CN106868166A - 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106868166A
CN106868166A CN201710178811.4A CN201710178811A CN106868166A CN 106868166 A CN106868166 A CN 106868166A CN 201710178811 A CN201710178811 A CN 201710178811A CN 106868166 A CN106868166 A CN 106868166A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
johne
bacillus
primer
nfo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710178811.4A
Other languages
English (en)
Inventor
何洪彬
赵贵民
王洪梅
侯佩莉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Normal University
Original Assignee
Shandong Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Normal University filed Critical Shandong Normal University
Priority to CN201710178811.4A priority Critical patent/CN106868166A/zh
Publication of CN106868166A publication Critical patent/CN106868166A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了用于检测副结核分支杆菌的试剂盒。本发明提供的副结核分支杆菌RPA‑nfo检测引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低可以检测到8拷贝/反应的副结核分支杆菌DNA。无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅或人体腋窝温度，25min就能对待测样本的粗裂解物进行副结核分支杆菌DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层副结核病的诊断工作。

Description

用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条技术，现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒。
背景技术
副结核病，也称副结核性肠炎，是由副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis，MAP)引起牛、羊、鹿以及骆驼等多种动物的一种慢性传染病。OIE将其列为B类疫病，我国将其列为多种动物共患的二类动物疫病。副结核分支杆菌主要感染牛、羊和鹿，发病动物和隐性感染者是主要传染源，它们可通过乳汁、粪便和尿排出大量的病原菌。本病的流行特点是发展缓慢，发病率不高，病死率极高，并且一旦在动物群中出现则很难根除。近年来我国养殖场副结核病的感染率有上升的趋势，一些养殖场依然没有重视该病的防控。由于副结核病引起患病动物消瘦、生产性能下降、增加饲料消耗及易感染其他疾病直至死亡，给养殖业造成的经济损失相当严重，因此，规模化牧场副结核病的检疫与净化显得非常重要。
目前，副结核病的诊断方法主要有病原学方法、变态反应和血清学方法，其中，病原学主要有萋-尼氏抗酸染色、分离培养、PCR技术、LAMP快速检测等。对于萋-尼氏抗酸染色而言，由于粪便样品中可能还有其他的抗酸菌，会干扰染色法的诊断结果；对于分离培养法而言，分离培养耗时费工，分离率也较低；PCR技术对仪器设备和技术人员依赖程度高，在基层条件差和技术人员匮乏的情况下，很难实现现场实地快速诊断；LAMP快速检测虽然可以进行核酸的恒等温扩增，但仍不能对核酸粗提物的DNA样本进行直接扩增。此外，现有的采用PCR和LAMP诊断副结核病的报道中，其设计引物所依据的保守基因序列有多种，有的以副结核分枝杆菌ISMav2基因(AF286339)的保守区域设计引物(“牛副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立”，中国畜牧兽医，2012年第39卷第10期)；有的以牛副结核分枝杆菌的IS900基因序列作为靶基因设计特异性引物(“牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立”，中国预防兽医学报，2012年6月)，而根据不同的靶标(保守基因)设计的引物序列不同，对副结核分枝杆菌的诊断和检测效果也存在较大差异，因此，选择何种靶标作为引物设计的依据也是病原学法诊断副结核分枝杆菌的难点之一。
皮内变态反应能检测出副结核感染前期的大部分发病动物，但对于感染中后期以及处于耐受期的动物敏感性不强或者不出现反应状态。
动物在感染副结核分枝杆菌后的前期并不产生抗体，只有在临床症状阶段才产生抗体，所以使用血清学方法可能漏检副结核病阳性动物。
因此，从临床诊断的时效性方面考虑，亟需一种新的病原学现场快速恒等温扩增检测技术。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是目前新出现的一种体外快速核酸扩增技术，在37℃左右就能发生反应，并且仅需十几分钟就能扩增出痕量级的检测产物。同时RPA可以完成核酸粗提物的扩增，它通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)三种方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。基本的RPA扩增只需上下游引物，产物通过凝胶电泳检测，而RPA-nfo和RPA-exo反应，是通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)和核酸内切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，这两种方法分别通过LFD(nfo)和实时荧光(exo)两种不同的手段检测结果。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的检测方法。将RPA技术与LFD技术结合，通过LFD读取结果，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，借助恒温水浴锅用LFD就可以通过肉眼观察结果。但目前尚无文献报道利用RPA-LFD技术现场检测副结核分枝杆菌。
但RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，其应用并不十分普遍，其主要技术难点在于特异性引物和探针的设计和筛选，而引物/探针的设计和选择对RPA-nfo的结果是至关重要的，目前并没有像PCR扩增技术那样专门的引物/探针的设计软件，也没有较多的文献和试验数据提供技术依据。经相关检索，目前还未有针对副结核分枝杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。
综上，对于副结核分枝杆菌的RPA-LFD检测，目前尚无明确可借鉴的思路和结果，还需要技术人员做大量和深入的研究。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针；其RPA-nfo正向引物序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，其RPA-nfo探针序列如SEQ ID NO.3所示。
具体序列如下：
正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQ ID NO.1)
反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQ ID NO.2)
探针：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAAC CCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQ ID NO.3)。
本发明的探针，在其5'端用FAM标记，距离5'端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断。
需要说明的是，与常规PCR反应不同，RPA-nfo反应所需引物的长度通常为30～35bp，引物过短会严重影响重组酶的活性；但长引物也并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。LF探针长度一般在46～52bp，nfo核酶距离探针5'端30个碱基左右，距离3'端16～22个碱基左右，个别碱基的替换或增减都会对探针的特异性产生影响。因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物和探针组合，然后进行试验优化、筛选才能得到。
本发明设计了多组不同的引物和探针组合，经试验反复验证后，确定本发明所列出的上述引物和探针组合，其检测效果最佳。
本发明的第二方面，提供一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合。
进一步的，该试剂盒中还包括：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。
所述阳性质控标准品为：包括副结核分支杆菌IS900基因片段的阳性质控标准品；
优选的，所述副结核分支杆菌IS900基因片段阳性质控标准品由含有259个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；
所述含有259个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：
5'-ATCAGCGCGGCACGGCTCTTGTTGTAGTCGAAGGCGCGTTCCAGCGCCGAAAGTATTCCAGCAGCTGGGCGCGCATTCGGTTCGATCGCCCGGGTCCGATCAGCCACCAGATCGGAACGTCGGCTGGTCAGGATGCGCAGCTCGACTGCGATGTCATCGCCGGCGCGCAGAGGCTGCAAGTCGTGGCGCATCCGGGCCTGATCGGCGATGATCGCAGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTGCCTTCGCCGCGGTAACTACCCG-3'；(SEQ ID NO.4)
上述含有259个碱基的核苷酸片段是从副结核分支杆菌标准菌株基因组DNA中克隆得到。
所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。
所述RPA-nfo反应液，包括：recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁(MgAc)溶液、侧流层析试纸条(LFD；特异性检测生物素与FAM标记基因扩增产物)、LFD检测缓冲液(1×PBS+0.1％吐温20)、灭菌去离子双蒸水(ddH2O)，TE缓冲液、10％(w/v)SDS、2％(w/v)蛋白酶K和副结核分支杆菌标准阳性模板。
本发明的第三方面，提供一种非诊断目的的检测副结核分支杆菌的方法，步骤如下：
(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；
(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，筛选优化引物和探针，进行RPA-nfo扩增；
(3)用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有副结核分支杆菌。
步骤(2)中，所述RPA-nfo扩增的体系为25μL：其中包括1.0μL(10μM)的正向引物，1.0μL(10μM)的反向引物，0.3μL(10μM)的探针，rehydration缓冲液14.75μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH2O 4.7μL；将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。
