CN102146467A

CN102146467A - 检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及荧光定量pcr检测鼠疫耶尔森氏菌的方法

Info

Publication number: CN102146467A
Application number: CN2011100384544A
Authority: CN
Inventors: 李�禾; 吕沁风; 吴忠华; 郑伟
Original assignee: ZHEJIANG INTERNATIONAL TRAVEL HEALTHCARE CENTER
Current assignee: ZHEJIANG INTERNATIONAL TRAVEL HEALTHCARE CENTER
Priority date: 2011-02-15
Filing date: 2011-02-15
Publication date: 2011-08-10

Abstract

本发明提供了一种检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂，它包括上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针。本发明还提供了利用上述试剂荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。本发明根据鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒上特有的致病基因-血浆凝固酶及胞浆素原活化因子pla基因，设计引物和探针，与整个genebank数据库进行BLAST检索，发现其只对鼠疫菌上的pla基因序列特异，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。

Description

检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法

技术领域

本发明涉及检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及鼠疫病原菌的检测方法，尤其涉及复合探针鼠疫病原菌标识基因进行扩增，进而利用荧光PCR技术检测鼠疫病原菌的方法。

背景技术

鼠疫(Plague)由鼠疫杆菌引起的，严重危害人类的一种烈性传染病。鼠疫具有传染性强、传播迅速、病情严重、病死率高等特点，为国际检疫传染病之一。我国颁布的《传染病防治法》也将鼠疫定为甲类传染病。

传染病预防控制的最关键技术环节就是建立病原体侦查检测的实验室诊断方法，能准确、快速地检出与监测病原体。鼠疫耶尔森氏菌的检测目前仍然主要是依靠细菌培养，生化反应，血清凝集等方法来鉴定。这些方法已经使用了几十年，并在细菌鉴定中发挥了重大作用，但普遍存在检测时间滞后，方法的敏感性差等不足，不能满足快速准确的需求。传统PCR技术和核酸杂交技术的发现大大的促进了细菌检测技术的发展，但存在容易交叉污染、无法定量分析等不足。实时荧光定量PCR技术解决了传统PCR技术的不足，已经成为细菌等微生物快速定量检测的首选技术。定量PCR技术可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，具有高效、快速、特异的优点，非常适用于单一病原体的检测。Taqman探针、分子信标、杂交探针(Lightcycler)等用于炭疽、鼠疫、霍乱等生物战剂的检测中，相关仪器可对采集到的样品进行实时检测分析。发展快速、敏感、特异、系统的病原微生物的筛查技术、方法和试剂，发展先进、系统的病原微生物分离和检测方法，可以有效地对传染病的暴发和流行进行早期预警、快速确认，控制新发传染病的口岸传入，并可有助于提高对突发公共卫生事件、暴发疫情和不明原因疾病的快速应急反应和处理能力。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂，可以用于快速准确地检测鼠疫耶尔森氏菌。为此，本发明采用以下技术方案：它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；

上游引物的基因序列P1为：5’-ATTCTGTTGTTTTGCCTTGA-3’，即序列表SEQ NO：1所示序列；

下游引物的基因序列P2为：5’-CTTGGATGTTGAGCTTCCTA-3，即序列表SEQ NO：2所示序列；

荧光探针的基因序列T7为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，即序列表SEQ NO：3所示序列；

淬灭探针的基因序列SP6为：5’-TAAAATCCACTGTGATATCTT-3’，即序列表SEQ NO：4所示序列。

本发明另一个目的是提供一种荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法，可以快速准确地检测鼠疫耶尔森氏菌。为此，本发明采用以下技术方案：

它采用直接水煮法提取鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA：取50μl1×10⁹CFU/mL的细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟，10000×g离心2分钟，取2μl上清作为扩增模板；

所述方法的PCR反应体系为25μl：10mmol/L的Tris-HCl，pH为8.0；50mmol/L的KCl；体积百分比3％甲酰胺；5mmol/L MgCL₂；100μmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；0.5μmol/L的上述上游引物，0.5μmol/L的上述下游引物，1.5U Taq酶，100nmol/L的上述荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针；PCR反应程序为：预变性95℃3min、94℃5s、扩增的退火温度为54℃20s共40个循环；

所述方法还包括以下检测步骤：提取样本DNA为扩增模板，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用非鼠疫致病菌，阳性对照采用鼠疫耶尔森氏菌阳性参考品；反应结束后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中鼠疫耶尔森氏菌的浓度。

