CN1904068B - 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及及其利用试剂盒检测禽流感病毒的检测方法，试剂盒包括H5N1型禽流感病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶与逆转录酶，荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述H5N1型禽流感病毒血凝素基因标准品部分序列为5’-TGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTT-3’，本发明方法可直接检测病原体核酸，在禽流感发病早期症状不典型时期，就可以检测出是否含有H5N1型禽流感病毒特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便。

Description

一种H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

高致病性禽流感(HPAI)是由H5N1禽流感病毒引起的急性严重呼吸道传染病，其发病率和死亡率极高，是危害禽类的主要烈性传染病之一，被国际兽疫局定为A类传染病。近年来研究发现，高致病性禽流感病毒H5N1可突破种族屏障，感染人类致病甚至死亡。至2003年以来，亚洲与我国因感染禽流感H5N1病毒而死亡的人数已达64人，使之成为严重危害人类健康的恶性传染病之一，而且随着禽流感病毒H5N1对人类的不断适应与快速变异，已对人类的健康构成了极大的威胁。因此，建立快速准确的H5禽流感病毒诊断技术，是预防和控制HPAI扩散和侵入的首要环节。

目前，对H5N1病毒的诊断方法，以普通人流感为基础发展起来的主要有病毒分离、血清学诊断以及分子生物学方法。但病毒分离时间长，要求条件高，分离率低，而采集患者急性期与恢复期双份血清进行抗体测定来确认，又不能及时进行诊断，因此，使这两种方法在使用中受到很大的限制。

近几年发展起来的荧光定量PCR技术，它利用了PCR对脱氧核糖核酸(DNA)的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复性好、 特异性强、敏感性高和易操作等优点。

荧光定量PCR技术原理：荧光定量PCR是利用荧光染料在激发光的作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化荧光定量PCR仪就可以通过对荧光信号的采集与分析来实现对初始模板的定量。

常用的荧光标记方法可简单分为两大类：1、非特异检测——双链DNA内插式荧光染料；2、扩增序列专一检测——主要指荧光探针和特异性引物，荧光标记的探针共有三类：(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3)Taqman双标记探针。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基因(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5′端荧光基团的发射波长正好是3′端荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3′端荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cycle threshold，Ct)与检测病毒核酸量对数值呈线性负相关。 根据荧光定量PCR反应中的Ct值就能算出原始的模板量。

(三)发明内容

本发明就是根据上述原理，设计适合禽流感病毒的特异性引物和特异性探针，发明目的在于提供一种H5N1型高致病性禽流感病毒的基因快速检测试剂盒及检测方法。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，包括H5N1型禽流感病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶与逆转录酶，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述H5N1型禽流感病毒血凝素基因标准品部分序列为5’-TGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTT-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物序列5’-TGGATGGCTCCTCGGRAAC-3’，下游引物序列5’-ARGACCATTCCGGCACATT-3’，所述特异性探针序列为5’-FAM-TGTGTGACGAATTCAT-NFQ-MGB-3’，其中FAM为报告荧光基团，NFQ为非荧光淬灭基团，MGB为修饰基团。

所述荧光扩增检测试剂主要成分如下：

一步法RT-PCR缓冲液    终浓度为1×

特异性扩增上游引物    0.2～0.6μM

特异性扩增下游引物    0.2～0.6μM

特异性探针            0.6～1.0μM

脱氧三磷酸核苷混合物  400～800μM

余量为DEPC水。

上述物质浓度均为各物质在反应体系中的终浓度。脱氧三磷酸核苷混合物dATP、dTTP、dCTP、dGTP混合。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温、高压消毒的MiliQ级纯水。

所述一步法RT-PCR缓冲液终浓度为1×，意思是缓冲液中各组分浓度与1×RT-PCR bufffer相同，即表示缓冲液中各组分在反应液中终浓度如下：KCl 50mM，Tris-HCl 10mM，TritonX-100  0.1％，MgCl₂ 1.5mM。本发明中选用体积为反应液总体积20％的5×RT-PCR buffer。

通常，为减少RNA酶污染，所述荧光扩增检测试剂中还添加有RNA酶抑制剂，本发明中RNA酶抑制剂优选终浓度为0.8活力单位/μL的RNasin。RNasin核酸酶抑制剂是由Promega研究和开发的，具有广谱的RNA酶抑制活力，用于清除RNA酶污染。RNasin核酸酶抑制剂是1个50kD大小的蛋白，它和RNA酶以非共价键按1∶1结合，而抑制RNA酶活力，结合常数为10-14。RNasin核酸酶抑制剂的活力单位定义为抑制5ngRNase A水解2`，3`-单磷酸环化胞苷的50％的活力所用的抑制剂的量。

