CN111676319A - 一种检测猪瘟病毒的lamp引物组、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种检测猪瘟病毒的lamp引物组、试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN111676319A CN202010572979.5A CN202010572979A CN111676319A CN 111676319 A CN111676319 A CN 111676319A CN 202010572979 A CN202010572979 A CN 202010572979A CN 111676319 A CN111676319 A CN 111676319A
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张婵
范葶莉
时国强
李翀
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Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开一种检测猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法。本发明提供的检测引物包括一对外引物，一对内引物和一对环引物。本发明提供的引物仅对猪瘟病毒有扩增反应，且最低检测限可达6拷贝/μl，对猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒等10种病原无扩增反应，特异性强，灵敏度高，检测效果准确可靠，操作简单，适用于猪瘟病毒的快速检测，可用于进出口检疫、食品卫生部门、畜牧饲养场等的现场检测，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

一种检测猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法。
背景技术
猪瘟病毒(Classical Swine fever virus，CSFV)是猪瘟的病原，感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)，其他动物不发病。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，以高热、内脏器官严重出血和高死亡率为特征，是对养猪业危害最大、最危险传染病之一，呈世界范围流行，被世界动物卫生组织列为A类16种法定传染病之一，我国定为一类列性传染病。近年来，我国猪瘟在流行病学、临床症状和病理变化等方面出现了较大的变化，发病呈周期性、波浪式的地区性散发性流行，临床症状和病理变化表现为非典型或温和型，亚临床感染、持续感染和免疫耐受普遍存在。因此，依靠常规临床症状和病理变化很难确诊，给我国猪瘟防控工作带来较大的困难。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amlification，LAMP)，是一种新兴的核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。目前，用于荧光快速检测猪瘟病毒的LAMP引物组的检测结果灵敏度较低，且易产生假阴性或假阳性结果。
发明内容
针对现有检测猪瘟病毒的LAMP方法存在特异性差、灵敏度低的问题，本发明提供一种检测猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种检测猪瘟病毒的LAMP引物组，包括一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP和一对环引物LF和LB，其中，所述外引物的序列为：
F3：5′-AGATTCCCTACCTCCCTCCTA-3′；
B3：5′-AACACCCTTTCTGAATGACCA-3′；
所述内引物的序列为：
FIP：5′-GGAGACTGGTTGGGCTTACAC-3′；
BIP：5′-TTATTCTACTGGCTGCTCAGG-3′；
所述环引物的序列为：
LF：5′-AGGGCGGCAGCAGAATCAGTA-3′；
LB：5′-CGGTGCCCTTATTGGATACGG-3′。
相对于现有技术，本发明针对猪瘟病毒基因组的5′端非编码区设计了特异性引物，该引物仅对猪瘟病毒有扩增反应，且最低检测限可达6拷贝/μl，对猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒等10种病原无扩增反应，特异性强，灵敏度高，检测效果准确可靠，操作简单，适用于猪瘟病毒的快速检测，可用于进出口检疫、食品卫生部门、畜牧饲养场等的现场检测，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
本发明还提供了一种检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒，包含上述的LAMP引物组。
优选的，所述LAMP试剂盒还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。
优选的，所述LAMP反应液包括dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、MgSO4水溶液，EvaGreen和双蒸水。
优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
本发明还提供上述LAMP试剂盒的使用方法，具体操作为：提取待测病毒的基因组RNA，并将提取的基因组RNA进行反转录，得cDNA，以反转录得到的cDNA为模板，用所述试剂盒进行LAMP扩增，观察荧光信号，若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为猪瘟病毒阳性，若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为猪瘟病毒阴性。
