点，并将末端三个碱基硫化。原理为在发生错配时，高保真酶无法对硫化碱基发挥5’至3’核酸外切酶活性，使3’末端无法延伸。从而判定支原体是够存在耐药突变。本发明操作简单，反应时间短。为临床提供一种简单迅速的检测肺炎支原体及耐药突变的方法。

Description

一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。涉及荧光PCR技术；涉及一种肺炎支原体大环内酯类耐药突变位点(A2063G)的检测方法；还涉及使用该方法进行检测的试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasmal pneumonia,MP)感染可引起包括上呼吸道感染、气管支气管炎、肺炎等临床疾病。发病率以青少年最高，尤其是学龄期前后的儿童对肺炎支原体更易感。肺炎支原体感染占儿童社区获得性肺炎的10％～40％。有研究表明，亚洲肺炎支原体在成人社区获得性肺炎中占11.4％。近年来,多个国家和地区报道肺炎支原体的感染率和耐药率都有所升高,严重危害儿童和青少年的健康。研究显示肺炎支原体对大环内酯类药物耐药严重。主要耐药机制为23S rRNA上A2063G位点突变。所以，发病早期迅速检测肺炎支原体及其是否耐药，对临床治疗具有重要意义。

肺炎支原体潜伏期约为2-3周。临床症状较轻且不典型。目前，对肺炎支原体的检测主要方法有培养法、冷凝集试验法、ELISA法和 PCR法。而针对肺炎支原体耐药性的检测则主要是基于培养法的药敏试验法。

传统培养法虽然结果可靠，但试验周期过长，且操作复杂，试验室要求高，对临床早期诊断指导意义有限；冷凝集试验依赖冷凝集素的量，但发病初期冷凝集素量少，该方法易出现假阴性结果，并且部分其他疾病也有冷凝集素产生；ELISA试验针对特异性抗体，但发病初期抗体量少，甚至部分个体无抗体，检测结果灵敏度差，易出现假阴性结果；PCR方法灵敏度高，准确度高，但传统PCR方法需要电泳检测，易出现样本污染，不易操作。对肺炎支原体耐药的检测一般使用药敏方法，该方法操作复杂，用时较长。

荧光PCR方法特异性和敏感性都优于传统PCR技术，闭管检测，减少污染，检测速度快，结果易读。

为此，有必要设计一种新型的试剂盒，能够快速、准确的检测肺炎支原体及其耐药性。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种快速核酸检测肺炎支原体的试剂，用来克服现有检测试剂盒检测速度慢、准确性低的问题。

本发明是这样实现的，一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂，所述试剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂和第二试剂中均由体系液和引物组成，所述体系液中含有终浓度为以下的各物质：1×Q5Buffer、200μM dNTP、EVAGREEN 0.6μM、1×ROX、BSA 0.2-0.8mg/mL、甜菜碱0.2-0.8M、Q5高保真酶0.1-0.5U/μL、纯水，所述第一试剂中含有肺炎支原体检测引物，所述第二试剂中含有耐药性检测引物。

dNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写。是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,等在内的统称，N 是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。在生物 DNA合成中，以及各种PCR(RT-PCR(reverse transcription PCR)、 Real-time PCR)中起原料作用。在PCR反应中,使用低dNTP浓度, 可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100μl的反应体系中,4 种dNTP的浓度为20μmol/L,可基本满足合成2.6μg DNA或 10pmol/L的400bp序列。

EvaGreen是一种染料，它是Biotium公司研发的新一代DNA结合染料，它同时适合于实时定量PCR以及高分辨率熔解曲线分析 (HRM)。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性结合双链DNA，从而大大降低了染料对PCR反应的抑制作用。其具有的另一个重要的特性是安全、无毒。

甜菜碱是一种生物碱，具有强烈的吸湿性能，所以在制作工艺中经常会使用抗结块剂处理，其分子结构、应用效果与天然甜菜碱无明显差别，属于化学合成的天然物等同物。在本体系液中用于提高扩增效率。

