CN101440400B - 含89k毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测含89K毒力岛猪链球菌2型的基因快速检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒的特异性扩增引物及特异性探针为：16S上游引物：5’-AGCGCAGGCGGTTTGA-3’；16S下游引物：5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；16S特异性探针：5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；89K上游引物：5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；89K下游引物：5’-CGTCTACACCGAATT GTTTTGCA-3’；89K特异性探针：5’-HEX-CATGGGAGATATAAAG AAC-MGB-3’；其中FAM、HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团。本发明方法取样方便简单，检测速度快，灵敏度高、结果准确，可用于SS2发病早期诊断。

Description

含89K毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法

(一)技术领域

本发明涉及一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，自1968年国际上首次报道至2007年止，全世界范围内已超过409例人感染猪链球菌2型(SS2)导致病例发生。早在1990年秋～1991年春，我国长江三角洲某些地区就已发生因链球菌引起的疾病，症状表现为链球菌中毒性休克综合症(STSS)，1998-2005年江苏和四川SS2疫情大暴发，死亡多例，患者大多表现为STSS，但对何种致病因子引起该病及其致病机理尚未查明。2007年文献报道，对来自中毒性休克综合症临床病人的1998年江苏分离株和2005年四川分离株分别作了全序列基因测定，发现这两个中国强毒株比欧洲株多出一段89K序列片段。阐明该致病因子可能是三次流行的SS2的一种重要致病因子，可能是引起我国STSS病的关键致病岛，可作为判定菌株毒力强弱的指标。2008年报道了没有89K毒力岛基因的SS2毒株其毒力下降，致病性与一般SS2株相同；其动物试验表明：含89K毒力岛的SS2感染动物后，两天内动物死亡；当敲除了89K毒力岛中的两组分细胞信号转导基因SalK/SalR的SS2感染动物时，动物存活14天以上。可见89K毒力岛为SS2强毒力株所必有的。

目前针对SS2核酸建立快诊方法的有普通PCR、多重PCR及荧光定量PCR等方法，但未见有同步检测猪链球菌和89K毒力岛基因的检测方法。为了更好的研究携带89K致病岛基因SS2菌株感染的流行病学特征，早期发现病人，及时救治，和有效控制这种病原菌的传播与流行，有必要建立一个快速、敏感且特异的检测方法。为此，针对SS种特异性16S rRNA基因以及89K毒力岛基因序列合成TaqMan-MGB引物与探针研制了该方法。

近几年发展起来的荧光定量PCR技术，它利用了PCR对脱氧核糖核酸(DNA)的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。

荧光定量PCR技术原理：荧光定量PCR是利用荧光染料在激发光的作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化荧光定量PCR仪就可以通过对荧光信号的采集与分析来实现对初始模板的定量。

常用的荧光标记方法可简单分为两大类：1、非特异检测—双链DNA内插式荧光染料；2、扩增序列专一检测—主要指荧光探针和引物探针，荧光标记的探针共有三类：(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3)Taqman双标记探针。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5＇端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、HEX等，3＇端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA、MGB等。当探针完整的时候，5＇端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3＇端荧光基团淬灭，仪器检测不到5＇端报告基团所激发的荧光信号(就是说5＇端荧光基团的发射波长正好是3＇端荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3＇端荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5＇—3＇外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5＇端报告基团游离于反应液中，远离3＇端荧光淬灭基团的屏蔽，5＇端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cycle threshold，Ct)与检测病原核酸量对数值呈线性负相关。根据荧光定量PCR反应中的Ct值就能算出原始的模板量。

TaqMan-MGB探针则是近几年才出现的新型探针，与一般Real-timePCR及TaqMan探针相比，其荧光本底低，分辨率更高，杂交稳定性及特异性更强，敏感度更高，结果更精确，可以将探针的Tm值提高10℃左右等优点。