步骤(3)的具体步骤为：取RPA反应产物1μL与49μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入，5min之内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中副结核分支杆菌核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样品中不含副结核分支杆菌核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的RPA技术是最新的一种核酸体外扩增技术，在检测时间上均优于PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术，其反应在25min内就能从单个模板分子得到大约1012扩增产物。
(2)本发明提供的副结核分支杆菌RPA-nfo检测引物与探针组合以及试剂盒，最低可以检测到8拷贝/反应的副结核分支杆菌DNA，RPA-LFD检测引物与探针分别与牛分支杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、非洲分支杆菌、布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、衣原体等细菌均无交叉反应，具有灵敏度高、特异性强的特性。
(3)本发明提供的副结核分支杆菌RPA-nfo引物与探针组合以及试剂盒不仅可用于副结核分支杆菌分菌株的检测，还可用于粪便、血液、奶样等临床样本的检测。
(4)本发明提供的副结核分支杆菌RPA-LFD检测方法使用方便，无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅，25min就能对待测样本的粗裂解物进行副结核分支杆菌DNA的检测，适合现场或基层副结核病的诊断工作。
(5)使用本发明的试剂盒能够有效诊断出副结核分枝杆菌，及时的发现副结核分枝杆菌阳性动物，为副结核病的防制提供技术保障。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：副结核分支杆菌RPA-nfo引物与探针的筛选，A：6对引物与探针的电泳图，B：A图对应引物与探针的LFD结果，其中，1：F1-R1-LF1(235bp和107bp)，2：F2-R1-LF1(213bp和107bp)，3：F3-R1-LF1(158bp和106bp)，4：F2-1-R2-LF2(259bp和161bp)，5：F2-2-R2-LF2(224bp和161bp)，6：F2-3-R2-LF2(200bp和161bp)。B图中a：为4×104拷贝/μL副结核分支杆菌阳性质控标准品，b：是以pEASY-T3空载质粒的阴性对照。
图2：副结核分支杆菌RPA-LFD灵敏性检测，其中1～7：模板分别为8×106～8×100拷贝/μL的阳性质控标准品，8：阴性对照，9：模板为ddH2O。
图3：副结核分支杆菌RPA-LFD特异性检测，其中，1：模板为副结核分支杆菌4×104拷贝/μL的阳性质控标准品，2～11：模板分别为牛分支杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌、非洲分支杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、衣原体基因组DNA；12：阴性对照。
图4：副结核分支杆菌RPA-LFD重复性检测，其中1、2、3：分别在三个独立时间段进行的试验，模板为副结核分支杆菌4×104拷贝/μL的阳性质控标准品，2是1检测完1周后进行的重复性试验，3是2检测完1个月后进行的重复性试验。
图5：副结核分支杆菌RPA-LFD临床样本的检测，其中，+：模板为副结核分支杆菌4×104拷贝/μL的阳性质控标准品DNA，－：阴性对照组，1～9：副结核分支杆菌核酸阳性粪便DNA，11：副结核分支杆菌核酸阳性血清DNA，13～16：副结核分支杆菌核酸阳性血液DNA，18：副结核分支杆菌核酸阳性奶样DNA，10、12、17、19：分别为副结核分支杆菌核酸阴性的粪便、血清、血液和奶样DNA。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有针对副结核分支杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。基于此，本发明提出了一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒。
在本申请的一种实施方案中，提供了一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：
正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQ ID NO.1)
反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQ ID NO.2)
探针：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQ ID NO.3)。
对于副结核分支杆菌而言，能够作为靶标序列的保守基因的种类有多种，但以不同的保守基因区域设计的引物不同，对副结核分支杆菌的诊断和检测的效果不同。本申请对用于设计引物的副结核分支杆菌的靶标序列进行了优化筛选，结果发现，以IS900基因作为靶标序列设计RPA引物，可以提高检测分析的特异性。
另外，RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，常规的PCR引物多半是不适用于RPA分析的，因为RPA引物比一般的PCR引物要长，通常需要达到30-35个碱基，引物过短会严重影响重组酶的活性，降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；但长引物也并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。另外，在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增的关键因素。但RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，目前还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，需要不断的摸索条件进行优化，通过设计多组候选引物进行测试和筛选，对于RPA引物的设计，目前，只有设计引物和探针的长度、GC含量等简单信息，试验表明，一个碱基的删减都有可能影响RPA的扩增性能与成败。RPA技术没有相应的引物和探针的设计软件，需要通过多次的试验筛选和优化。