上述LAMP试剂盒的使用方法，耗时短、反应结果直观，可用于猪瘟病毒的快速检测。
优选的，所述LAMP扩增的体系包括以下试剂及用量：
10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL，
5mol/L的甜菜碱2.5μL，
25μmol/L的F3引物0.2μL，
25μmol/L的B3引物0.2μL，
25μmol/L的FIP引物1.6μL，
25μmol/L的BIP引物1.6μL，
25μmol/L的LP引物0.8μL，
25μmol/L的BP引物0.8μL，
10mmol/L的dNTP 3.0μL，
25mmol/L的MgSO4溶液6.0μL，
8U的Bst DNA聚合酶.0μL，
模板RNA2.0μL，
5U的AMV逆转录酶1.0μL，
双蒸水补足至25μL。
优选的，所述LAMP扩增的反应条件为：65℃，40min。
上述优选的反应条件可进一步提高猪瘟病毒的检测效率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
引物筛选和设计
参照Genbank中登录的猪瘟病毒的CP016318基因5′端非编码区的保守序列(SEQID NO:7)设计了两对特异性引物(外引物F3、B3，内引物FIP、BIP)，为了提高扩增效率，根据设计的4条引物又设计出1对环引物(LF、LB)，引物序列如表1所示。
Figure BDA0002550320640000041
取猪瘟阳性样品，采用RNA试剂盒提取基因组RNA，反转录得到cDNA，并用反转录得到的cDNA作为模板，在等温荧光PCR仪上分别使用上述设计的引物组合A和引物组B进行LAMP扩增，扩增反应体系为：10×Thermopol聚合酶浓缩缓冲液2.5μL，甜菜碱(5mol/L)4.0μL，正向和反向内引物(25μmol/L)各0.2μL，正向和反向外引物(25μmol/L)各1.6μL，正向和反向环引物(25μmol/L)各0.8μL，dNTP(10mmol/L)3.0μL，MgSO4(25mmol/L)6.0μL，Bst DNA聚合酶(8U)1.0μL，Eva Green 1μL，模板RNA 2.0μL，AMV逆转录酶(5U)1.0μL，双蒸水补足至25μL。
扩增条件为：65℃，40min。
结果显示，引物组A可以在19min检测出猪瘟病毒阳性样品核酸，引物组B在第45min检出猪瘟病毒阳性样品核酸，说明本发明设计的引物组A具有较高的扩增效率。
本发明最终筛选的LAMP检测引物组序列如表2所示，通过BLAST比对确定其特异性后，由上海生工生物工程有限公司合成。
表2
Figure BDA0002550320640000051
将上述引物用双蒸水稀释至浓度为25μmol/L，-20℃保存备用。
实施例2
一种测猪瘟病毒的LAMP引物组，包括一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP和一对环引物LF和LB，其中，所述外引物的序列为：
F3：5′-AGATTCCCTACCTCCCTCCTA-3′；
B3：5′-AACACCCTTTCTGAATGACCA-3′；
所述内引物的序列为：
FIP：5′-GGAGACTGGTTGGGCTTACAC-3′；
BIP：5′-TTATTCTACTGGCTGCTCAGG-3′；
所述环引物的序列为：
LF：5′-AGGGCGGCAGCAGAATCAGTA-3′；
LB：5′-CGGTGCCCTTATTGGATACGG-3′。
检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒，包含上述的引物组、Bst DNA聚合酶、dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、MgSO4水溶液，Eva Green、甜菜碱、阳性对照、阴性对照和双蒸水。
其中，阴性对照为无菌水，阳性对照为带有CSFV 5′端保守序列的质粒PMD18-CSF。
上述试剂盒的使用方法为：提取待测病毒的基因组RNA，并将提取的基因组RNA进行反转录，得cDNA，以反转录得到的cDNA为模板，用所述试剂盒进行LAMP扩增，观察荧光信号，若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为猪瘟病毒阳性，若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为猪瘟病毒阴性。
其中，LAMP扩增体系如下：
10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL，
5mol/L的甜菜碱2.5μL，
25μmol/L的F3引物0.2μL，
25μmol/L的B3引物0.2μL，
25μmol/L的FIP引物1.6μL，
25μmol/L的BIP引物1.6μL，
25μmol/L的LP引物0.8μL，
25μmol/L的BP引物0.8μL，
10mmol/L的dNTP 3.0μL，
25mmol/L的MgSO4溶液6.0μL，
8U的Bst DNA聚合酶.0μL，
模板RNA2.0μL，
5U的AMV逆转录酶1.0μL，
双蒸水补足至25μL。
扩增条件为：65℃，40min。
采用上述试剂盒对76份疑似CSFV感染的待检测样品进行检测，提取待检测临床样品的基因组RNA，设置一个阴性对照和一个猪瘟病毒阳性对照，按照本实施例中试剂盒的使用方法进行LAMP检测。经检测，其中阴性对照无荧光信号，阳性对照的荧光信号强度随时间的增加而增强。76份待检测样品中，阳性结果为27份，阴性结果为49份，用TaqMan荧光定量PCR(引物序列上游：5′-AGATTCCCTACCTCCCTCCTA-3′，下游：5′-AACACCCTTTCTGAATGACCAC-3′)对上述76份待检测样品进行检测，结果与LAMP检测结果完全相同，符合率为100％。
实施例3
3.1特异性试验
