CN108441542A - 基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法 - Google Patents

基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法。本发明提供的该试剂盒包括如SEQ ID NO.1～3所示的引物和探针。本发明提供的方法能在40分钟内完成标本中GBS的检测，检测快速准确；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，且结果直接肉眼观察，实验操作简捷。

Description

基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试 剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种无乳链球菌的检测试剂盒，特别涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法。
背景技术
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，group B streptococcus，GBS)属于链球菌属B血清群，为一种常见的有荚膜的革兰氏阳性致病菌。GBS是围生期女性泌尿生殖道感染和新生儿感染的常见病原菌，具有发病率高和病死率高的特点。GBS寄生在母体生殖道，分娩时可导致新生儿携带该菌，是引发以产褥期脓毒症、肺炎和脑膜炎为特征的新生儿感染的重要致病菌之一；同时，孕妇GBS感染易发生胎膜早破、绒毛羊膜炎、子宫内膜炎和尿道感染等疾病。20世纪70年代以来，GBS所致的妇女生殖道感染，尤其是在围产期感染呈上升趋势。90年代以来，在发达国家GBS感染是新生儿间接死因的第一位，而发展中国家感染正在上升。
对GBS的诊断主要是通过对孕产妇直肠或阴道拭子、新生儿的血液或脑脊液进行细菌培养来实现，但在检测孕妇GBS发现此菌普通培养对营养要求较高，培养鉴定耗时较长(至少2d)且阳性率较低。近年来，国内外已有运用血清学检测方法检测血清中的GBS特异性抗原及对GBS感染菌株进行血清型分型，方法有乳胶凝集实验(LA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，协同凝集试验(CoA)及对流免疫电泳(CIE)等。这些方法的特异性约为95％左右，但敏感性从19％到82％不等。即使选用不同试剂盒，这种方法在孕妇定植中检出率仅为4％-37％。1997年，美国食品和药品管理局(FDA)发出这类方法假阴性率和假阳性率均很高的可信度警告。另外，血清学方法包括酶免疫分析，CIE以及抑制性酶联免疫分析等也可对GBS分型，但均需要高滴度的抗血清或昂贵的试剂盒，限制了应用。
由于传统的培养和血清学检测方法存在检测耗时长、检测灵敏度和阳性率低及检测成本昂贵等问题，再加上GBS的抗生素预防策略的实施以及抗生素的广泛应用，对轻度感染和经抗生素治疗的患者，传统的培养和血清学检测方法出现很高的假阴性率和假阳性率发生。
PCR技术的发展，为检测各种临床标本中的病原菌提供了快速、敏感、特异的有力的工具，近年来在检测GBS感染方面也得到了广泛的应用。但是，人们仍在在研究更为快速、更为灵敏、更为简便、不依赖于精密仪器的检测方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，包括引物GBS-F-1、引物GBS-R-1和探针GBS-P-1；
引物GBS-F-1：5’-CTCTAGTAAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTTATC-3’；
引物GBS-R-1：5’-BIOTIN-CTATTGGTAGTCGTGTAGAAGCCTTAACAGATG-3’；
探针GBS-P-1：5’-FAM-CAACTGAAGCAAATGGATCTAAAATGCGAAT/IDSP(DSPACER)/ACCAGCTTAGTTATCCC-C3 SPACER-3’。
所述的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒还包括用于RPA扩增的nfo试剂、用于RPA扩增的水、试纸条和试纸条检测缓冲液中的至少一种。
所述的用于RPA扩增的nfo试剂包括nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。
所述的nfo干粉试剂中包含用于RPA扩增的酶。
所述的用于RPA扩增的酶为能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种。
所述的试纸条为侧流层析试纸条。
所述的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒包含预混液，预混液中的主要成分为引物GBS-F-1、引物GBS-R-1和探针GBS-P-1。
所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物GBS-F-1 0.42μM，引物GBS-R-1 0.42μM，探针GBS-P-1 0.12μM。
所述的用于RPA扩增的水优选为双蒸水或超纯水。
一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测方法，应用上述试剂盒实现，包括如下步骤：
(1)对待检测样本提取基因组DNA；
(2)配制RPA扩增反应体系；每50μl反应体系的组成如下：1管nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μM的引物GBS-F-1和GBS-R-1各2.1μl、浓度为10μM的探针GBS-P-1 0.6μl、基因组DNA2μl，用于RPA扩增的水补足至47.5μl；
(3)加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μl，立即进行RPA扩增，37℃反应25min；