本申请在试验过程中，设计了多组不同的引物和探针，并分别进行组合，经RPA反应后分别检测其特异性和扩增效率，以筛选最优的可用于临床检测的引物和探针组合。结果发现，以上述的引物和探针组合对副结核分支杆菌进行检测的特异性和灵敏度最优。
在本申请的另一种实施方案中，提供了一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合、阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。
本申请通过将上述优选的引物和探针组合设计成试剂盒，结合侧流层析试纸条读取检测结果，方便对试验样品进行快速检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
下面实施例中所用一些材料和试剂如下：副结核分枝杆菌C68604标准菌株购自中国兽医药品监察所，非结核分枝杆菌标准菌株如非洲分支杆菌(ATCC26420)和耻垢分枝杆菌(ATCC607)来自山东省胸科医院，牛分支杆菌(ATCC19210)、结核分枝杆菌H37Rv株、禽分枝杆菌标准菌株(ATCC25291)、非洲分支杆菌、布鲁氏菌A19疫苗株、大肠杆菌K99株、沙门氏菌、衣原体等常见微生物核酸样品由本实验室保存；临床上确诊为副结核病阳性的粪便、血液、血清、奶样DNA样本等均由山东师范大学反刍动物疾病研究中心保存。引物与探针由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNAAmplification nfo Kits购自TwistDX公司，侧流层析试纸条(HybriDetect Dipsticks)购自Milenia公司，pEASY-T3载体试剂盒和PCR mix购自北京全式金生物科技有限公司。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：引物与探针的设计和筛选
1.引物与探针的设计
目前，RPA-nfo引物与探针的设计没有具体操作规则，必须经过RPA反应后检测其特异性和扩增效率，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针。试验中需要从靶标序列两端设计多对引物与探针进行优化和筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。
本发明根据副结核分枝杆菌特异性的IS900基因(GengBank No.S74401)设计正向引物、反向引物与探针，分别见表1，有6组引物与探针的RPA组合。设计引物时，首先在Genebank数据上BLAST了引物设计区域IS900基因的保守性，均与现有副结核分枝杆菌菌株序列100％匹配。再对设计的上下游引物和探针进行BLAST对比，结果发现均不与其他基因序列相匹配，保证了引物序列的特异性。
表1引物对与探针序列
注：Biotin：生物素标记；FAM：羧基荧光素标记；dSpacer：核苷酸碱基类似物，是nfo核酸酶切割位点；C3-Spacer：聚合酶延伸阻断物。
2.利用RPA-nfo扩增反应筛选引物和探针
通过建立副结核分支杆菌RPA-LFD检测方法，利用RPA-nfo扩增反应对引物和探针进行筛选，具体步骤如下：
(1)阳性质控标准品的制备：
①模板DNA的提取：对副结核分支杆菌标准菌株应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
②PCR扩增：以提取的DNA为模板，用如下引物进行扩增：
IS900-S：5'-A T C A G C G C G G C A C G G C T C T T G-3'，
IS900-A：5'-C G G G T A G T T A C C G C G G C G A A G-3'
反应体系为50μL，包括2×PCR mix：25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH2O 19μL。反应条件为：94℃3min，94℃30sec、60℃30sec、72℃25sec，35个循环，72℃10min。
③重组质粒的构建及阳性质控标准品的建立：将PCR产物进行凝胶纯化回收，然后连接pEASY-T3载体，转化，提取质粒后双酶切鉴定，将阳性重组质粒进行测序，并进行序列比对。序列正确的重组质粒命名为pEAST-T3-IS900，将上述阳性质粒用紫外分光光度计测定浓度，为160ng/μL，按照下述公式计算出每μL质粒中的DNA拷贝数，结果为4×1010拷贝/μL，将这个阳性质粒作为阳性质控标准品。
拷贝数(copies/μL)＝质粒浓度×10-9×6.02×1023/(660×质粒总长度)
(2)阴性质控标准品：阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。
(3)副结核分枝杆菌RPA-nfo反应体系的建立
RPA-nfo反应体系为25μL：
将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接置于37℃恒温水浴锅反应25min。
反应结束后取1μL与49μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入上述混合缓冲液，5min之内观察结果，通过试纸条的显示进行判读。若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中副结核分枝杆菌核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样本中不含副结核分枝杆菌核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。
