CN106868167A

CN106868167A - 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒

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Publication number: CN106868167A
Application number: CN201710179319.9A
Authority: CN
Inventors: 王洪梅; 赵贵民; 侯佩莉; 丁乃峥; 何成强; 何洪彬
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2017-06-20

Abstract

本发明公开了一种用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒，该试剂盒包括正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示，其中反向引物序列5’‑端用生物素标记；探针序列5’‑端用FAM标记，距离5’‑端30个碱基的位置处设有dSpacer，3’端用C3‑spacer阻断。本发明提供的牛支原体RPA‑nfo检测引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低可以检测到10拷贝/反应的牛支原体DNA，RPA‑nfo检测引物与探针分别与其他支原体以及多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎链球菌等细菌均无交叉反应。

Description

用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体的说，它涉及一种应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条技术现场快速检测牛支原体核酸的引物、探针、试剂盒及其用途。

背景技术

牛支原体(Mycoplasmabovis，M.bovis)属于柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属，可以引起牛肺炎、乳房炎、关节炎、生殖道炎和流产等多种临床疾病。我国在2008年从患肺炎的犊牛肺脏中首次分离到该病原，此后相继在重庆、甘肃、宁夏、贵州、山西、吉林等大部分省份报道了牛支原体病。我国部分牛场牛支原体肺炎病例的死亡率在10％左右，高的可以达到60％，给养牛业造成巨大的经济损失。

目前国内外尚无有效的疫苗预防牛支原体病，抗生素的早期治疗可以起到一定作用，因此早期快速诊断是防治本病的前提。牛支原体病的病原学诊断方法主要有分离培养和分子生物学方法，分离培养耗时耗力，一般需要数周才能出结果。分子生物学方法包括常规PCR、实时定量PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)，以及高通量的基因芯片技术等。PCR技术和基因芯片技术往往需要昂贵的仪器设备、专业的技能型人才、复杂的操作过程，目前不能适应基层及现场的快速检测需要。LAMP技术虽然可以进行核酸的恒等温扩增，由于它的反应温度在60℃～65℃，反应时间在30～60min，仍然不能在常温下进行，并且不能对核酸粗提物的DNA样本进行直接扩增。此外，现有的诊断和检测牛支原体的报道中，其设计所依据的保守基因序列有多种，有的以oppD/F作为保守序列设计引物(CN 105420379A)；有的以P48脂蛋白基因作为保守序列设计引物(“基于脂蛋白P48的牛支原体快速检测方法的建立”，胡国明)，而根据不同的靶标(保守基因)设计的引物序列不同，对牛支原体的诊断和检测效果也存在较大差异，因此，选择何种靶标作为引物设计的依据也是牛支原体诊断牛支原体的难点之一。因此，从临床诊断的时效性方面考虑，亟需一种可用于现场恒等温条件下的简易核酸检测技术。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术可以在30～42℃，即借助人体温度在十几分钟就能完成核酸样本的痕量级扩增，更适合基层疾病现场就地的核酸检测。同时RPA可以完成核酸粗提物的扩增，它通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)三种方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。基本的RPA扩增只需上下游引物，产物通过凝胶电泳检测，而RPA-nfo和RPA-exo反应，是通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)和核酸内切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，这两种方法分别通过LFD(nfo)和实时荧光(exo)两种不同的手段检测结果。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的检测方法。

RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，其应用并不十分普遍，其主要技术难点在于特异性引物和探针的设计和筛选，而引物/探针的设计和选择对RPA-nfo的结果是至关重要的，目前并没有像PCR扩增技术那样专门的引物/探针的设计软件，也没有较多的文献和试验数据提供技术依据。经过相关检索，目前并没有针对牛支原体RPA-LFD检测的相关报道。

综上，对于牛支原体的RPA-LFD检测，目前尚无明确可借鉴的思路和结果，还需要技术人员做大量和深入的研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种用于通过RPA-LFD技术检测牛支原体的引物对和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和探针，所述RPA-nfo正向引物序列如SEQIDNo.1所示，所述反向引物序列如SEQIDNo.2所示，所述RPA-nfo探针序列如SEQIDNo.3所示。

