CN114075611A - 一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试剂盒 - Google Patents

一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试剂盒 Download PDF

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王小明
李俊敏
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Abstract

本发明公开了一种双靶标SARS‑CoV‑2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试剂盒，涉及病毒核酸检测方法技术领域。本发明选取SARS‑CoV‑2病毒核衣壳蛋白N基因及刺突蛋白S基因双基因序列，针对SARS‑CoV‑2病毒的保守区域设计出双靶点特异性核酸检测引物组，可特异性检测SARS‑CoV‑2病毒。本发明还提供检测SARS‑CoV‑2病毒的一锅法RT‑LAMP荧光检测试剂盒，咽拭子等样本无需核酸提取，在65℃等温条件下，通过荧光扩增仪观察扩增曲线，30分钟内可准确检测SARS‑CoV‑2病毒，直接实现“病毒‑结果”的检测。该荧光试剂盒采用双引物组设计，特异性强，灵敏度高，无交叉反应，可快速准确地筛查SARS‑CoV‑2病毒，操作简单，安全性高；检测结果直观，判定操作简单，在病毒核酸检测领域具有良好的应用优势。

Description

一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试 剂盒
技术领域
本发明涉及病毒核酸检测方法技术领域，尤其涉及一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，一种检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒以及应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的一种急性感染性肺炎，新型冠状病毒具有极强的传染性，在未进行严格防控状态下，基本再生数R0为3.8；当前全球新冠肺炎已经导致1300多万感染者和57万感染者死亡。
在疫情防控过程中，实时荧光定量RNA反转录与cDNA聚合酶链式扩增相结合的检测技术RT-qPCR是检测病毒的主要手段，但是该检测技术存在检测时间长，仪器设备操作复杂等问题，造成当前临床应用假阴性较高的问题。这一方法需要进行核酸的提取，容易造成医务人员的感染和核酸丢失，影响检测的准确性。为了解决上述问题，已引入数字PCR，测序以及等温扩增技术。目前临床已有新型冠状病毒等温扩增试剂，可缩短扩增时间，设备要求较低，但是依然存在通量低，需要核酸提取，检测时间较长，较高概率假阴性和假阳性。
例如，专利CN111254227A公开了一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，包括以S基因为靶标的第一荧光探针组、以E基因为靶标的第二荧光探针组、以M基因为靶标的第三荧光探针组、以ORF 3a基因为靶标的第四荧光探针组、以N基因为靶标的第五荧光探针组，和以ORF 1ab基因为靶标的第六荧光探针组中的至少两种荧光探针组；至少两种荧光探针组中，至少一种荧光探针组标记的荧光分子具有区别于其余的荧光探针组的荧光发射光谱。该专利通过荧光原位杂交技术进行检测，判断过程复杂，不直观。
再如，专利CN111270021A公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用，需要对样品进行核酸提取，容易造成二次污染等问题，存在安全隐患。
综上，临床急需一种无需核酸提取，直接使用呼吸道样本加样检测，防止二次污染和防止检测人员被感染；对仪器设备要求不高；灵敏度高，特异性强；可快速批量完成检测的新型冠状病毒核酸检测试剂(盒)，对疑似病例进行快速确诊，保证患者得到及时治疗具有重大意义。
发明内容
为提高对疑似SARS-CoV-2病毒感染者和新型冠状病毒大规模筛查的准确性和快速特点，本发明的第一目的是提供一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，实现对SARS-CoV-2病毒的准确检测。
本发明的第二目的在于提供一种检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，对咽拭子样本免核酸提取，利用双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，实现COVID-19快速检测、筛查。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
本发明提供的鉴别COVID-19的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，根据GenBank:MN908947.3公布的全长为29903bp的SARS-CoV-2病毒序列，应用Primer Explorer软件设计并通手工筛选，获得SARS-CoV-2病毒N及S两组特异性引物组。该双靶点引物组可特异性检测SARS-CoV-2病毒并开发成检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP检测荧光试剂盒。
第一方面，本发明提供一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，包括N基因引物组和S基因引物组；
所述N基因引物组包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；
所述F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1、LB-1的核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-1：CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC；
B3-1：CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT；
FIP-1：ACCCACATAATAAGCTGCAGCA-GTTATTTGACTCCTGGTGATT；
BIP-1：ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCTGA；
LF-1：CCAGCTGTCCAACCTGAAGA；
LB-1：ACTGTGCACTTGACCCTCTC。
其进一步地技术方案为，所述S基因引物组包括一对外引物F3-2和B3-2、一对内引物FIP-2和BIP-2、以及一对环引物LF-2、LB-2；
所述F3-2、B3-2、FIP-2、BIP-2、LF-2、LB-2的核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-2：CACCCGCAATCCTGCTAAC；
B3-2：CCAGCCATTCTAGCAGGAGA；
FIP-2：TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGC-GCTGCAATCGTGCTACAACT；
BIP-2：GGCGGCAGTCAAGCCTCTTC-CCTACTGCTGCCTGGAGTT；
LF-2：TGGCAATGTTGTTCCTTGAGG；
LB-2：ATCACGTAGTCGCAACAGTTC。
本发明选取SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白N基因及刺突蛋白S基因双基因序列，针对作为SARS-CoV-2病毒双靶点的保守区域设计出双靶点特异性核酸检测引物组，可特异性检测COVID-19。