(三)发明内容

本发明是根据上述原理，设计适合含89K毒力岛猪链球菌2型的特异性引物和特异性探针，提供一种Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测含89K毒力岛猪链球菌2型的基因快速检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物(dNTP)和DNA聚合酶，

所述特异性扩增引物及特异性探针为：

16S rRNA上游引物序列为：

5’-AGCGCAGGCGG TTTGA-3’；

16S rRNA下游引物序列为：

5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；

16S rRNA特异性探针序列为：

5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；

89K上游引物序列为：

5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；

89K下游引物序列为：

5’-CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA-3’；

89K特异性探针序列为：

5’-HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC-MGB-3’；

其中FAM、HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团。

如果需要达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括猪链球菌种特异性16S rRNA和89K毒力岛部分基因克隆质粒标准，所述猪链球菌种特异性16S rRNA部分基因标准序列为：5’-agcgcaggc ggtttgataagtctgaagtaaaaggctgtgg cttaaccatagta cgctttggaaactgt-3’；所述89K毒力岛部分基因标准序列为：5’-ataa aaataccgctgtt ggatggagcatgggagatataaagaacgttgcaaaacaattcggtgtagacg-3’。以梯度浓度的标准品进行荧光检测，Cyclerthreshold value(Ct值)与样品中核酸模板量对数值呈线性负相关，可以通过绘制标准曲线计算出待测样品中SS2核酸含量。克隆质粒标准品：以猪链球菌种特异性16SrRNA和含89K毒力岛基因猪链球菌种DNA为模板，分别扩增16S rDNA、89K毒力岛基因目的片段，将扩增产物克隆至pMD18-T载体上，转化至DH5α大肠杆菌中，挑取阳性克隆增殖后提取质粒DNA进行序列测定以鉴定插入序列，并测定质粒DNA浓度进行拷贝数的换算。

本发明关键在于特异性引物和荧光探针的设计，以及克隆质粒标准序列的设计，试剂盒中的其他组分，比如DNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物等，均可参照本领域常规试剂盒组成。通常的，PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×PCR buffer、0.3～0.5μM的引物、0.1～0.3μM的荧光探针、1～5U的DNA聚合酶、0.2～0.4mM的dNTPs，通常取2～μL的模板，反应总体积通常为20～50μL。

本发明中，所述DNA聚合酶等基础试剂为premix EX Taq DNA聚合酶试剂，是采用探针法进行Real Time PCR的广谱试剂。试剂中已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP等试剂预混在一起，是一种2×浓度的试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。试剂中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法。该试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。ROX Reference Dye II浓度为50×，添加量为0.5μL(PCR反应液总体积25μL)。

所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1:1:1:1的混合物。

所述空白对照：用配置反应体系的DEPC水代替模板。

本发明还涉及一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品DNA；

(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入空白对照或待测样品DNA配成PCR反应液，进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性扩增引物及特异性探针为：

16S rRNA上游引物序列为：

5’-AGCGCAGGCGGTTTGA-3’；

16S rRNA下游引物序列为：

5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；

16S rRNA特异性探针序列为：

5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；

89K上游引物序列为：

5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；

89K下游引物序列为：

5’-CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA-3’；

89K特异性探针序列为：

5’-HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC-MGB-3’；

其中FAM、HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团；

(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号为阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

为达到定量检测的效果，可同时以猪链球菌种特异性16S rRNA和89K毒力岛部分基因克隆质粒作为标准在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以克隆质粒拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标分别绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照相应标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度；所述猪链球菌种特异性16S rRNA部分基因标准序列为：5’-agcgcaggc ggtttgataagtctgaagtaaaaggctgtgg cttaaccatagta cgctt tggaaactgt-3’；所述89K毒力岛部分基因标准序列为：5’-ataa aaataccgctgttggatggagcatggga gatata aagaacgttgcaaaacaattcggtgt agacg-3’。