取猪瘟阳性样本和10种与猪瘟病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体，按照DNA/RNA提取试剂盒使用说明书分别提取猪瘟病毒(CSFV)，猪口蹄疫病毒(FMDV)和水泡型口炎病毒(VSV)的RNA基因组，以及猪伪狂犬病毒(PRV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪传染型胃肠炎病毒(TEGV)，猪轮状病毒(RV)，猪蓝耳病病毒(PRRSV)，乙型脑炎病毒(JEV)，猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪细小病毒(PPV)的基因组DNA。
将提取得到的CSFV、FMDV、VSV的基因组RNA进行反转录，得到cDNA，并用反转录得到的CSFV、FMDV、VSV的cDNA和pRV、PEDV、TEGV、RV、PRRSV、JEV、PCV-2与PPV的基因组DNA作为模板进行LAMP扩增，设置一个阴性对照和一个猪瘟病毒阳性对照，按照本发明LAMP试剂盒的使用方法进行LAMP检测。
扩增反应体系为：10×Thermopol聚合酶浓缩缓冲液2.5μL，甜菜碱(5mol/L)4.0μL，正向和反向内引物(25μmol/L)各0.2μL，正向和反向外引物(25μmol/L)各1.6μL，正向和反向环引物(25μmol/L)各0.8μL，dNTP(10mmol/L)3.0μL，MgSO4(25mmol/L)6.0μL，Bst DNA聚合酶(8U)1.0μL，Eva Green 1μL，模板RNA 2.0μL，AMV逆转录酶(5U)1.0μL，双蒸水补足至25μL。
将上述反应物混合均匀后，65℃反应40min。
结果表明：本发明的试剂盒可以成功检测出猪瘟阳性样本和阳性对照，FMDV、VSV、PRV、PEDV、TEGV、RV、PRRSV、JEV、PCV-2、PPV和阴性对照结果均为阴性，说明本发明筛选的LAMP引物组制备的试剂盒具有很高的特异性。
3.2敏感性测试
将带有CSFV 5′端保守序列的质粒PMD18-CSF进行梯度稀释，分别稀释成2×102copies/μL、2×101copies/μL、6copies/μL、4copies/μL、2copies/μL。采用本发明提供的LAMP检测方法进行灵敏度试验。
实验结果说明，发明所构建的猪瘟病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度为6拷贝/μl，灵敏度高。
3.3重复性
用本发明提供的三批试剂盒对30份阳性样品进行重复检测，又由3位检测人员进行检测，每个样品重复检测3次，以验证该方法的重复性，结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002550320640000091
结果表明，采用本发明提供的不同批次的LAMP试剂盒由不同检测人员检测猪瘟阳性样品，重复测定三次变异系数C.V＝0％，说明本发明提供的LAMP试剂盒三次检测数据的无变异程度，且批次间也无变异，重复性好。
实验结果说明，本发明试剂盒可用于临床检测，具有较高的准确度。
综上所述，本发明提供的引物和试剂盒快速检测猪瘟病毒，且特异性强、灵敏度高、准确度好，有利于尽快采取有效的治疗和防控措施，减少这些疾病对养猪业造成的危害，有利于在临床实践中推广应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002550320640000101
Figure BDA0002550320640000111
Figure BDA0002550320640000121
Figure BDA0002550320640000131
Figure BDA0002550320640000141
Figure BDA0002550320640000151
SEQUENCE LISTING
<110> 河北三狮生物科技有限公司
<120> 一种检测猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法
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ctcgtatacg atattggata cactaaattt cgatttggtc tagggcaccc ctccagcgac 60
ggccgaaatg ggctagccat gcccatagta ggactagcaa acggagggac tagccgcagt 120
ggcgagctcc ctgggtggtc taagtcctga gtacaggaca gtcgtcagta gttcgacgtg 180
agcactagcc cacctcgaga tgctacgtgg acgagggcat gcccaagaca caccttaacc 240
ctggcggggg tcgctagggt gaaatcacat tatgtgatgg gggtacgacc tgatagggtg 300
ctgcagaggc ccactagcag gctagtataa aaatctctgc tgtacatggc acatgggacc 360
agctgtttgc aagaaggtta ctgaacacga aagatgcacc acgtctataa tggataagtt 420
gactgctttc tttggagtaa tgccaagggg cactactccc agagctcccg taagattccc 480
tacctccctc ctaaagataa gaagagggct ggagactggt tgggcttaca cacaccaagg 540
tggcatcagc tcagtagacc atgtcacttg tgggaaagac ttactggtgt gtgacaccat 600
gggtcggaca agggttgttt gccagtcaaa taataagatg accgacgagt ccgaatacgg 660
agtcaaaact gactccgggt gccgagaggg agccaggtgt tacgtgttta acccggaagc 720
agttaacata tcaggcacta aaggagccat ggtccactta cagaaaacgg gtggagaatt 780