第二方面，本发明提供一种检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，包括反应预混液A、反应预混液B、阳性质控、阴性对照，还包括以下物质：1)Bst DNA大片段聚合酶；2)AMV逆转录酶；3)SYBR Green I荧光染料；4)10×反应缓冲液；5)权利要求1或2所述的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组；6)dNTPs；7)硫酸镁；8)甜菜碱；9)甲酰胺；10)DEPC水。
其进一步地技术方案为，所述反应预混液A包括Bst DNA大片段聚合酶2-10U、AMV逆转录酶2-10U、0.5μL SYBR green I荧光染料(1000×)；
所述反应预混液B包括10×反应缓冲液、如第一方面所述的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、dNTPs 1-5mM、硫酸镁1-12mM、甜菜碱0.1-1.5mM、甲酰胺和DEPC水。
其进一步地技术方案为，所述甲酰胺选用体积分数30％以下的甲酰胺溶液。
优选地，所述甲酰胺选用体积分数2-15％的甲酰胺溶液。
其进一步地技术方案为，所述阳性质控为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白N基因及刺突蛋白S基因的基因组片段；所述阴性对照为DEPC水。
其进一步地技术方案为，所述反应预混液B的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组中，N基因引物组和S基因引物组的浓度比例为1：0.1～10。
优选地，所述反应预混液B的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组中，N基因引物组和S基因引物组的浓度比例为1：0.5～8。
更优选地，所述反应预混液B的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组中，N基因引物组和S基因引物组的浓度比例为1：1～5。
其进一步地技术方案为，所述N基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
其进一步地技术方案为，所述S基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
以上所述的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒的使用方法，包括环介导等温扩增和结果判定：
(1)待检咽拭子样品或核酸片段，无需对咽拭子样品核酸提取，直接检测。
(2)一锅法RT-LAMP反应体系及条件：检测管中的25μL反应体系含有3μL反应预混液A，17μL反应预混液B，待检样品5μL，同时设置阳性质控和阴性对照，放入荧光扩增仪中，设定65℃反应30min，并在85℃中断反应。
(3)荧光扩增仪观察扩增曲线：
通过荧光扩增仪观察扩增曲线是否呈“S”型，确定检测结果。观察到呈“S”型扩增曲线，则检测结果判定为阳性，即检测样本中含有SARS-CoV-2病毒；观察到不呈“S”型扩增曲线，则检测结果判定为阴性，即检测样本中不含有SARS-CoV-2病毒。
本发明的有益效果是：
1)本发明根据Gene Bank中公布的SARS-CoV-2病毒的N基因及S基因序列，设计双靶点特异性核酸检测引物组，用于特异性检测SARS-CoV-2。实验表明，本发明试剂盒，可特异性检测SARS-CoV-2病毒，与EB病毒，HCMV病毒，呼吸道常见病毒(甲/乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒和人副流感病毒等)和肠道病毒等不发生交叉反应，灵敏度高，可快速准确地筛查SARS-CoV-2病毒；
2)本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，针对咽拭子样本无需核酸提取，操作简单，在65℃等温条件下，30分钟内可准确、闭管式快速检测筛查SARS-CoV-2病毒；
4)本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒对仪器要求不高，检测结果判定简单，通过荧光扩增仪可观察到扩增曲线，确定检测结果。
综上本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，无需核酸提取，封闭操作，可防止二次污染，保证了操作人员及环境的安全，检测结果直观容易判定，可用于医院、诊所和检测实验室对SARS-CoV-2病毒携带者进行快速筛查。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒对SARS-CoV-2病毒的检测结果；
图2为本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒对SARS-CoV-2病毒的特异性检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本发明实施例提供一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，包括N基因引物组和S基因引物组；
所述N基因引物组包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；
所述F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1、LB-1的核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-1：CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC；
B3-1：CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT；
FIP-1：ACCCACATAATAAGCTGCAGCA-GTTATTTGACTCCTGGTGATT；
BIP-1：ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCTGA；
LF-1：CCAGCTGTCCAACCTGAAGA；
LB-1：ACTGTGCACTTGACCCTCTC。
实施例2
本发明实施例提供一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，包括N基因引物组和S基因引物组；
所述S基因引物组包括一对外引物F3-2和B3-2、一对内引物FIP-2和BIP-2、以及一对环引物LF-2、LB-2；
所述F3-2、B3-2、FIP-2、BIP-2、LF-2、LB-2的核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-2：CACCCGCAATCCTGCTAAC；
B3-2：CCAGCCATTCTAGCAGGAGA；
FIP-2：TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGC-GCTGCAATCGTGCTACAACT；
BIP-2：GGCGGCAGTCAAGCCTCTTC-CCTACTGCTGCCTGGAGTT；
LF-2：TGGCAATGTTGTTCCTTGAGG；
LB-2：ATCACGTAGTCGCAACAGTTC。
实施例3
本发明实施例提供一种检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，该试剂盒由反应预混液A，反应预混液B、阳性质控、阴性对照组成。具体的，应用本实施例的试剂盒，25μL反应体系含以下物质：待检样本5μL，3μL反应预混液A(Bst DNA大片段聚合酶4U，AMV逆转录酶8U，SYBR green I荧光染料0.5μL(1000×)，17μL反应预混液B(引物组2.8μL，dNTP 1.0mM，甜菜碱1.2mM，硫酸镁12mM，体积分数12％甲酰胺溶液，DEPC水补足至17μL)。