(4)试纸条检测：取5μl RPA扩增产物，加入100μl试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5-15min，最后判读结果；
(5)结果判读：
每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；
①若只是试纸条的Control条带显色，检测结果为阴性；
②若试纸条的Control条带和检测条带同时显色，检测结果为阳性。
步骤(1)中所述的标本包括泌尿生殖道分泌物棉拭子。
所述的检测方法可在非诊断目的领域中进行应用，如实验研究领域中。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过引物和探针的设计、优化，采用RPA等温扩增技术，对无乳链球菌的检测时间快速，灵敏度高，不需要特殊仪器设备；
(2)本发明的检测结果采用试纸条显色的方法，操作简便快捷。
附图说明
图1是GBS RPA在不同温度下的扩增效果图；其中，泳道BC为空白对照，泳道M为100bp DNA Marker。
图2是GBS RPA在不同时间下的扩增效果图；其中，泳道BC为空白对照，泳道M为100bp DNA Marker。
图3是GBS RPA扩增特异性的检测结果图；其中，泳道1为B型链球菌、泳道2为德氏乳杆菌、泳道3为乳酸乳球菌、泳道4为淋病奈瑟菌、泳道5为厌氧消化链球菌、泳道6为奇异变形杆菌、泳道7为加德纳氏菌、泳道8为鲍曼不动杆菌、泳道9为脆弱拟杆菌、泳道10为短双歧杆菌、泳道11为柯氏动弯杆菌、泳道12为阴道毛滴虫、泳道13为解脲脲原体、泳道14为沙眼衣原体、泳道15为白色念珠菌、泳道16为A型链球菌、泳道17为肺炎链球菌、泳道18为金黄色葡萄球菌、泳道19为粪肠球菌、泳道BC为空白对照、泳道M为100bp DNA Marker。
图4是GBS RPA扩增灵敏性的检测结果图；其中，图A是琼脂糖凝胶检测结果图，图B是试纸条检测结果图；图B中1-6分别对应的DNA拷贝数为：101、102、103、104、105和106。
图5是本发明的检测结果图；其中，1-3为临床GBS阳性棉拭子标本，4-6为临床GBS阴性棉拭子，7为空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术可视化的无乳链球菌(GBS)核酸检测方法。本发明利用RPA等温扩增技术结合免疫层析技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对GBS基因组序列进行分析，设计出了用于RPA扩增的特异性引物和探针，并对引物探针进行了优选，同时对RPA扩增反应条件进行了优化。
本发明中所使用的基因组模板为从生殖泌尿道分泌物棉拭子提取基因组得到。
实施例1
(一)引物设计和优选
RPA技术中，引物和探针的设计不是常规的技术。本发明发明人通过查阅大量关于RPA技术的文献，对其中的引物和探针分析其序列、GC含量等，然后以无乳链球菌的cAMP基因为靶基因进行设计引物和探针。备选引物探针见表1。
表1备选RPA引物和探针序列(均为5’-3’)
表中的GBS-F表示上游引物，GBS-R表示下游引物，GBS-P表示探针。
将各个引物和探针配制成10μmol/L，备用。以ATCC标准GBS菌株(ATCC12973)提取基因组DNA为模板，采用上述备选的引物和探针进行RPA扩增，然后通过PCR产物纯化试剂盒将扩增产物进行纯化，再通过1％的琼脂糖电泳进行观察其扩增效果。
RPA扩增反应体系如下：基因组DNA(20～40ng/μl)2μl、1管nfo干粉试剂、RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μM的引物GBS-F-1和GBS-R-1各2.1μl、浓度为10μM的探针GBS-P-10.6μl、水补足至47.5μl；然后加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μl，混匀后立即进行RPA扩增，38℃反应30min；
结果表明，组1扩增出的目的条带最强，扩增效率最高，组2和组3扩增出的目的条带较暗弱，且在尾部存在较强的弥散条带，为引物和探针形成二聚体。
(二)RPA扩增条件的优化
1、扩增温度的优化
将上述体系配制好以后(使用组1的探针和引物)，扩增温度分别采用36℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃进行扩增反应，反应时间30min，然后将扩增产物进行纯化，进行琼脂糖电泳观察其扩增效果。
结果如图1所示，显示在37℃扩增条带最亮，扩增效果最好。
2、扩增时间的优化
将上述体系配制好以后，扩增温度采用37℃，扩增反应时分别采用5min、10min、15min、20min、25min和30min，然后将扩增产物进行纯化，进行琼脂糖电泳观察其扩增效果。
结果如图2所示，显示在扩增25min条带最亮，扩增效果最好。
3、扩增特异性
为了分析此方法的检测特异性，我们针对检测的标本为生殖泌尿道分泌物和种属上相邻的菌种，采用了生殖泌尿道常见细菌种类和相邻种属的细菌进行检测特异性分析，分别采用了德氏乳杆菌(ATCC 12315)、乳酸乳球菌(ATCC 49032)、淋病奈瑟菌(ATCC49226)、厌氧消化链球菌(ATCC 27337)、奇异变形杆菌(ATCC12453)、加德纳氏菌(ATCC14018)、鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)、脆弱拟杆菌(ATCC 25285)、短双歧杆菌(ATCC15700)、柯氏动弯杆菌(ATCC 35242)、阴道毛滴虫(ATCC 30001)、解脲脲原体(ATCC27816)、沙眼衣原体(ATCCVR-571B)、白色念珠菌(ATCC 10231)、A型链球菌(ATCC 19615)、肺炎链球菌(ATCC 12384)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和粪肠球菌(ATCC 29212)等病原体(上述菌株均购自北京北纳创联生物技术研究院，本实验室冻存)，分别提取细菌基因组DNA后，采用基因组DNA(20～40ng/μl)2μl加入上述扩增体系，在37℃扩增25分钟，进行琼脂糖电泳观察其扩增效果。并同时采用免疫层析试纸条检测：取5μl RPA扩增产物，加入100μl试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5-15min，最后判读结果。