所述荧光扩增检测试剂中还添加有终浓度5mM的二巯基苏糖醇(DTT)。

所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量1∶1∶1∶1的混合物。

所述DNA聚合酶用量为0.5～5酶活力单位/反应，选自下列之一：①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。

所述逆转录酶用量为6～300酶活力单位/反应，选自下列之一：① M-MuLV逆转录酶；②AMV逆转录酶。

所述荧光扩增检测试剂组成如下：

5×RT-PCR buffer         终浓度为1×

二巯基苏糖醇             5mM

RNA酶抑制剂RNasin        0.1活力单位/μL

特异性扩增上游引物       0.48μM

特异性扩增下游引物       0.48μM

特异性探针               0.64μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 200μM

余量为                   DEPC水。

一种H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测方法，所述的检测方法以H5N1型禽流感病毒血凝素基因标准品为对照，采用待测病人的含漱液为分析样本，所述方法步骤如下：

(1)取含漱液提取病毒RNA；

(2)荧光PCR扩增检测：取荧光扩增检测试剂与反应所需的DNA聚合酶与逆转录酶配成反应液，加入对照品与分析样本的RNA分别进行扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；

(3)结果分析：选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性；

所述H5N1型禽流感病毒血凝素基因部分序列为 5’-TGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTT-3’，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，所述特异性扩增引物为：上游引物序列5’-TGGATGGCTCCTCGGRAAC-3’，下游引物序列5’-ARGACCATTCCGGCACATT-3’，所述特异性探针序列为5’-FAM-TGTGTGACGAATTCAT-NFQ-MGB-3’，其中FAM为报告荧光基团，NFQ为非荧光淬灭基团，MGB为修饰基团。

所述的方法取定量荧光扩增检测试剂配制反应液，具体的，反应体系每25μL组成如下：

5×RT-PCR buffer    5μL

二巯基苏糖醇        5mM

RNA酶抑制剂RNasin   0.1活力单位/μL

特异性扩增上游引物  0.48μM

特异性扩增下游引物  0.48μM

特异性探针          0.64μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM

Ampli TaqR DNA聚合酶2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶         50酶活力单位/反应

分析样本病毒RNA     5μL

DEPC水补足至        25μL；

所述检测方法步骤(2)PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94 ℃变性2min，以95℃15s，50℃退火30sec扩增40个循环，在50℃进行单点荧光检测。退火温度适宜范围为50～55℃，退火时间适宜范围为30sec～1min。

本发明有益效果主要体现在：

1、早期诊断：PCR可直接检测病原体核酸，在禽流感发病早期症状不典型时期，就可以检测出是否含有H5N1型禽流感病毒特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便。

2、取样简单方便：可取潜伏期或发病早期禽流感患者呼吸道样本进行检测。

3、与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时省力，可在2～3小时内完成检测。

4、灵敏度高，由于采用了特异性基因扩增和特异性基因探针杂交结合的双重技术，诊断的灵敏度更高。

5、采用计算机实时监测技术，在实验进程中即可判断是否含有病毒基因，且实验结果的判断方便准确。

6、可实现病毒核酸的定量分析，利用已知拷贝数、含有H5N1型禽流感病毒基因重组质粒为标准品制作标准曲线，可对原始标本中的病毒含量进行定量分析。

(四)说明书附图

图1为H5N1型禽流感病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法标准品扩增曲线；

图2为H5N1型禽流感病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法标准曲线；

图3为荧光定量RT-PCR对禽流感病毒H5核酸检测的重现性；

图4为TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR对人感染H5N1高致病禽流感病 毒临床标本的检测。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

利用本发明所述的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法对浙江省2006年2月发生的疑似H5N1高致病性禽流感病毒感染患者的下呼吸道吸出物标本1份进行检测，结果阳性(该样本经中国疾病预防控制中心复检，证实为H5N1阳性)。

(1)标准曲线测定：

反应体系如下：

5×RT-PCR buffer     5μL

二巯基苏糖醇         5mM

RNA酶抑制剂RNasin    0.1单位/μL

特异性扩增上游引物   0.48μM

特异性扩增下游引物   0.48μM

特异性探针           0.64μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM

Ampli TaqR DNA聚合酶 2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶          50酶活力单位/反应

H5N1病毒标准品RNA    5μL

DEPC水补足至         25μL；

PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94℃变性2min，以95℃15s，50℃退火30sec扩增40个循环，在50℃进行单点荧光检测。