3.引物和探针的筛选结果
RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，目前尚无副结核分枝杆菌RPA检测的相关报道，现有分子生物学技术如LAMP等的副结核分枝杆菌相关的引物和探针并不一定适用于RPA，其引物和探针的设计原理和规则与PCR等扩增技术也不相同，需经过大量实验验证和分析。
对表1中的6组副结核分支杆菌RPA-nfo引物与探针组合分别进行RPA-LFD检测筛选，优化出1组最优的引物和探针组合，结果如图1所示，3：为最优引物与探针组合扩增结果。其他组也出现了检测条带，但在反应模板和反应条件相同的情况下，3的检测条带最亮，说明扩增效率最高，3的引物与探针组合扩增效率高于其他组合。最优的引物与探针序列见表1中IS900-F2、IS900-R1、IS900-LF1，分别为本发明提供的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物序列，本发明在进行副结核分支杆菌DNA的检测时，灵敏度高、特异性强、重复性好(图1)。
副结核分支杆菌RPA-LFD检测方法的灵敏性、特异性和重复性考察
1.试验方法：
(1)副结核分枝杆菌RPA-LFD灵敏性检测
将阳性质控标准品以10倍倍比稀释成8×106～8×100拷贝/μL，在RPA-nfo反应管中加入2μL，以本发明实施例1筛选得到的引物与探针按照上述实施例1中步骤(3)进行RPA-nfo扩增，同时以pEASY-T3空载质粒为阴性对照，检验本方法的灵敏性。
(2)副结核分枝杆菌RPA-LFD特异性检测
以本发明实施例1筛选得到的引物与探针分别对牛分支杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌、非洲分支杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、衣原体基因组DNA进行扩增，4×104拷贝/μL的副结核分枝杆菌阳性质控标准品DNA为阳性对照模板，同时以pEASY-T3空载质粒为阴性对照，验证本方法的特异性。
(3)副结核分枝杆菌RPA-LFD重复性检测
以本发明实施例1筛选得到的引物与探针对4×104拷贝/μL的副结核分枝杆菌阳性质控标准品DNA、pEASY-T3空载质粒进行RPA-LFD检测，分别在三个不同时间段进行重复性试验，首次检测、第2和第3次分别间隔1周和1个月后进行，验证本方法的重复性。
2.试验结果
(1)灵敏性考察结果
以10倍倍比稀释的7个梯度的副结核分枝杆菌阳性质控标准品DNA为模板进行检测，结果如图2所示，25μL体系的RPA-LFD检测限为8拷贝/反应。说明本发明提供的引物、探针及其检测方法的灵敏性高。
(2)特异性考察结果
以6种分支杆菌和4株其他细菌作为对照菌株，分别进行RPA-LFD检测，结果如图3所示，只有以副结核分枝杆菌DNA为模板的RPA-nfo反应管在LFD的检测线处出现条带，为阳性结果；而其它细菌菌株以及pEASY-T3空载质粒均未出现检测条带，均出现对照条带。说明本发明提供的副结核分枝杆菌RPA-nfo引物与探针组合能特异性检测副结核分枝杆菌，与其他细菌均无交叉反应。
(3)重复性考察结果
在3个不同时间段进行重复性试验，分别以4×104拷贝/μL的副结核分枝杆菌DNA为模板进行扩增，检测结果一致，结果如图4所示，说明本发明提供的引物、探针以及阳性质控标准品重复性好，可操作性强。
需要说明的是，本发明的副结核分枝杆菌RPA-LFD检测方法之所以具有灵敏性高(检测限达8拷贝/反应)、特异性强和重复性好等优势，是基于特殊的靶标(IS900基因)设计RPA引物，并对RPA引物进行优化筛选而实现的。首先根据特殊的靶标设计RPA引物能够实现对副结核分枝杆菌的特异性检测；目前已报道的用于副结核分枝杆菌检测的保守基因序列有多个，但如何从众多的保守基因序列中选择靶标进行RPA引物设计是方案设计的难点所在。其次RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，目前还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，需要不断的摸索条件进行优化。第三，通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)切割掉3'端阻止序列，也会影响副结核分枝杆菌RPA-LFD检测的效果。
本申请在实验过程中以不同的保守基因作为靶标区域，设计了多组RPA引物，但在检测过程中有出现与其他细菌之间的交叉反应，检测的特异性不如以IS900基因作为靶标设计的RPA引物。
本申请还以IS900基因作为靶标设计了多组RPA引物，为与LFD技术相结合，另外设计了不同的探针序列，通过不同的引物和探针的组合，考察检测的灵敏度，结果发现，不同引物和探针的组合，其检测的灵敏度相差较大，以本发明实施例1中筛选和优化得到的引物和探针组合的检测灵敏度最优。
实施例3：用于副结核分支杆菌检测的试剂盒
1.试剂盒的组成：实施例1筛选的引物和探针组合，阳性质控标准品、阴性质控标准品，rehydration缓冲液，醋酸镁(280mM)、ddH2O和侧流层析试纸条。
2.扩增体系及检测方法：
RPA-nfo反应体系为25μL：
将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接置于37℃恒温水浴锅反应25min。
反应结束后取1μL与49μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入上述混合缓冲液，5min之内观察结果，通过试纸条的显示进行判读。若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中副结核分枝杆菌核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样本中不含副结核分枝杆菌核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。
实施例4：副结核分枝杆菌RPA-LFD检测方法的应用
1.实验步骤
(1)临床样本的现场制备