BSA是牛血清白蛋白，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为 Blocking agent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。在本体系液中主要作用是增加DNA聚合酶的稳定性。

体系液中ROX是一种荧光试剂，在体系液中的作用是作为参比荧光的。ROX内参染料,用于消除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号,最大限度的提高了扩增的准确性。内参基因是为了平衡不同模板之间的差异,而ROX在不断的加热退火过程中的荧光比较稳定,用以做为体系中的阳性较正。ROX不参与PCR反应,仅消除加样误差和仪器孔之间误差作用。内标的作用：内标探针与标基因探针采用不同的荧光报告基团标记,通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物,避免PCR假阴性。ROX的作用：用于校正加样误差和管间差异,便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值, 使定量更准确。

Q5高保真酶是New England Biolabs(NEB)公司推出的一种性能强劲的DNA聚合酶——Q5超保真DNA聚合酶。它不仅带来了极为出色的保真度，还确保了各种扩增子的可靠扩增，而无论其GC含量如何。这种DNA聚合酶的保真度比普通的Taq酶高50倍，导致扩增产物的错误率极低。因为聚合酶与Sso7d DNA结合结构域融合，从而改善了保真度、速度和性能可靠性。

此外，Q5Buffer是为了配合Q5高保真酶而使用的。Q5的缓冲液体系也为PCR产物的成功扩增起到作用。它确保了各种扩增子的可靠扩增，而无论其GC含量如何。

1×Q5Buffer和1×ROX均为浓度表示方式，该方式属于本领域通用表示手段，本领域技术人员看到后可以理解。

本发明的进一步技术方案是：所述肺炎支原体检测物引物包括

第一上游引物F1：GTCCCGCTTGAATGTGTA，以及

第一下游引物R1：TCGCATCAACAAGTCTAGC。

本发明的进一步技术方案是：所述耐药性检测物引物包括

第二上游引物F2：TTAGCCGCAACGGGACGGA，以及

第二下游引物R2：AGTCAAACTGCCCACCTAAC。

本发明的进一步技术方案是：所述第二上游引物F2中3’末端三个碱基为硫化碱基。引物是一小段DNA，由含有四种碱基的核苷酸组成。核苷酸之间是以第一核苷酸中五碳糖上3’-羟基和第二个核苷酸五碳糖上5’-羟基与一个磷酸形成3’，5’-磷酸二酯键连接。引物的3’末端是指核苷酸有3’-羟基的一端。DNA聚合酶合成DNA 的方向是5’端→3’端，所以3’末端就是引物向下延长的末端。高保真DNA聚合酶具有3’->5’核酸外切酶活性，可以识别并切除发生错配的碱基。引物末端发生错配时，高保真酶可切除末端错配，使 DNA链继续延伸。若引物末端为硫化碱基并发生错配时，聚合酶无法发挥外切酶活性。错配使DNA链延伸中止。这就是分子开关法检测基因突变的原理。

本发明的进一步技术方案是：前面所述引物的浓度为0.25-1μM。

本发明的另一目的在于提供一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法，该方法包括以下步骤：

步骤A：样品处理步骤，所述样品处理步骤系将样品进行预处理后提取获得待检DNA；

步骤B：加样步骤，所述加样步骤系将待检DNA及对照物加入前面所述试剂中；

步骤C：测试步骤，所述测试步骤系将PCR管放入荧光定量PCR 仪上设置反应条件后检测荧光。

本发明的进一步技术方案是：所述步骤A包括以下分步骤：

步骤A1：取待测人痰液并使用液化试剂液化痰液；

步骤A2：对液化后痰液离心，弃上清液；

步骤A3：直接用DNA提取试剂盒提取待测DNA；或加入20～30μL 三蒸水煮沸5分钟，再取上清液做待检DNA。

本发明的进一步技术方案是：所述步骤B包括以下顺序可变的分步骤：

步骤B1：将待检DNA分别加入第一试剂和第二试剂中，其中待检DNA与试剂体积比为1:9；

步骤B2：将阴性对照物分别加入第一试剂和第二试剂中，其中阴性对照物与试剂体积比为1:9，所述阴性对照物系指双蒸水；

步骤B3：将阳性对照物分别加入第一试剂和第二试剂中，其中阳性对照物与试剂体积比为1:9，所述阳性对照物系指野生型MP基因组DNA。

本发明的进一步技术方案是：所述步骤C中荧光定量PCR仪设置的反应条件为：预变性98℃30s，98℃变性10s、72℃退火及延伸 20s，30个循环并在72℃时检测荧光。