所述PCR反应液涉及可按照常规进行。具体的，所述PCR反应液主要成分如下：

PCR缓冲液                   终浓度为1×

DNA聚合酶                   0.5～5酶活力单位/反应

dNTP                        终浓度为0.2～0.4mM

16S rDNA上游引物            终浓度为0.1～0.3μM

16S rDNA下游引物            终浓度为0.1～0.3μM

16S rDNA探针                终浓度为0.1～0.3μM

89K上游引物                 终浓度为0.3～0.5μM

89K下游引物                 终浓度为0.3～0.5μM

89K探针                     终浓度为0.4～0.6μM

待分析样本DNA               终浓度为10～10⁵ng/μL

溶剂为DEPC水。

所述PCR扩增反应条件如下：95℃变性10s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火20s扩增，45个循环。

优选的，所述方法如下：

(1)取待测病人的呼吸道咽拭子、血液或体液，提取待测样品DNA；

(2)取所述的特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入空白对照或待测样品DNA配成PCR反应液，进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪于60℃进行下进行双点荧光检测；

所述PCR反应液组成如下：

premix EX Taq试剂                    终浓度为1×

16S rDNA上游引物                     终浓度为0.2μM

16S rDNA下游引物                     终浓度为0.2μM

16S rDNA探针                         终浓度为0.2μM

89K上游引物                          终浓度为0.4μM

89K下游引物                          终浓度为0.4μM

89K探针                              终浓度为0.48μM

待分析样本DNA                        终浓度为10～10²ng/μL

溶剂为DEPC水；

对于部分需要Dye的Real Time PCR扩增仪。上述PCR反应液中

还需要添加ROX Reference Dye II，添加量为0.5μL/25μL反应液总体积。

所述PCR扩增反应条件如下：95℃变性10s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火20s扩增，45个循环；

(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以样品DNA的两项Ct值均<37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则：其中两项Ct值均<35且扩增曲线良好可直接判定为阳性，任意一项Ct值在35～37之间则重复进行PCR扩增和荧光检测，两次检测均能得到良好S型扩增曲线则判定为阳性。

本发明有益效果主要体现在：

1、早期诊断：PCR可直接检测病原体核酸，在SS2发病早期症状不典型时期，就可以检测出是否含有含89K毒力岛猪链球菌2型特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便；

2、取样简单方便：可取潜伏期或发病早期含89K毒力岛猪链球菌2型患者呼吸道咽拭子、血液、体液等标本进行检测；

3、与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时省力，可在2小时左右完成检测；

4、灵敏度高特异性强，由于采用了两套特异性基因扩增和特异性基因探针杂交结合的四重技术，诊断的灵敏度更高，特异性更强；

5、采用计算机实时监测技术，在实验进程中即可判断是否含有病原基因，且实验结果的判断方便准确；

6、可实现病原核酸的定量分析，利用已知拷贝数、含有89K毒力岛猪链球菌2型基因重组质粒为标准品制作标准曲线，可对原始标本中的病原含量进行定量分析。

(四)附图说明

图1为含89K毒力岛猪链球菌2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR方法标准品扩增曲线；

图2为含89K毒力岛猪链球菌2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR方法标准曲线；

图3为TaqMan-MGB双重荧光定量PCR对人感染含89K毒力岛猪链球菌2型临床标本的检测。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

利用本发明所述的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法对浙江省1份疑似SS2病人应急样本进行检测，结果阳性，见图3。

(1)标准曲线测定：

①标准溶液获得：

以猪链球菌种特异性16S rRNA和含89K毒力岛基因猪链球菌种DNA为模板，分别扩增16S rDNA、89K毒力岛基因目的片段，将扩增产物克隆至pMD18-T载体(Takara公司)上，转化至DH5α大肠杆菌中，挑取阳性克隆增殖后提取质粒DNA进行序列测定以鉴定插入序列，并测定质粒DNA浓度进行拷贝数的换算。