具体序列如下：

SEQIDNo.1：5'-GTAGCAACAAAAACACTAAAGATTATGACT-3'

SEQIDNo.2：5'-(Biotin)AACTTGAATTTGAACTAAGTAGTTGTATAG-3'

SEQIDNo.3：5'-(FAM)AAATGAGTTTCACAAAACCAAAGCCTTAAT(dSpacer)GACCTAGATATGAATGA(C3-Spacer)-3'。

本发明的反向引物序列5’-端用生物素(Biotin)标记；探针序列5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基的位置处设有dSpacer，3’-端用C3-spacer阻断。

目前，RPA-LFD引物与探针的设计没有具体的操作规则，且无专门的RPA引物设计软件可用，必须经过RPA-nfo反应后应用LFD检测，经过不断的筛选，获得可用于临床检测的引物与探针。实验中需要从靶标序列两端设计多对引物与探针进行优化和筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。

本发明设计了多组不同的引物和探针组合，经试验反复验证后，确定本发明所列出的上述引物和探针组合，其检测效果最佳。

本发明的第二个方面，提供一种用于现场快速检测牛支原体的试剂盒，该试剂盒包括所述引物对和探针组合。

进一步的，所述试剂盒还包括阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。

优选的，所述阳性质控标准品为：包含牛支原体uvrC基因片段阳性质控标准品；所述牛支原体uvrC基因片段阳性质控标准品由含有如SEQIDNo.4所示281个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成。

所述含有281个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo.4所示：

SEQIDNo.4：

5'-TAAATGAGCGCAGTGCTGATGTTGAATATATTAAGCAATCAATTTCTAAATTTTTTAGTAGCAACAAAAACACTAAAGATTATGACTTAGTTATAGCTGATGGCGGTATACAACAAGTTAATGAAGCTAAAAAAACGCTTAAAACGCTTAATATAAACATCCCTGTTATTGGATTAGTAAAAAATGAGTTTCACAAAACCAAAGCCTTAATTGACCTAGATATGAATGAAATTCATATTAATGACTTAGAACTATACAACTACTTAGTTCAAATTCAAGTT-3'。

所述含有281个碱基的核苷酸片段是从牛支原体核酸阳性的临床病料DNA模板中克隆得到。

所述阴性质控标准品为pEASY-Y3空载质粒。

所述RPA反应液包括recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、醋酸镁溶液、侧流层析试纸条(特异性检测生物素与FAM标记基因扩增产物)、LFD检测缓冲液(1×PBS+0.1％吐温20)、TE缓冲液、SDS、蛋白酶K。

本发明的第三个方面，提供一种非诊断目的的检测牛支原体的方法，包括以下步骤：

(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，根据牛支原体的uvrC基因，设计特异性正向引物、反向引物和探针，筛选优化引物和探针，进行RPA-nfo扩增；

(3)用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有牛支原体。

优选的是，步骤(2)中所述的正向引物、反向引物和探针依次如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示。

优选的是，步骤(2)中RPA扩增反应体系为25μL：其中包括1.0μL(10μM)的正向引物，1.0μL(10μM)的反向引物，0.3μL(10μM)的探针，rehydration缓冲液14.75μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH₂O 4.7μL；将上述23.75μL混合物加入RPA反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。

优选的是，步骤(3)的具体步骤为：取RPA反应产物1μL与49μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入，5min之内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中牛支原体核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样品中不含牛支原体核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。

所述检测方法不仅可用于牛支原体分离株的检测，还包括组织、奶样、气溶胶等样本的现场检测。

本发明的第四个方面，提供下述任一应用，包括：

(1)所述的引物对和探针组合在制备检测牛支原体的试剂盒、芯片、扩增反应试剂的应用；

(2)所述的试剂盒在检测牛支原体中的应用；

(3)所述的方法在检测牛支原体中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种可快速有效检测出牛支原体成分的引物对及探针组合的筛选方法，包括以下步骤：

(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，根据牛支原体的特异性的基因，设计多条特异性正向引物、反向引物和探针，筛选和优化引物与探针，进行RPA-nfo扩增；