本专利的第三个目的在于提供一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂盒，所述试剂盒包括如前所述的第一试剂和第二试剂，还包括阴性对照品和阳性对照品，其中所述阴性对照品为双蒸水；所述阳性对照品为野生型MP基因组DNA。

本方案的基本原理是通过将上游引物3’末端放在2063位点上，并将末端三个碱基硫化。在扩增过程中突变型模板与引物末端不匹配，具有5’->3’核酸外切酶活性的Q5高保真酶对末端进行切除，但由于碱基硫化后，Q5高保真酶无法完成矫正，反应无法继续进行。而野生型末端匹配，可以继续扩增。

现有技术中虽然以及存在使用荧光PCR进行检测的技术，但是现有技术的原理是通过等位基因特异性实时定量PCR检测技术(具体原理是设计特异性和非特异性引物，使无5’→3’核酸外切酶活性的 Taq酶在引物末端不匹配的情况下，扩增效率降低。)对野生和突变型的肺炎支原体分别进行PCR。检测野生型肺炎支原体时，特异性引物和非特异性引物PCR扩增速度有所差别，再利用标准曲线，计算反应体系中的DNA浓度，从而计算出是否发生突变以及突变的比例。

而本专利，使用具有5’→3’核酸外切酶活性的高保真聚合酶，配合3’末端硫化的引物。当引物与模板发出错配时，高保真酶将发挥外切酶作用切除错配，但硫化后的引物使酶失效，所以无法切除错配，反应无法延伸。

由此可见，本发明产品引物引入3’末端硫化结合高保真酶来提高特异性，技术上具有创新性；无需标准曲线，操作简单，定性分析，更适合临床使用。

本发明的有益效果是：本方案提供的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒检测准确度高，反应迅速，对反应环境要求低，成本相对低廉，可以广泛的进行推广。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变方法的基于荧光PCR检测方法示意图。

图2是本发明实施例提供的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变体系灵敏度检测的示意图。

图3是本发明实施例提供的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变体系特异性检测的示意图。

图4是本发明实施例提供的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变方法野生型样品实际检测结果。

图5是本发明实施例提供的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变方法突变型样品实际检测结果。

具体实施方式

本发明提供一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒。

本发明的一个目的是提供一种基于荧光PCR技术对肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变位点(A2063G)的快速检测试剂盒。所述试剂盒由体系液1、体系液2、阳性对照品及阴性对照品组成。

所述试剂盒中所提供的体系液中含有终浓度为以下的各物质：1 ×Q5Buffer、200μM dNTP、EVAGREEN 0.6μM、1×ROX、BSA 0.2-0.8 mg/mL、甜菜碱0.2-0.8M、Q5高保真酶0.1-0.5U/μL、纯水。

其中体系液1中的上游引物和下游引物为肺炎支原体检测用引物，其序列分别为：

上游引物F1：GTCCCGCTTGAATGTGTA

下游引物R1：TCGCATCAACAAGTCTAGC

体系液2中包含的上游引物和下游引物为23S rRNA 2063位点野生型MP检测用引物，其序列为：

上游引物F2：TTAGCCGCAACGGGACGGA

下游引物R2：AGTCAAACTGCCCACCTAAC

所述体系液2中上游引物，其特征在于引物3’末端三个碱基为硫化碱基。

图1是本方案基因识别示意图。

所述试剂盒反应条件为：预变性98℃30s，98℃变性10s、72℃退火及延伸20s,30个循环并在72℃时检测荧光。

所述试剂盒还包括阴性及阳性对照品，所述阴性对照品为双蒸水；所述阳性对照品为野生型MP基因组DNA。

本发明所述试剂盒，其使用方法具体步骤如下：

1)样品处理和模板提取，样品范围适用于疑似肺炎支原体感染的患者痰液等样品；使用液化试剂液化痰液，10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30μL三蒸水煮沸5分钟，再取2μL上清液做待检模板DNA；