所述引物组为实施例1和实施例2所述的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，核苷酸序列如SEQ ID No1-12所示。其中，N基因引物组和S基因引物组的浓度比例为1：1。所述N基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2，所述S基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
需要说明的是，在其他实施例中，反应预混液B可使用体积分数30％以下的甲酰胺溶液，优选为2-15％的甲酰胺溶液。本发明实施例中以反应预混液B中含有体积分数10％的甲酰胺溶液为例进行说明。
实施例4
应用本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒进行检测，检测样品为采集的咽拭子。
检测方法如下：
(a)样本：待检4个咽拭子样品，无需对咽拭子样品进行核酸提取，直接检测；
(b)一锅法RT-LAMP荧光反应及反应体系：待检样本5μL，反应预混液A 3μL(BstDNA大片段聚合酶2U，AMV逆转录酶10U，SYBR green I荧光染料0.5μL(1000×)，反应预混液B17μL(引物组2.0μL，dNTP 1mM，甜菜碱1.2mM，硫酸镁12mM，体积分数10％甲酰胺，DEPC水补足至17μL)；同时设置阳性质控和阴性对照，于65℃反应30min，并在85℃中断反应。
所述引物组为实施例1和实施例2所述的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，核苷酸序列如SEQ ID No1-12所示。其中，N基因引物组和S基因引物组的浓度比例为1：1。所述N基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2，所述S基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
(c)荧光扩增仪观察扩增曲线。通过荧光扩增仪观察扩增曲线是否呈“S”型，确定检测结果。
具体的，完成反应后，观察荧光扩增仪观察扩增曲线。结果示意图如图1所示，P为阳性质控，含有SARS-CoV-2病毒N及S基因组片段；N为阴性对照，DEPC水；1、4为阴性样本；2、3为阳性样本，含有SARS-CoV-2病毒的咽拭子样本(已确诊)。荧光扩增仪观察扩增曲线，由图1可知，P阳性质控和2、3阳性样本呈“S”型，说明样本中含有SARS-CoV-2病毒，1、4阴性样本和N阴性对照无扩增曲线，则说明样本中没有含SARS-CoV-2病毒。
特异性验证：
本实验采用实施例3提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒进行特异性验证。
(a)待检样本：待检测样本为不同类型的假病毒，包括：SARS-CoV-2病毒(含目的片段的假病毒)，灭活甲型流感病毒的H1N1/H3N2；乙型流感病毒FluB；人副流感病毒的1/2/3型；腺病毒的B/E属；肺炎支原体；肺炎衣原体，MERS-Cov和SARS假病毒，所述待检样本可直接进行检测，不需要提取核酸。
(b)反应体系及条件(25μL反应体系，同实施例3)：
反应预混液A 3μL，反应预混液B17μL，待测样本5μL，反应体系在65℃反应30min，在85℃中断反应。
(c)检测结果判断：
通过荧光扩增仪观察扩增曲线是否呈“S”型，确定检测结果。观察到呈“S”型扩增曲线，则检测结果判定为阳性，即检测样本中含有SARS-CoV-2病毒；观察到不呈“S”型扩增曲线，则检测结果判定为阴性，即检测样本中不含有SARS-CoV-2病毒。
具体的，完成反应后，观察荧光扩增仪观察扩增曲线。如图2所示，图中：P阳性质控为SARS-CoV-2的S基因及N基因重组克隆质粒，N阴性对照为DEPC水；SARS-CoV-2病毒(含目的片段的SARS-CoV-2假病毒)，1.灭活甲型流感病毒的H1N1/H3N2；2.乙型流感病毒FluB；3.人副流感病毒的1/2/3型；4.腺病毒的B/E属；5.肺炎支原体；6.肺炎衣原体，7.MERS-Cov和8.SARS假病毒)。
由图可知，M和P阳性质控的反应管呈蓝色，蓝色说明样本中含有SARS-CoV-2病毒，N阴性样本和1-12的反应管呈紫色，紫色说明样本中没有含SARS-CoV-2病毒。实验结果显示本发明试剂盒可特异性地检测SARS-CoV-2病毒，与其他待检病毒等不发生交叉反应。
图2结果表明，P阳性质控以及SARS-CoV-2病毒的反应管扩增曲线呈“S”型，证实了样本中含有SARS-CoV-2病毒，N阴性样本和1-8的反应管无扩增曲线，证实了样本中没有含SARS-CoV-2病毒。实验结果显示本发明提供的试剂盒可特异性地检测SARS-CoV-2病毒，与其他待检病毒等不发生交叉反应。
LAMP检测与传统qPCR检测比较
选取100个咽拭子样本，经二代核酸测序证实含阳性样本21个，阴性样本79例。分别用本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒、qPCR对上述样本进行检测，结果见表1。
表1：LAMP检测结果与qPCR检测结果比较
Figure BDA0002626029370000101
由表1的结果可知，本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒的阳性样本检出率为100％。而qPCR误将一例阳性样本检测为阴性。可见，本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒具有准确性更高的优点。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试剂盒
<141> 2020-08-10
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctaggtttca aactttactt gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cctttttcta cagtgaagga tt 22
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acccacataa taagctgcag cagttatttg actcctggtg att 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgaaaatgg aaccattaca gatgccaacg tacactttgt ttctga 46
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccagctgtcc aacctgaaga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
actgtgcact tgaccctctc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cacccgcaat cctgctaac 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccagccattc tagcaggaga 20
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tgctcccttc tgcgtagaag cgctgcaatc gtgctacaac t 41
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggcggcagtc aagcctcttc cctactgctg cctggagtt 39
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tggcaatgtt gttccttgag g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atcacgtagt cgcaacagtt c 21