采用所述方法可以快速有效检测出牛支原体成分的引物对及探针组合，经过上述筛选方法使得检测引物对和探针形成的试剂盒的特异性更强，灵敏度更高。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明提供的RPA技术是最新的一种核酸体外扩增技术，在检测时间上均优于PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术，其反应在25min内就能从单个模板分子得到大约10¹²扩增产物。

(2)本发明将RPA技术与LFD技术结合，通过LFD读取结果，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，通过恒温水浴锅提供热源，用LFD通过肉眼就可以观察结果。因此，RPA-LFD技术在牛支原体病的现场快速诊断方面具有广阔的应用前景。

(3)基于对牛支原体特异性引物对和探针的筛选和优化，最低可以检测到10拷贝/反应的牛支原体DNA，RPA-nfo检测引物与探针分别与其他支原体以及多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎链球菌等细菌均无交叉反应，本发明提供的牛支原体RPA检测引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强。

(4)本发明提供的牛支原体RPA-nfo引物与探针组合以及试剂盒不仅可用于牛支原体分菌株的检测，还可用于鼻拭子、血液、奶样、气溶胶、组织等临床样本的检测。

(5)本发明提供的牛支原体RPA-LFD检测方法使用方便，无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅，25min就能对待测样本的粗裂解物进行牛支原体DNA的检测，适合现场或基层牛支原体快速检测和牛支原体病的诊断工作。

(6)使用本发明的试剂盒能够有效诊断出牛支原体病原，及时的发现牛支原体阳性动物，为牛支原体病的防制提供技术保障。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：牛支原体RPA-nfo引物与探针的筛选，A：7对引物与探针的电泳图，B：A图对应引物与探针的LFD结果，其中，1：uvrC-F1-R-LF1(281bp和100bp)，2：uvrC-F2-R-LF1(224bp和100bp)，3：uvrC-F3-R-LF1(144bp和100bp)，4：uvrC-F4-R-LF1(139bp和161bp)，5：oppD-oppF-F1-R-LF2(234bp和89bp)，6：oppD-oppF-F2-R-LF2(212bp和89bp)，7：oppD-oppF-F3-R-LF2(146bp和89bp)。B图中a：模板为5×10⁴拷贝/μL的牛支原体阳性质控标准品，b：是以pEASY-T3空载质粒代替模板的阴性对照。

图2：牛支原体RPA-LFD灵敏性检测，其中，1～8：分别为5×10⁷～5×10⁰拷贝/μL的阳性质粒标准品，9：阴性对照，10：模板为ddH₂O。

图3：牛支原体RPA-LFD特异性检测，其中，1：模板为5×10⁴拷贝/μL的牛支原体DNA，2～11：模板分别为无乳支原体、丝状支原体丝状亚种SC型、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎链球菌基因组DNA；12：阴性对照组。

图4：牛支原体RPA-LFD重复性检测，其中1、2、3：分别为三个独立时间段的试验，模板为5×10⁴拷贝/μL的牛支原体DNA，2是1检测完1周后的重复性试验，3是2检测完1个月后进行的重复性试验。

图5：牛支原体RPA-LFD临床样本的检测，其中，+：模板为5×10⁴拷贝/μL牛支原体阳性质控标准品DNA，－：阴性对照组，1～9：牛支原体核酸阳性鼻拭子样本DNA，11：牛支原体核酸阳性牛肺脏组织样本DNA，13：牛支原体核酸阳性奶牛场环境气溶胶样本DNA，15：牛支原体核酸阳性血液样本DNA，17：牛支原体核酸阳性奶样样本DNA，10、12、14、16、18：分别为牛支原体核酸阴性鼻拭子、牛肺脏组织、气溶胶、血液和奶样临床样本DNA。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有针对牛支原体进行RPA-LFD检测的相关报道以及现有技术中对于牛支原体的检测方法存在一些不足。基于此，本发明提出了一种用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒。

在本发明的一种实施方案中，提供一种用于现场快速检测牛支原体的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：