取前述克隆质粒标准品10¹⁰copies/ml，按10倍稀释制作10⁹～10¹copies/ml梯度溶液。

②标准曲线的绘制：

PCR反应液终浓度组成如下：

premix EX Taq试剂(2×)(Takara公司)          12.5μl，

16S rDNA上游引物                            0.2μM，

16S rDNA下游引物                            0.2μM，

16S rDNA探针                                0.2μM，

89K上游引物                                 0.4μM，

89K下游引物                                 0.4μM，

89K探针                                     0.48μM，

ROX Reference Dye II                         0.5μL

克隆质粒标准梯度溶液                        4μL

DEPC水补足至25μL；

反应条件为95℃变性10s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火20s扩增，45个循环。在60℃进行双点荧光检测。

标准品的扩增曲线见图1(图中从左至右，扩增的基因拷贝数依次10倍稀释)，实心圆标示的“S”型曲线是两个特征基因重组质粒10⁷拷贝/反应时的检测结果；实心正方形、实心三角形、实心菱形和星形的“S”型曲线的重组质粒浓度分别是10⁶、10⁵、10⁴和10³拷贝/反应。根据标准品Ct值，以克隆质粒拷贝浓度的对数为X轴，CT值为Y轴，制得标准曲线见图2。

(2)样本检测：

(1)提取样品病毒RNA；取浙江省2008年疑似SS2感染患者的血液应急样本用DNA提取试剂盒[Takara宝生物(大连)工程有限公司]，提取DNA；

(2)荧光PCR扩增检测：

PCR反应液终浓度组成：

premix EX Taq酶(2×)             12.5μl，

16S rDNA上游引物                 0.2μM，

16S rDNA下游引物                 0.2μM，

16S rDNA探针                     0.2μM，

89K上游引物                      0.4μM，

89K下游引物                      0.4μM，

89K探针                          0.48μM，

ROX Reference Dye II             0.5μL

血液应急样本提取DNA(约100ng/μL)  4μL

DEPC水补足至25μL；

反应条件为95℃变性10s，1个循环；95℃ 5s，60℃退火20s扩增，45个循环。在60℃进行双点荧光检测。

(3)实时荧光PCR过程中，Cycler threshold value(Ct值)与样品中核酸模板量对数值呈线性负相关，可以通过标准曲线(图2)计算出样品中SS2核酸含量。样品扩增曲线见图3，荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的S型增长，判断为阳性，左边的(Ct值约26)“S”型曲线是病人血液应急样本的SS2菌16S rRNA基因测定阳性结果；右边的(Ct值约30)“S”型曲线为是病人血液应急样本的89k毒力岛基因测定阳性结果。

                                         序列表_ST25.txt

                     SEQUENCE LISTING

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>含89K毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

<210>7

<211>68

<212>DNA

<213>Streptococcus suis

<400>7

<210>8

<211>69

<212>DNA

<213>Streptococcus suis

<400>8

Claims (3)

1.一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测试剂盒，主要包括猪链球菌种特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于：

所述特异性扩增引物及特异性探针为：

16S rRNA上游引物序列为：

5’-AGCGCAGGCGGTTTGA-3’；

16S rRNA下游引物序列为：

5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；

16S rRNA特异性探针序列为：

5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；

89K上游引物序列为：

5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；

89K下游引物序列为：

5’-CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA-3’；

89K特异性探针序列为：

5’-HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC-MGB-3’；

其中FAM、HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括猪链球菌种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因片段标准品，所述猪链球菌种特异性16S rRNA基因片段标准品序列为：5’-agcgcaggc ggtttgataagtctg aagtaaaaggctgtgg cttaaccatagtacgctttggaaactgt-3’；所述89K毒力岛片段标准品序列为：5’-ataa aaataccgctgttggatggagcatgggagatataaagaacgttgcaaaaca attcggtgt agacg-3’。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1的混合物。

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