Claims (10)

1.一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，其特征在于，包括N基因引物组和S基因引物组；
所述N基因引物组包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；
所述F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1、LB-1的核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-1：CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC；
B3-1：CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT；
FIP-1：ACCCACATAATAAGCTGCAGCA-GTTATTTGACTCCTGGTGATT；
BIP-1：ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCTGA；
LF-1：CCAGCTGTCCAACCTGAAGA；
LB-1：ACTGTGCACTTGACCCTCTC。
2.如权利要求1所述的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组，其特征在于，所述S基因引物组包括一对外引物F3-2和B3-2、一对内引物FIP-2和BIP-2、以及一对环引物LF-2、LB-2；
所述F3-2、B3-2、FIP-2、BIP-2、LF-2、LB-2的核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-2：CACCCGCAATCCTGCTAAC；
B3-2：CCAGCCATTCTAGCAGGAGA；
FIP-2：TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGC-GCTGCAATCGTGCTACAACT；
BIP-2：GGCGGCAGTCAAGCCTCTTC-CCTACTGCTGCCTGGAGTT；
LF-2：TGGCAATGTTGTTCCTTGAGG；
LB-2：ATCACGTAGTCGCAACAGTTC。
3.如权利要求1或2所述的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组在制备检测SARS-CoV-2病毒的荧光检测试剂盒中的应用。
4.一种检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于，包括反应预混液A、反应预混液B、阳性质控、阴性对照；
所述反应预混液A包括Bst DNA大片段聚合酶、AMV逆转录酶、荧光染料；
所述反应预混液B包括10×反应缓冲液、权利要求1或2所述的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、甲酰胺和DEPC水。
5.根据权利要求4所述的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于，所述甲酰胺选用体积分数30％以下的甲酰胺溶液。
6.根据权利要求5所述的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于，所述甲酰胺选用体积分数2-15％的甲酰胺溶液。
7.根据权利要求5所述的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白N基因及刺突蛋白S基因的基因组片段；所述阴性对照为DEPC水。
8.根据权利要求4所述的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于，所述反应预混液B的双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组中，N基因引物组和S基因引物组的浓度比例为1：0.1～10。
9.根据权利要求8所述的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于，所述N基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
10.根据权利要求8所述的检测SARS-CoV-2病毒的一锅法RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于，所述S基因引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
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