正向引物：5'-GTAGCAACAAAAACACTAAAGATTATGACT-3'；

反向引物：5'-(Biotin)AACTTGAATTTGAACTAAGTAGTTGTATAG-3'；

探针：5'-(FAM)AAATGAGTTTCACAAAACCAAAGCCTTAAT(dSpacer)GACCTAGATATGAATGA(C3-Spacer)-3'。

研究表明，牛支原体的保守16SRNA序列与无乳支原体PG2株同源性高达99％，但是其表面膜蛋白的同源性非常低，可以通过P81基因的体外表达产物建立一种敏感的血清学诊断方法。因此，金云云等人为快速检测牛支原体，根据GenBank中登录的牛支原体P81基因序列设计特异性引物，通过条件优化，建立了牛支原体环介导等温扩增检测方法。

关于牛支原体致病机理的研究目前尚无统一定论，但是众多学者认为其对宿主细胞的黏附作用是其感染宿主的第一步，而这种黏附作用主要由牛支原体表面的众多脂蛋白来完成，P48蛋白作为牛支原体表面的一种脂蛋白，具有高度的保守性。因此，包世俊等人根据牛支原体P48脂蛋白基因和无乳支原体基因之间的差异，设计并筛选出一对特异性PCR扩增引物，建立了牛支原体的PCR快速检测方法。

oppD/F是寡肽转运ATP结合蛋白质的简称，是牛支原体特异性基因，编码牛支原体2条短肽。申之义等人根据牛支原体OPPD/F基因的特异性保守序列设计的，用以定性、定量检测待测样品中的牛支原体。

综上，对于牛支原体而言，能够作为靶标序列的保守基因种类很多，以不同的保守基因序列设计的引物不同，对于牛支原体的诊断和检测效果并不相同。本申请对用于设计引物的牛支原体的靶标序列进行了优化筛选，结果发现，以uvrC基因作为靶标序列设计RPA引物，灵敏度高，特异性强。

另外，RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，常规的PCR引物多半是不适用于RPA分析的，因为RPA引物比一般的PCR引物要长，通常需要达到30-35个碱基，引物过短会严重影响重组酶的活性，降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；但长引物也并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。另外，在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增的关键因素。但RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，目前还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，需要不断的摸索条件进行优化，通过设计多组候选引物进行测试和筛选。

本发明在试验过程中，设计了多组不同的引物和探针，并分别进行组合，经RPA反应后分别检测其特异性和扩增效率，以筛选最优的可用于临床检测的引物和探针组合。结果发现，以上述的引物和探针组合对牛支原体进行检测的特异性和灵敏度最优。

在本申请的另一种实施方案中，提供了一种用于现场快速检测牛支原体的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合、阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。

本申请通过将上述优选的引物和探针组合设计成试剂盒，结合侧流层析试纸条读取检测结果，方便对试验样品进行快速检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例和对比例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。

下述实施例中所用一些菌株、试剂和材料如下：

无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)PG2株、丝状支原体丝状亚种SC型(Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides small colony，MmmSC)PG1株、丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)PG3株、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp)87001株、绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumonia，Mo)Y98株购自中国兽医药品监察所。牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎链球菌以及临床上确诊为牛支原体阳性的鼻拭子、肺组织、气溶胶、血液和奶样DNA样本等均由山东师范大学反刍动物疾病研究中心保存。引物与探针由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNA Amplification nfo Kits购自TwistDX公司，侧流层析试纸条(HybriDetect Dipsticks)购自Milenia公司，pEASY-T3载体试剂盒和PCR mix购自北京全式金生物科技有限公司。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

实施例1引物与探针的设计和筛选

目前，RPA-nfo引物与探针的设计没有具体规则，必须经过RPA反应后检测其特异性和扩增效率，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针。实验中需要从靶标序列两端设计多对引物与探针进行优化和筛选，个别碱基的替换或增减都会对试验结果产生重要影响。

本发明根据牛支原体特异性的uvrC基因(GengBank No.AF003959)和oppD-oppF基因(GengBank No.AF130119)分别设计正向引物，反向引物与探针，分别见表1。设计引物时，首先在Genebank数据上BLAST了引物设计区域uvrC基因和oppD-oppF基因的保守性，均与现有牛支原体菌株序列100％匹配。再对设计的上下游引物和探针进行BLAST对比，结果发现均不与其他基因序列相匹配，保证了引物序列的特异性。