本发明具有显著的优点，通常传统的鼠疫耶尔森氏菌检测技术操作繁琐，耗时较长，影响因素多，不能达到快速诊断的目的。根据鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒上特有的致病基因-血浆凝固酶及胞浆素原活化因子pla基因，设计引物和探针，与整个genbank数据库进行BLAST检索，发现其只对鼠疫菌上的pla基因序列特异，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。

附图说明

图1a为实施例1中组合1的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为1×10⁵cfu/ml的实时扩增曲线、2为1×10⁴cfu/ml的实时扩增曲线、3为1×10³cfu/ml的实时扩增曲线。

图1b为实施例1中组合2的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为1×10⁵cfu/ml的实时扩增曲线、2为1×10⁴cfu/ml的实时扩增曲线、3为1×10³cfu/ml的实时扩增曲线。

图2a为实施例1中FP探针的纯度分析图谱。

图2b为实施例1中QP探针的纯度分析图谱。

图3a为实施例1中上游引物的的HPLC分析图谱。

图3b为实施例1中下游引物的的HPLC分析图谱。

图4为淬灭探针的淬灭效果图，其中，1表示单有荧光探针组，2表示复合探针组。

图5为荧光探针的延伸性能图，其中，1为加上游引物组，2.为不加上游引物组。

图6为本发明实施例2绘制的荧光定量PCR标准曲线

具体实施方式

实施例1引物与探针的制备

1.靶基因选择

鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒上有产生鼠疫耶尔森氏菌素的pst基因和血浆凝固酶及胞浆素原活化因子pla基因，后者被认为与人类致病有关，可作为鼠疫菌的诊断标志。根据检索genbank数据库，获得pla基因序列。

2.荧光探针、淬灭探针与PCR引物的设计和筛选

遵循复合探针设计原则，根据pla基因的序列，设计了两组引物和探针。荧光探针5′端标记荧光分子FAM作为报告基团，3′端标记磷酸，以阻断其延伸。淬灭探针的3′端连接一淬灭基团Dabcyl。

为了从两组复合探针及引物组合中筛选出扩增效率高的一个组合，将这些组合进行实时PCR分析，采用检测鼠疫耶尔森氏菌标准株ATCC23053-B1的3个不同浓度样本(1×10⁵cfu/ml、1×10⁴cfu/ml、1×10³cfu/ml)，观察它们同时扩增同一样品的能力来确定最佳组合。如表1和图1a、1b所示，采用组合1进行检测时，其检测样品时的C_T值较小，而且荧光响应强度值ΔRFU较高，说明该组合扩增效率较高，因此，在后述的所有实验中，均采用这个组合。

表1引物及探针组合对扩增效率的影响

最终确定的引物序列及荧光探针序列与整个genbank数据库进行BLAST检索，发现其只对鼠疫耶尔森氏菌上的pla基因序列特异，和其它物种的核酸序列无同源，因此该组引物和探针设计符合要求。

组合1引物和探针的序列如下：

3.检测探针与PCR引物的制备

用于检测鼠疫耶尔森氏菌的寡核苷酸(包括荧光探针、淬灭探针以及PCR引物)的化学合成、标记与纯化使用美国ABI公司的Expedite 8909DNA合成仪，荧光探针用美国transgenomic公司的荧光素FAM标记，淬灭探针用美国transgenomic公司的Dabcyl淬灭试剂标记。

3.1.探针的质量鉴定

取纯化的荧光探针和淬灭探针约3μg用去离子水稀释至10μl，用微量注射器注入高效液相色谱仪，色谱条件为：流动相(A：0.1mol/L TEAA溶液；B：乙腈)，分析柱：C-18，4.6×250nmol/L，分析梯度0～30min，8％～30％B，流速1ml/min。最后记录色谱图并分析探针纯度。如图2a、2b所示，均为单一峰型，荧光探针纯度大于95％，淬灭探针纯度大于95％，纯度合格。

3.2.PCR引物的质量鉴定

取纯化的上游引物及下游引物约3μg用去离子水稀释至10μl，用微量注射器注入高效液相色谱仪，色谱条件为：流动相(A：0.1mol/L TEAA溶液；B：乙腈)，分析柱：C-18，4.6×250nmol/L，分析梯度0～30min，8％～30％B，流速1ml/min。最后记录色谱图并分析引物纯度。如图3a、3b所示，均为单一峰型，上游引物纯度大于95％，下游引物纯度大于95％，纯度合格。

3.3.引物和探针性能的鉴定

利用优化后的PCR反应体系，鉴定PCR产物的电泳行为，PCR产物的序列分析，并对荧光淬灭基团的淬灭效果和荧光探针的延伸性能进行研究。结果表明：扩增序列正确，无非特异性扩增，引物和探针设计正确；荧光探针和淬灭探针质量符合要求。