标准品的扩增曲线见图1(图中从左至右，扩增的病毒拷贝数依次为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²)，根据标准品Ct值制得标准曲线见图2。

(2)样本检测：

(1)提取样品病毒RNA；取浙江省2006年2月发生的疑似H5N1高致病性禽流感病毒感染患者的下呼吸道吸出物标本200ul用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit提取病毒RNA，浓度1.0μg/μL；

(2)荧光PCR扩增检测：

反应体系：

5×RT-PCRbuffer         5μL

二巯基苏糖醇            5mM

RNA酶抑制剂RNasin       0.1单位/μL

特异性扩增上游引物      0.48μM

特异性扩增下游引物      0.48μM

特异性探针              0.64μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM

Ampli TaqR DNA聚合酶    2.5酶活力单位/反应

AMV逆转录酶             50酶活力单位/反应

样品RNA                 5μL

DEPC水补足至            25μL；

PCR循环条件设置为45℃30min逆转录，94℃变性2min，以95℃15s，50℃退火30sec扩增40个循环，在50℃进行单点荧光检测。

(3)实时荧光PCR过程中，cycler threshold value(Ct值)与样品中核酸模板量对数值呈线性负相关，可以通过标准曲线计算出样品中H5N1病毒核酸含量。选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。

H5荧光定量RT-PCR的重现性评价：选择10⁷～10⁵copies的三个外标准品进行定量PCR检测，每个样本作五次重复，通过计算同一样本Ct值的变异系数来验证方法的重复性。变异系数均小于1％，说明该方法重复性好，见图3和表1：

表1  荧光定量RT-PCR检测禽流感病毒H5的重现性

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR对人感染H5N1高致病禽流感病毒临床标本的检测：利用本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法对浙江省2006年2月发生的疑似H5N1高致病性禽流感病毒感染患者的下呼吸道吸出物标本1份进行检测，(核酸提取和荧光定量RT-PCR过程同前所述)，扩增曲线见图4，结果阳性(该样本经中国疾病预防控制中心复检，证实为H5N1阳性)。

序列表.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>一种H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>59

<212>DNA

<213>Orthomyxo virus

<400>1

tggatggctc ctcggaaacc caatgtgtga cgaattcatc aatgtgccgg aatggtctt    59

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

tggatggctc ctcggraac                                                19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

argaccattc cggcacatt                                                19

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

tgtgtgacga attcat                                                   16

Claims (8)

1.一种H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，包括H5N1型禽流感病毒血凝素基因标准品、荧光扩增检测试剂以及DNA聚合酶与逆转录酶，所述荧光扩增检测试剂主要包括一步法RT-PCR缓冲液、特异性扩增引物及特异性探针、脱氧三磷酸核苷混合物，其特征在于：所述H5N1型禽流感病毒血凝素基因标准品部分序列为5’-TGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTT-3’，所述特异性扩增引物为：上游引物序列5’-TGGATGGCTCCTCGGRAAC-3’，下游引物序列5’-ARGACCATTCCGGCACATT-3’，所述特异性探针序列为5’-FAM-TGTGTGACGAATTCAT-NFQ-MGB-3’，其中FAM为报告荧光基团，NFQ为非荧光淬灭基团，MGB为修饰基团。

2.如权利要求1所述的H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂主要成分如下：

一步法RT-PCR缓冲液     终浓度为1×

特异性扩增上游引物     0.2～0.6μM

特异性扩增下游引物     0.2～0.6μM

特异性探针             0.6～1.0μM

脱氧三磷酸核苷混合物   400～800μM

余量为DEPC水。

3.如权利要求2所述的H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂中还添加有终浓度为0.1活力单位/μL的RNA酶抑制剂RNasin。

4.如权利要求2所述的H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂中还添加有终浓度5mM的二巯基苏糖醇。

5.如权利要求1所述的H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量1∶1∶1∶1的混合物。

6.如权利要求1所述的H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶用量为0.5～5酶活力单位/反应，选自下列之一：①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶。

7.如权利要求1所述的H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述逆转录酶用量为6～300酶活力单位/反应，选自下列之一：①M-MuLV逆转录酶；②AMV逆转录酶。

8.如权利要求1所述的H5N1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒，其特征在于所述荧光扩增检测试剂组成如下：

5×一步法RT-PCR缓冲液         终浓度为1×

二巯基苏糖醇                  5mM

RNA酶抑制RNasin               0.1活力单位/μL

特异性扩增上游引物            0.48μM

特异性扩增下游引物            0.48μM

特异性探针                    0.64μM

脱氧三磷酸核苷混合物为：

dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM

余量为DEPC水。

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