2)取体系液1和2各18μL，分别加入2μL待检模板，并分别设置阴性对照管和阳性对照管。加样完成后，短暂离心。

3)将PCR管放入荧光定量PCR仪上设置反应条件：预变性98℃ 30s，98℃变性10s、72℃退火及延伸20s,30个循环并在72℃时检测荧光。

4)体系1中有S型曲线表明样本中含有肺炎支原体，无S形曲线表明样本中不含肺炎支原体；体系2种有S形曲线表明肺炎支原体不耐药，无S形曲线则表明肺炎支原体耐药。

本发明的基本原理是通过将上游引物3’末端放在2063位点上，并将末端三个碱基硫化。在扩增过程中突变型模板与引物末端不匹配，具有5’->3’核酸外切酶活性的Q5高保真酶对末端进行切除，但由于碱基硫化后，Q5高保真酶无法完成矫正，反应无法继续进行。而野生型末端匹配，可以继续扩增。

下面结合附图通过具体的肺炎支原体及2063耐药突变检测过程来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一

1引物制备

通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出肺炎支原体特异性基因及23S rRNA的核酸片段设计出引物并合成，得到如下的引物：

肺炎支原体检测引物

序列编号1

上游引物F1：GTCCCGCTTGAATGTGTA

序列编号2

下游引物R1：TCGCATCAACAAGTCTAGC

耐药突变检测引物

序列编号3

上游引物F2：TTAGCCGCAACGGGACGGA

序列编号4

下游引物R2：AGTCAAACTGCCCACCTAAC

2体系液制备

配制含有如下成分及浓度的的体系液：1×Q5Buffer 4μL、200 μM dNTP、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、EVAGREEN 0.6μM、 1×ROX、BSA 0.4mg/mL、甜菜碱0.8M、纯水9.66μL和Q5高保真酶 0.5U/μL。体系液1中加入的上下游引物为F1、R1；体系液2中加入的上下游引物为F2、R2；

3阴性对照品和阳性对照品制备：

肺炎支原体使用相应增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0mL增菌液使用试剂盒提取基因组DNA分装后作为阳性对照品；将无菌水纯分装作为阴性对照品。

4样品处理和模板制备

样品范围适用于疑似肺炎支原体感染的患者痰液等样品。使用液化试剂液化痰液，10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30μL三蒸水煮沸5分钟，再取2μL 上清液做待检模板DNA；

5加样

按照下表加入各试剂：

表1各检测管组分

6将检测管放到荧光定量PCR仪上，设定预变性98℃30s，98℃变性10s、72℃退火及延伸20s,30个循环并在72℃时检测荧光。

7结果判读：2号和5号管在荧光定量PCR仪上出现S形曲线， 3号和6号管在荧光定量PCR仪上无S形曲线则表明体系正常；检测管1和检测管4判读见表2。

表2反应结果判读方法

图2-5为测量结果图谱。其中图2为体系检测灵敏度，可以看出不通过浓度之间曲线的差异。图3为体系检测特异性，可以看出本体系具有明显的特异性区分。图4为野生型样本实际检测结果，图5为突变型样本实际检测结果，结合图4、5即可区分样品的具体类型。

本方案提供的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒检测准确度高，反应迅速，对反应环境要求低，成本相对低廉，可以广泛的进行推广。

现有技术中虽然以及存在使用荧光PCR进行检测的技术，但是现有技术的原理是通过等位基因特异性实时定量PCR检测技术(具体原理是设计特异性和非特异性引物，使无5’→3’核酸外切酶活性的 Taq酶在引物末端不匹配的情况下，扩增效率降低。)对野生和突变型的肺炎支原体分别进行PCR。检测野生型肺炎支原体时，特异性引物和非特异性引物PCR扩增速度有所差别，再利用标准曲线，计算反应体系中的DNA浓度，从而计算出是否发生突变以及突变的比例。