将粪便、奶样离心沉淀等临床样本用200μL TE缓冲液[1.0M Tris-HCl(pH8.0)10mL，0.5M Na2EDTA·2H2O(pH8.0)2mL，加蒸馏水至1000mL]重悬，血液、血清等液体样本直接取200μL，然后加入30μL 10％(w/v)SDS和3μL 2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃温育1h，期间上下颠倒数次。
(2)临床样本的检测
按照步骤(1)中临床样本现场裂解处理的方法，分别对本实验室保存的已经用副结核分枝杆菌特异性PCR引物扩增后测序正确的9份粪便样本，1份血清样本，4份血液样本以及1份奶样样本，进行副结核分枝杆菌RPA-LFD检测，同时将上述不同类型样本各取1份阴性样本进行处理，以4×104拷贝/μL副结核分枝杆菌DNA和pEASY-T3空载质粒分别为阳性、阴性对照。同时以本实验室建立的副结核分枝杆菌SYBR Green I荧光定量PCR和LAMP检测方法为对照进行10份粪便样本的检测。
2.试验结果
对本实验室确诊的10份粪便、2份血清、5份血液、2份奶样样本，应用本发明实施例3的试剂盒中提供的副结核分枝杆菌RPA-nfo引物与探针进行检测，结果见图5，检测结果与测序确诊的结果均一致。
以上结果充分说明用本发明提供的副结核分枝杆菌RPA-LFD引物、探针组合以及试剂盒可用于不同临床样本的检测，该方法具有较高的灵敏度和特异性，最重要的是可以对临床粪便、奶样等样本直接进行现场快速的诊断。
3.结果对比
以SYBR Green I荧光定量PCR和LAMP检测方法为对照，进行10份粪便临床样本的检测。
将上述10份粪便临床样本(9个阳性样本，1个阴性样本)分别采用SYBR Green I荧光定量PCR、LAMP快速检测和RPA-LFD检测，对比结果如下：
表2：对比结果
SYBR Green I荧光定量PCR LAMP快速检测 RPA-LFD检测
阳性 9 8 9
阴性 1 2 1
由上述对比结果可以看出，采用本申请的RPA-LFD检测方法与LAMP快速检测相比，其检测的准确性更高，无假阳性或假阴性的检测结果；与SYBR Green I荧光定量PCR相比，本申请的RPA-LFD检测无需特殊仪器设备，只需借助恒温水浴锅，25min能对待测样本的粗裂解物进行副结核分支杆菌DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层实验条件差的地区副结核病的诊断工作。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgtcgttgg ccacccgctg cgagagcaat 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actcgaccgc taattgagag atgcgattg 29
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacaaccac ctccgtaacc gtcattgtca gatcaaccca gcagac 46
<210> 4
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcagcgcgg cacggctctt gttgtagtcg aaggcgcgtt ccagcgccga aagtattcca 60
gcagctgggc gcgcattcgg ttcgatcgcc cgggtccgat cagccaccag atcggaacgt 120
cggctggtca ggatgcgcag ctcgactgcg atgtcatcgc cggcgcgcag aggctgcaag 180
tcgtggcgca tccgggcctg atcggcgatg atcgcagcgt ctttggcgtc ggtcttgcct 240
tcgccgcggt aactacccg 259

Claims (10)

1.一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：
正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQ ID NO.1)
反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQ ID NO.2)
探针：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQ ID NO.3)。
2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备副结核分支杆菌检测的试剂盒、芯片和/或扩增反应试剂中的用途。
3.一种检测副结核分支杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品为包括副结核分支杆菌IS900基因片段的阳性质控标准品；
优选的，所述副结核分支杆菌IS900基因片段阳性质控标准品由含有259个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；
所述含有259个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No.4所示。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-nfo反应液，包括下述试剂中的至少一种：
recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁溶液、侧流层析试纸条、LFD检测缓冲液、灭菌去离子双蒸水，TE缓冲液、SDS、蛋白酶K和副结核分支杆菌标准阳性模板。
8.一种非诊断目的的检测副结核分支杆菌的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；
(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合进行RPA-nfo扩增；