结果如图3所示，可见应用组1的引物和探针，基于RPA技术，只有GBS可以被检出，其它细菌均未被检出。
4、扩增灵敏度
GBS基因组DNA分别用1×101、1×102、1×103、1×105和1×106个拷贝，采用上述扩增体系，在37℃扩增25分钟，然后将扩增产物进行纯化，进行琼脂糖电泳观察其扩增效果。并同时采用免疫层析试纸条检测：取5μl RPA扩增产物，加入100μl试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5-15min，最后判读结果。
结果如图4显示，检测限在低至1×102个拷贝的GBS基因组DNA可以被检测出来。
(三)临床标本检测
取已经培养检测后的50例生殖泌尿道分泌物棉拭子标本，其中GBS培养阳性标本10例，阴性40例。
1.标本处理
采用5％的Chelex-100进行标本DNA快速提取：
(1)将棉拭子放入1.5ml离心管中，加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子；
(2)12000rpm离心5min，去上清；
(3)沉淀加入1ml灭菌生理盐水混匀，12000rpm离心5min，去上清；
(4)沉淀加入50ul 5％的Chelex-100溶液，混匀，100℃恒温处理10min；
(5)12000rpm离心5min，上清备用。
2.RPA扩增体系配制
标本上清或对照取2μl、1管nfo干粉试剂、RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μM的引物GBS-F-1和GBS-R-1各2.1μl、浓度为10μM的探针GBS-P-10.6μl、水补足至47.5μl。
3.RPA扩增
各反应管中加入280mM乙酸镁2.5μl，混匀后立即进行RPA扩增，37℃反应25min.
4.试纸条检测
取5μl RPA扩增产物，加入100μl试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5-15min，最后判读结果。
50例标本的检测结果与细菌培养结果完全一致。部分结果如图5所示：1-3为临床GBS阳性棉拭子标本，4-6为临床GBS阴性性棉拭子，7为空白对照。
从上述实施实例看，本发明能准确地检测出临床标本中GBS，检测快速，整个实验过程包括标本处理可以在40分钟内完成；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，且结果直接肉眼观察，实验操作简捷。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示的引物GBS-F-1、如SEQ ID NO.2所示的引物GBS-R-1和如SEQID NO.3所示的探针GBS-P-1。
2.根据权利要求1所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括用于RPA扩增的nfo试剂、用于RPA扩增的水、试纸条和试纸条检测缓冲液中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的用于RPA扩增的nfo试剂包括nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的用于RPA扩增的水为双蒸水或超纯水。
5.根据权利要求2所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的试纸条为测流层析试纸条。
6.根据权利要求1所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒包含预混液，预混液中的成分包含引物GBS-F-1、引物GBS-R-1和探针GBS-P-1。
7.根据权利要求6所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物GBS-F-1 0.42μM，引物GBS-R-1 0.42μM，探针GBS-P-1 0.12μM。
8.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测方法，其特征在于：应用权利要求1～7任一项所述的试剂盒实现，包括如下步骤：
(1)对待检测样本提取基因组DNA；
(2)配制RPA扩增反应体系；每50μl反应体系的组成如下：1管nfo干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μM的引物GBS-F-1和GBS-R-1各2.1μl、浓度为10μM的探针GBS-P-1 0.6μl、基因组DNA 2μl，用于RPA扩增的水补足至47.5μl；
(3)加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μl，立即进行RPA扩增，37℃反应25min；
(4)试纸条检测：取5μl RPA扩增产物，加入100μl试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5-15min，最后判读结果；
(5)结果判读：
每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；
①若只是试纸条的Control条带显色，检测结果为阴性；
②若试纸条的Control条带和检测条带同时显色，检测结果为阳性。
9.根据权利要求8所述基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的标本包括泌尿生殖道分泌物棉拭子。
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