ctcgtatacg atattggata cactaaattt cgatttggtc tagggcaccc ctccagcgac 840
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tacctccctc ctaaagataa gaagagggct ggagactggt tgggcttaca cacaccaagg 1320
tggcatcagc tcagtagacc atgtcacttg tgggaaagac ttactggtgt gtgacaccat 1380
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cacctgtgtg acagcatcag gaaccccggc cttctttgac ctcaagaacc ttaagggctg 1620
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gaagaacgag gattccaaac caaccaagct catgagtggg atacaaacgg tttctaaaag 1740
cgccacagac ttgacggaga tggtgaagaa gataacgacc atgaacaggg gagagttcag 1800
acaaataacc ctggccacag gtgccggaaa aactacagag ctccctagat cagttataga 1860
agagataggg aggcataaga gggtgttggt cttaatcccc ttgagggcgg cagcagaatc 1920
agtataccaa tacatgagac agaaacatcc gagtatagca ttcaatctaa ggataggtga 1980
gatgaaggaa ggtgatatgg ccacgggaat aacctatgcc tcttacggtt acttttgcca 2040
gatgtcacaa cccaaggtga gagccgcaat ggtagaatat tcctttatat tcctagatga 2100
gtatcattgt gctaccccag aacaactggc aatcatgggg aagatccaca gattctcaga 2160
aaacctgcgg gtggtagcta tgacagcgac accggcaggc acagtaacaa ccactgggca 2220
gaaacaccct atagaggaat ttatagcccc ggaagtgatg aaaggagaag acttgggttc 2280
tgagtactta gatattgccg gactgaagat accagtagag gagatgaaga ataacatgct 2340
agtttttgtg cccaccagga acatggcggt agaggcggca aagaaattga aggcca 2396

Claims (8)

1.一种检测猪瘟病毒的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3和B3，一对内引物FIP和BIP和一对环引物LF和LB，其中，所述外引物的序列为：
F3：5′-AGATTCCCTACCTCCCTCCTA-3′；
B3：5′-AACACCCTTTCTGAATGACCA-3′；
所述内引物的序列为：
FIP：5′-GGAGACTGGTTGGGCTTACAC-3′；
BIP：5′-TTATTCTACTGGCTGCTCAGG-3′；
所述环引物的序列为：
LF：5′-AGGGCGGCAGCAGAATCAGTA-3′；
LB：5′-CGGTGCCCTTATTGGATACGG-3′。
2.一种检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的LAMP引物组。
3.如权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。
4.如权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液包括dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、MgSO4水溶液，Eva Green和双蒸水。
5.如权利要求4所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.权利要求5所述的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于，具体操作为：提取待测病毒的基因组RNA，并将提取的基因组RNA进行反转录，得cDNA，以反转录得到的cDNA为模板，用所述试剂盒进行LAMP扩增，观察荧光信号。
7.如权利要求6所述的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于：所述LAMP扩增的体系包括以下试剂及用量：
10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL，
5mol/L的甜菜碱2.5μL，
25μmol/L的F3引物0.2μL，
25μmol/L的B3引物0.2μL，
25μmol/L的FIP引物1.6μL，
25μmol/L的BIP引物1.6μL，
25μmol/L的LP引物0.8μL，
25μmol/L的BP引物0.8μL，
10mmol/L的dNTP 3.0μL，
25mmol/L的MgSO4溶液6.0μL，
8U的Bst DNA聚合酶1.0μL，
模板RNA2.0μL，
5U的AMV逆转录酶1.0μL，
双蒸水补足至25μL。
8.如权利要求6所述的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于：所述LAMP扩增的反应条件为：65℃，40min。
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