表1引物对与探针序列

注：Biotin：生物素标记；FAM：羧基荧光素标记；dSpacer：核苷酸碱基类似物，是nfo核酸酶切割位点(nfo核酸酶为大肠杆菌核酸内切酶IV)；C3-Spacer：聚合酶延伸阻断物。

首先，本发明经过初步筛选得到表1中的7组引物/探针，然后针对表1中的7组牛支原体RPA-nfo引物与探针组合分别进行RPA-LFD检测筛选，优化出1组最优的引物和探针组合，如图1所示。

RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，目前尚无牛支原体RPA检测的相关报道，现有分子生物学技术如LAMP等的牛支原体相关的引物和探针并不适用于RPA，其引物和探针的设计原理和规则与PCR等扩增技术也不相同，需经过大量实验验证和分析，本发明筛选并优化得到一组引物对和探针，其序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，进行牛支原体DNA的检测时，灵敏度高、特异性强、重复性好(图1)。

实施例2牛支原体RPA-LFD检测方法的建立

1.实验步骤

(1)阳性质控标准品的制备：

①模板DNA的提取：对本实验室通过PCR检测牛支原体阳性的奶牛肺脏组织提取基因组DNA。

②PCR扩增：以提取的DNA为模板，用上游引物uvrC-S：5'-TAAATGAGCGCAGTGCTGAT-3'，下游引物uvrC-A：5'-AACTTGAATTTGAACTAAGT-3'进行扩增，反应体系为50μL，包括2×PCR mix：25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH₂O 19μL。反应条件为：94℃3min，94℃30sec、60℃30sec、72℃30sec，35个循环，72℃10min。

③重组质粒的构建及阳性质控标准品的建立：将PCR产物进行凝胶纯化回收，然后连接pEASY-T3载体(该载体为常规的载体，通过商业途径可购买到)，转化，提取质粒后双酶切鉴定，将阳性重组质粒进行测序，并进行序列比对。序列正确的重组质粒命名为pEAST-T3-uvrC，将上述阳性质粒用紫外分光光度计测定浓度，为195ng/μL，按照下述公式计算出每μL质粒中的DNA拷贝数，结果为5×10¹⁰拷贝/μL，将这个阳性质粒作为阳性质控标准品。

拷贝数(copies/μL)＝质粒浓度×10^-9×6.02×10²³/(660×质粒总长度)

(2)阴性质控标准品：阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。

(3)牛支原体RPA-nfo反应体系的建立

RPA-nfo反应体系为25μL：

将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接置于37℃恒温水浴锅反应25min。

反应结束后取1μL与49μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入上述混合缓冲液，5min之内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中牛支原体核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样本中不含牛支原体核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。

(4)牛支原体RPA-LFD灵敏性检测

将阳性质控标准品以10倍倍比稀释成5×10⁷～5×10⁰拷贝/μL，以本发明的RPA-LFD试剂盒提供的引物与探针按照上述步骤(3)进行RPA-nfo扩增，DNA为模板2μL，同时以pEASY-T3空载质粒为阴性对照，检验本方法的敏感性。

(5)牛支原体RPA-LFD特异性检测

以本发明的RPA-LFD试剂盒提供的引物与探针分别对无乳支原体、丝状支原体丝状亚种SC型、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎链球菌基因组DNA进行扩增，以5×10⁴拷贝/μL牛支原体DNA为阳性对照模板，同时以pEASY-T3空载质粒为阴性对照，验证本方法的特异性。

(6)牛支原体RPA-LFD重复性检测

以本发明的RPA-LFD试剂盒提供的引物与探针分别对5×10⁴拷贝/μL牛支原体DNA、pEASY-T3空载质粒进行RPA-LFD检测，分别在不同三个时间段进行重复性试验，首次检测、第2和第3次分别间隔1周和1个月后进行，验证本方法的重复性。