(3)用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有副结核分支杆菌。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RPA-nfo扩增的体系为25μL：其中包括1.0μL的正向引物，1.0μL的反向引物，0.3μL的探针，rehydration缓冲液14.75μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH2O 4.7μL；将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为：取1μL RPA扩增产物与49μL的LFD检测缓冲液混合，将LFD置入上述混合液中，5min内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品副结核分支杆菌核酸阳性，仅出现对照条带则说明该样品中不含副结核分支杆菌，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。
CN201710178811.4A 2017-03-23 2017-03-23 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒 Pending CN106868166A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710178811.4A CN106868166A (zh) 2017-03-23 2017-03-23 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710178811.4A CN106868166A (zh) 2017-03-23 2017-03-23 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106868166A true CN106868166A (zh) 2017-06-20

Family

ID=59172141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710178811.4A Pending CN106868166A (zh) 2017-03-23 2017-03-23 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106868166A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723375A (zh) * 2017-09-20 2018-02-23 李佳萌 一种检测立氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途
CN107937574A (zh) * 2017-11-15 2018-04-20 锦州医科大学 羊副结核分支杆菌的lamp检测引物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
CN108441542A (zh) * 2018-04-17 2018-08-24 广州市妇女儿童医疗中心 基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法
CN109321668A (zh) * 2018-10-24 2019-02-12 安徽大千生物工程有限公司 检测人结核分支杆菌的电容式生物芯片的制备使用方法
CN109439727A (zh) * 2018-04-25 2019-03-08 内蒙古华星康为生物科技有限公司 一种检测微生物的方法及试剂盒
CN109825627A (zh) * 2019-03-28 2019-05-31 南京林业大学 一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的引物和探针组合及其应用
CN109825628A (zh) * 2019-03-28 2019-05-31 南京林业大学 一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的引物和探针组合及其应用
CN110499370A (zh) * 2018-05-20 2019-11-26 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所 一种基于rpa技术检测爪哇根结线虫的引物和探针

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104685068A (zh) * 2012-04-27 2015-06-03 乔治-奥古斯特大学哥廷根公法基金会 鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的检测方法
CN104862406A (zh) * 2015-06-01 2015-08-26 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104685068A (zh) * 2012-04-27 2015-06-03 乔治-奥古斯特大学哥廷根公法基金会 鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的检测方法
CN104862406A (zh) * 2015-06-01 2015-08-26 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OLAF PIEPENBURG等: "DNA detection using recombination proteins", 《PLOS BIOLOGY》 *
WANSADAJ JAROENRAM等: "Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick for discriminating between infectious Penaeus stylirostris densovirus and virus-related sequences in shrimp genome", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
樊晓旭等: "重组酶聚合酶扩增技术在疾病快速检测中的研究进展", 《中国动物检疫》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723375A (zh) * 2017-09-20 2018-02-23 李佳萌 一种检测立氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途