3.4.荧光探针和淬灭探针性能鉴定

3.4.1.淬灭探针的作用

根据复合探针检测原理，荧光探针和淬灭探针在无模板时，应能杂交结合并使荧光探针的荧光被淬灭，为了检测淬灭探针的淬灭能力，分别检测了两探针混合形成复合探针时及单有荧光探针时体系中的荧光强度。具体反应在1×PCR反应缓冲液(10mmol/L Tris，50mmol/L KCl)中进行，然后采用在iCycler PCR仪上运行，并与退火温度时采集并记录两管第一个点的荧光值，如图4和表2所示。

结果表明复合探针组体系中的荧光强度要比只有荧光探针时的荧光强度小得多，说明淬灭探针能很好地淬灭荧光探针发出的荧光。

表2淬灭探针的淬灭效果测定

3.4.2.荧光探针的延伸性能

由于荧光探针的3’被磷酸化，它应该失去延伸能力，不能直接作为引物进行扩增。配制2管PCR反应体系，其中一管体系中不加上游引物，另一管加有上游引物，并以鼠疫耶尔森氏菌裂解液为模板。然后进行实时荧光PCR检测，结果如图5所示，不加上游引物管无荧光响应，可见荧光探针的延伸性能已被抑制。

3.4.3对PCR扩增产物序列的确认

将鼠疫耶尔森氏菌荧光PCR产物经酚/氯仿抽提和丙醇沉淀后，连接到T-vector上，进行克隆转化，然后提取阳性克隆的质粒DNA，用BeckmanCEQ-2000自动测序仪进行DNA序列测定。测序结果与pla基因序列比对，确定测定结果符合预期的DNA序列，表明该方法进行了特异性扩增。

实施例2，鼠疫耶尔森氏菌的检测

为了考察本发明检测实际应用能力，特制备了鼠疫耶尔森氏菌污染的血液、水样、土壤、表面粘染等模拟标本，同时设置纯菌作为阳性对照，非鼠疫致病菌作为阴性对照。

1.样品制备

(1).污染血液的制备和处理：定值鼠疫耶尔森氏菌用抗凝血系列稀释，制成浓度为1×10⁶CFU/ml-1×10¹CFU/ml的污染血液样本。取含不同浓度细菌的血液各1ml，12000rpm离心10分钟，弃去上清，加入1ml红细胞裂解液(50mmol/LTrisHCL，25mmol/L KCl，5mmol/LMgCl₂，pH7.5，TKM液)，剧烈振荡混匀2min，12000rpm离心10分钟弃上清，再加TKM液1ml，混匀，12000rpm离心10分钟弃上清，沉淀采用直接水煮法提取DNA，煮沸10分钟后，取上清2μl进行PCR扩增。

(2).污染水样的制备和处理：定值鼠疫耶尔森氏菌用自来水系列稀释，制成浓度为1×10⁶CFU/ml-1×10¹CFU/ml的污染水样本。取含不同浓度细菌的水各1mL，12000r/min离心10分钟，小心吸去上清，采用直接水煮法提取DNA，煮沸10分钟后，取上清2μl进行PCR扩增。

(3).污染土壤的制备和处理：定值鼠疫耶尔森氏菌系列稀释后，加入预装有土壤的离心管中混匀，制成浓度为1×10⁶CFU/ml/0.1g-1×10¹CFU/ml/0.1g的污染土壤标本。1000r/min离心1分钟，取上清转移至一新管中，12000r/min离心10分钟，小心吸去上清，再加入500μLPBS溶液混匀，12000r/min离心10分钟，小心吸去上清，采用直接水煮法提取DNA，煮沸10分钟后，取上清2μl进行PCR扩增。

(4).污染表面沾染样品的制备和处理：摘取植物叶片，剪碎后装入离心管，加入系列稀释鼠疫耶尔森氏菌，浸泡1小时，制成浓度为1×10⁶CFU/ml/0.1g-1×10¹CFU/ml/0.1g的污染表面沾染标本，取上清转移至一新管中，12000r/min离心10分钟，小心吸去上清，再加入500μlPBS溶液混匀，12000r/min离心10分钟，小心吸去上清，采用直接水煮法提取DNA，煮沸10分钟后，取上清2μl进行PCR扩增。

(5).阴、阳性对照：为了考察检测方法的特异性，用本方法分析了2株鼠疫耶尔森氏菌阳性特异性参考品和19株阴性特异性参考品，见表3和表4。检测时设立阳性质控品和阴性质控品。