2.试验结果

对7组牛支原体RPA-nfo引物与探针组合分别进行RPA-LFD检测筛选，优化出1组最优的引物和探针组合，结果如图1所示，A图为各引物探针组合对应的电泳图，B图中，3：为最优引物与探针组合扩增结果。引物与探针序列见表1，uvrC-F2、uvrC-R、uvrC-LF分别为本发明提供的SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。以10倍倍比稀释的8个梯度的牛支原体阳性质控标准品DNA为模板进行检测，结果如图2所示，25μL体系的RPA-LFD检测限为10拷贝/反应。对5株其他支原体和5株其他细菌作为对照菌株，分别进行RPA-LFD检测，结果如图3所示，只有以牛支原体DNA为模板的RPA-nfo反应管在LFD的检测线处出现条带，为阳性结果；而其它支原体和细菌菌株以及pEASY-T3空载质粒均未出现检测条带，均出现对照条带。说明牛支原体RPA-nfo引物与探针组合能特异性检测牛支原体，与其他支原体和细菌均无交叉反应。在3个不同时间段进行重复性试验，分别以5×10⁴拷贝/μL牛支原体DNA为模板进行扩增，检测结果一致，结果如图4所示，说明本试剂盒提供的引物、探针以及阳性质控标准品重复性好，可操作性强。

本发明的牛支原体RPA-LFD检测方法之所以具有灵敏性高(检测限达10拷贝/反应)、特异性强和重复性好等优势，是基于特殊的靶标(uvrC基因)设计RPA引物，并对RPA引物进行优化筛选而实现的。首先根据特殊的靶标设计RPA引物能够实现对牛支原体诊断和检测；目前已报道的用于牛支原体分型诊断的保守基因序列有多个，但如何从众多的保守基因序列中选择靶标进行RPA引物设计是方案设计的难点所在。其次RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，目前还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，需要不断的摸索条件进行优化。第三，通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)切割掉3'端阻止序列，也会影响牛支原体RPA-LFD检测的效果。

本申请在实验过程中以不同的保守基因作为靶标区域，设计了多组RPA引物，但在检测过程中有出现与其他细菌之间的交叉反应，检测的特异性不如以uvrC基因作为靶标设计的RPA引物。

本发明还以uvrC基因作为靶标设计了多组RPA引物，为与LFD技术相结合，另外设计了不同的探针序列，通过不同的引物和探针的组合，考察检测的灵敏度，结果发现，不同引物和探针的组合，其检测的灵敏度相差较大，以本发明实施例1中筛选和优化得到的引物和探针组合的检测灵敏度最优。

实施例3牛支原体RPA-LFD检测方法的应用

1.实验步骤

(1)临床样本的现场制备

将肺脏组织、气溶胶离心沉淀、奶样离心沉淀等临床样本用200μL TE缓冲液[1.0MTris-HCl(pH8.0)10mL，0.5M Na₂EDTA·2H₂O(pH8.0)2mL，加蒸馏水至1000mL]重悬，鼻拭子溶解液、血液等液体样本直接取200μL，然后加入30μL 10％(w/v)SDS和3μL 2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃温育1h，期间上下颠倒数次。

(2)临床样本的检测

按照步骤(1)中临床样本现场裂解处理的方法，分别对本实验室保存的已经用牛支原体特异性PCR引物扩增后测序正确的9份鼻拭子样本，1份牛肺脏组织样本，1份气溶胶样本，1份血液样本以及1份奶样样本进行牛支原体RPA-LFD检测，同时将上述不同类型样本各取1份阴性样本进行处理，以5×10⁴拷贝/μL牛支原体DNA和pEASY-T3空载质粒分别为阳性、阴性对照。同时以本实验室建立的牛支原体TaqMan荧光定量PCR和LAMP检测方法为对照进行10份鼻拭子的检测。

2.试验结果

对本实验室确诊的10份鼻拭子、2份牛肺组织、2份气溶胶、2份血液和2份奶样样本应用本发明提供的牛支原体引物与探针进行了RPA-LFD检测，结果见图5。以上结果充分说明用本发明提供的牛支原体RPA-LFD引物、探针组合以及试剂盒可用于不同临床样本的检测，该方法具有较高的灵敏度和特异性，最重要的是可以对临床鼻拭子、气溶胶等样本直接进行现场快速的诊断。