而本专利，使用具有5’→3’核酸外切酶活性的高保真聚合酶，配合3’末端硫化的引物。当引物与模板发出错配时，高保真酶将发挥外切酶作用切除错配，但硫化后的引物使酶失效，所以无法切除错配，反应无法延伸。

由此可见，本发明产品引物引入3’末端硫化结合高保真酶来提高特异性，技术上具有创新性；无需标准曲线，操作简单，定性分析，更适合临床使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京百康芯生物科技有限公司

<120> 一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法和试剂盒

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcccgcttg aatgtgta 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgcatcaac aagtctagc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttagccgcaa cgggacgga 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtcaaactg cccacctaac 20

Claims (10)

1.一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂，其特征在于：所述试剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂和第二试剂中均由体系液和引物组成，所述体系液中含有终浓度为以下的各物质：1×Q5 Buffer、200μM dNTP、EVAGREEN 0.6μM、1×ROX、BSA 0.2-0.8 mg/mL、甜菜碱 0.2-0.8 M、Q5高保真酶0.1-0.5 U/μL、纯水，所述第一试剂中含有肺炎支原体检测引物，所述第二试剂中含有耐药性检测引物。

2.根据权利要求1所述的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂，其特征在于：所述肺炎支原体检测物引物包括

第一上游引物F1：GTCCCGCTTGAATGTGTA，以及

第一下游引物R1：TCGCATCAACAAGTCTAGC。

3.根据权利要求1所述的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂，其特征在于：所述耐药性检测物引物包括

第二上游引物F2：TTAGCCGCAACGGGACGGA，以及

第二下游引物R2：AGTCAAACTGCCCACCTAAC。

4.根据权利要求3所述的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂，其特征在于：所述第二上游引物F2中 3’末端三个碱基为硫化碱基。

5.根据权利要求1-4中任一所述的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂，其特征在于：所述引物的浓度为0.25-1μM。

6.一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：样品处理步骤，所述样品处理步骤系将样品进行预处理后提取获得待检DNA；

步骤B：加样步骤，所述加样步骤系将待检DNA及对照物加入权利要求1-5中任一所述试剂中；

步骤C：测试步骤，所述测试步骤系将PCR管放入荧光定量PCR仪上设置反应条件后检测荧光。

7.根据权利要求6所述的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法，其特征在于，所述步骤A包括以下分步骤：

步骤A1：取待测人痰液并使用液化试剂液化痰液；

步骤A2：对液化后痰液离心，弃上清液；

步骤A3：直接用DNA提取试剂盒提取待测DNA；或加入20〜30μL三蒸水煮沸5分钟，再取上清液做待检DNA。

8.根据权利要求6所述的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法，其特征在于：所述步骤B包括以下顺序可变的分步骤：

步骤B1：将待检DNA分别加入第一试剂和第二试剂中，其中待检DNA与试剂体积比为1:9；

步骤B2：将阴性对照物分别加入第一试剂和第二试剂中，其中阴性对照物与试剂体积比为1:9，所述阴性对照物系指双蒸水；

步骤B3：将阳性对照物分别加入第一试剂和第二试剂中，其中阳性对照物与试剂体积比为1:9，所述阳性对照物系指野生型MP基因组DNA。

9.根据权利要求6所述的快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的方法，其特征在于：所述步骤C中荧光定量PCR仪设置的反应条件为：预变性98℃ 30s，98℃变性 10s、72℃退火及延伸20s，30个循环并在72℃时检测荧光。

10.一种快速核酸检测肺炎支原体及耐药突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利1-4中任一所述的第一试剂和第二试剂，还包括阴性对照品和阳性对照品，其中所述阴性对照品为双蒸水；所述阳性对照品为野生型MP基因组DNA。