表3阳性菌株相关信息

表4阴性特异性菌株相关信息

*ATCC：指美国标准菌库，CMCC：指中国医学菌种保藏中心

2.荧光定量PCR的反应体系及反应程序

荧光PCR反应体系为25μl，经优化后成分如下：10mmol/L的Tris-HCl，pH为8.0；50mmol/L的KCl；3％甲酰胺；5mmol/L MgCl₂浓度；100μmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；0.5μmol/L的上述上游引物，0.5μmol/L的上述下游引物，1.5U Taq酶，100nmol/L的上述荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针。PCR仪的运行参数为：预变性95℃3min。95℃5s、扩增的退火温度为54℃20s，40个循环。

3.标准曲线制备

3.1.质粒DNA参考品的制备：通过体外重组的方式将扩增片段插入到T载体，并转化大肠杆菌，提取阳性克隆进行测序，将测序正确的克隆，于空气浴摇床37℃振荡培养增菌，培养物用Promega质粒提取试剂盒提取质粒，取样稀释后用紫外分光光度计测定质粒浓度，并按公式〔浓度(拷贝/μl)＝OD₂₆₀×稀释倍数×50×阿伏加德罗常数/双链长度bp×660〕计算出DNA的初始拷贝数。然后用TE稀释成1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶拷贝/μl六个浓度进行分类，50μl/管分装，-70℃保存。

3.2.质粒DNA参考品标准曲线的制备：取不同DNA载量的质粒参考品(1×10⁰个拷贝/μl、1×10¹个拷贝/μl、1×10²个拷贝/μl、1×10³个拷贝/μl、1×10⁴个拷贝/μl、1×10⁵个拷贝/μl、1×10⁶个拷贝/μl)各2μl，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后根据得到的各个浓度梯度的循环阈值C(t)(见表5)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线(见图6)。

表5检测质粒DNA的灵敏度分析

如图6所示，将上述数据进行回归分析，得到PCR回归方程为：Y＝-3.283X+39.806，相关系数为0.996。实验结果表明，在1×10¹-1×10⁶拷贝范围之间，样本拷贝数与其相应的C_T值具有良好的相关性，因此，本方法可对1×10¹-1×10⁶拷贝范围内的模板进行定量。

4.样品检测

以上述鼠疫耶尔森氏菌污染的血液、水样、土壤、表面粘染等模拟标本及阴、阳性特异性对照样本提取DNA作为扩增模板，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在荧光定量PCR仪上进行扩增。反应体系及扩增条件与做标准曲线时一致。结果见表6，表7在模拟水样、血液和表面沾染样品中，可检出1×10³CFU/ml的细菌，而在污染土壤中，最低只能检出1×10⁵CFU/ml/0.1g的细菌。鼠疫耶尔森氏菌结果为阳性，所有非鼠疫耶尔森氏菌结果为阴性。

表6模拟污染样品的检测结果

*ND：Not Detectected

表7特异性检测结果

*ND：Not Detectected

<110> 浙江国际旅行卫生保健中心

<120> 检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attctgttgt tttgccttga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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cttggatgtt gagcttccta 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taatacgact cactataggg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taaaatccac tgtgatatct t 21

Claims

1.检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂，其特征在于它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；

上游引物的基因序列P1为：5’-ATTCTGTTGTTTTGCCTTGA-3’；

下游引物的基因序列P2为：5’-CTTGGATGTTGAGCTTCCTA-3；

荧光探针的基因序列T7为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；

淬灭探针的基因序列SP6为：5’-TAAAATCCACTGTGATATCTT-3’。

2.一种荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法，其特征在于：它采用直接水煮法提取鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA：取50μl1×10⁹CFU/mL的细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟，10000×g离心2分钟，取2μl上清作为扩增模板；

所述方法的PCR反应体系为25μl：10mmol/L的Tris-HCl，pH为8.0；50mmol/L的KCl；体积百分比3％甲酰胺；5mmol/LMgCL₂；100μmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；0.5μmol/L的权利要求1所述的上游引物，0.5μmol/L的权利要求1所述的下游引物，1.5U Taq酶，100nmol/L的权利要求1所述的荧光探针，200nmol/L的权利要求1所述的淬灭探针；PCR反应程序为：预变性95℃3min、94℃5s、扩增的退火温度为54℃20s共40个循环；

3.如权利要求2所述的一种荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法，其特征在于：荧光定量PCR标准曲线采用以下步骤制得：

取不同DNA载量的质粒参考品各2μl，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后根据得到的各个浓度的循环阈值C(t)，采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。