3.结果对比

将上述10份鼻拭子临床样本分别采用TaqMan荧光定量PCR和LAMP快速检测，对比结果如下：

	TaqMan荧光定量PCR	LAMP快速检测	RPA-LFD检测
				阳性	9	8	9
阴性	1	2	1

由上述对比结果可以看出，采用本申请的RPA-LFD检测方法，其检测的准确性更高，无假阳性或假阴性的检测结果，无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅，25min就能对待测样本的粗裂解物进行牛支原体DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层实验条件差的地区牛支原体的诊断工作。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒

<130> 2016

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtagcaacaa aaacactaaa gattatgact 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacttgaatt tgaactaagt agttgtatag 30

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaatgagttt cacaaaacca aagccttaat gacctagata tgaatga 47

<210> 4

<211> 281

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taaatgagcg cagtgctgat gttgaatata ttaagcaatc aatttctaaa ttttttagta 60

gcaacaaaaa cactaaagat tatgacttag ttatagctga tggcggtata caacaagtta 120

atgaagctaa aaaaacgctt aaaacgctta atataaacat ccctgttatt ggattagtaa 180

aaaatgagtt tcacaaaacc aaagccttaa ttgacctaga tatgaatgaa attcatatta 240

atgacttaga actatacaac tacttagttc aaattcaagt t 281

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taaatgagcg cagtgctgat gttgaat 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttaaaacgc ttaatataaa catccctgt 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aacgcttaat ataaacatcc ctgttattg 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgaacaaat acgtcaagag tacaatata 29

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caatatatca ataattttaa tttcgcataa ca 32

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgttatgtat gctggcaaaa ttgttgaaag a 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctggtggggt tccttgaatt gagaataatc t 31

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tccagctcac ccttatacat gagcgcttat ccggctatac ctgaa 45

Claims

1.一种用于通过RPA技术检测牛支原体的引物对和探针组合，其特征是：其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示，其中反向引物序列5’-端用生物素标记；探针序列5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基的位置处设有dSpacer，3’ -端用C3-spacer阻断。

2.包括权利要求1所述的引物和探针组合的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征是：所述试剂盒还包括阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA反应液。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述RPA反应液包括recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、醋酸镁溶液、侧流层析试纸条、LFD检测缓冲液、TE缓冲液、SDS和蛋白酶K。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述阳性质控标准品包括牛支原体uvrC基因片段阳性质控标准品；所述牛支原体uvrC基因片段阳性质控标准品由含有如SEQIDNo.4所示的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。

6.一种非诊断目的的检测牛支原体的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

（2）以步骤（1）中处理的样本为模板，根据牛支原体的uvrC基因，设计特异性正向引物、反向引物和探针，进行RPA-nfo扩增；

（3）用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有牛支原体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是：步骤（2）中所述的正向引物、反向引物探针依次如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示；步骤（2）中RPA扩增反应体系为25 μL：其中包括1.0 μL的正向引物，1.0 μL的反向引物，0.3 μL的探针，rehydration缓冲液14.75 μL，待测样本DNA或粗裂解产物2 μL，ddH₂O 4.7 μL；将上述23.75 μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入1.25 μL 280 mM醋酸镁溶液，混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。

8.如权利要求6所述的方法，其特征是：步骤（3）的具体步骤为：取RPA反应产物1 μL与49 μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入，5 min之内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中牛支原体核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样品中不含牛支原体核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明检测不成立。

9.一种可快速有效检测出牛支原体成分的引物对及探针组合的筛选方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

（2）以步骤（1）中处理的样本为模板，根据牛支原体的特异性的基因，设计多条特异性正向引物、反向引物和探针，进行RPA-nfo扩增；

10.下述任一应用，包括：

（1）权利要求1所述的引物对和探针组合在制备检测牛支原体的试剂盒、芯片、扩增反应试剂的应用；

（2）权利要求3~5中任一项所述的试剂盒在检测牛支原体中的应用；

（3）权利要求6~8中任一项所述的方法在检测牛支原体中的应用。