CN107723375B (zh) * 2017-09-20 2021-03-30 李佳萌 一种检测立氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途
CN107937574A (zh) * 2017-11-15 2018-04-20 锦州医科大学 羊副结核分支杆菌的lamp检测引物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
CN108441542A (zh) * 2018-04-17 2018-08-24 广州市妇女儿童医疗中心 基于重组酶聚合酶扩增技术的无乳链球菌可视化核酸检测试剂盒及方法
CN109439727A (zh) * 2018-04-25 2019-03-08 内蒙古华星康为生物科技有限公司 一种检测微生物的方法及试剂盒
CN110499370A (zh) * 2018-05-20 2019-11-26 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所 一种基于rpa技术检测爪哇根结线虫的引物和探针
CN109321668A (zh) * 2018-10-24 2019-02-12 安徽大千生物工程有限公司 检测人结核分支杆菌的电容式生物芯片的制备使用方法
CN109825627A (zh) * 2019-03-28 2019-05-31 南京林业大学 一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的引物和探针组合及其应用
CN109825628A (zh) * 2019-03-28 2019-05-31 南京林业大学 一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的引物和探针组合及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106868166A (zh) 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒
Fang et al. Comparison of real-time, quantitative PCR with molecular beacons to nested PCR and culture methods for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in bovine fecal samples
CN106811541A (zh) 用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒
CN102146466B (zh) 检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法
CN104862406B (zh) 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒
CN106868167A (zh) 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒
CN110093457A (zh) 一种非洲猪瘟病毒asfv-lamp检测引物组及试剂盒
Bölske et al. Diagnosis of paratuberculosis by PCR.
CN102146476B (zh) 一种检测α-珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒
CN104862405A (zh) 鉴别气溶胶中布鲁氏菌s2疫苗株的引物、探针以及试剂盒
CN103710433B (zh) 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒
CN112322764B (zh) 布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法
Gultekin et al. Prevalence and molecular characterization of Giardia duodenalis in dogs in Aydin, Turkey
CN110004250A (zh) 一种非洲猪瘟病毒lamp可视化检测试剂盒
CN108048584A (zh) Raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒
CN103725796A (zh) 一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光pcr检测试剂盒及其制备
CN110283936A (zh) 一种非洲猪瘟病毒lamp-hnb可视化检测试剂盒
Halm et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis
CN108315478A (zh) Raa荧光法检测狂犬病病毒的探针及试剂盒
CN108048589A (zh) 牛双芽巴贝斯虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法
CN102154487A (zh) 检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法
CN104911269A (zh) 鉴别气溶胶中布鲁氏菌a19疫苗株的引物、探针及试剂盒
CN106868113A (zh) 用于鉴定牛型结核分枝杆菌的snp标记及其应用
CN105063228B (zh) 一种柱状黄杆菌的检测试剂盒及检测方法
CN115873979B (zh) 一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增raa引物探针组合及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170620